BIOLOGÍA Y BIOTEC. VEGETAL
20 Actividades Seleccionadas
BIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA VEGETAL (2015)
20 Actividades Seleccionadas
Dra. Maria Antonia Malajovich
Biotecnología: enseñanza y divulgación
http://bteduc.com
PROGRAMA
INTRODUCCIÓN: LAS PLANTAS Y EL HOMBRE
UNIDAD 1: CRECIMIENTO, NUTRICIÓN Y DESARROLLO
Germinación. Nutrientes. Meristemas y crecimiento. Auxinas y tropismos. Multiplicación in vivo y
multiplicación in vitro. Aspectos tecnológicos.
A1. Germinación y desarrollo A2. Tropismos
A3. Nutrición mineral e hidroponía
A4. Micropropagación de tejidos vegetales A5. Crecimiento in vitro de embriones de maiz A6. El cultivo de callos de zanahoria
A7. El cultivo de meristemas de ajo
UNIDAD 2: EL TRANSPORTE DE SUSTANCIAS A TRAVÉS DE LA PLANTA
Raíz, tallo y hojas. Xilema y floema. La absorción. El sistema foliar y la transpiración. Teoría de
Dixon.
A8. La absorción de agua
A9. La estructura de la raíz y del tallo A10. Transporte a través del tallo A11. La transpiración
RESPIRACIÓN Y FOTOSÍNTESIS
Aspectos fisiológicos. Estudio cuali y cuantitativo. Factores que influyen en la fotosíntesis.
Producción primaria. Mecanismos alternativos de la fijación de carbono (Plantas en C3, C4 y
CAM)
A12. Los pigmentos de los vegetales A13. La estructura foliar
A14. La fotosíntesis
A15. La fotosíntesis (Evidencias experimentales) A16. Factores que influyen en la fotosíntesis
A17. Fotosíntesis y respiración (Parámetros disponibles) A18. Fotosíntesis y respiración (Problemas de medición) A19. Fotosíntesis y respiración (Punto de compensación) A20. Fotosíntesis y producción primaria
LAS PLANTAS Y EL HOMBRE
LAS PLANTAS COMO ALIMENTO
De las 3000 especies de plantas que vienen siendo usadas como alimento por el hombre, el mundo depende de unas 20 para obtener la mayoría de sus proteínas y calorías. Las principales plantas cultivadas son:
Cereales: trigo, arroz, maíz, centeno, avena,
cebada, sorgo.
Leguminosas: arveja, diversos tipos de porotos, soja,
lenteja, garbanzo, cacahuete.
Raíces y tubérculos: papa, cará en Brasil,
batata, mandioca, zanahoria, remolacha.
Productoras de azúcar: remolacha, caña de azúcar.
Frutas y hortalizas: banana, dátil, coco, aceituna, aguacate, mango, fruto del árbol del pan, alcachofa,
brócolis, coliflor, tomate, pimienta, quiabo en Brasil o quimbombó, berenjena, pepino, zapallo.
Considerando la necesidad calórica media y la producción de cereales, algunos autores estimaron el número de personas que pueden ser alimentadas. Los cálculos sugieren que 1 Ha puede abastecer a 14 personas con una dieta exclusivamente vegetariana. Entretanto, el número se reduce a 4 o 5 si la mitad de la dieta proviene de productos animales. Extrapolando los datos para la cantidad de suelo arable y teniendo en cuenta que todo el suelo puede ser utilizado para el cultivo de cereales, los mismos autores calcularon que la Tierra podría mantener aproximadamente 15 billones de personas con una dieta vegetariana o cinco billones con una dieta mixta.
Con el progreso de las tecnologías agrícolas (revolución verde) ha habido un aumento considerable en la cantidad de alimentos. Sin embargo, algunas cifras divulgadas por el CGIAR ( (Consultative Group on International Agricultural Research) nos informan que 2,8 billones de personas sobreviven con menos de 2 dólares diarios, aproximadamente 40.000 personas mueren diariamente de causas relacionadas con el hambre y 180 millones de niños mueren anualmente de enfermedades relacionadas con la falta de vitamina A. A pesar de haber suficiente alimento, la pobreza impide que este llegue a todos los seres humanos.
LAS PLANTAS MEDICINALES
La salud del 75 a 90% de la población rural depende de la utilización de plantas medicinales y, según la OMS (Organización Mundial de la Salud), no es posible ni deseable sustituirlas en los próximos años por medicamentos occidentales.
