Síntese, caracterização e avaliação antineoplásica de novos derivados 3-hidroxiindolin-2-onas-3-substituídos

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. Síntese, caracterização e avaliação antineoplásica de novos derivados 3-hidroxiindolin-2-onas-3-substituídos. GILMAR FELICIANO DOS SANTOS. JOÃO PESSOA 2017.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. Síntese, caracterização e avaliação antineoplásica de novos derivados 3-hidroxiindolin-2-onas-3-substituídos Gilmar Feliciano dos Santos*. Dissertação. de. Mestrado. apresentada. como. requisito. Parcial para obtenção do título de Mestre em Química Orgânica pela Universidade Federal da Paraíba. Orientador: Mário Luiz Araújo de Almeida Vasconcellos Co-Orientador: Cláudio Gabriel Lima Junior *Bolsista (CNPq). JOÃO PESSOA 2017.

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(5) Aos meus pais por sempre lutarem por mim, possibilitando que eu chegasse até aqui.. Ao prof. Claudio Gabriel pela orientação, incentivo e amizade durante os dois anos de convivência..

(6) AGRADECIMENTOS. Ao criador pela vida e pelas oportunidades que coloca em meu caminho. A meus familiares, que torceram para eu além de ser o primeiro formado em toda uma família humilde, fosse o primeiro mestre. Aos meus amigos, em especial Alan Ferreira e Jandiellison Souza, que deram forças e estiveram presentes desde a seleção ao término do mestrado e aos amigos que a Finlândia me deu, Alcione e Rafaela, que tanto torcem por mim. A gestora Cida, da Escola Estadual de Ensino de Médio José Paulo de França, que fez de tudo para flexibilizar os horários e facilitar minha ida diária ao curso. Aos meus alunos que tanto torceram por minha ascensão pessoal e profissional. Aos professores Cláudio Gabriel e Mário Vasconcellos pela orientação, conselhos e oportunidade durante esta caminhada. A professora Gardênia Carmen Gadelha Militão (UFPE) pela realização dos testes biológicos dos compostos presentes nesta dissertação. Aos meus colegas de laboratório Allana, Danilo, Luciana, Jackson, Joyce, Tayna, Rhuan, João Paulo, Thayza e Sandro pela paciência e contribuição direta ou indireta para realização deste trabalho. Ao CNPQ pela concessão da bolsa..

(7) RESUMO. O número crescente de casos de câncer, as estatísticas que apontam para milhões de novos casos nos próximos anos, como também as limitações no tratamento tornam a busca por novos candidatos a fármacos antineoplásicos uma necessidade atual. O núcleo indólico, presente em alguns produtos naturais, vem sendo considerado uma estrutura privilegiada apresentando diversas atividades biológicas, inclusive antineoplásica. Neste trabalho, apresentamos inicialmente a síntese e caracterização de 21 derivados 3-hidroxi-indol-2ona-3-substituídos, obtidos via reação de Morita-Baylis-Hillman, onde 12 são inéditos, utilizando isatina (1) e seus derivados como eletrófilos e acrilonitrila, acrilato de metila e p-nitro-fenilacrilamida, como aceptores de Michael. A maioria dos adutos foi obtida em bons a excelentes rendimentos (92-99%). Os tempos reacionais variaram de acordo com o aceptor utilizado, onde para os adutos contendo o grupo nitrila, as reações demonstraram ser mais rápidas (1h – 24h). A avaliação preliminar da atividade citotóxica foi realizada em 5 linhagens tumorais e análise dos dados mostrou que os compostos com maiores atividades (CI50 < 3µM) 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h, 3i são aqueles que continham o grupo nitrila, dentre os quais os compostos 3f (CI50= 42 nM) e 3i (CI50= 48 nM) apresentaram resultados muitos promissores, contra a linhagem HL60 (leucemia promielocítica). O composto 3f apresentou um excelente índice de seletividade (IS = 967,14), muito superior ao fármaco de referência doxorrubinina (IS = 12,73). A caracterização estrutural dos compostos foi realizada por espectroscopia de RMN 1H e 13. C e massa de alta resolução.. Palavras-chave: Núcleo indólico. Estruturas privilegiadas. Reação de Morita-Baylis-Hillman. Atividade antineoplásica..

(8) ABSTRACT. The growing number of cancer cases, statistics that indicate millions of new cases in the next years and treatment limitations as well make the search for new antineoplastic drug a current necessity. The 3-Substituted-3-hydroxyindolin-2-ones nucleus, present in some natural products, has been considered a privileged structure with several biological activities, including antineoplastic. In this work, it is presented the synthesis and characterization of 21 3-Substituted-3-hydroxyindolin-2-ones derivatives obtained by Morita-Baylis-Hillman reaction; 12 of them are unpublished, and it was used isatin and your. derivatives. such. as. electrophilic. and. acrylonitrile,. Acrylate. and. p-. nitrophenylacrylamide as Michael acceptors. Most of the adducts were obtained in good to excellent yields (92-99%). The reaction times varied according to the acceptor used, in those adducts containing nitrate group, the reactions were faster (1h - 24h). The preliminary evaluation of cytotoxic activity was executed in 5 tumoral lines and data analysis showed that the compounds with the greatest activities (IC 50 <3μM) 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h, 3i are those containing nitrile group, among these compounds, 3f (IC50= 42 nM) and 3i (IC50= 48 nM) showed very promising results, against the HL60 line (promyelocytic leukemia). The Compound 3f presented an excellent selectivity index (IS = 967.14), much higher than the reference drug doxorubinin (IS = 12.73). The structural characterization of the compounds was performed by spectroscopy of 1H and 13C NMR and high resolution mass.. Keywords: 3-Substituted-3-hydroxyindolin-2-ones nucleus. Privileged structures. Morita-Baylis-Hillman reaction. Antineoplastic activity.

(9) LISTA DE FIGURAS Figura 1: Exemplos de fármacos utilizados no tratamento quimioterápico ............................... 16 Figura 2: Estrutura privilegiada e fármacos com núcleo em comum e sua atividade biológica 17 Figura 3: Estrutura Privilegiada e atividade biológica de fármacos contendo o núcleo indólico em comum ................................................................................................................................... 17 Figura 4: Isatina (1) e alguns derivados - estruturas privilegiadas ............................................. 18 Figura 5: Produtos naturais com potencial antineoplásico contendo o núcleo indólico ............. 19 Figura 6: Esquema geral para a síntese das séries congêneres ................................................... 29 Figura 7: Análise retrossintética dos adutos propostos para as séries congêneres das acrilonitrilas e dos ésteres de acrilatos ........................................................................................ 30 Figura 8: Análise retrossintética dos adutos propostos para a séries congênere das acrilamidas ..................................................................................................................................................... 31 Figura 9: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do composto 3g ................................... 40 Figura 10: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do composto 4g ................................. 41 Figura 11: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do composto 5a................................. 42 Figura 12: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 1b ................................................. 67 Figura 13: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 1b .................................................. 67 Figura 14: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 1c.................................................. 68 Figura 15: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 1c ................................................... 68 Figura 16: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 1d ................................................. 69 Figura 17: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 1d .................................................. 69 Figura 18: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 1e.................................................. 70 Figura 19: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 1e ................................................... 70 Figura 20: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 1h ................................................. 71 Figura 21: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 1h .................................................. 71 Figura 22: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 1i .................................................. 72 Figura 23: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 1i ................................................... 72 Figura 24: Espectro de RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) de 2 ................................................... 73 Figura 25: Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) de 2 .................................................... 73 Figura 26: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 3f ........................................ 74 Figura 27: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 3f ....................................... 74 Figura 28: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 3f ......................................... 75 Figura 29: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 3g ....................................... 75 Figura 30: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 3g....................................... 76 Figura 31: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 3g ........................................ 76 Figura 32: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 3h ....................................... 77 Figura 33: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 3h ...................................... 77 Figura 34: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 3h ........................................ 78 Figura 35: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 3i ........................................ 78 Figura 36: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 3i ....................................... 79 Figura 37: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 3i.......................................... 79 Figura 38: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 4d ....................................... 80 Figura 39: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 4d ...................................... 80 Figura 40: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 4f ........................................ 81 Figura 41: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 4f ...................................... 81.

