A R T E R I T I S V Í R I C A E Q U I N A
RESUMEN
La arteritis vírica equina (AVE) es una enfermedad vírica y contagiosa de los équidos causada por el virus de la arteritis equina (EAV), un virus con ARN clasificado en la familia Arteriviridae. El virus se encuentra en las poblaciones de caballos de muchos países por todo el mundo. Aunque en el pasado se describían muy raramente, los brotes de AVE parecen en aumento.
La mayoría de las infecciones adquiridas naturalmente con el EAV son subclínicas. Cuando aparecen, los síntomas clínicos de la AVE varían en extensión y gravedad. La enfermedad se caracteriza principalmente por fiebre, depresión, anorexia, edema, en especial en las patas y en el escroto y prepucio de sementales, conjuntivitis, una reacción cutánea de tipo urticario, aborto, y en raras ocasiones una neumonía fulminante o una neumo–enteritis en potros jóvenes. Excepto por la mortalidad en potros jóvenes, la frecuencia de casos con mortalidad en los brotes de AVE es muy baja. Por lo general, los caballos afectados se recuperan por completo desde el punto de vista clínico. En un alto porcentaje de sementales infectados se establece un estado de portador duradero, pero no en yeguas o en caballos no reproductores.
Identificación del agente: Clínicamente la AVE no puede diferenciarse de otras enfermedades equinas de tipo respiratorio y sistémico. El diagnóstico de la infección por el EAV descansa en el aislamiento del virus, la detección del antígeno vírico o su ácido nucleico, o en la demostración de una respuesta específica de anticuerpos. Se debe intentar el aislamiento del virus en cultivos celulares de riñón de conejo, caballo o mono, a partir de muestras clínicas apropiadas o en las obtenidas post–mortem. La identidad de los aislamientos del EAV debe confirmarse por pruebas de neutralización, por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT–PCR), o por métodos inmunoquímicos, fundamentalmente por inmunofluorescencia indirecta o por técnicas de avidina–biotina–peroxidasa.
En casos sospechosos de enfermedad la detección e identificación del EAV también puede intentarse utilizando la prueba RT–PCR y cebadores apropiados del ARN vírico.
Cuando la mortalidad se asocia con un brote sospechoso de AVE, debe examinarse una amplia variedad de tejidos para evidencia histológica de panvasculitis, que es especialmente notable en las pequeñas arterias de todo el cuerpo. Las lesiones vasculares características que se presentan en el animal maduro no son una propiedad destacable en los abortos relacionados con la AVE. Pruebas serológicas: Para la detección de anticuerpos frente al EAV se han utilizado varias pruebas serológicas que incluyen neutralización vírica (NV), fijación de complemento (FC), inmunofluorescencia indirecta, inmunodifusión en medio sólido y enzimoinmunoensayo (ELISA) . Las pruebas actualmente más utilizadas son la prueba NV aumentada con complemento y la técnica ELISA. La prueba NV es muy sensible y específica y tiene mucho valor en el diagnóstico de la infección aguda y en estudios de seroprevalencia. Se han desarrollado varios métodos ELISA, ninguno de los cuales ha sido validado tan ampliamente como la prueba NV aunque algunos parecen mostrar una especificidad y sensibilidad similar. La prueba FC es menos sensible que cualquiera de estos procedimentos, pero puede utilizarse para diagnosticar una infección reciente.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Existen dos vacunas comerciales contra la AVE derivadas de cultivo de tejidos. Una es una vacuna con virus vivo modificado (MLV) que se prepara a partir de un virus que se ha atenuado para los caballos por múltiples pases seriados en cultivos primarios de células de caballo y de conejo. Se ha demostrado que es segura y protectora para caballos sementales y yeguas no preñadas. Está contraindicada la vacunación
de potros menores de 6 semanas de edad y de yeguas gestantes en los dos últimos meses de gestación. No existe evidencia de reversión del virus vacunal a virulento después de su utilización en el campo durante muchos años. La segunda vacuna es un producto inactivado y con adyuvante que se prepara con virus obtenido de cultivo celular equino que puede usarse tanto en caballos de reproducción como en los no reproductores. A falta de datos apropiados sobre seguridad, no se recomienda en la actualidad el uso de la vacuna en yeguas gestantes.
A. INTRODUCCIÓN
La arteritis vírica equina (AVE) es una enfermedad vírica contagiosa de los équidos causada por el virus de la arteritis equina (EAV), un virus con ARN monocatenario y con polaridad de mensajero, que es el miembro prototipo del género Arterivirus, de la familia Arteriviridae, orden Nidovirales (6). Algunas de las denominaciones descriptivas que se usaron en el pasado para referirse a una enfermedad clínicamente semejante a AVE son linfangitis epizoótica de ojo rosado, fiebre tifoide y rotlaufseuche. El espectro natural de hospedadores del EAV parece limitado a los équidos y el virus no constituye un riesgo sanitario para los humanos (40). El EAV está presente en los caballos de muchos países en todo el mundo (40). En los últimos años ha habido un aumento en la incidencia de AVE asociada a una mayor frecuencia de movimiento de caballos y a la utilización de semen transportado (2, 40).
Aunque la mayoría de los casos de infección aguda con EAV son subclínicos, algunas cepas del virus originan enfermedad con una gravedad variable (40). Los casos típicos de AVE se pueden presentar combinados con cualquiera de los siguientes síntomas: fiebre, depresión, anorexia, leucopenia, edema, especialmente en las patas, escroto y prepucio de los sementales, conjuntivitis, descargas oculares, edema supra y periorbital, rinitis, descarga nasal, reacción cutánea local o generalizada de tipo urticario, aborto y, raramente, neumonía o neumo-enteritis fulminante en potros jóvenes. Independientemente de la gravedad de los síntomas clínicos, los caballos afectados se recuperan casi siempre por completo. La frecuencia de casos mortales en brotes de AVE es muy baja; en general, la mortalidad solo se presenta en potros muy jóvenes, sobre todo en aquellos con infección congénita del virus (29, 40).
