Detección de la multi-resistencia bacteriana

Detección de la multi-resistencia bacteriana

Dr. Germán Bou, Jefe de Servicio de Microbiología del Complejo Hospitalario Universitario A Coruña (CHUAC); Director del Grupo de Investigación de Microbiología y Enfermedades Infecciosas del Instituto de Investigación Biomédica de la Coruña (INIBIC) en el Área de Genética, Microbiología y Medicina Molecular; y Profesor Asociado de Ciencias de la Salud, del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela.

En el siglo XX, las muertes por enfermedades infecciosas descendieron (patrón EEUU) debido a la combinación de mejoras en el desarrollo y en los sistemas de salud como estándares de vida, saneamiento, agua potable, vacunas y medicamentos antibióticos efectivos.

Los antibióticos ayudaron a mejorar el mundo. La penicilina aumentó la supervivencia de enfermos con neumonia y bacteremia del 10% al 90%.

Pero un hecho

destacable de las bacterias en general es su rápida evolución a los antibióticos. Tal y como se muestra en la figura de abajo, es notoria la aparición de un gran número de enzimas tipo β-lactamasas identificadas tras la introducción de los primeros

antibióticos β-lactámicos. Este patrón evolutivo con semejante rapidez no se observa en otros modelos biológicos.

Una preocupación especial, desde hace meses es la emergencia de cepas resistentes a la colistina, único antibiótico que nos quedaba seguro frente a las bacteria Gram negativas multirresistentes.

Paralelamente, el descubrimiento y desarrollo de nuevos antimicrobianos en los últimos años ha tenido la evolución contraria. Muy pocos nuevos antibióticos han sido aprobados en el actual siglo.

Por otro lado, la crisis de la RAM ha llegado ahora por diversas razones: -

Causas relativas a los microbios: evolución rápida

- Causas humanas: Población humana

Sobreuso de los antibióticos

-

Sobre prescripción

Cursos de tratamiento extensos

-

Almacenamiento

Compras sin prescripción

-

-

-

La RAM va a ser un problema de tremendas dimensiones. Las muertes atribuibles a la RAM para el año 2050 se estima en torno a los 10 millones como se puede ver en la figura siguiente:

Según un informe de septiembre de

2016 del Banco Mundial (Drug

Resistant Infections. A Threat of Economic Future, World Bank Group) existe también una repercusión económica importante relacionada las bacterias RAM: Pérdida en el

PIB, entre el 1,1 y el 3,8% (> 5% en los países con ingresos bajos), que conducirá a 28 M de personas a la pobreza, e incremento de los costes de la atención de salud de $300M a $1000.000M, y afectación del desarrollo sostenible.

Hoy día se tiende a considerar el problema de la RAM, menos de manera médica individual y más global, integrado, multisectorial, enfocado hacía la Salud, sobre todo en lo que se refiere a la transmisión de los genes RAM, que afecta a bacterias humanas, animales y de entornos naturales.

Para enfocar bien el problema, se ha llegando a acuerdos tripartitos como los de la Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), World Organization for Animal Health (OiC) y World Health Oganization (WHO o OMS)

El plan Global de Acción de la OMS se puede resumir así: “mantener la capacidad de prevenir y tratar infecciones con medicamentos seguros y eficientes … usados de manera responsable y accesibles para todos"

(WHO, 2015. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance.

http :// apps.who.int/iris/bitstream/10665/193736/1/9789241509763_eng.pdf?ua=1)

El Grupo Especial de Coordinación Interagencial de la OMS, en mayo 2017,

reconocía que la RAM es compleja y que exige un enfoque multisectorial, y un marco general de intervenciones, el vínculo entre la RAM y el Plan de Acción Mundial con los

ODS, la necesidad de mejores datos, pero también actuar sobre lo que ya se conoce, el papel del medio ambiente en la aparición y propagación de la RAM, la necesidad de investigación y desarrollo relacionada con la RAM, educación para profesionales relevantes y público en general y participación de la comunidad social.

http:// www.who.int/antimicrobial-resistance/interagency-coordination-group/IACG-firstMtgReport.pdf?ua=1

Frente a este problema , las soluciones pueden ser múltiples y pasan por mejorar el control d ela infección, planes de optimización del uso de antimicrobianos, protocolos de seguimiento de microorganismos multirresistentes y optimizar la detección

temprana de los mismos a través de metodología del laboratorio.