(10) Figura 42: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 4f ......................................... 82 Figura 43: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 4g ....................................... 82 Figura 44: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 4g....................................... 83 Figura 45: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 4g ........................................ 83 Figura 46: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 4h ....................................... 84 Figura 47: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 4h ...................................... 84 Figura 48: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 4h ........................................ 85 Figura 49: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 5a ....................................... 85 Figura 50: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 5a ...................................... 86 Figura 51: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 5a ......................................... 86 Figura 52: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 5b ....................................... 87 Figura 53: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 5b ...................................... 87 Figura 54: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 5b ........................................ 88 Figura 55: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 5c........................................ 88 Figura 56: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 5c ...................................... 89 Figura 57: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 5c......................................... 89 Figura 58: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do aduto 5d ....................................... 90 Figura 59: Espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) do aduto 5d ...................................... 90 Figura 60: Espectro de massas de alta resolução ESI(-) do aduto 5d ........................................ 91.

(11) Sumário 1. INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------------------------- 11 1.1 CÂNCER ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 14 1.1.1 Aspectos e Classificação --------------------------------------------------------------------------- 14 1.2. QUIMIOTERAPIA E SUAS LIMITAÇÕES -------------------------------------------------- 15. 2 ESTRUTURAS PRIVILEGIADAS: DEFINIÇÃO E APLICAÇÕES RECENTES NO DESIGN DE NOVOS CANDIDATOS A FÁRMACOS ---------------------------------------------- 16 2.1 COMPOSTOS 3-HIDROXI-INDOLIN-2-ONAS-3-SUBSTITUÍDOS COMO ESTRUTURA PRIVILIEGIADA PARA A BUSCA POR NOVOS AGENTES ANTICÂNCER. ------------------------------------------------------------------------------------------------- 18 2.2. SÍNTESE DE 3-HIDROXI-INDOLIN-2-ONAS-3-SUBSTITUÍDOS ------------------- 20. 2.3. REAÇÃO DE MORITA-BAYLIS-HILLMAN ------------------------------------------------ 22. 4 OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 27 4.1OBJETIVO GERAL --------------------------------------------------------------------------------------- 27 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS---------------------------------------------------------------------------- 27 5 ESTRATÉGIAS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 29 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------- 33 6.1 PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DA ISATINA ------------------------------------------------ 33 6.2 SÍNTESE DOS ADUTOS MBH DERIVADOS DA ISATINA 3a – 3i ---------------------- 34 6.3 SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DE ISATINA 4a – 4h --------------------------------- 35 6.4 SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DE ISATINA 5a – 5d --------------------------------- 37 6.5 TRATAMENTO ESPECTROCÓPICO DOS AMBH DERIVADOS DA ISATINA ----- 39 6.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DOS COMPOSTOS SINTETIZADOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 42 7 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS -------------------------------------------------------------------- 47 7.1 CONCLUSÕES--------------------------------------------------------------------------------------------- 47 7.2 PERSPECTIVAS------------------------------------------------------------------------------------------- 47 8 PARTE EXPERIMENTAL --------------------------------------------------------------------------------- 49 8.1 MATERIAIS E MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------------- 49 8.2 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1b --------------------------------------------------- 49 8.3 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1c ---------------------------------------------------- 50 8.4 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1h --------------------------------------------------- 50 8.5 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1i ---------------------------------------------------- 51 8.6 PROCEDIMENTO GERAL PARA A SÍNTESE DE 1d E 1e ---------------------------------- 51.

(12) 8.7 PROCEDIMENTO GERAL PARA SÍNTESDE DE 1f E 1g ----------------------------------- 52 8.8 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 2 ------------------------------------------------------ 53 8.9 PROCEDIMENTO GERAL PARA A SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DA ISATINA 3a – 3i ------------------------------------------------------------------------------------------------ 53 8.10 PROCEDIMENTO GERAL PARA A SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DA ISATINA 4a – 4h ----------------------------------------------------------------------------------------------- 56 8.11PROCEDIMENTO GERAL PARA A SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DA ISATINA 5a – 5d ---------------------------------------------------------------------------------------------- 58 REFERÊNCIAS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 62 ESPECTROS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 67.

(13) INTRODUÇÃO.

(14) 11. 1. INTRODUÇÃO. Além de ser uma enfermidade que mata milhões de pessoas por ano, o câncer vem apresentando estimativas cada vez mais preocupantes. Nos países em desenvolvimento é esperado nas próximas décadas um impacto de câncer na população que corresponde a 80% dos mais de 20 milhões de casos mundiais estimados para 2025. A estimativa para o Brasil, biênio 2016-2017, aponta a ocorrência de cerca de 600 mil novos casos de câncer. Excetuando-se o câncer de pele não-melanoma (aproximadamente 180 mil casos novos), ocorrerão cerca de 420 mil casos novos de câncer. Os cânceres de próstata (61 mil) em homens e mama (58 mil) em mulheres serão os mais frequentes. (INCA, 2016) Os fármacos antineoplásicos utilizados no tratamento do câncer apresentam limitações devido ao seu mecanismo de ação, o qual interfere diretamente nas funções de reprodução celular. O grande obstáculo continua sendo o fato de tais drogas atuar não apenas sobre células tumorais, mas também em células saudáveis. Mesmo em doses terapêuticas, os quimioterápicos podem ocasionar severas toxicidades, fato este que motiva a busca por novos fármacos que minimizem ou até mesmo acabem com estas limitações. (SIMÃO et al., 2012) No desenvolvimento de novos fármacos para combater o câncer e inúmeras enfermidades, aparecem na literatura cada vez mais relatos sobre o uso de estruturas privilegiadas, isto é, pequenas moléculas orgânicas que podem interagir com mais de um tipo de bioreceptor. (FERNANDES, TIRITAN, PINTO 2015). Compostos que apresentam o núcleo indólico, por exemplo, vêm apresentado diversas atividades biológicas. (SINGH; DESTA, 2012) Derivados 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos são compostos heterocíclicos, cujo núcleo indólico pode ser considerado uma estrutura privilegiada, uma vez que estão presentes em várias unidades nucleares de muitos produtos naturais e compostos farmaceuticamente ativos, tornando-se assim alvos sintéticos interessantes para o planejamento de novos candidatos a fármacos. (YAN et al., 2013) Diversos produtos naturais e análogos sintéticos,. que apresentam o núcleo. indólico, vêm apresentando um amplo espectro de atividades biológicas, como por exemplo: alto potencial anti-oxidante, anti-câncer, anti-HIV e neuroprotetoras. (PEDDIBHOTLA,2009).

(15) 12. Para a síntese de derivados 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos, diversas reações podem ser empregadas, tais como as reações aldólicas catalisadas por arginina (YAN et al., 2013) e reação de Henry (MESHRAM et al., 2013). Uma via sintética também conveniente é o emprego das reações de Morita-Baylis-Hillman (RMBH) entre isatina (1) e alcenos ativados, catalisadas por amina terciária (LIMA-JUNIOR et al., 2016) Em relato na literatura (LIMA-JUNIOR, 2012) foram sintetizados e bioavaliados frente a linhagem cancerígena HL-60 (leucemia promielocítica) 40 adutos de MoritaBaylis-Hillman (AMBH), onde foi observado que os derivados que apresentavam o núcleo indólico foram os mais ativos da série congênere. Com base no exposto, o presente trabalho tem como finalidade a síntese de uma nova série congênere de derivados 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos via reação de Morita-Baylis-Hillman com derivados de isatina e aceptores de Michael e a sua bioavaliação frente a linhagens de células tumorais..

(16) 13. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.