La AVE no se puede diferenciar clínicamente de varias enfermedades respiratorias y sistémicas equinas, siendo las más comunes la gripe equina, las infecciones por herpesvirus equinos 1 y 4, las infecciones con los virus A y B de la rinitis equina y por adenovirus, así como las infecciones debidas a estreptococos, particularmente la púrpura hemorrágica. La enfermedad también presenta similitudes clínicas con la anemia infecciosa equina, casos de infección con el virus Getah, peste equina africana, e intoxicación causada por el aliso gris (Berteroa incana). El EAV se multiplica en el tracto respiratorio de los animales con infección aguda y se excreta en grandes cantidades (39). Un porcentaje variable de sementales con infección aguda se convierten en portadores crónicos del virus en el tracto reproductivo y en excretores continuos a través del semen (40, 41). El estado de portador solo se ha encontrado en sementales, no en yeguas, caballos castrados o potros sexualmente inmaduros (40).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1. Identificación del agente
a) Aislamiento del virus
Cuando se sospecha la aparición de un brote de AVE o cuando se intenta confirmar un caso de una infección subclínica por el EAV, debería aislarse el virus de frotis nasofaríngeos y conjuntivales, muestras de sangre no coagulada, y semen de los sementales que puedan ser posibles portadores del virus (40). Para aumentar la probabilidad de aislar el virus, se deben obtener muestras representativas lo más pronto posible después de la aparición de la fiebre en los caballos afectados. Hay evidencias de que la heparina puede inhibir el crecimiento del EAV en células RK–13 (1) y, por tanto, su empleo como anticoagulante puede interferir con el aislamiento del virus a partir de sangre completa. Cuando en casos de mortalidad de potros y animales más viejos se sospeche que se trata de AVE, se puede intentar el aislamiento del EAV de varios órganos, especialmente de los ganglios linfáticos asociados con el tracto alimentario y órganos asociados, y también de los pulmones, hígado y bazo (31). En brotes de aborto relacionados con AVE, los líquidos placentarios y fetales, así como los tejidos fetales, placentarios y linforeticulares pueden ser una fuente productiva de virus (40).
Los frotis con fines de aislamiento deben sumergirse en un medio adecuado de transporte y, junto con líquidos o tejidos recogidos para aislamiento del virus o para pruebas por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT–PCR), deben enviarse al laboratorio refrigerados o congelados
en un contenedor con aislamiento, utilizando con preferencia un servicio nocturno de transporte. Las muestras de sangre no coagulada deben transportarse refrigeradas pero no congeladas.
Aunque se ha descrito que no siempre se logra en casos naturales de infección por EAV (32, 40), el aislamiento del virus se debe intentar de muestras clínicas o de tejidos de necropsias utilizando cultivos celulares de riñón de conejo, caballo o mono (32, 40). Se pueden usar líneas celulares seleccionadas como RK–13 (ATCC CCL–37), LLC–MK2 (ATCC CCL–7) y células de riñón de mono verde africano (Vero) (ATCC CCL–81), o cultivos primarios de riñón de caballo o conejo, aunque el sistema de elección son las células RK–13 con bajo número de pases iniciales. El aislamiento primario del EAV en células RK–13 a partir de semen parece influenciado por varios factores (37). Se obtienen aislamientos más frecuentes cuando se utilizan monocapas de 3–5 días de edad, un gran inóculo en comparación con el área que presenta la superficie celular en botellas o en placas con multipocillos inoculados y, sobre todo, cuando se incorpora carboximetil celulosa al medio. Debe advertirse que la mayoría de las células RK–13, incluyendo la ATCC CCL–37, están contaminadas con el virus de la diarrea bovina, cuya presencia parece aumentar la sensibilidad de este sistema para el aislamiento primario del EAV. Hay alguna evidencia que apoya que el aislamiento primario del EAV, sobre todo de semen, aumenta en células RK–13 con una historia de elevado número de pases.
Los cultivos inoculados se examinan diariamente para observar efecto citopático (ECP), que normalmente aparece a los 2–6 días. En ausencia de ECP visible, los sobrenadantes de cultivo deben volver a inocularse en monocapas celulares frescas después de 5–7 días. La mayoría de los aislamientos del EAV se logran en el primer o segundo pase por cultivo celular (40, 41). La identidad de los aislamientos se puede confirmar en una prueba de neutralización, por el ensayo de RT–PCT (2) o por un método inmunocitoquímico, fundamentalmente por inmunofluorescencia indirecta (11) o por la técnica de la avidina–biotina–peroxidasa (ABC) (28). Se ha utilizado un antisuero policlonal de conejo para identificar el EAV en cultivos celulares infectados. También se han desarrollado anticuerpos monoclonales de ratón contra la proteína de la nucleocápsida (4) (N) y de la envoltura (GL) del EAV (12) y un antisuero policlonal específico de conejo contra la proteína M de la envoltura, que permiten detectar varias cepas del virus en células RK–13 a las 12–24 horas de la infección (2,28).
•
Aislamiento de virus del semen (Prueba prescrita para el comercio internacional)
Existe amplia evidencia de que los sementales excretan constantemente a corto y largo plazo EAV en el semen, pero no en secrecciones respiratorias o por la orina; tampoco se ha demostrado el virus en la capa leucocitaria de la sangre de dichos animales (40, 41). La sangre de los sementales debe probarse primero mediante la prueba de neutralización vírica (NV) o mediante un enzimoinmunoensayo (ELISA) validado adecuadamente. Se debe tratar de aislar el virus del semen de los sementales seropositivos con anticuerpos contra el EAV que no tengan antecedentes de vacunación contra AVE. También se recomienda el aislamiento del virus en el caso de semen enviado, cuando no se dispone de sangre del semental donador. A ser posible, el aislamiento del virus del semen debe intentarse con dos muestras, que se pueden recoger el mismo día, en días consecutivos o a intervalos de días o semanas. No hay evidencias de que el resultado del aislamiento del virus de un semental particular esté influenciado por el intervalo entre la toma de muestras o la época del año. El aislamiento del EAV debe realizarse con preferencia en una porción del eyaculado completo recogido mediante una vagina artificial o mediante un condón y una falsa yegua de engaño. Cuando no es posible obtener semen de este modo, un método alternativo menos deseable es tomar una muestra en la desmonta al tiempo de la reproducción. Se debe tener cuidado en no usar antisépticos o desinfectantes en la limpieza de los genitales externos del semental antes de la recogida. Las muestras deben contener la fracción de la eyaculación rica en esperma con la que se asocia el EAV. El virus no se presenta en la fracción pre–esperma del semen (40, 41). Inmediatamente después de la recogida, el semen debe refrigerarse en hielo o en contenedores de nevera para su traslado al laboratorio sin retraso. Cuando es posible que se produzca alguna tardanza, antes de enviar el semen a prueba, se puede congelar a –20°C, o menos, durante varios días o semanas antes de su envío al laboratorio. No se ha detectado que la congelación de las muestras disminuya el aislamiento del EAV del semen de un semental portador.
