THE INHIBITORY EFFECT OF COLOSTRUM ON MICROBIOLOGICAL METHODS USED FOR ANTIBIOTIC DETECTION IN EWES MILK

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EFECTO DEL CALOSTRO SOBRE LOS MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS DE DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS

EN LECHE DE OVEJA

THE INHIBITORY EFFECT OF COLOSTRUM ON

MICROBIOLOGICAL METHODS USED FOR ANTIBIOTIC

DETECTION IN EWES MILK

BELTRÁN M.C., BORRÁS M., RODRÍGUEZ M., MOLINA M.P.

Instituto de Ciencia y Tecnología Animal. Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera, s/n. 46022 Valencia. Email: mbeltran@dca.upv.es RESUMEN

El estudio evalúa el efecto de la presencia de calostro sobre la respuesta de diferentes métodos micro-biológicos de detección de inhibidores en leche de oveja. Para ello se utiliza leche de oveja libre de sus-tancias inhibidoras a la que se adicionan cantidades crecientes de tres tipos de calostro (0-12, 24 y 48 horas postparto) procedentes de ovejas no tratadas con antibióticos en el momento del secado. Las muestras se analizaron con tres métodos microbiológicos (BRT®AiM, Delvotest®MCS y Eclipse®100). La presencia de calostro en la leche de oveja afecta a la respuesta de los métodos microbiológicos de de-tección de inhibidores a concentraciones relativamente elevadas en la leche. La concentración de ca-lostro capaz de provocar la aparición de un 95% de resultados positivos en los métodos ensayados (CMI) depende del tipo de calostro (horas postparto) y del método considerado. En general, esta con-centración se incrementa con el tiempo transcurrido desde el parto en todos los métodos utilizados siendo el método BRT®AiM el más afectado por la presencia de la secreción calostral en la leche.

Palabras clave: calostro, leche de oveja, inhibidores, métodos microbiológicos.

SUMMARY

The aim of this study is to analyse the effect that the presence of colostrum has on the response of the microbiological methods for the detection of inhibitors in ewes milk. Antibiotic free ewe’s milk samples were used, artificially spiked with three types of colostrum (0-12, 24 and 48 hours postpartum) ob-tained from ewes not treated with antibiotics in the moment of the drying off. The spiked samples were analysed by three microbiological tests (BRT®AiM, Delvotest®MCS and Eclipse®100). The presence of colostrum in the milk affects the response of the methods at relatively high concentrations in the milk. The minimal inhibitory concentration of colostrum (CMI) in the milk depends on the type of colostrum and considered method. In general, the CMI increases with the time passed from the partu-rition in all the used methods being the method BRT®AiM the most affected by the presence of this se-cretion in the milk.

Key words: colostrum, ewe’s milk, inhibitors, microbiological method.

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Introducción

El calostro se considera un alimento impres-cindible para el cordero durante las primeras fases de su vida postnatal, por su capacidad de transmitir al recién nacido una inmunidad de tipo pasivo que le permite hacer frente a posibles infecciones procedentes del medio ambiente que le rodea. Sin embargo, su pre-sencia en la leche resulta indeseable y la le-gislación española, así como la de otros mu-chos países, exige que la leche destinada al consumo humano no contenga calostros (Real Decreto 2484/1967). Esta restricción se debe, principalmente, al hecho de que el calostro presenta unas características ﬁsicoquímicas muy diferentes a las de la leche, propiamen-te dicha, que repercupropiamen-ten negativamenpropiamen-te so-bre su calidad higiénica y su aptitud tecnoló-gica (Tsioulpas y col., 2007).

Por otra parte, el incremento de proteínas, es-pecialmente de inmunoglobulinas (IgG), que supone la incorporación de calostro a la leche podría estar relacionado, en determinadas cir-cunstancias, con los resultados “falsos positi-vos” que se obtienen con los métodos micro-biológicos de detección de antibióticos en leche (Egan y Meaney, 1984). Estos métodos, basados en la inhibición del crecimiento mi-crobiano, pueden verse afectados por varios factores, tanto metodológicos (presencia de conservante, calentamiento previo de las muestras) como relacionados con la propia composición de la leche (Althaus y col., 2003). Así, por ejemplo, elevados recuentos de célu-las somáticas, de ácidos grasos libres y de gra-sa o proteína, han sido relacionados con un elevado porcentaje de resultados “falsos po-sitivos” en diversos métodos comerciales de cribado (Andrew, 2001).