(17) 14. 1.1 CÂNCER. 1.1.1 Aspectos e Classificação. Um conceito formal utilizado na contemporaneidade é que é uma doença caracterizada pelo crescimento desordenado de células que tendem a invadir tecidos e órgãos vizinhos. Considerada uma doença genética, pode ser transmitida a uma célula normal, através da transferência de genes tumorais (cópias de genes normais que sofreram mutações). (INCA,2016) Na transcrição, há a síntese de proteínas que mostra perda ou ganho de sua função biológica e as mutações que ocorrem durante esta etapa são modificações transmitidas no material genético e acontecem em qualquer célula e são ocasionadas por agentes físicos e químicos do meio ambiente ou por produtos tóxicos da própria célula (radicais livres, por exemplo). (FURTADO; NEPOMUCENO, 2012) Em termos de tipos de câncer, pode-se dizer que há relatos de mais de 200 tipos, que se pode desenvolver em qualquer órgão de nosso corpo. Biologicamente falando, os órgãos são constituídos por diferentes tipos de células estruturadas em camadas, por exemplo, de tecidos. Os tecidos são constituídos de tipos específicos de célula. O câncer pode se desenvolver a partir de quase quaisquer tipos de célula no corpo. (INSTITUTO ONCOGUIA, 2015). A classificação do câncer não se dá de acordo com os tecidos para os quais se espalhou, mas sim com o tipo de célula normal. Sendo assim temos de acordo com esta classificação, que é denominada primária, que os vários tipos de câncer podem ser colocados em um dos seguintes grupos: carcinomas (tecidos epiteliais); sarcomas (tecidos conjuntivos); linfomas (sistema linfático); leucemia (células da medula óssea); mielomas (malignidade nas células plasmáticas da medula óssea que produz os anticorpos); melanomas (melanócitos); gliomas (tecidos de suporte cerebral ou da medula espinhal) e neuroblastomas, atribuído a tumor pediátrico derivado de células malignas resultantes de células neuronais primordiais. (ALMEIDA et al., 2005) Há uma distribuição epidemiológica que sugere aumento de casos e tipos de câncer com o status socioeconômico da população. Ainda segundo este estudo, câncer de mama, próstata, cólon, reto e, simultaneamente, a presença de taxas de incidência persistentemente elevadas de tumores geralmente são associados com a pobreza, juntamente com o câncer de colo de útero, pênis, estômago e cavidade oral. Esta.

(18) 15. distribuição certamente resulta de exposição a um grande número de diferentes fatores de risco ambientais relacionados ao processo de industrialização – agentes químicos, físicos e biológicos - e de exposição a outros fatores relacionados às disparidades sociais. (VIERO; LARA, 2015). 1.2 QUIMIOTERAPIA E SUAS LIMITAÇÕES. O tratamento do câncer pode ser realizado basicamente por quatro abordagens: a cirurgia e a radioterapia, como tratamentos locais; a quimioterapia e a terapia com agentes biológicos (como hormônios, anticorpos ou fatores de crescimento) como tratamentos sistêmicos. A quimioterapia é uma modalidade terapêutica importante para o câncer, representada pelo emprego de substâncias químicas isoladas ou em combinação. Essas drogas interferem no processo de crescimento e divisão celular, destruindo as células tumorais, mas também agredindo as células normais que possuem características semelhantes. (ROSAS et al., 2013) A quimioterapia consiste na aplicação de medicamentos para combater as células que formam os tumores dos canceres. Trata-se de uma abordagem sistêmica e torna possível a cura de alguns tumores, além de permitir o tratamento precoce de metástases não detectáveis, essa modalidade de tratamento traz inúmeros efeitos colaterais, os quais se relacionam ao fato de não afetarem exclusivamente as células tumorais. Frequentes incluem mielossupressão, náuseas, vômitos, diarreia e alopecia. (RODRIGUES; POLIDORI, 2012) A frequência dos efeitos colaterais pode variar de acordo com o diagnóstico, o paciente, a pré-medicação, a função hepática, a dose e o tratamento utilizado. Geralmente, a incidência de efeitos adversos é maior em pacientes com provas de função hepática elevadas. (FREITAS; NEVES, 2013) A figura 1 apresenta a estrutura de alguns fármacos utilizados no tratamento quimioterápico..

(19) 16 Figura 1: Exemplos de fármacos utilizados no tratamento quimioterápico. Alcançar o objetivo primário da quimioterapia, que é destruir as células neoplásicas preservando as normais, ainda é um desafio. Grande parte dos agentes quimioterápicos atua com baixa seletividade atingindo não só as células malignas quanto as saudáveis, particularmente as células de rápido crescimento, como as gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico. Isto explica a maior parte dos efeitos colaterais da quimioterapia: náuseas, perda de cabelo e susceptibilidade maior às infecções. (ALMEIDA, et al., 2005) Com base no exposto, observa-se que a busca por novos candidatos a fármacos mais seletivos para o tratamento do câncer ainda configura-se um desafio nos dias atuais, fato que vêm impulsionando vários grupos de pesquisa tanto no cenário nacional quanto internacional. (WELSCH; SNYDER; STOCKWELL, 2010). 2 ESTRUTURAS PRIVILEGIADAS: DEFINIÇÃO E APLICAÇÕES RECENTES NO DESIGN DE NOVOS CANDIDATOS A FÁRMACOS. O desenho de candidatos a fármacos multialvos tem crescido nos últimos anos e se baseiam em uma unidade estrutural que possua atributos para interação com os receptores preconizados. Neste contexto, a utilização de estruturas privilegiadas, subunidades com pontos farmacofóricos para mais de um receptor, devem ser consideradas para o desenvolvimento racional e triagem de novos compostos com perfil multialvo. (MORPHY et al., 2004, apud in SILVA,2013) O conceito de estruturas privilegiadas, entre os quais os produtos naturais com bioatividades conhecidas e que estendem esta definição à maioria dos metabólitos secundários, foi sugerido inicialmente por Evans e colaboradores (1988) como uma estrutura com mais de um bioreceptor podendo ser a estrutura base para demais.

(20) 17. compostos, e em seguida, estendidas a estruturas de produtos naturais tais como indoles e outros. (NEWMAN, 2008) Estruturas privilegiadas são pequenas moléculas orgânicas que podem ser ferramentas poderosas, impactando áreas como biologia e medicina, atuando em macromoléculas. que. regulam. processos. biológicos.. (WELSCH,. SNYDER,. STOCKWELL, 2010) A figura 2 apresenta a N-acilidrazona, uma estrutura privilegiada presente em alguns compostos farmaceuticamente ativos, e atividade de compostos com esta subunidade. Figura 2: Estrutura privilegiada e fármacos com núcleo em comum e sua atividade biológica. O processo para identificação de uma estrutura privilegiada está envolto de muitos desafios. A correlação apenas à frequência de ocorrência de certas subunidades e coleções de moléculas bioativas não é o suficiente para se definir que uma estrutura é privilegiada, pois necessitam de estudos criteriosos que confirmem a importância das subunidades para interação fármaco-receptor. (SILVA, 2013) A figura 3 apresenta mais alguns exemplos de estruturas privilegiadas e derivados que apresentam tais núcleos com suas respectivas atividades.. Figura 3: Estrutura Privilegiada e atividade biológica de fármacos contendo o núcleo indólico em comum. Os derivados da isatina são exemplos de estrutura privilegiada de significativa importância na área de química medicinal. A maioria desses compostos apresentam.

(21) 18. atividades biológicas e farmacêuticas e despertam grande atenção dos químicos nos últimos anos. (MORADI; ZIARANI; LASHGARI, 2017). Encontra-se na literatura estudos acerca de sua grande variedade de atividades biológicas, relevantes para aplicação como inseticidas e fungicidas e em uma vasta gama de terapias farmacológicas, incluindo medicamentos anticancerosos, antibióticos e antidepressivos. (PAKRAVAN et al., 2013) A figura 4 apresenta a isatina (1) e alguns derivados com suas respectivas atividades biológicas.. Figura 4: Isatina (1) e alguns derivados - estruturas privilegiadas. 2.1 COMPOSTOS. 3-HIDROXI-INDOLIN-2-ONAS-3-SUBSTITUÍDOS. COMO. ESTRUTURA PRIVILIEGIADA PARA A BUSCA POR NOVOS AGENTES ANTICÂNCER.. Derivados 3-hidroxi-indolin-2-onas-3-substituídos tornaram-se alvos sintéticos importantes, uma vez que suas estruturas formam as unidades centrais de muitos produtos naturais e compostos farmaceuticamente conhecidos, por exemplo a Convolutamidina e Paratunamida D, que se encontram na figura 5. A Convolutamidina é uma substância que apresenta atividade na diferenciação de células de leucemia promielocítica humanas HL60, e a Paratunamida D apresenta atividade biológica contra células de carcinoma epidermóide. (YAN et al., 2013) A figura 5 mostra alguns produtos naturais que apresentam o núcleo indólico, e que possuem potencial antineoplásico..