• Procedimiento de la prueba
i) Antes de la inoculación en cultivos celulares las muestras de semen se pretratan mediante
sonicaciones breves (tres ciclos de 15 segundos) y se centrifugan a 1.000 g durante 10 minutos a 4°C para precipitar los espermatozoides.
ii) Después de eliminar el medio de cultivo se inoculan monocapas confluentes de células RK–13 de 3–
5 días, dispuestas en botellas de cultivo de tejidos de 25 cm2 o en placas con pocillos múltiples, con
diluciones decimales seriadas (10–1–10–3) del plasma seminal en un medio de mantenimiento para
cultivo de tejidos que contenga 2% de suero fetal bovino y antibióticos. Se utiliza un inóculo de 1 ml
por botella de 25 cm2 y se inoculan al menos dos botellas por cada dilución de plasma seminal.
pocillos inoculados por dilución de la muestra. En cada prueba se deben incluir diluciones apropiadas de una muestra control de semen positivo para el virus o de un virus utilizado como control de título conocido diluido en el medio de cultivo.
iii) Las botellas o las placas cubiertas se cierran y se rotan cuidadosamente para dispersar el inóculo
cobre las monocapas celulares.
iv) Los cultivos inoculados se incuban a continuación durante 1 hora a 37°C en un incubador aeróbico o
en un incubador con humedad y una atmósfera de 5% de CO2 en aire, dependiendo de si se emplean
botellas o placas con pocillos múltiples.
v) Sin extraer el inóculo ni lavar la monocapa celular, se recubre ésta última con medio que contiene
0,75% de carboximetil celulosa y antibióticos.
vi) Las botellas o placas se incuban de nuevo a 37°C y se analizan microscópicamente para ECP vírico,
que por lo general se aprecia a los 2–6 días.
vii) En ausencia de ECP visible, los sobrenadantes de cultivo se vuelven a inocular en monocapas celulares frescas después de 5–7 días. Después de eliminar el medio con el que se cubren, las monocapas se tiñen con una solución de cristal violeta tamponada y formalina al 0,1%.
La identidad de cualquier virus aislado debe confirmarse por NV, por inmunofluorescencia, o por la técnica
ABC, utilizando un antisuero polivalente monoespecífico frente a EAV o MAbs frente a las proteínas N o GL
del virus (11, 28, 40, 41), o bien mediante una prueba de tipo RT–PCR y cebadores apropiados de ARN vírico (2).
En la prueba de neutralización, se prueban diluciones decimales seriadas del virus aislado frente a un MAb o a un antisuero monoespecífico preparado contra la cepa Bucyrus que es prototipo del EAV (ATCC VR 796) y también con un suero negativo para anticuerpos neutralizantes del virus. Como controles de la prueba se realizan las titulaciones correpondientes al virus prototipo Bucyrus con los mismos anticuerpos reaccionantes de referencia. La prueba se realiza en botellas de 25 cm2 para cultivo de tejidos o en placas con pocillos múltiples. Se inactivan durante 30 minutos cantidades apropiadas de anticuerpos positivos y negativos frente a EAV en un baño a 56°C y se diluyen ¼ en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2; a continuación, se distribuyen 0,3 ml del anticuerpo diluido en cinco tubos para cada aislamiento de virus
problema. Se realizan diluciones decimales seriadas de cada virus (10–1–10–5) en Medio Mínimo Esencial
de Eagle con 10% de suero fetal bovino, antibióticos y 10% de complemento de cobaya fresco. Luego se añaden 0,3 ml de cada dilución de virus a los tubos que contienen anticuerpos positivos y negativos. Se agitan los tubos y la mezcla virus/anticuerpo se incuba durante 1 hora a 37°C. Después las mezclas se
inoculan en cultivos confuentes en monocapa de células RK–13 de 3–5 días, en botellas de 25 cm2 o en
placas con pocillos múltiples, utilizando dos botellas o pocillos por cada dilución de virus. Cada botella se inocula con 0,25 ml de la mezcla virus/anticuerpo; cuando se utilizan placas con pocillos múltiples se prorratea el tamaño del inóculo. Las botellas o placas inoculadas se incuban 2 horas a 37°C, moviéndolas con cuidado a la hora para dispersar el inóculo sobre la monocapa celular. Sin extraer el inóculo ni lavar las monocapas celulares, éstas se recubren con medio que contiene 0,75 % de carboximetil celulosa y se incuban 4–5 días a 37°C en un incubador aeróbico o en un incubador con humedad y una atmósfera de 5%
de CO2 en aire. Después de eliminar el medio, las monocapas se tiñen con una solución de cristal violeta
tamponada y formalina al 0.1%. Se cuentan las placas o calvas producidas, y se determina el título de infectividad del virus tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos contra el EAV utilizando el método de Spearman–Kärber. La identificación del virus aislado se basa en el grado de reducción del número de placas o calvas en comparación con las de la cepa prototipo Bucyrus del EAV.