Algunas de dichas sustancias y su utilización, así como las plantas de las cuales son extraídas, figuran en el cuadro:
Sustancia Utilización Origen
Diosinina Fabricación de anticonceptivos. Especies silvestres de Dioscorea. Vincristina y Vinblastina
(alcaloides)
Tratamiento de leucemia y enfermedad de Hodgkin.
Vinca rósea.
Morfina Anestésico, en hospitales. Amapola o Papaver somnífera. Curare Relajante, en cirugías. Chondrodendrom tomentosum.
Hasta el momento, han sido identificadas 20.000 especies de plantas medicinales. La mitad de las drogas es extraída de plantas silvestres (no cultivadas) y su comercio se calcula en 40.000 millones de dólares. En muchos casos, el principio activo puede ser identificado y sintetizado químicamente. El ácido acetilsalicílico, por ejemplo, un analgésico tradicionalmente extraído de la cáscara del sauce, fue copiado en la fórmula de la aspirina y productos análogos.
LAS PLANTAS INDUSTRIALES
Las plantas industriales productoras de fibras, óleos, perfumes, maderas, etc. tienen un valor incalculable y su comercio internacional representa muchos millones de dólares por año.
Recientemente, algunas plantas comenzaron a ser utilizadas en la industria. Como por ejemplo, algunas especies de Chrysantemum productoras de piretrinas, un producto contra los insectos voladores que, siendo más fuerte que el DDT resulta inocuo para los mamíferos. O como la jojoba (Simmondsia chinensis) que sustituyó al esperma de ballena.
La explotación de maderas tiene un rol importante en la economía de los países tropicales. Muchos árboles son aún utilizados como leña constituyendo un recurso energético básico para muchas poblaciones. Por eso es particularmente grave la destrucción de 11 millones de Ha de bosques y la desertificación de 27 millones de Ha de tierra por año.
Se espera que lo avances de la tecnología permitan la recuperación del suelo, el reforestamiento y la multiplicación de especies productoras de madera o de pulpa de papel.
INVESTIGACIÓN: ¿Cuál es el uso de la soja? ¿Y del algodón? ¿Y del maíz?
LAS PRÁCTICAS AGRÍCOLAS
Las prácticas agrícolas y las plantas que hoy cultivamos se desarrollaron en un período corto de la historia evolutiva de los vegetales.
Poco se sabe del paso de vida nómade del hombre colector y cazador hacia una vida sedentaria que permite el cultivo y la domesticación de plantas y animales. Sin embargo, podemos decir con certeza que las plantas actuales tienen muy poca semejanza con sus ancestros salvajes. En algunas como por ejemplo, el trigo y las leguminosas, el proceso de dispersión de las semillas depende en la actualidad exclusivamente de la actividad humana.
Desde el neolítico hasta el final del siglo XIX, el mejoramiento de las plantas utilizadas por el hombre dependía de aquellos directamente involucrados en su cultivo. En los últimos 100 años, la agricultura pasó por grandes cambios debido al progreso de la genética clásica y la introducción de nuevas prácticas agronómicas (uso de fertilizantes y herbicidas, irrigación, mecanización).
Recientemente, comenzaron a aplicarse técnicas de cultivos de células y tejidos vegetales, que justamente con el uso de algunos de los avances recientes de la ingeniería genética, han facilitado el mejoramiento de las plantas. Esto se volvió mucho más rápido, eficiente y productivo.
Se estima que hasta 2015 habrá un aumento de la población de 2 billones de personas, alcanzando el tamaño de la población el valor de 8 billones de personas. La mayor parte del aumento ocurrirá en los países en vías de desarrollo, donde las poblaciones urbanas se podrán triplicar. El premio Nobel Normal Borlaug calcula que, en 2025, la demanda de alimentos sólo podrá ser satisfecha si la producción media de cereales es 80% mayor que la producción media de 1990. El desafío de erradicar la pobreza suma un nuevo desafío tecnológico: aumentar la producción sin expandir el área de tierra cultivada ni aumentar el consumo de agua y energía (que comienzan a escasear). Las nuevas tecnologías agrícolas tendrán un papel importante que cumplir.