(22) 19 Figura 5: Produtos naturais com potencial antineoplásico contendo o núcleo indólico. Adutos de Morita-Baylis-Hillman vêm apresentando atividade contra Linhagens de células tumorais humanas. Expandindo assim a diversidade de atividade biológica que os AMBH podem apresentar. (LIMA-JUNIOR; VASCONCELLOS, 2012) Em trabalho publicado em 2006 (KOHN et al., 2006) dos 18 adutos sintetizados, alguns apresentaram atividade contra 8 linhagens celulares tumorais, dentre elas: UACC62, MCF7, NCIADR, 786-0, NCI460. Este não é o trabalho pioneiro de AMBH com atividade biológica, mas pôde mostrar para a ciência o potencial antineoplásico que AMBH podem apresentar. Em seus estudos, porém, não se utilizou da estrutura privilegiada isatina (1), o que coube a outros pesquisadores, sintetizarem via RMBH, uma vez que a literatura não apresentava muitos relatos. Os compostos que contêm o núcleo indólico presente em muitos produtos naturais e farmacêuticos, tem apresentado siginificativa atividade biológica contra várias enfermidades, dentre as quais, um potencial anti-câncer. (PEDDIBHOTLA, 2009) Compostos derivados da isatina que possuíam este mesmo núcleo, apresentaram significativa atividade biológica contra a linhagem HL-60 (leucemia promielocítica), apresentando bons índices de seletividade, atuando na indução de apoptose celular. (LIMA-JUNIOR et al., 2016).

(23) 20. 2.2 SÍNTESE DE 3-HIDROXI-INDOLIN-2-ONAS-3-SUBSTITUÍDOS. Encontra-se na literatura vários métodos para a preparação de compostos contendo o grupo 3-hidroxi-indol-2-ona 3-substituídos, dentre os quais podemos citar as reações aldólicas catalisadas por arginina (YAN et al., 2013) e reação de Henry (MESHRAM et al., 2013). Estas reações utilizam isatina (1) e derivados como substrato, uma vez que há a presença de uma carbonila cetônica eletrofílica. Desde que a síntese de compostos 3-hidroxi-indol-2-ona 3-substituídos por via aldólica foi realizada usando a prolina como catalisador, outros organocatalisadores baseados em aminoácidos têm sido desenvolvidos como imitadores de enzimas para reações adversas. O mecanismo nas reações mediadas por prolina baseia-se na formação inicial de um imina entre o átomo de nitrogênio da arginina e o grupo carbonila do substrato e depois a conversão para uma enamina. Uma imina pode ser formada por outros aminoácidos e assim os outros aminoácidos poderia catalisar reações semelhantes, a exemplo da arginina. Reações utilizando a arginina apresentaram rendimentos variando de 88% - 98%, sendo portanto um bom catalisador. O produto foi obtido como uma mistura racêmica. (YAN et al., 2013) O esquema 1 apresenta a o esquema geral da síntese do núcleo indólico por via aldólica catalisada por arginina.. Esquema 1: Metodologia de síntese de 3-hidroxi-indolin-2-onas-3-substituídos por via aldólica. Quando R1=R2=R3=R4= H e R5 um composto fenílico, os produtos obtidos apresentaram o rendimento variando de 95% – 98%. A reação de Henry mostrou-se eficiente para a reação de síntese de compostos 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos pela reação de isatina (1) com nitroalcanos em DMF, sob condições anidridas (MESHRAM, et al., 2013). Entre as vantagens mencionadas na pesquisa, encontram-se o fato deste método proporcionar altos rendimentos, apresentar economia de átomos por ser realizada em uma única etapa e aplicável a uma variedade de derivados da isatina, bem como nitroalcanos. O esquema 2.

(24) 21. apresenta a metodologia geral para a síntese dos compostos, bem como a variação de rendimento dos produtos obtidos.. Esquema 2: Metodologia para a síntese de compostos 3-hidroxi-indol-2-ona 3-substituídos via reação de Henry. Há, no entanto, outra via sintética que vem ganhando destaque na literatura, para a obtenção do 3-hidroxi-indolin-2-onas-3-substituídos realizada a partir da isatina (1) com aceptores de Michael, por meio da Reação de Morita-Baylis-Hillman (RMBH). (GARDEN; SKAKLE, 2002; KHALAFI-NEZHAD; MOHAMMADI, 2012) A literatura já vem apresentando muitas RMBH envolvendo a utilização de aldeídos como eletrófilo. No entanto, o emprego de cetonas é bem menor. Uma das vantagens dessa via sintética está no potencial biológico que os AMBH vêm apresentando como também quantitativos rendimentos (CHUNG; IM; KIM, 2002; GARDEN; SKAKLE, 2002). O esquema 3 apresenta a metodologia empregada por Garden e Skakle (2002). Esquema 03: Metodologia para a síntese de compostos 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos via RMBH.

(25) 22. 2.3 REAÇÃO DE MORITA-BAYLIS-HILLMAN. A reação de Morita-Baylis-Hillman teve sua origem em 1968, quando Morita descreveu a reação de um aldeído com compostos acrílicos catalisada por tricicloexilfosfina. Morita nomeou a transformação como adição carbinólica. No entanto, o rendimento da reação foi extremamente baixo (20%). (SANTOS et. al., 2015) A reação ganhou o nome Baylis-Hillman devido os estudos feitos por A. B. Baylis e M. E. D. Hillman no qual utilizaram uma amina terciária bicíclica DABCO como catalisador na reação de aldeídos com alcenos ativados. A RMBH é uma reação de formação de ligação C – C entre um carbono eletrofílico (aldeídos, cetonas ou iminas) e a posição  de um alceno (ou Alcino) ligado a grupos retiradores de elétrons (GRE) catalisada por aminas terciárias ou alquil (aril) fosfinas, sendo o DABCO o catalisador mais utilizado. (LIMA-JUNIOR et al., 2016). O esquema 4 apresenta a metodologia utilizada na RMBH.. Esquema 4: A reação de Morita-Baylis-Hillman. A RMBH é indiscutivelmente um método sintético orgânico poderoso e versátil de formação da ligação carbono – carbono gerando produtos polifuncionalizados conhecidos como AMBH, sendo obtidos numa reação one pot catalisada por aminas terciárias, sendo o DABCO a mais utilizada. As etapas mecanísticas para a formação destes adutos envolvem adição de Michael seguida por uma etapa de adição aldólica e eliminação (SINGH; BHARADWAJ; TIWARI, 2014). Há inúmeras vantagens na utilização desta de reação. Uma delas está relacionada a total economia de átomos, como também a possibilidade de ser realizada em meio aquoso ou até mesmo na ausência de solventes, além de ser organocatalisada. Tais características têm recebido grande atenção dos químicos orgânicos sintéticos atualmente.