La mayoría de los EAV aislados de sementales portadores se logra en el primer pase en cultivo celular empleando el procedimiento indicado de la prueba (40, 41). La existencia de toxicidad no vírica o de contaminación bacteriana en las muestras no es un problema importante cuando se trata de aislar este virus del semen de sementales. Si se observa toxicidad no viral, normalmente aparece en las monocapas inoculadas con la dilución 10–1 del plasma seminal y mucho más raramente con la 10–2. Para superar este
problema se ha empleado con cierto éxito un tratamiento del plasma seminal con polietilén glicol (peso
molecular 6000) (19). El método descrito implica añadir polietilén glicol a las diluciones 10–1–10–3 del
plasma seminal hasta una concentración final del 10% para cada dilución. Las mezclas se mantienen una noche a 4°C con agitación suave y después se centrifugan a 2.000 g durante 30 minutos, eliminándose el sobrenadante. Los precipitados se resuspenden en el medio de mantenimiento de los cultivos a la décima parte del volumen de las diluciones originales y las mezclas se homogenizan. A continuación se centrifugan a 2.000 g durante 30 minutos y los sobrenadantes se toman y se usan para inoculación. No hay evidencias que indiquen que el pretratamiento del plasma seminal de este modo reduzca la sensibilidad del procedimiento para aislar el virus.
La presencia de anticuerpos anti–EAV en el plasma seminal de algunos sementales que excretan virus no parece influir en la detección del estado de portador en estos animales.
b) Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
La prueba RT–PCR es un método adicional (al aislamiento de virus por cultivo celular) para la detección del AVE. Se han desarrollado y evaluado pruebas RT–PCR simples, anidadas, y de un tubo en tiempo real con TaqMan® para la detección de virus en cultivos celulares, en el semen y en secrecciones nasales (3, 5, 21). Se ha descrito la extracción de ARN en un solo paso seguido por trascripción inversa y amplificación (5, 21). La detección de los productos amplificados se puede llevar a cabo por electroforesis en gel de agarosa o por un ensayo ELISA–PCR utilizando reactivos comerciales. La prueba RT–PCR proporciona un medio de identificar ARN específico del virus en muestras clínicas, es decir, filtrados de frotis nasofaríngeos, leucocitos, semen, orina, y muestras de tejidos post–mortem (2, 3, 5, 21). Se han obtenido resultados comparables de aislamientos de virus tanto con una prueba de RT–PCR anidada que tarda solo dos días en realizarse como con una prueba en tiempo real TaqMan® (2, 3, 5, 21). La prueba tiene la ventaja de no necesitar virus vivos para su realización. No obstante, debido a la elevada sensibilidad de este procedimiento, existe una contaminación cruzada potencial entre muestras de laboratorio, lo que puede originar resultados positivos falsos. El riesgo de contaminación es mayor en la RT–PCR convencional debido al paso separado de la transcripción inversa y al segundo paso de PCR en las pruebas de PCR anidada (3). Para reducir el riesgo de que ocurra esto se debe de tener un cuidado especial, sobre todo durante los pasos de extracción del ARN y amplificación, y se necesita incluir en cada prueba de PCR un control positivo y otro negativo para EAV y, donde corresponda, una preparación de ARN extraído del líquido de un cultivo celular de células no infectadas.
Para la sensibilidad de la prueba RT–PCR es crítica la selección de las secuencias de los cebadores, que deben diseñarse preferentemente de las regiones más conservadas del genoma vírico. En ensayos RT– PCR sencillos, anidados o a tiempo real con TaqMan® se ha descrito que son efectivas las secuencias tomadas de los genes de la polimerasa viral o de las proteínas de la nucleocápsida (N) o la envoltura (M) (3, 5, 21). Varias evidencias indican que la zona de lectura abierta (ORF) 7 es el gen más conservado entre las diferentes cepas del EAV (7) y los cebadores específicos para la ORF–7 han detectado diversas cepas de virus de origen europeo y norteamericano (3). Sin embargo, hasta que se alcance un acuerdo general o un conjunto de cebadores universalmente admitidos, se aconseja utilizar la prueba RT–PCR en unión con el aislamiento del virus, y no como una alternativa para su identificación en muestras clínicas o post–mortem. Cuando el aislamiento del virus se realiza de completo acuerdo con los procedimientos recomendados por la OIE, se ha comprobado que es comparable a la prueba RT–PCR para la detección del EAV (2, 3, 5, 21). Debe destacarse que la prueba RT–PCR no distingue entre virus infeccioso, no infeccioso o incompleto y, por tanto, no permite establecer el estado infeccioso actual de un animal particular o de una muestra de semen, un factor que es de considerable importancia con relación al comercio internacional de caballos y de semen de equinos.
Las cepas de EAV aisladas de diferentes partes del mundo se clasifican en diversos grupos filogenéticos por análisis de las secuencias de los genes de las proteínas de la envoltura (GL, GS, M) y de la nucleocápsida (N) (4, 8, 39). Las relaciones entre las cepas a nivel de la secuencia de los nucleótidos es un instrumento molecular epidemiológico de utilidad para trazar el origen de brotes de AVE (2).
c) Métodos
histopatológicos
e
inmunohistoquímicos
Cuando se asocia la mortalidad a un brote sospechoso de AVE, se deben examinar muchos tejidos para evidencias histológicas de panvasculitis, que es especialmente pronunciada en las pequeñas arterias de todo el cuerpo, especialmente en el ciego, colon, bazo, glándulas linfáticas asociadas y corteza adrenal (11, 26). La presencia de una arteritis necrotizante diseminada que afecta a las células endoteliales y medias de los vasos se considera patognomónica de AVE. Las lesiones vasculares características que se presentan en el animal maduro no son, sin embargo, una propiedad destacable en abortos relacionados con la AVE (25).
El antígeno del EAV se puede identificar en varios tejidos de animales afectados por la AVE en presencia o en ausencia de lesiones (11). Se puede detectar en el citoplasma de células infectadas por inmunofluorescencia utilizando un suero equino policlonal anti–EAV conjugado (11) o por la técnica ABC utilizando MAbs de ratón contra las proteínas N o GL del virus (29).
2. Pruebas
serológicas
Para detectar anticuerpos contra el EAV se han usado varias pruebas serológicas que incluyen la neutralización (microneutralización [38], y reducción de placas o calvas [30]), la prueba de fijación de complemento (FC) (16), la inmunofluorescencia (11), la inmunodifusión en medio sólido (11) y las pruebas ELISA (7, 9, 23, 24, 27, 36). Actualmente, la prueba más en uso tanto para el diagnóstico de la infección, realizar estudios sobre prevalencia, y analizar caballos para exportación, es una prueba de microneutralización en presencia de complemento.
