FUNDAMENTOS DE LA
FUNDAMENTOS DE LA
TÉCNICA PCR
PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Técnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Técnica que nos permite amplificar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
6
¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde
DNA Polimerasa 3’ 5’ dNTPs dTTPdATP dGTP dCTP
+
Mg ++ 5’ 3’EXTENSION DEL CEBADOR
DNA Polimerasa
3’ 5’
DNA polimerasa
5’ 3’
Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar
8 ¿Qué necesitamos?
DNA molde
Tampón de la reacción (tris,BSA, K…) Nucleotidos (dNTPs, A, C, G y T)Cebadores
DNA polimerasa
Mg++. Primer express
•PrimerGensearches strings of amino acid residues in order to reverse-translate
oligonucletide primers of a desired range of lengths and maximum number of degeneracies. •Primer(Stanford) Sun Sparcstations only
•Primer (Whitehead) Unix, Vms (and DOS and Mac if you can compile it)
•Amplify, Bill Engels (Macintosh only), is for use in designing, analyzing, and simulating experiments involving the polymerase chainreaction (PCR). You can obtain your copy of Amplify here
•PrimerDesign 1.04, a DOS-program to choose primer for PCR or oligonucleotide probes. See also the PrimerDesign Welcome Page.
•PC-Rare, a new software by R. Griffais, which uses a rare octamer at the 3' termini of the primer. This powerful (but user friendly) software is available for Macintosh and Windows environment.
•Primer Design, a Java applet by Luca Ida Giovanni TOLDO.
•CODEHOP, PCR primers designed from protein multiple sequence alignments (Local
mirror siteat WIS).
•Primer3, an online service to pick PCR primers from nucleotide sequence. (Local mirror siteat WIS).
.NetPrimer(PREMIER Biosoft International). NetPrimer combines the latest primer design algorithms with a web-based interface allowing the user to analyze primers over the internet
Programas de ordenador ELECCIÓN DE PRIMERS Evitar G y C en el extremo 3’
-10
DNA polimerasas
Termoestables: Tª óptima de actuación de 72-74ºC
- Taq DNA polimerasa
- Tth polimerasa
Termolábiles: Tª óptima de actuación de 42ºC
- DNA polimerasa I de E. Coli
- Fragmento Klenow de DNA polimerasa
- T4 DNA polimerasa
Taq DNA Polimerasa es la polimerasa de elección
(no tienen actividad 3’-5’ exonucleásica)
PARA AUMENTAR LA FIDELIDAD
No aumentar mucho los ciclos No añadir cantidades excesivas de Cl2Mg Disminuir el tiempo de cada ciclo
Igual cantidad para los cuatro dNTPs y en la mínima concentración
12
Buffer de la reacción
La composición puede ser distinta según las casa
comerciales.
- ClK
- Tris-ClH
- Gelatina
- DMSO
- Detergentes: tritón...
- BSA
- PEG
Cloruro de Magnesio (MgCl
2)Su concentración resulta fundamental para la
optimización de la reacción
Contribuye a aumentar la temperatura de hibridación
[Mg] disminuyen la especificidad
COMPONENTE VOLUMEN CONCENTRACION FINAL
H2O esteril 20,7μL
Buffer PCR 10x 2,5μL 1X
dNTPs mix 0.2μL 200μM (cada uno)
(25mM de cada uno)
Primer mix 0,4μL 0,4μM (cada primer)
(25 pmoles/μL de cada primer)
Taq DNA polimerasa 0,2μL 1U/25μL
“n CICLOS”: ciclo 4
18
Después de:
- 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2
Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N.
La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la
cantidad de DNA es dos veces la del ciclo anterior.
Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que
aparecen en rojo.
No se puede detectar la amplificación hasta el ciclo 25 Se observa una fase lineal a partir del 25
Al final existe una fase de meseta que se representa en rojo
Si representamos los valores en una escala logarítmica, podemos ver las diferencias en ciclos anteriores.
Esto es porque la amplificación de PCR es una reacción exponencial. Existe una relación directa entre el número de copias (cantidad de DNA)
y el ciclo de amplificación
20 1. RNA- PCR
2. PCR con primers degenerados 3. PCR “hot start”
4. PCR touchdown 5. RAPD PCR
6. PCR en tiempo real V. ALGUNOS TIPOS DE REACCIÓN PCR
PCR “Hot start”
Produce generalmente productos más específicos
-Se someten los tubos a Tª de desnaturalización.
- Se colocan en el tubo todos los componentes de la reacción a
excepción de la Taq DNA polimerasa.
- En ese momento se añade la polimerasa.
22 Touchdown PCR
- Se basa en la utilización de una Tª de hibridación
decreciente 1ºC en cada ciclo hasta alcanzar una Tª que se mantiene los últimos ciclos (10 ciclos)
RAPD PCR
(Rapid amplification polymorphism DNA) -Se utilizan primers diseñados al azar.
-Se obtienen patrones de bandas , que pueden ser utilizados por ejemplo para la
diferenciación de especies. RAPD-PCR Patés C/ C/PtPt PtPt O O PvPv PllPll C C PtPt
PCR en tiempo real
- Se llama así porque se detecta el progreso de la reacción de PCR tal y como va transcurriendo. Los datos se van recogiendo a lo largo de todo el proceso y
no solamente al final de la reacción (tal y como ocurriría en una PCR estándar)
1º.- Excitación de las 96 muestras de la placa mediante una lámpara halógena de tungsteno
2º.- La fluorescencia emitida es captada por unos filtros ópticos, cada uno de ellos capta de forma óptima determinados colorantes fluorescentes (SYBR Green, FAM, VIC, TAMRA, ROX...).
3º.- La emisión de fluorescencia se está midiendo de forma continua en cada momento de la reacción
PCR EN TIEMPO REAL
PCR CUANTITATIVO
24
Dos estrategias de marcaje
SONDAS TaqMan
SYBR green
SONDAS
TaqMan
Polimerización
Desplazamiento de la cadena
Rotura de la sonda y separación del Reporter
26
AMPLIFICACIÓN EN TIEMPO REAL
En la primera fase , el crecimiento es geométrico. No hay ningún componente limitando y por tanto la cuantificación será más precisa.
28 PCR a tiempo real Punto final
-Si se realiza una PCR estándar (punto final). La conclusión sería que existe una cantidad muy distinta entre muestras.
- Si se realiza un real time PCR se ve que la concentración es la misma porque todas las muestra empiezan en el mismo ciclo.
PCR Tiempo Real
- Cuantificación
Absoluta: Nº de copias de un virus, de un gen
Relativa: comparación de un tejido normal frente a otro tumoral
- Detección
Ensayo +/-: presencia o ausencia
Discriminación alélica (SNPs): análisis de mutaciones
PCR aplicada a la identificación genética
1% 5% 10% 25% 50% 75% 100%
PCR aplicada a la seguridad alimentaria
32
2.- Identificación genética mediante marcadores genéticos
Establecimiento de un sistema de trazabilidad (rastreabilidad) desde el animal vivo hasta sus partes en la carnicería
3.- Detección de patógenos en alimentos
Salmonella , Listeria , Toxoplasma, Campilobacter,
E.coli O157 son los agentes màs frecuentes en las
infecciones causadas por alimentos
Creación de plantas transgénicas
Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1%
Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes
Mediante técnica PCR