(26) 23. devido a busca pelo desenvolvimento de processos voltados para a química verde. (LIMA-JUNIOR et al., 2016). Uma das limitações que encontramos para esta reação é o seu alto tempo reacional e baixos rendimentos. No Brasil, alguns grupos de pesquisa têm dedicado seus esforços para o desenvolvimento de metodologias para melhorar os rendimentos e velocidade da reação MBH . Um exemplo é a utilização de 4- ( N , N - dimetilamino ) piridina ( DMAP ), como um catalisador para a reação de Morita - Baylis - Hillman entre aldeídos aromáticos e de acrilato de metila sob condições brandas, que apresentou menores tempos reacionais. (SANTOS et al.,2015) Nas últimos trinta anos os AMBH têm sido utilizados para síntese de vários heterociclos e carbociclos. Além do alto potencial sintético os adutos obtidos vêm apresentando significativo potencial biológico, o que faz com que a RMBH torne-se cada vez mais utilizada no campo medicinal, atividades como antimalarial, leishmanicida, antitumoral, antifúngica e antibacteriana, são exemplos de atividades já relatadas de AMBH . Em trabalhos mais recentes AMBH têm apresentado atividade anticancerígena, estendendo assim o potencial biológico desses compostos. (LIMA-JUNIOR et al., 2016) Os AMBH obtidos a partir de derivados de isatina vêm apresentando potencial anticâncer (PEDDIBHOTLA, 2009; LIMA-JUNIOR, 2012). As primeiras sínteses de AMBH com derivados de isatina foram realizadas pela primeira vez por RMBH em 2002, apresentando bons rendimentos. (GARDEN; SKAKLE, 2002; CHUNG et al., 2002). A síntese de 3-hidroxi-indolin-2-onas-3-substituídos, vem apresentando bons resultados nas taxas de reações de Morita-Baylis-Hillman entre derivados de isatina e ésteres acrílicos ou acrilonitrila, sob condições isentas de solventes. (RADMOGHADAM; YOUSEFTABAR-MIRI, 2011) Encontra-se na literatura também relatos da síntese de acrilamidas 3-hidroxiindolin-2-onas-3-substituídos via RMBH. Numa mistura de solvente 1: 1 de dioxano / H2O, a acrilamida pode sofrer a reação de Baylis-Hillman com aldeídos aromáticos ativados sob pressão atmosférica e à temperatura ambiente. A água foi pensada para favorecer a formação dos intermediários zwiterionicos e, assim, promover a reação. (GUO et al., 2005). Recentemente a reação usando derivados de isatina com acrilamida, DABCO como promotor e fenol como aditivo em acetonitrila como solvente, gerou AMBH em bons rendimentos. Tais compostos apresentam entre suas vantagens, o fato de oferecer.

(27) 24. átomo de nitrogênio livre para alquilações, diversificando ainda mais a estrutura do composto base. (SINGH; BHARADWAJ; TIWARI, 2014) As acrilamidas estão entre os compostos que têm sido avaliados como quimioterápicos contra o câncer, uma vez que afetam a concentração de glutationa (GSH), proteína presente em maior concentração em células de linhagens cancerígenas do que em células normais. (TEW, 1994). Independentemente da substituição em orto, meta ou para, algumas acrilamidas substituídas apresentaram significativo potencial inibidor das taxas de reação de GSH. (CEE et al., 2015) Adicionalmente, embora compostos derivados de acrilamidas apresentem significativa atividade biológica (WU et al., 2003), nenhuma atenção vem sendo dada a AMBH derivados de isatina e acrilamidas. Até o presente momento, nenhuma investigação foi realizada. O esquema 5 apresenta a metodologia empregada na síntese de AMBH derivados de arilacrilamidas. Esquema 5: Metodologia para a síntese de acrilamidas 3-hidroxi-indolin-2-onas-3-substituídos e alguns adutos obtidos. Fonte: Adaptada de Singh e colaboradores (2014). Com base no exposto este trabalho buscou além da síntese de alguns derivados 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos a partir de derivados de isatina com ésteres acrílicos ou acrilonitrila, também a síntese de acrilamidas. Para isto, foi utilizado como aceptor de.

(28) 25. Michael 4-nitrofenil acrilamida, sendo a reação promovida por DABCO. A escolha deste aceptor se baseia no fato de que em trabalhos anteriores, AMBH contendo grupo nitro foram fortemente ativos frente a linhagens de câncer (KOHN et al., 2006; MOHAN et al., 2006)..

(29) 26. OBJETIVOS.

(30) 27. 4 OBJETIVOS 4.1OBJETIVO GERAL. Ampliar o estudo acerca de estruturas privilegiadas, sintetizando novos derivados que apresentam o núcleo indólico, via reação de Mortita-Baylis-Hillman, e que possam apresentar significativa contribuição no combate às linhagens de células cancerígenas e tornarem-se novos candidatos a fármacos.. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.  Realizar sínteses de intermediários da isatina (1);  Desenvolver melhores condições reacionais na obtenção de compostos 3-. hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos, via RMBH entre isatina (1) e seus direvados e aceptores de Michael;  Discutir a bioavaliação, a ser realizada, dos compostos sintetizados frente às linhagens cancerígenas;.

(31) 28. ESTRATÉGIAS.

(32) 29. 5 ESTRATÉGIAS. Baseado em relatos na literatura (PEDDIBHOTLA, 2009; LIMA-JUNIOR et al., 2016) acerca do potencial anticâncer de compostos que apresentam o núcleo indólico, onde os AMBH derivados da isatina apresentaram forte atividade citotóxica frente a células de HL-60 (leucemia), nossa estratégia inicial consistirá na síntese de novas séries congêneres de 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos derivados da isatina, via reação de Morita-Baylis-Hillman com aceptores de Michael. A figura 6 apresenta o esquema geral para a síntese das séries congêneres.. Figura 6: Esquema geral para a síntese das séries congêneres. Para a síntese das séries congêneres dos AMBH de acrilonitrilas e acrilato de metila serão utilizados como material de partida a isatina (1), que após a síntese de seus.

(33) 30. derivados por meio de reações de nitração, cloração e alquilação, os derivados obtidos reagirão com os alcenos ativados acrilonitrila e acrilato de metila. A figura 7 mostra a análise retrossintética para a síntese dos adutos propostos nestas séries. Figura 7: Análise retrossintética dos adutos propostos para as séries congêneres da acrilonitrila e do acrilatos de metila. Para a síntese da série congênere dos AMBH de acrilamidas serão utilizados com material de partida derivados da isatina, que após a síntese de seus derivados por meio de reações, cloração e alquilação, os derivados obtidos reagirão com o aceptor de Michael p-nitrofenilacrilamida. A figura 8 apresenta a análise retrossintética para adutos propostos nesta série..

(34) 31 Figura 8: Análise retrossintética dos adutos propostos para a séries congênere das acrilamidas.

(35) 32. RESULTADOS E DISCUSSÃO.

(36) 33. 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 6.1 PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DA ISATINA O presente trabalho foi iniciado pela preparação dos derivados da isatina. Estes, por sua vez foram sintetizados via reação de nitração e cloração (SILVA et al., 2010). De forma breve, para a síntese do derivado nitrado (1b), empregou-se uma mistura de ácido nítrico em ácido sulfúrico. Já o derivado diclorado (1c) foi obtido usando uma mistura de ácido tricloroisocianúrico (ATCI) em ácido sulfúrico. Os derivados apresentaram rendimentos, 72 % e 99%, respectivamente. Posteriormente, os derivados nitrados e clorados foram submetidos a reação de alquilação usando iodeto de metila e brometo de alila (PERIYARAJA, SHANMUGAM E MANDAL, 2013) fornecendo os derivados (1d-1g) com rendimentos (45 – 93%). A própria isatina (1) também foi alquilada seguindo mesmo protocolo gerando derivados 1h e 1i com rendimentos que variaram entre 95 e 99%. O esquema 6 sumariza o caminho sintético para a preparação destes intermediários sintéticos derivados da isatina. Esquema 6: Rotas sintéticas para a preparação dos derivados da isatina..

(37) 34. Os intermediários foram caracterizados por RMN 1H e 13C e suas estruturas foram confirmadas baseadas na comparação com a literatura (SILVA et al., 2010; KHALAFINEZHAD; MOHAMMAD, 2012) 6.2 SÍNTESE DOS ADUTOS MBH DERIVADOS DA ISATINA 3a – 3i Para a síntese dos compostos 3a – 3i foi realizada reação de Morita-BaylisHillman (RMBH) utilizando acrilonitrila como aceptor de Michael e isatina (1) e seus derivados como substrato eletrofílico. Todas as reações foram realizadas usando DABCO como promotor, usando THF como solvente e a temperatura ambiente. Cabe ressaltar que os compostos 3f, 3g, 3h e 3i são inéditos, os compostos já existentes na literatura foram sintetizados para realização da análise biológica. Os resultados obtidos estão sumarizados na Tabela 1 Tabela 1: Rendimentos e tempos reacionais da reação de preparação dos compostos 3a – 3i. Entrada. AMBH. R1. R2. R3. Tempo (h). Rendimento isolado. H. H. H. 2,5. 99%. H. H. CH3. 1,5. 95%. H. H CH2CH=CH2. 2. 99%. 3a 1 3b 2 3c 3. 3d 4. 3e 5. NO2 H. H. 18. 93%. NO2 H. CH3. 19. 82%.