Además de la prueba NV, la prueba FC se ha utilizado para diagnosticar infecciones recientes por EAV, puesto que los anticuerpos que fijan complemento son de duración relativamente transitoria (16). En contraste, los títulos de anticuerpo neutralizante frente a EAV pueden persistir durante años después de la infección natural (40). Aunque se han desarrollado varias pruebas ELISA (7, 9, 27), ninguna se ha validado tan ampliamente como la NV, pese a que algunas parecen ofrecer una sensibilidad y especificidad comparables (7, 23, 24, 36). A diferencia de la prueba NV, una reacción positiva por ELISA no refleja necesariamente el estado de protección inmune de un caballo individual frente al EAV ya que están implicados anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes.
Mediante protocolos convencionales de inmunización se han preparado en caballos y en conejos antisueros contra EAV no purificado. Además, se han desarrollado en ratón anticuerpos monoclonales y en conejo anticuerpos policlonales monoespecíficos para la proteína de la nucleocápsida (N), la proteína de la envoltura (GL), las proteínas de la envoltura (M y GS) y otras proteínas del EAV (12).
Se dispone de sueros estandarizados de la OIE para el EAV1 que pueden facilitar la estandarización de la
prueba de microneutralización y la de ELISA.
Hasta la fecha solo se ha reconocido un serotipo importante (30, 40). Éste está representado por la cepa prototipo Bucyrus (ATCC VR 796), del cual han derivado todos los virus de referencia utilizados en todas las pruebas serológicas de AVE. El stock de virus se obtiene en la línea celular RK–13, se clarifica de restos celulares por centrifugación a baja velocidad y se guarda en alícuotas a –70°C. Se descongelan varias alícuotas y se determina la infectividad del virus por titulación en células RK–13.
a) Neutralización del virus (prueba prescrita para el comercio internacional)
La prueba NV se utiliza para analizar sementales en cuanto a evidencia de infección por EAV y para determinar si se necesita detectar el virus en semen mediante cultivo celular o por una prueba RT–PCR. Se puede utilizar también con finalidad diagnóstica para confirmar la infección en casos sospechosos de AVE. El procedimiento de la prueba NV de uso más difundido es el desarrollado por los Laboratorios del Servicio Nacional Veterinario del Departamento de Agricultura de los EE. UU. (38). Se recomienda realizar la prueba
en células RK–13 utilizando como virus de referencia la cepa aprobada CVL–Bucyrus (Weybridge)2. La
historia completa de pases de la cepa CVL (Weybridge) no está documentada pero deriva originalmente de la cepa Bucyrus prototipo del virus. La sensibilidad de la prueba NV para detectar anticuerpos contra EAV está muy influenciada por varios factores, especialmente por el origen y la historia de pases de la cepa vírica utilizada (14, 15). La cepa CVL–Bucyrus y la cepa vacunal muy atenuada de EAV son de sensibilidad semejante para detectar sueros positivos de título bajo, especialmente en caballos vacunados contra AVE. En esta prueba es importante obtener una muestra de sangre estéril pues la contaminación del suero puede interferir los resultados. Se continúan realizando esfuerzos para lograr una mayor uniformidad en el protocolo de la prueba y en la comparación de los resultados serológicos entre los laboratorios que utilizan la prueba NV.
• Procedimiento de la prueba
i) Los sueros se inactivan 30 minutos en agua a 56°C (sueros control solamente una vez)
ii) En placas de microtitulación para cultivo celular con 96 pocillos de fondo plano, se realizan diluciones dobles seriadas del suero problema inactivado (volúmenes de 25 µl) con medio de cultivo libre de suero, comenzando con la dilución 1/2 y utilizando filas duplicadas de pocillos para cada suero problema. La mayoría de los sueros se analizan inicialmente a dilución 1/4 y 1/8 (dilución final del suero, después de añadir a cada pocillo un volumen igual de la dilución apropiada del stock de virus). Las muestras positivas a la dilución 1/8 se pueden volver a comprobar, si se desea, y titularse por determinación a punto final. Deben incluirse en cada prueba controles individuales de suero, así como controles negativos y positivos de título conocido alto y bajo.
iii) Se prepara una dilución del stock de virus que contenga en 25 µl de 100 a 300 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) utilizando como diluyente medio de cultivo celular sin suero que contenga antibióticos y complemento fresco de cobaya o conejo a una concentración final del 10%.
iv) A cada pocillo con 25 µl de cada dilución de suero se añaden 25 µl de la dilución apropiada del stock
de virus, excepto en los pocillos de control del suero problema.
v) Se incluye una re–titulación de la dilución de trabajo del stock de virus, utilizando cuatro pocillos por cada dilución decimal, para confirmar la validez de los resultados de la prueba.
1 Disponible del Dr. P.J. Timoney, Director, Gluck Equine Research Center, Dept of Veterinary Science, University of
Kentucky, Lexington, Kentucky 40546–0099, EE. UU.
2 Disponible en el Virology Department, Veterinary Laboratory Agency; Weybridge, New Haw, Addlestone KY15 3NB,
vi) Se cubren las placas y se agitan suavemente para facilitar la mezcla suero/virus.
vii) Las placas se incuban durante 1 hora a 37°C en una atmósfera húmeda de 0,5% de CO2 en aire.
viii) Se prepara una suspensión de células RK–13 de cultivos de 3–5 días cuya concentración asegure la formación de monocapas confluentes en los pocillos de las placas de microtitulación a las 18– 24 horas de la siembra.
ix) A cada pocillo se añaden 100 µl de la suspensión celular, se cubren las placas con sus tapas o se sellan con cinta aislante y se agitan suavemente.
x) Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera húmeda de 0,5% de CO2 en aire.