El calostro presenta, además de un gran con-tenido en grasa y proteína, grandes cantida-des de inhibidores naturales (lactoferrina e in-munoglobulinas) que pueden interferir en el crecimiento del microorganismo del método

incrementando el porcentaje de resultados “falsos positivos” o “falsos no conformes”. Por tanto, el objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de la presencia de calostro en la le-che de oveja sobre la respuesta de los méto-dos microbiológicos de detección de inhibi-dores en leche más utilizados en España.

Materiales y métodos

Se utilizó una muestra de leche de mezcla, li-bre de sustancias inhibidoras, con una com-posición y calidad higiénica estándar para la leche de oveja. Esta muestra se dividió en 3 alícuotas y a cada una de ellas se adicionaron cantidades crecientes de diferentes tipos de calostro hasta obtener 12 concentraciones de ensayo. Las muestras de calostro utilizadas en el estudio procedían de 12 ovejas de raza Manchega y fueron obtenidas a las 0-12, 24 y 48 horas postparto.

La composición química de las muestras de calostro y leche se determinó con un espec-trofotómetro de infrarrojos (MilkoScan FT120. Foss. Hillerod, Dinamarca) previamente cali-brado para la leche de oveja y el recuento de células somáticas, se calculó según el méto-do ﬂuoro-opto-electrónico con el equipo au-tomático Fossomatic 5000 (Foss. Hillerod, Di-namarca). El pH se midió con un pH-metro comercial (Crison. Mod. Basic 20+_{. Barcelona,}

España) y la concentración de inmunoglobu-linas (IgG) siguiendo el procedimiento descri-to por Rodríguez y col. (2009) mediante la uti-lización de un kit comercial ELISA (Bethyl Laboratories, Inc. Montgomery, USA). Todas las muestras de leche adicionadas de calostro se analizaron con tres métodos mi-crobiológicos: BRT®_{AiM (Analytik in Milch}

Pro-duktions-und Vertriebs-GmbH. Munich, Ale-mania), Delvotest®_{MCS (DSM Food Specialties.}

Delf, Holanda) y Eclipse®_{100 (Zeu-Inmunotec.}

Zaragoza, España) siguiendo las indicaciones del fabricante. Para cada una de las concen-traciones se ensayaron un total de 16

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En la Tabla 2 se presentan las frecuencias de resultados positivos obtenidos con los tres ti-pos de calostro (0-12, 24 y 48 horas ti- postpar-to) en los distintos métodos microbiológicos de control. Como se puede observar, con

con-centraciones del 5%, 12,5% y 22,5% de calos-tro en la leche, se obtienen un 37,5%, 25% y 6,3% de resultados positivos para los méto-dos BRT®_{AiM, Delvotest}®_{MCS y Eclipse}®_100,

respectivamente.

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ciones. La lectura de resultados se realizó de manera visual por tres personas entrenadas, clasiﬁcando los resultados como negativos (“conformes”) y positivos (“no conformes”). Para el tratamiento estadístico de los datos se aplicó un procedimiento de regresión logísti-ca mediante el programa estadístico SAS®

(2001). A partir de los datos obtenidos se cal-culó la “concentración mínima inhibitoria” (CMI) de calostro, deﬁnida como el porcenta-je de calostro que provoca la aparición de un

95% de resultados positivos, para cada tipo de calostro y método considerado en el estu-dio.

Resultados y discusión

Las características ﬁsicoquímicas de las mues-tras de calostro y leche utilizadas en el expe-rimento (Tabla 1) son similares a las indicadas por otros autores para el calostro y la leche del ganado ovino (Molina y col., 1995).