(38) 35. 3f 6. NO2 H CH2CH=CH2. 5. 98%. 3g 7. Cl. Cl. H. 24. 95%. Cl. Cl. CH3. 1. 99%. Cl. Cl CH2CH=CH2. 2. 97%. 3h 8. 3i. 9. Pode-se observar na tabela 1 que a condição experimental empregada foi satisfatória, formando produtos em tempos reacionais que variaram de 1 a 24 horas e excelentes rendimentos (82 – 99%), não havendo formação de coprodutos. Em se tratando dos compostos com o grupo nitro esperava-se que o mesmo por ser grupo retirador de elétron diminuísse o tempo reacional, no entanto pelos resultados apresentados há um aumento nos tempos reacionais e uma diminuição nos rendimentos em comparação com os compostos sem este grupo retirador de elétrons. Pode-se observar ainda que os compostos alquilados na presença do grupo cloro apresentam menores tempos reacionais que os seus respectivos nitrados. 6.3 SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DE ISATINA 4a – 4h Para a síntese dos compostos 4a – 4h foi realizada reação de Morita-BaylisHillman utilizando acrilato de metila como aceptor de Michael e isatina (1) e seus derivados como substrato eletrofílico..

(39) 36. As condições experimentais empregadas foram semelhantes a aplicada na série anterior. A tabela 2 apresenta os valores de tempo e rendimento para a preparação de 4a – 4h. Tabela 2: Resultados obtidos na síntese dos adutos de Morita-Baylis-Hillman derivados do acrilato de metila.. Entrada. AMBH. R1. R2. R3. Tempo (h). Rend. isolado. 4a 1. H. H. H. 18. 93%. H. H. CH3. 120. 93%. H. H. CH2CH=CH2 120. 92%. 4b 2. 4c 3. 4d 4 NO2. H. H. 2. 67%. NO2. H. CH3. 48. 98%. NO2. H. CH2CH=CH2. 23. 99%. 96. 56%. 4e 5 4f 6. 4g.

(40) 37. 7. Cl. Cl. H. Cl. Cl. CH3. 4h 8. 2,5. 99%. Pela tabela 2 acima, pode-se observar que os compostos 4a – 4h foram obtidos em tempo reacionais que variaram de 2 a 120 horas com rendimentos (56-99%). A utilização de irradiação de micro-ondas (80 °C) em um reator de micro-ondas CEM Discover-System, equipado com um sistema de irradiação contínua de μW com potência programável no intervalo de 0 a 300 W, foi empregada para a preparação de 4g, mas não se observou melhora no rendimento reacional. Cabe ressaltar que os adutos 4f, 4g e 4h são inéditos na literatura, os compostos já existentes na literatura foram sintetizados para realização da análise biológica. Observa-se ainda que a presença de grupos nitro nos compostos reduziu os tempos de reações e aumentou o rendimento dos compostos alquilados, fato este que era esperado devido a presença de grupos retiradores de elétrons ligado ao anel aromático que proporcionam um aumento na velocidade da reação. Em se tratando do composto metilado pode-se observar que a presença do grupo cloro reduziu o tempo reacional e aumentou o rendimento. Houve necessidade de separação cromatográfica para o isolamento dos produtos 4d e 4g, tendo em vista que houve formação de coprodutos. Para realizar a purificação foi utilizada uma coluna cromatográfica (Eluente 25% - AcOEt / Hexano). 6.4 SÍNTESE DOS AMBH DERIVADOS DE ISATINA 5a – 5d Para sintetizar os compostos 5a – 5d foi utilizado como aceptor de Michael 4nitro-fenilacrilamida. Este, por sua vez foi sintetizado seguindo protocolo da literatura (CEE et al.,2015). Sua preparação envolveu a reação entre 4-nitroanilina e cloreto de acroleíla como mostrado no esquema abaixo. O aceptor foi obtido em 85% de rendimento e caracterizado por métodos físicos. O esquema 7 apresenta a metodologia de síntese de 2..

(41) 38 Esquema 7: Metodologia de síntese do derivado 2. Após a preparação de 2, iniciou-se a preparação dos AMBH. Todos os compostos pertencentes a esta série são inéditos. O protocolo sintético utilizado para a síntese destes compostos foi o mesmo aplicado nas séries anteriores, usando THF como solvente e DABCO como promotor. Foi utilizado 1.2 equivalentes do aceptor de Michael e a reação foi conduzida a temperatura ambiente. Os resultados de tempo reacional e rendimento estão sumarizados na Tabela 3. Tabela 3: Resultados de tempo e rendimentos reacionais obtidos na preparação de 5a – 5d.. Entrada. AMBH. Tempo (h). Rendimento isolado. R1 R2. R3. H H. CH3. H H. CH2CH=CH2. 96. 48%. Cl Cl. CH3. 168. 22%. 5a 1. 168. 62%. 5b 2. 5c 3.

(42) 39. 5d 4. Cl Cl CH2CH=CH2. 168. 64%. Pode-se observar pela tabela 3 que os tempos reacionais foram mais longos quando comparado as séries sintetizadas anteriormente. Isto deve-se a baixa reatividade de acrilamidas quando comparada com acrilonitrila e acrilato de metila. Observa-se também que os rendimentos obtidos são mais baixos (22 -64%). A literatura apresenta poucos relatos de sucesso na síntese desta classe de compostos via RMBH. Em se tratando de reações usando derivados de isatina, somente um relato é presente na literatura até o presente momento, sendo de total relevância a investigação de novos protocolos experimentais para esta classe de moléculas.. 6.5 TRATAMENTO ESPECTROCÓPICO DOS AMBH DERIVADOS DA ISATINA. Todos. os. compostos. sintetizados. foram. caracterizados. por. técnicas. espectroscópicas (RMN 1H e RMN 13C). Para os compostos inéditos, foi realizada análise de massas de alta resolução. As estruturas dos compostos 3a, 3b 4c e 4e foram confirmadas de acordo com a literatura (CHUNG et al., 2012; KHALAFI-NEZHAD e MOHAMMADI, 2012). As estruturas dos compostos 4a e 4b foram confirmadas de acordo com a literatura (LIMA-JUNIOR, 2012). Os compostos 3f, 3g, 3h, 3i, 4d, 4f, 4g, 4h, 5a, 5b, 5c e 5d são inéditos e destacaremos um composto pertencente a cada série sintetizada. Podemos observar na Figura 9 o espectro de RMN 1H do composto 3g. De forma geral, um singleto é observado em 10.55 ppm relacionado ao hidrogênio amídico e os picos relacionados aos hidrogênios aromáticos se apresentam como singleto. Os picos relacionados aos hidrogênios vinílicos geminais aparecem em deslocamento químico de 5.45 e 5.61 ppm. Atribui-se ao hidrogênio da hidroxila um deslocamento de 6.46 ppm, (valor que difere do deslocamento geralmente atribuído a este hidrogênio, 0,5 – 5,0 ppm) devido ao efeito indutivo (SILVA et al., 2008; KHALAFI-NEZHAD; MOHAMMADI, 2012). Uma segunda proposta de explicação para o fato deste sinal do hidrogênio da hidroxila em 6.46 ppm estar em forte desblindagem, parte do princípio que devido a.

(43) 40. fatores conformacionais, a hidroxila pode se colocar numa posição que faça com o sistema aromático uma ligação de hidrogênio não clássica, desblindando o hidrogênio da hidroxila. (OLIVEIRA; ARAUJO, 2011) Figura 9: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do composto 3g. Já na figura 10, podemos observar o espectro de RMN 1H do composto 4g onde se pode observar um singleto relativo aos hidrogênios metílicos e em 5.64 e 5.69 ppm dois singletos referentes aos hidrogênios olefínicos. Em campo alto, observa-se os dois singletos referentes aos hidrogênios aromáticos e ao hidrogênio da hidroxila. O singleto em 10.17 ppm é atribuído ao hidrogênio amídico..