xi) Las placas se observan microscópicamente a las 12–18 horas para ECP no vírico y de nuevo a las 48–72 horas de incubación para ECP vírico. La validez de la prueba se confirma estableciendo que la dilución de trabajo del stock de virus contenía de 30–300 DICT50 y que los títulos de los controles de suero positivo están dentro de 0,3 unidades logarítmicas decimales de sus títulos predeterminados. Una solución de suero se considera positiva si hay una reducción del 75%, o preferiblemente del 100%, en la cantidad de ECP vírico en los pocillos del suero problema en comparación con el que se presenta en los pocillos con la dilución más baja de virus control. A continuación se calculan los puntos finales de titulación por el método de Spearman–Kärber. Un título de ¼ o superior se considera positivo. Un suero negativo debe mostrar solo trazas (menos del 25%) o ninguna neutralización vírica a la dilución más baja ensayada. A veces los títulos de anticuerpos pueden ser difíciles de definir si se observa una neutralización parcial a lo largo de varias diluciones del suero. Raras veces puede encontrarse que los sueros causen cambios tóxicos a las diluciones más bajas. En tales casos puede ser imposible establecer si la muestra es negativa o positiva con bajo título. El problema puede superarse probando otra muestra de suero del animal en cuestión o volviendo a ensayar la muestra tóxica en placas de microtitulación con monocapas confluentes de células RK–13 sembradas el día anterior. Se ha descrito que la toxicidad del suero puede reducirse o eliminarse si se adsorbe a células RK–13. En la evaluación de sueros que originan citotoxicidad no vírica se debe tener en cuenta el estado de vacunación para herpesvirus equinos. Una de las vacunas contra herpesvirus equinos disponible actualmente en Europa puede estimular anticuerpos contra células de riñón de conejo, lo que a su vez puede interferir con los resultados de la prueba (20).
b) Enzimoinmunoensayo
Para detectar anticuerpos contra el EAV se han desarrollado varios ELISAs directos o indirectos (7, 9, 23, 24, 27, 36). Éstos se basan en la utilización de virus purificados o de antígenos recombinantes derivados de los virus. La utilidad de las pruebas iniciales estaba limitada por la frecuencia de reacciones positivas falsas (10), que se asociaban con la presencia de anticuerpos contra varios antígenos de los cultivos de tejidos en los sueros de caballos que habían sido vacunados con antígenos derivados de cultivos de tejidos (10). La identificación del importante papel de la proteína GL en la estimulación de la respuesta inmune humoral contra el EAV condujo al desarrollo de varios ELISAs que emplean una porción de ella, o la proteína recombinante completa producida en un sistema de expresión bacteriano o de baculovirus (9, 12, 23). Más recientemente, se ha utilizado un péptido sintético conjugado a ovoalbúmina que presenta los aminoácidos 81–106 de la proteína GL (36). Algunas de estas pruebas parecen presentar una sensibilidad y especificidad comparables a las de la prueba NV y pueden detectar anticuerpos contra el EAV antes de que se pueda obtener una reacción positiva por la prueba NV (7). Sin embargo, pueden ocurrir reacciones negativas falsas en algunas de estas pruebas. El análisis al azar de una librería de péptidos fágicos con sueros policlonales de caballos infectados por el EAV permitió la identificación de ligandos, que se purificaron y emplearon como antígenos en un ELISA para el EAV (24). Sin embargo, no se encontró correlación entre los valores de absorbancia obtenidos con este ensayo y los títulos de anticuerpos neutralizantes, lo que indica que los anticuerpos detectados estaban dirigidos fundamentalmente contra epítopos no superficiales del virus. Un ELISA basado en el uso combinado de las proteínas estructurales GL, M o N del EAV, expresadas por baculovirus recombinantes, detectó con éxito los anticuerpos en caballos infectados natural o experimentalmente, pero no en animales vacunados contra AVE (23). Respecto a cualquier ELISA para EAV basado en la proteína GL, es muy importante considerar el hecho de que la sensibilidad de la prueba varía en función de la secuencia del dominio o región superficial que se utilice en el ensayo de esta proteína vírica. Entre aislamientos del EAV, se ha encontrado una considerable variación en la secuencia de aminoácidos de este dominio (4). Para aumentar la sensibilidad de un ELISA basado en GL puede ser necesario incluir varias secuencias del dominio superficial que representen diferentes aislamientos filogenéticos de EAV en vez de depender de una única secuencia superficial. Otros dos ELISAs de descripción más reciente parecen ofrecer un diagnóstico más prometedor y fiable de infecciones por EAV (9, 36). Se ha descrito un ELISA bloqueante que utiliza un MAb producido contra la proteína GL con una sensibilidad del 99.4% y una especificidad del 97.7% en comparación con la prueba NV (9). Otra prueba, que es un ELISA con un péptido sintético de GL conjugado a ovoalbúmina, tiene una sensibilidad y especificidad del 96.75% y 95.6%, respectivamente, utilizando una referencia de 400 sueros
positivos por NV y 400 muestras negativas por NV (36). Es posible que se disponga en breve de un ELISA con una sensibilidad y especificidad similar a la de la prueba NV.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se han desarrollado contra el EAV varias vacunas experimentales y comerciales. En la actualidad hay dos vacunas disponibles comercialmente y ambas derivan de cultivos celulares. La primera es una vacuna con virus vivo modificado (MLV) preparada con virus atenuado para caballos después de múltiples pases en cultivos de células de caballo y de conejo (13. 30). Esta vacuna está autorizada para uso en sementales, yeguas no gestantes y caballos no reproductores. Aunque los caballos no reproductores se pueden vacunar en cualquier época, los sementales y las yeguas deben vacunarse por lo menos 3 semanas antes de la reproducción. No se recomienda utilizar la vacuna en yeguas gestantes, especialmente en los últimos 2 meses de la gestación, ni en potros menores de 6 semanas a menos que exista un riesgo importante de exposición a la infección natural. La vacuna está comercializada en EE.UU. y Canadá. También se ha empleado en Nueva Zelanda, sometida a control gubernamental, para ayudar al programa de erradicación de la AVE en dicho país.La segunda vacuna comercializada contra la AVE es un producto inactivado que se prepara con virus crecido en cultivo de células de caballo, que se filtra, se inactiva químicamente y se combina a continuación con un adyuvante metabolizable. La vacuna está autorizada para empleo en caballos reproductores y no reproductores. A falta de datos apropiados sobre su seguridad, no se recomienda en la actualidad para utilización en yeguas gestantes. El régimen inicial de vacunación supone dos dosis de vacuna administradas intramuscularmente y separadas 3–6 semanas. El fabricante recomienda una vacunación de refuerzo a intervalos de 6 meses. La vacuna inactivada está autorizada para uso comercial en algunos países europeos como Dinamarca, Francia, Alemania, Irlanda, Suecia y Reino Unido.