Tabla 1. Características fisicoquímicas de las muestras de calostro y de leche utilizadas. Muestra pH _(x103RCS_cel/ml) Principales componentes (%) _(mg/ml)IgG

G P L ST

Calostro 0-12 horas 6,36 5.442 10,86 21,63 1,71 35,2 51,52

Calostro 24 horas 6,42 1.890 10,80 15,36 2,52 29,68 39,43

Calostro 48 horas 6,66 1.364 8,95 8,06 4,12 22,06 10,30

Leche 6,75 402 7,11 4,96 5,25 18,32 4,55

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Cuando se adiciona a la leche calostro de 24 horas se observa que son necesarias mayores concentraciones para provocar la aparición de un resultado positivo en todos los métodos utilizados (BRT®_{AiM=10%, Delvotest}®_MCS=

15% y Eclipse®_{100=30%) siendo nuevamente}

el método BRT®_{AiM el más afectado por la}

pre-sencia de esta secreción en la leche. Sin embargo con el calostro de 48 horas, no se observan interferencias con ninguno de los métodos utilizados, hasta una concentración del 50%, ya que los resultados obtenidos fue-ros negativos para todas las concentraciones de ensayo en todos los métodos de control. Estos resultados podrían estar relacionados con el marcado descenso de la concentración de IgG en el calostro ovino que se produce en las primeras 48 horas después el parto

(Ray-nal-Lujtac y col., 2005) y que explicarían la nor-malización de los resultados analíticos trans-currido este tiempo.

En la Tabla 3 se presentan las ecuaciones de predicción obtenidas a partir del modelo de regresión logística que en todos los casos, pre-sentan elevados coeﬁcientes de concordan-cia (>91%). A partir de estas ecuaciones se cal-culó la CMI de calostro para cada uno de los métodos y tipo de calostro utilizado que, como puede observarse, depende del tipo de calostro y del método considerado. En gene-ral, se incrementa a medida que aumenta el tiempo transcurrido tras el parto en todos los métodos utilizados siendo el BRT®_{AiM el más}

afectado por la presencia de secreción calos-tral en la leche, al presentar la CMI más baja en todos los momentos considerados.

Tabla 2. Frecuencia de resultados positivos según la concentración y el tipo de calostro añadido.

Método

analítico calostroEdad ₀ ₁ _2,5 ₅ _7,5Concentración calostro (%)₁₀ _12,5 ₁₅ ₂₀ ₂₅ ₃₅ ₅₀

BRT®_AiM 12 horas 0 0 0 37,5 37,5 56,3 100 100 100 100 100 100 24 horas 0 0 0 0 0 31,3 43,8 100 100 100 100 100 48 horas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Delvotest® MCS 12 horas 0 0 0 0 0 0 25 50 100 100 100 100 24 horas 0 0 0 0 0 0 0 50 50 100 100 100 48 horas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Concentración calostro (%) 0 2,5 5 10 15 20 22,5 25 27,5 30 40 50 Eclipse®₁₀₀ 12 horas 0 0 0 0 0 0 6,3 25 81,3 100 100 100 24 horas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 100 100 48 horas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

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Conclusiones

La presencia de calostro en la leche de oveja puede interferir en la respuesta de los méto-dos microbiológicos de detección de inhibi-dores aunque su efecto depende del tipo de calostro (horas postparto) y del método con-siderado. En general, estas interferencias se

presentan a concentraciones relativamente elevadas en la leche de oveja (5-25%) espe-cialmente con el calostro más próximo al par-to (0-12 horas postparpar-to). Transcurridas 48 ho-ras postparto, son necesarias concentraciones muy elevadas de calostro en la leche (>50%) para provocar la aparición de un resultado po-sitivo en los métodos microbiológicos de

con-

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Tabla 3. Ecuación de regresión y Concentración mínima inhibitora (CMI) de calostro. Método L=Logit [P]=b0+b01[T1]+b02[T2]+b2[Cal] _(%)C CMI (%)

12 h 24 h 48 h

BRT AiM L=-5,1049-2,5217[T1]-42,1017[T2]+0,6382 [Calostro] 91,06 12,61 16,56 78,58

Delvotest L=-7,9546-1,5359[T1]-35,0601[T2]+0,5276[Calostro] 91,28 20,66 23,57 87,11

Eclipse L=-29,4168-4,6043[T1]-43,6274[T2]+1,1344[Calostro] 93,79 28,53 32,58 96,98 L= ln (probabilidad de resultado (+)/1-probabilidad resultado (+)); Tipo calostro: Calostro 12 h T1=0 y T2=0; Calostro 24 h T1=1 y T2=0; Calostro 48 h T1=0 y

T2=1; C: coeﬁciente de concordancia porcentual

Bibliografía

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