(44) 41 Figura 10: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do composto 4g. Na figura 11 apresenta-se o espectro de RMN 1H do composto 5a. Nele é possível observar um pico em deslocamento químico de 10.66 ppm referente a presença do próton amídico. Observa-se também a presença em 3.37 ppm dos prótons metílicos da porção carboximetiléster e na região entre 6.35 e 6.60 ppm dois singletos referentes aos prótons olefínicos. Neste espectro o sinal do hidrogênio da hidroxila não pôde ser observado. Dois dupletos na região entre 7.75 e 8.15 ppm corresponde a presença do sistema AA´BB´da porção da 4-nitrofenil acrilamida (PAVIA et al., 2010)..

(45) 42 Figura 11: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) do composto 5a. 6.6 AVALIAÇÃO SINTETIZADOS. DA. ATIVIDADE. CITOTÓXICA. DOS. COMPOSTOS. Após a síntese e caracterização das substâncias propostas neste trabalho, a etapa posterior consistiu no envio destas moléculas para a avaliação citotóxica. Estas por sua vez foram realizadas no Laboratório de Proliferação Celular, coordenada pela professora Dra. Gardenia Carmen Gadelha Militão, pesquisadora do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). As substâncias propostas foram avaliadas frente a 5 linhagens tumorais: HL60 (leucemia promielocítica), MCF-7 (carcinoma de mama-humano), NCI-H292 (carcinoma de pulmão – humano), HEP-2 (carcinoma de colo uterino – humano) e HEPG2 (hepatocarcinoma). A partir dos experimentos realizados foi obtido a Concentração Inibitória em 50% (CI50) e o intervalo de confiança (IC) foi calculado por regressão não linear. Os compostos com CI50 < 3µM foram julgados como muito ativos, enquanto que compostos com valores de CI50 entre 3-6 μM foram considerados com boa atividade. Por outro lado, os compostos com CI50 entre 6 μM e 12 μM foram considerados moderadamente ativos, enquanto que.

(46) 43. compostos com CI50 entre 12-24 μM foram considerados como tendo baixa atividade in vitro. Finalmente, os compostos que exibem CI50 > 24 foram considerados inativos (FORTES et al., 2016) A tabela 4 abaixo sumariza os resultados da avaliação citotóxica dos adutos sintetizados. Tabela 4 - Concentração inibitória em 50% (CI50) e intervalo de confiança (IC) das amostras em 5 linhagens tumorais e seu intervalo de confiança. Doxorrubinina foi usada como controle positivo. * NT=não testado AMBH 3a 3b 3c 3d 3e 3f 3g 3h 3i 4a. MCF-7 6 5.0-7.0 11,59 7.36- 18.86 4,2 3.92 – 4.50. HEP-2 3,4 2.85-4.00 4,06 3.27 – 5.05 2,33 1.96 – 2.79. NICIH292 2,4 1.75-3.35 5,05 4.67 – 6.31 3,42 3.00 – 3.88. HL60 3,6 2.65-3.05 1,77 3.70 – 5.19 1,83 1.59 – 2.13. HEP G2 17,45 13.70 – 22.19 29,25 22.99 -37.29 19,58 14.60 -25.88. >50. >50. >50. >50. >50. 6,49 5.95- 7.03 6,88 5.93 –8.04 8,39 6.82– 9.10 9,57 8.65 –10.60 3,9 3.27 -4.84. 5,79 5.02-6.56 5,96 4.91-7.37 5.22 4,10-6.72 2,1 1.81–2.41 3,9 3.25-4.55 48,8 40.30– 59.06 38,22. 3,86 3.67-4.48 3,51 3.26-4.21 3.50 2.95-4.18 1,77 1.63-1.95 2,69 2.37-3.25. 2,93 2.70 –3.17 0,042 0,035-0,052 1,3 1.16- 1.45 1,42 1.28-1.52 0,048 0,035-0,063 27,51 21.67-34.98 17,25. 11,78 9.34 – 14.83 8,04 6.28– 10.32 2,54 2.09– 3.06 12,34 10.43-14.18 9,81 8.34-11.56. >50 25,18. 4b. 21.21-29.92 18,02. 4c 4d 4e. 12.60-25.82. 4g 4h 5a 5b 5c. 28,9. 29.15 –50.17 21.25 –39.23 11.54 –25.83 32,42. 45,2. >50 >50. 16,08. 26.04– 40.40 40.59– 50.37 12.93 –20.00. >50. >50. >50. >50. >50. >50. 34,25. 21,37. 20,34. 6,27. 48,7. 5.48– 9.11. 44.28 - 66.49. 20,22. 5,42. 40,89. 15.82– 25.85. 4.34 –6.76. 33.84 – 49.43. 14,63 12.19 –17.54. 4,76 3.92- 5.75. 34,75 27.14 - 44.45. 31.93-46.60 7,55. 4f. NT. 5.50– 10.37 7,52 5.35 – 10.60. 18.30 –31.70 14.59– 31.97 30,72 24.94 – 37.83 6,68 5.55-8.04. 30,32 43,9 4,2 >50 25.97– 35.43 39.30– 49.05 3.40 –5.14 66,4 18,79 34,2 18,04 43.80– 12.49 –29.24 27.82– 42.07 12.66 –27.72 100.68 41,98 18,73 38,52 5,38 36.41– 48.36 11.87– 26.60 31.21– 47.55 3.43 –8.42 38,88 >50 13,92 5,49. 31,08 26.57 - 36.41 NT NT NT.

(47) 44 30.80 –49.05 5d. >50. DOX. 0.37 0.18-0.92. 11.43 –16.96 42,19 24,2 23.85 - 74.68 18.95 –30.92 1.3 0.55 0.55-2.6 0.37-0.92. 3.73- 8.03 14,14 8.90 –22.50 0.11 0.1-0.33. NT 0.6 0.51-0.81. Ao analisar os resultados apresentados na tabela 4, observa-se que dos 21 compostos avaliados, 9 são considerados muito ativos. De forma geral, os compostos que possuem o grupo nitrila foram os mais ativos frente a pelo menos uma das 5 linhagens tumorais investigadas, sendo os adutos 3f e 3i os mais que apresentaram atividade na linhagem HL60 na escala de nanomolar. Pode-se observar que os compostos das séries congêneres dos adutos MBH alquilados nitrilados e seus respectivos ésteres apresentaram maiores atividades contra a linhagem HL60 quando continham os grupos nitro em comparação com os adutos que não continham grupos retiradores de elétrons. Fato este já relatado na literatura (KOHN et a., 2006; MOHAN et al., 2006) Os compostos contendo o grupo cloro apresentaram maiores atividades frente a linhagem HL60 do que seus respectivos compostos sem este grupo retirador de elétrons, a única exceção foi em relação ao composto alilado com o grupo nitro. Há relatos na literatura (VINE, et al., 2008) que evidenciam este mesmo fato atribuído ao fato dos compostos derivados da isatina diclorados exercem um efeito citostático inibindo o crescimento celular em valores quantitativos. Para cada linhagem avaliada o composto mais ativo foi o pertencente a série das nitrilas. Seguindo a ordem das linhagens na tabela 4 iniciando por carcinoma de mamahumano (MCF-7) temos como adutos com maiores atividades 3i, 3h, 3f e 3g. Há alguns anos já se destacava o aumento na atividade de fármacos contendo o grupo nitrila como farmacofórico, sendo uma importante porção que pode atuar como aceptor de Michael em meio biológico. (FLEMING et al., 2010) Observa-se também que os compostos amídicos se apresentaram inativos frente a maioria das linhagens investigadas. Somente os adutos 5b e 5c apresentaram uma boa atividade frente a HL60. Após esta investigação inicial, os compostos mais ativos foram investigados frente a sua atividade citotóxica em células mononucleares do sangue periférico (CMSP). O objetivo desta avaliação foi de observar a seletividade dos compostos frente a células.