En Japón se ha desarrollado otra vacuna inactivada contra la AVE por si ocurre un brote de AVE en ese país (18). Es una vacuna acuosa inactivada con formalina que se ha demostrado que es segura y eficaz en caballos reproductores y no reproductores. Para una inmunización óptima con esta vacuna, los caballos necesitan una fase inicial de dos inyecciones a intervalos de 4 semanas, con una dosis de refuerzo administrada cada 6– 12 meses. Como la vacuna no está comercializada actualmente, no se suministran detalles acerca de su producción.
Las directrices para la producción de vacunas se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las indicaciones dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. son de naturaleza general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
1. Control del inóculo
a) Características
del
inóculo
Tanto las vacunas comerciales con MLV o inactivadas derivan de la cepa prototipo Bucyrus del EAV (ATCC VR 796). La evidencia disponible señala la existencia de un único serotipo principal de virus, y la variación entre cepas no se considera importante en relación con la eficacia de las vacunas (30, 40).
En el caso de la vacuna con MLV, el virus prototipo se atenuó por pases seriados en cultivos primarios de riñón de caballo (HK–131), riñón de conejo (RK–111), y una línea celular diploide de la dermis de caballo, ATCC CCL57 (ECID–24) (13, 22, 30). Las indicaciones de empleo de esta vacuna señalan que el virus es seguro e inmunogénico entre los pases 80 y 111 en células primarias de riñón de conejo (13, 22, 30, 33, 34, 42).
La vacuna inactivada y con adyuvante se prepara de una cepa prototipo Bucyrus de EAV no atenuada (ATCC VR 796) que se ha purificado en calvas al cuarto pase seriado en línea celular diploide de la dermis de caballo (ECID–24). Después de crecer en cultivo celular, el virus se purifica por filtración antes de ser inactivado químicamente y añadir el adyuvante.
Los lotes apropiados del inóculo primario de virus para cada vacuna deben mantenerse en nitrógeno líquido o un sistema equivalente.
b) Método
de
cultivo
El virus de vacunas con MLV o inactivadas debe crecer en un sistema estable de cultivo celular, como las células de dermis de caballo, con un medio apropiado que se suplementa con suero bovino estéril o con seroalbúmina bovina como sustituto del suero bovino en el medio de cultivo. Las monocapas celulares deben lavarse antes de la inoculación del virus para eliminar trazas del suero bovino. En 2–3 días debe
obtenerse crecimiento vírico evidenciado por la aparición de cambios citopáticos en el 80–100% de las células.
c) Validación
como
vacuna
Tanto en el caso de vacunas con MLV como inactivadas, las respectivas cepas víricas deben crecerse en un sistema de cultivo celular apropiado que se haya aprobado oficialmente para producción de vacuna y que esté libre de bacterias, hongos, micoplasmas y virus ajenos (35). La identidad del virus vacunal en el inóculo primario debe confirmarse por neutralización con un suero homólogo anti–EAV. Se ha documentado científicamente la neutralización incompleta del EAV por antisueros homólogos de caballo o conejo (38) y constituye un problema para analizar el virus del inóculo primario en cuanto a virus ajenos y para confirmar la identidad del virus vacunal. El problema se ha evitado rebajando el título de infectividad del inóculo primario por debajo del requerido para la producción de inóculo vírico antes de realizar la prueba de neutralización sobre el virus diluido. Las mezclas virus/suero se prueban para virus vivos residuales por pases seriados en cultivo celular. No debe encontrarse evidencia de virus citopáticos, virus hemadsorbentes o cepas no citopáticas del virus de la diarrea bovina, sobre la base de intentos de aislar los virus en cultivo celular. Si se utilizan células de origen equino, debe comprobarse que están libres del virus de la anemia infecciosa equina. En el futuro, las nuevas tecnologías de PCR y ELISA de captura de antígeno pueden usarse como ayuda para el aislamiento en el análisis de agentes contaminantes.
Se ha demostrado que la vacuna con MLV es segura y eficaz para emplearla en sementales y yeguas no gestantes (33, 34, 42). La vacunación proporciona un alto nivel de inmunidad de protección que perdura durante varios años (22, 30, 40). En estudios experimentales y después de una dilatada utilización de la vacuna en condiciones de campo desde 1985, no hay evidencias de que el virus vacunal revierta a forma virulenta ni de que se recombine con la cepa natural del EAV. Además, muchos datos confirman que la cepa atenuada del EAV en la vacuna actual no se excreta en el semen de los sementales después de la vacunación ni se localiza en el tracto reproductor del semental ni establece el estado de portador (34, 40, 42).
Las vacunas comerciales inactivadas no provocan reacción y son seguras para empleo en caballos sanos de cría y no reproductores. Se pueden observar reacciones locales transitorias en menos del 10% de los caballos vacunados con la vacuna inactivada. Los limitados estudios de campo con esta vacuna señalan que es inmunogénica, estimulando un grado de inmunidad satisfactorio cuya duración todavía no se ha descrito.
Aunque no hay datos publicados sobre la eficacia de ninguna vacuna comercial para evitar el establecimiento del estado de portador en los sementales, se ha comprobado que una vacuna acuosa inactivada con formalina contra la AVE evita la persistencia vírica en el tracto genital de los sementales vacunados después de un posterior desafío mediante infección experimental con el EAV (17).