Se contemplan y analizan varios métodos actuales y de futuro:

Métodos actualmente más utilizados



Pruebas fenotípicas automáticas y/o

manuales



Pruebas proteómicas (MALDI-TOF MS)



Técnicas moleculares basadas en ácidos

nucleicos (PCR sobre todo)



Pruebas proteómicas

En línea con las medidas de control, el Dr. Bou y su equipo tienen amplia

experiencia en la detección rápida de bacterias (RAM) con el sistema MALDI-TOF MS. Algunos resultados a modo de resumen:

Detección de β-lactamasa(carbapenemasa) OXA-48

Desarrollaron un ensayo de espectrometría de masas con el MALDI-TOF MS, rápido y sensible (100%) que los existentes, para detectar bacterias productores β-latamasa tipo OXA-48 en 161 aislados clínicos previamente caracterizados. Se controló el ertapenem para detectar resistencia a carbapenemes, y se incluyó la temocilina como un marcador para las cepas productoras de OXA-48. Los datos de los resultados se obtuvieron en un tiempo dentro de 60 min.

J

Clin Microbiol 2016; 54(3): 754–759. doi: 10.1128/JCM.02496-15.

Resistencia a carbapenémicos de bacilos Gram negativos de hemocultivos positivos

Otro nuevo método desarrollado, basado en el MALDI-TOF, fue para la detección rápida y automática de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii productoras de carbapenemasas, directamente a partir de sangre de hemocultivos positivos. La actividad de la carbapenemasas se determinó en 30 minutos midiendo la hidrólisis de imipenem (0,31 mg/ml) en hemocultivos enriquecidos con una serie de 119 aislados previamente caracterizados, 81 de los cuales portaban un tipo de carbapenemasa (10 blaKPC, 10 blaVIM, 10 blaNDM, 10 blaIMP , 26 blaOXA-48-tipo,

9 blaOXA-23, 1 blaOXA-237, 3 blaOXA-24 y 2 blaOXA-58). Este ensayo resultó simple de realizar, económico, con ahorro de tiempo, universal para bacilos gramnegativos y altamente confiable (sensibilidad y especificidad generales de 98% y 100%, respectivamente). El tiempo total de 1 h, incluida la extracción, la incubación y el análisis del MALDI-TOF.

El procedimiento empleado podría establecerse como un método estandarizado en laboratorios clínicos ya que no requiere capacitación especializada en espectrometría de masas.

J Antimicrob Agents 2016; 48: 655-660.

http://dx.doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2016.08.024

Imipenem–avibactam: combinación para la detección rápida de carbapenemasas en Enterobacteriaceae y Acinetobacter baumannii por MALDI-TOF

En este estudio se propuso un novedoso método basado en MALDI-TOF MS para detectar Enterobacteriaceae y Acinetobacter baumannii productoras de

carbapenemasas. Se analizaron una serie de 131 aislados. Entre ellos, un total de 115 Enterobacteriaceae: 79 con una carbapenemasa (15 blaKPC, 7 blaNDM, 11 blaIMP, 12

blaVIM y 34 blaOXA-48) y 16 aislados de A. baumannii: 15 con carbapenemasas (10

blaOXA-23, 2 blaOXA-58, 2 blaOXA-24 y 1 blaOXA-237). El resto de los aislados no eran productores de carbapenemasas (controles negativos). Las bacterias se sometieron a pruebas de sensibilidad usando una combinación de imipenem-avibactam y se

analizaron mediante el software MALDI-TOF Biotyper Compass (Bruker Daltonik, Alemania). El ensayo mostró una sensibilidad y especificidad global para la detección de carbapenemasas del 98% y del 100%, respectivamente. La combinación de imipenem y avibactam mostró actividad contra Enterobacteriaceae productoras de KPC y OXA-48, pero no proporcionó ningún beneficio sobre A. baumannii.

Diag Microbiol InfectDis 2016; 87: 129-132.

doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2016.10.016.

Detección rápida del determinante de resistencia a quinolonas condicionada por plásmido AAC(6 ')-Ib-cr en Enterobacteriaceae por análisis con MALDI-TOF MS El objetivo del estudio fue la detección rápida del determinante de resistencia a fluoroquinolonas condicionada por el plásmido AAC(6')-Ib-cr en Enterobacteriaceae analizando por MALDI-TOF MS la actividad de la acetiltransferasa. La presencia de la enzima se midió en una colección de 81 cepas de control isogénicas de Escherichia coli [10 portanban AAC(6')-Ib-cr durante su exposición a ciprofloxacino, norfloxacino y levofloxacino] y un análisis adicional de 36 aislados clínicos [25 con AAC(6')-Ib-cr, además de diferentes combinaciones de mecanismos de resistencia a quinolonas]. El efecto de la acetilación produce un aumento de 43 Da en la masa de ciprofloxacino y norfloxacino, pero no de levofloxacino. Se encontró una clara diferenciación entre los aislados productores de AAC(6')-Ib-cr- y los no productores, todo en un tiempo de incubación de 30 minutos, tanto en las cepas de control isogénicas como en los aislados clínicos. El levofloxacino se encontró intacto. Hubo un acuerdo del 100% entre el ensayo basado en MALDI-TOF-MS y los resultados de la caracterización molecular de los aislados analizados. Este método es fácil de realizar y no consume mucho tiempo, ya que los resultados analíticos se pueden obtener en cuestión de minutos.