(48) 45. sadias. Sendo assim, os adutos 3b, 3c, 3e, 3f, 3g, 3h e 3i foram avaliados e os resultados estão apresentados na Tabela 5. Tabela 5 – Concentração que causa 50% de inibição do crescimento em CMSP e índice de seletividade (IS) frente a HL60.. Entrada 1 2 3 4 5 6 7 8 a b. Composto 3b 3c 3e 3f 3g 3h 3i DOX. CH50 (M) 14.72 2.75 11.16 13.54 6.79 8.40 7.14 1.4. ISb 8.32 1.50 3.80 967.14 5.22 5.92 549.23 12.73. Doxorrubinina (DOX) 5 µM foi usada como controle positivo. IS = CH50/CI50. A partir dos dados apresentados na tabela acima, observa-se que todos os compostos mais ativos frente a HL60 possuem baixa citoxicidade frente a células mononucleares do sangue periférico, sendo os compostos 3f e 3i os mais promissores, tendo em vista que apresenta maiores índices de seletividade (entradas 4 e 7)..

(49) 46. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS.

(50) 47. 7 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 7.1 CONCLUSÕES De posse ao trabalho, podemos concluir que:.  Todos os derivados 3-hidroxi-indol-2-ona-3-substituídos propostos neste trabalho (12 inéditos) foram sintetizados via reação de Morita-Baylis-Hillman em rendimentos quantitativos;  Compostos contendo o grupo nitrila apresentaram em sua maioria maior eficiência sintética com menores tempos reacionais (1 – 24 H)  Dentre os 21 adutos sintetizados 17 apresentaram atividade contra algumas linhagens de células cancerígenas;  Compostos contendo o grupo nitrila mostraram-se mais ativos do que seus respectivos ésteres e amidas;  O composto 3f apresentou a maior atividade citotóxica frente a linhagem de células HL-60 (leucemia) e com baixa toxicidade em glóbulos vermelhos do sangue humano (IS>960).. 7.2 PERSPECTIVAS  Investigar a síntese dos compostos mais ativos neste trabalho usando irradiação de micro-ondas, buscando diminuir tempo reacional assim como também aumentar seus rendimentos.  Avaliar o composto 3f em modelos experimentais in vivo, a fim de se obter índice terapêutico e outras informações relevantes acerca da toxicidade e possíveis mecanismos de ação.  Realizar estudo quantitativo da relação estrutura-atividade (QSAR).

(51) 48. PARTE EXPERIMENTAL.

(52) 49. 8 PARTE EXPERIMENTAL. 8.1 MATERIAIS E MÉTODOS. Todos os solventes e reagentes foram obtidos comercialmente e utilizados sem purificação prévia. A formação dos produtos foi acompanhada pela técnica de CCD, onde foram utilizadas cromatofolhas de alumínio suportadas em gel de sílica 60 (fase estacionária), contendo indicador de fluorescência a 254nm, e uma mistura de acetato de etila/hexano ou apenas acetato de etila como fase móvel, sendo irradiadas em câmera de ultravioleta. A purificação dos produtos foi feita utilizando a técnica de cromatografia em coluna do tipo flash, utilizando gel de sílica (fase estacionária) de granulometria 0.035 0.070 mm, e uma mistura acetato de etila/hexano como fase móvel. As colunas cromatográficas foram. realizadas usando sílica gel 300-. 400 mesh. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H e. 13. C) foram. obtidos usando um espectrômetro Varian Mercury 400, operando a 400 MHz para RMN 1. H e a 100 MHz para RMN 13C, disponível na Central Analítica da Universidade Federal. do Vale do São Francisco –UNIVASF, campus Petrolina – PE. Ainda foi utilizado para os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H e 13C) um espectrômetro Varian Mercury 200, operando a 200 MHz para RMN 1H e a 50 MHz para RMN 13C, disponível na Central Analítica da Universidade Federal da Paraíba -UFPB. As amostras foram solubilizadas em DMSO-d6 e usando o tetrametilsilano (TMS) como padrão interno. Os deslocamentos químicos ) foram obtidos em parte por milhão (ppm). Os desdobramentos químicos referentes a cada acoplamento dos hidrogênios foram expressos da seguinte forma: singleto (s), dubleto (d), tripleto (t), duplo dubleto (dd), triplo dubleto (td) e multipleto (m). Os espectros de Massas de alta resolução foram realizados no Laboratório de Cromatografia e Espectrometria de Massas (LACEM) na Universidade Federal de Goiás usando um espectrômetro Q-Exactive (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) tendo como fonte de ionização electrospray (-). As faixas de fusão foram obtidas em aparelho digital Fisatom Modelo 431D.. 8.2 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1b.

(53) 50. A um erlenmeyer adicionou-se 19 mmol de NaNO3 em 10 mL de H2SO4 sendo esta mistura deixada a 0 °C. Em outro erlenmeyer adicionou-se 20 mmol de isatina (1) e 20 mL de H2SO4 concentrado. O sistema foi mantido a banho de gelo, a 0°C, até a solubilização da isatina (1). Em seguida adicionou-se o conteúdo da mistura nitrante no erlenmeyer contendo a isatina (1), e a mistura permaneceu no banho de gelo a 0°C por 2 h. Após isso a mistura foi vertida em gelo picado num outro erlenmeyer, e o precipitado formado foi filtrado. Esta reação foi encerrada após 2 h, fato este confirmado por análise via CCD. Após filtração, foi obtido um sólido amarelo com 72% de rendimento. RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): dAr-H), 8.21 (d, 1H, Ar-H), 8.45 (m, 1H, Ar-H) 11.7 (s, 1H, NH) RC (50 MHz, DMSO-d6):  . 8.3 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1c. Adicionou-se a um erlenmeyer de 250 mL 0,3945 g de TICA (1,7 mmols) em 1 mL de H2SO4, em banho de gelo a 0°C. Em seguida adicionou-se 0,25 g de isatina (1) (1,7 mmols) e após a adição a mistura foi submetida a agitação magnética nas condições ambiente e acompanhada por CCD. Após o término da reação, foi realizada extração líquido-líquido, onde a fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro. Após filtração e evaporação do solvente, foi obtido um sólido preto com 99% de rendimento. RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): d, 1H, Ar-H), 7.84 (d, 1H, Ar-H), 11.6 (s, 1H, NH) RC (50 MHz, DMSO-d6):  . 8.4 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1h.

(54) 51. Em um balão de 125 mL foram adicionados 5 mL de DMF seco, 5 mmol de isatina (1) e K2CO3 (1.5 equivalente). A mistura obtida foi submetida à agitação magnética, a temperatura ambiente, sob atmosfera de argônio. Posteriormente foi adicionado de de forma gotejada lentamente 0,40 mL de iodeto de metila (1.5 equivalente). Após o término da reação foi realizado extração líquido-líquido usando acetato de etila e água destilada, e foi realizada cromatografia em coluna para purificar o produto (Eluente 25% - AcOEt / Hexano). A fase orgânica foi evaporada obtendo-se um sólido vermelho com 95% de rendimento. RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): s, 3H, CH3), 7.11 (m, 2H, Ar-H), 7.60 (m, 2H, Ar-H). RC (50 MHz, DMSO-d6):  . 8.5 PROCEDIMENTO PARA A SÍNTESE DE 1i. Em um balão de 250 mL foram adicionados 5 mL de DMF seco, 2,3 mmol de isatina (1) e NaH (1,2 equivalente). A mistura obtida foi submetida à agitação magnética e deixada a temperatura ambiente sob atmosfera de argônio. Posteriormente foi adicionado de forma gotejada e lenta o brometo de alila (1.2 equiv.). Após o término desta reação, foi realizado extração líquido-líquido usando acetato de etila e água destilada. A fase orgânica foi tratada com Na2SO4 anidro e filtrada. Após isolamento, foi obtido um sólido vermelho em 99% de rendimento. RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): d, 2H, CH2), 5.27 (m, 2H, =CH2), 5.85 (m, 1H, =CH), 7.09 (m, 1H, Ar-H), 7.60 (m, 1H, Ar-H). RC (50 MHz, DMSO-d6):  . 8.6 PROCEDIMENTO GERAL PARA A SÍNTESE DE 1d E 1e.