2. Método de producción
Tanto la vacuna con MLV como la inactivada se producen mediante cultivo de los inóculos víricos respectivos en un sistema celular de dermis de caballo. Antes de la inoculación con el virus de siembra las monocapas celulares deben lavarse para eliminar restos de suero bovino del medio de cultivo. Los cultivos inoculados deben mantenerse en un medio adecuado. La recogida de los cultivos infectados debe efectuarse cuando el ECP característico afecta a casi toda la monocapa celular. Se recoge el sobrenadante y las células, y se clarifica la preparación mediante filtración de los restos celulares y el material no deseado. En el caso de la vacuna inactivada, el virus purificado se inactiva después químicamente y se añade un adyuvante metabolizable.
3. Control del proceso
Las vacunas con MLV o inactivadas deben producirse en una línea celular estable cuya identidad se haya probado y confirmado que está libre de bacterias, hongos y de micoplasmas y otros agentes contaminantes. Además de la prueba previa a la producción sobre contaminantes tanto en el inóculo primario de virus para cada vacuna como en la línea celular, los cultivos celulares infectados con los respectivos virus vacunales deben examinarse macroscópicamente para evidencias de crecimiento microbiano u otros contaminantes extraños durante el período de incubación. Si no se puede determinar con seguridad el crecimiento en un recipiente por inspección visual, se deben realizar subcultivos, examen microscópico, o ambas cosas.
4. Control de lotes
a) Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en los materiales biológicos se presentan en el Capítulo I.1.5.
b) Inocuidad
Cada lote de producción de vacuna debe probarse para contaminantes bacterianos, fúngicos o micoplasmas, tanto en el caso de vacunas con MLV como inactivadas. La vacuna debe ensayarse para seguridad por inoculación intramuscular de al menos dos caballos seronegativos para anticuerpos neutralizantes contra la AVE, cada uno con una dosis liofilizada (35). Ninguno de los caballos inoculados debe desarrollar síntoma alguno de la enfermedad, excepto leve pirexia, durante un período posterior de observación de 2 semanas. Además, se deben tomar diariamente frotis nasofaríngeos de cada caballo para aislamiento de virus; también se debe determinar diariamente la fórmula leucocitaria y la temperatura corporal. Después de la vacunación no deben aparecer cambios febriles o hematológicos significativos (34, 40, 42). Ocasionalmente, se puede observar en el caballo vacunado una excreción limitada de virus vacunal por el tracto respiratorio que no supera los 7 días (42). No hay evidencias de excreción del virus en el semen de sementales después de la vacunación (34, 42).
Para asegurar una inactivación completa del virus vacunal, cada serie de lotes de vacuna inactivada debe comprobarse para virus viables mediante tres pases seriados en células de la dermis del caballo y por inmunofluorescencia directa marcando con el conjugado específico para EAV antes de añadir el adyuvante. Esto debería continuarse con un ensayo de seguridad en cobayas y ratones.
c) Potencia
La potencia de la vacuna en los contenedores o recipientes finales se determina por ensayos de infectividad con formación de calvas en monocapas cultivadas de células de la dermis del caballo y por una prueba de vacunación de desafío mediante infección experimental en caballos (35). La vacuna debe probarse en cultivo celular por triplicado, calcularse el título infectivo medio, y determinarse el contenido en dosis teniendo en cuenta que cada dosis de vacuna debe contener un mínimo de 3 x 104 unidades formadoras de calvas de EAV. La potencia in vivo de la vacuna con MLV o inactivada se estima por una única prueba de vacunación de desafío en 17–20 caballos vacunados y en 5–7 caballos control o en dos pruebas cada una de las cuales comprende diez vacunados y cinco controles no vacunados.
La concentración de antígeno vírico en la vacuna inactivada es superior a mil veces la concentración del antígeno vírico presente en la vacuna con MLV.
d) Duración de la inmunidad
Dentro de los 3 meses siguientes a la vacunación con MLV, en la mayoría de los caballos deben aparecer títulos de anticuerpos neutralizantes contra el VEA (33, 34, 40, 42). La respuesta a la vacunación primaria se caracteriza por un rápido descenso en el título de anticuerpos, y un número significativo de animales revierten a la seronegatividad a los 1–3 meses post–vacunación (42). Sin embargo, la revacunación con esta vacuna ocasiona una respuesta anamnésica excelente, desarrollándose elevados niveles de anticuerpos que permanecen relativamente estables durante 12 meses o más (40).
Varios estudios experimentales han mostrado que la mayoría de los caballos vacunados con vacuna inactivada desarrollan títulos de anticuerpos neutralizantes contra el EAV bajos o moderados hacia el día 14 después de la segunda vacunación. No existe información publicada sobre la duración de la inmunidad debida a esta vacuna.
e) Estabilidad
La vacuna liofilizada con MLV se puede mantener a 2–7°C por lo menos durante 3–4 años sin pérdida de infectividad, con tal de que se mantenga en la oscuridad (22). La infectividad se conserva mucho más tiempo si la vacuna se congela a –20°C o a temperatura inferior. Sin embargo, una vez rehidratada, debe utilizarse en 1 hora o destruirse. La vacuna inactivada se conserva como suspensión líquida a 2–8°C. sin pérdida de potencia en al menos 1 año, si está protegida de la luz.
f) Conservantes
Los conservantes que se añaden a las vacunas con MLV o inactivadas son neomicina, polimixina B y anfotericina B.
g) Precauciones
(riesgos)
Las yeguas gestantes no deben vacunarse con vacuna que contenga MLV durante los últimos 2 meses de gestación ya que hay riesgo, aunque mínimo, de invasión fetal por el virus vacunal. Puede surgir la posibilidad de una reacción anafiláctica producida por la vacuna, aunque muy raramente, con la administración de uno u otro tipo de vacuna. A falta de datos adecuados sobre seguridad, no se recomienda en la actualidad la utilización de vacunas inactivadas en yeguas gestantes.
5. Pruebas sobre el producto final
a) Inocuidad
Con excepción de la vacuna inactivada, que necesita ser ensayada para esterilidad una segunda vez para asegurar la ausencia de contaminación, no se necesitan pruebas de seguridad adicionales en las vacunas inactivadas o con MLV.
b) Potencia
En los productos finales no se necesitan pruebas de potencia adicionales a las realizadas para cada lote de producción de las vacunas inactivadas o con MLV.
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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la Arteritis vírica equina (ver Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar el listado más actualizado: www.oie.int).