J Antimicrob

Chemother2017; 72: 1074-1080. doi: 10.1093/jac/dkw552

Detección directa rápida de Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasas en muestras clínicas de orina mediante análisis MALDI-TOF MS

Lo autores procesaron 3 041 muestras de orina mediante citometría de flujo, y se utilizó un valor de corte de ≥1.5 ×105 _{bacterias/ml para seleccionar las muestras,} quedando 608 muestras para identificación bacteriana directa. La detección de la actividad carbapenemasa por análisis con MALDI-TOF MS sólo se realizó después de la identificación directa confiable de bacilos gramnegativos. Se desarrolló un nuevo procedimiento para extraer bacterias de muestras de orina utilizando el Sepsityper Kit (Bruker Daltonik, Alemania). La resistencia a carbapenem se detectó con imipenem como marcador antibiótico y los resultados se interpretaron automáticamente utilizando el módulo STAR-BL del software MALDI-TOF Biotyper Compass (Bruker Daltonik, Alemania). Con el MALDI-TOF MS produjo una identificación directa

confiable de 91% (503/553) de las muestras. El ensayo mostró 100% de sensibilidad (30/30) y especificidad (454/454) para detectar la actividad carbapenemasa dentro de los 90 min de recepción de la muestra. Los aislados incluidos en el estudio se

caracterizaron además por PCR y secuenciación, y se detectó blaOXA-48 en todos los aislados que dieron positivos con el MALDI-TOF MS. El método ahorra al menos 24-48 horas en relación con los métodos de habituales actuales.

J Antimicrob Chemother 2017; 72: 1350–1354. doi:

Hacia la detección temprana de Enterobacteriaceae productoras de β-lactamasas mediante análisis con MALDI-TOF MS

El método se evaluó en términos de sensibilidad, especificidad y tiempo de respuesta con respecto al antibiótico utilizado (cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, cefpodoxima o cefepima) y el rendimiento del software MBT STAR-BL (Bruker Daltonik GmbH, Alemania) relativo a interpretación cualitativa de los espectros para detectar resistencia por β-lactamasa usando el MALDI-TOF MS (Bruker Daltonik) en una colección de 11 cepas de control isogénicas de Escherichia coli que expresan

diferentes tipos de β-lactamasas. Para la validación clínica, se determinó la actividad β-lactamasa en 100 aislados clínicos en condiciones evaluadas previamente,

caracterizados por PCR y secuenciación.

La validación clínica del ensayo mostró una sensibilidad y especificidad del 100% para detectar la resistencia a los β-lactámicos en 30 minutos midiendo la hidrólisis de

ceftriaxona (0,50 mg / ml) con el software automático MBT STAR-BL. En cuanto a los antibióticos evaluados, la ceftriaxona arrojó un 70% más de resultados positivos que la cefotaxima, un 80% más que la ceftazidima y un 20% más que la cefpodoxima, con un 100% de especificidad. Cefepime reveló una sensibilidad del 100%, pero solo un 27% de especificidad. Para el mismo tiempo de incubación, el software dió un promedio de 41% más de resultados positivos en relación con la detección de resistencia que la interpretación cualitativa de los espectros.

Esta validación clínica del método demostró ser altamente confiable, simple de realizar y de ahorro de tiempo, transformando la detección de resistencia a

β-lactámicos por MALDI-TOF MS en una técnica lista para usar en laboratorios clínicos.

J Antimicrob Chemother 2017; 72: 2259-2262. https//doi.org/10.1093/jac/dkx127.

Métodos moleculares

Estos métodos usados para la detección de bacterias RAM se resumen así: ‒ PCR simple o múltiple

‒ PCR en tiempo real (Sybr green, Taqman, Hybridization probes) ‒ PCR de hibridación inversa

‒ Micromarrays de DNA

‒ Amplificación basada en las secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) ‒ Amplificación isotérmica de DNA (LAMP)

Evaluación de un nuevo procedimiento para la detección rápida de

Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasas (EPC) utilizando equipos de carbapenemasas modulares LightMix®

Los equipos (kits) modulares de PCR multiple dirigidos a la detección de genes de resistencia los carbapenemes blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP y blaOXA-48- se evaluaron en términos de sensibilidad y especificidad en un conjunto de 118 aislados clínicos marcados. Entre estos, 96 fueron EPC genotípicamente caracterizados por PCR y secuenciación. Los límites de detección se calcularon para los diferentes genes de resistencia en términos de ufc/ml. Además, los kits se usaron para evaluar la colonización de enfermos mediante EPC al comparar este ensayo con el kit Xpert® Carba-R en 127 muestras rectales, perirrectales y faríngeas. También se evaluaron hemocultivos de bacteriemias (4) y hemocultivos enriquecidos (23) con aislados genotípicamente caracterizados.

La sensibilidad y especificidad global del ensayo de PCR múltiple fue del 99% y del 100%, respectivamente. El límite de detección para blaKPC, blaVIM, blaIMP y blaOXA-48 es de 60 ufc/ml y para blaNDM 500 ufc/ml. Los estudios de colonización y

bacteriemia revelaron un acuerdo del 100% entre los resultados obtenidos por este ensayo y los obtenidos por GeneXpert®.

son ensayos altamente confiables y utilizables para enfermos colonizados y sépticos, y pueden ayudar a mejorar el control de la infección. Su diseño modular facilita la detección rentable de EPC en entornos hospitalarios.

J Antimicrob Chemother 2016; 71: 3420-3423. doi:10.1093/jac/dkw356.

Conclusiones de los métodos fenotípicos, proteómicos y moleculares

Pros Contras

Baratos

Fáciles de usar Requiere aislamiento bacteriano24-48 horas de incubación Tiempo total lento 24-48 horas Métodos proteómicos

Pros Contras

Bajos costos de operación Identificación rápida Fácil de manejar

Solo se necesita una colonia

Excelente identificación de bacterias

Altos costos iniciales

Base de datos incompleta todavía Poca experiencia aún en detección de RAM

No se aplica a muestras clínicas, excepto muestras de orina y hemocultivos positivos

Se necesita más automatización Métodos moleculares

Pros Contras

Rapidez

Detección de bacterias exigentes Detectan pequeñas cantidades de bacterias

Detectan genes RAM

Útiles para vigilancia epidemiológica

Interpretación de resultados

(colonización vs. Infección, calidad de la muestra, no detección de nuevos patógenos)

Coste eficiencia

Solo se encuentran los genes que se buscan

El desarrollo de vacunas, es buena arma frente a los microorganismos patógenos, y ahora una prioridad para la salud mundial debido a la creciente resistencia a múltiples fármacos en las bacterias. El Dr. Bou y su equipo también están trabajando en este campo.

Diseño de vacunas bacterianas atenuadas vivas basadas en la auxotrofia de D-glutamato

La síntesis de D-glutamato es esencial para la formación de la pared celular

bacteriana. El Dr. Bou comenta un artículo publicado en Nature Communication por él y su equipo una estrategia para generar vacunas eficaces de células enteras

auxotróficas para D-glutamato. Generaron vacunas auxotróficas D-glutamato para tres patógenos principales, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y

Staphylococcus aureus. Estas vacunas bacterianas muestran atenuación de virulencia y crecimiento autolimitado en ratones, y provocan anticuerpos funcionales y de

reactividad cruzada, e inmunidad celular. Estas respuestas se correlacionan con la protección contra la infección letal aguda con otras cepas de la misma especie,

incluidos clones resistentes a múltiples fármacos, virulentos y/o de alto riesgo, como A. baumannii AbH12O-A2 y Ab307-0294, P. aeruginosa PA14, y S. aureus USA300LAC resistente a la meticilina adquirido en la comunidad. Este enfoque puede aplicarse potencialmente para el desarrollo de vacunas vivas atenuadas para prácticamente cualquier otro patógeno bacteriano, y no requiere la identificación de determinantes de virulencia, que a menudo son específicos de patógenos.

Se produce respuesta inmune humoral hasta 293 días post-vacunación, celular condicionada por IFN-g, IL-4 y IL-17 contra cepas no relacionadas incluyendo MDR, y clones de alto riesgo internacionales y altamente virulentos, incluídos los veterinarios. La vacuna protege frente a infecciones agudas letales causadas por A. baumannii, P. aeruginosa y S. aureus.

Nature Communications 8, Artículo número 15480 (2017). doi:10.1038/ncomms15480

El grupo tecnológico empresarial de las ciencias de la vida de Galicia (BIOGA) premió este proyecto como “Mejor Idea Empresarial Biotech 2016”, y también recibió el premio Caixa Impulse.