LA EROSIÓN GENÉTICA
La práctica agrícola moderna tiene como consecuencia la uniformización de las cultivos con la consecuente pérdida de diversidad genética. Un arroz de origen filipino, el IR8, por ejemplo, se cultiva desde Taiwan a Benin. Este dato es particularmente impresionante cuando sabemos que en la India existían a comienzos de siglo más de 30.000 variedades nativas de arroz. Se calcula que de aquí a 30 años no habrán más de 50 variedades, siendo 10 de ellas las que cubrirán ¾ partes del subcontinente.
Sabiendo que la uniformidad genética aumenta la vulnerabilidad y las enfermedades, los agrónomos han tratado de diversificar las variedades, incluso dentro de los límites impuestos por la reproducción comercial. En consecuencia, según la WWF (World Wildlife Foundation) unas 40.000 especies vegetales se habrán extinguido entre 1985 y 2050. Este número es mayor que el registrado 65 millones de años atrás en el período cretáceo, cuando ocurrió la mayor extinción conocida de seres vivos.
Un tipo de selección diferente también puede aumentar la erosión genética. Este es el caso de las plantas medicinales e industriales donde muchas de las especies utilizadas no son cultivadas. Las “mejores” plantas son las primeras en ser recogidas mientras que las menos interesantes quedan en el terreno y producen las semillas que darán origen a las próximas generaciones. Se trata de una selección negativa.
LA CONSERVACIÓN DE LA BIODIVERSIDAD
Hoy se admite que existen puntos geográficos en los cuales existe mayor diversidad de plantas cultivadas y silvestres. Generalmente, esos puntos (= centros de diversidad) coinciden con el lugar donde se originó el cultivo. La batata, por ejemplo, se originó en los Andes y, en esas montañas donde fueron cultivadas durante miles de años, encontramos la máxima diversidad.
Las migraciones humanas permitieron la aparición de centros de diversidad secundarios. Pero, es interesante observar que debido a diversos factores, como las glaciaciones, son pocos los centros que se encuentran fuera de una franja limitada por los trópicos y que coincide con lo que hoy denominamos Tercer Mundo. La presión decurrente de expansión del área dedicada a la agricultura constituye una amenaza más para la biodiversidad. En este sentido sería beneficioso disponer de una tecnología agrícola más eficiente.
La conservación de la biodiversidad y de los recursos genéticos va mucho más allá de la salvación de las especies. El objetivo es conservar suficiente diversidad dentro de cada especie como para garantizar que su potencial genético sea usado en el futuro. La producción comercial de tomate, por ejemplo, sería imposible sin la contribución de genes silvestres de América Latina. En este sentido es fundamental la contribución de las nuevas tecnologías para el salvaguardo del germoplasma.
La biodiversidad puede se conservada in situ mediante la protección ambiental de una región determinada. Este método es ideal en el caso de las plantas silvestres, ya que permite mantener la dinámica evolutiva de la especies, pero es caro y desencadena muchas veces conflictos políticos y sociales.
La conservación ex situ involucra la recolección de muestras representativas de una población y su manutención en bancos de germoplasma y/o jardines botánicos, en forma de semillas, estacas, tejidos in
vitro, plantas enteras, etc. El período de conservación depende de la especie y de la técnica utilizada. Este
método se aplica especialmente a las plantas cultivadas que producen semillas. Además de facilitar el acceso a la información de los mejoradores, tiene la ventaja de conservar el material en un espacio reducido y con cuidados intensivos. Por otro lado, congela la evolución natural de las especies y debido a las limitaciones del tamaño de las muestras puede ser insuficiente para conservar los recursos fitogenéticos.
1. GERMINACIÓN Y DESARROLLO
En una semilla encontramos un embrión rodeado por una cantidad variable de albumen (sustancia de reserva) y tegumento. La semilla permanece dormida hasta que las condiciones ambientales resultan apropiadas para la germinación. Factores como la disponibilidad de agua y oxígeno son críticos para el inicio del proceso. La raíz es la primer estructura en emerger de la mayoría de las semillas en germinación, permitiendo que la planta se fije al suelo y absorba agua.
Las semillas parecen aumentar de volumen hasta que el tegumento se rompe. ¿Por qué?¿Cuál es la primer estructura que emerge de la semilla?¿Por qué algunas semillas no germinarán? Dibuje una plantita en detalle indicando el hipocótilo, la raíz, los pelos radiculares y el tallo.
¿Cuándo aparece la clorofila? ¿Cuál es la función primaria de los cotiledones? ¿Cuál es la diferencia entre crecimiento y desarrollo?
Germinación epígea (Poroto)
2. TROPISMOS
2.1. GRAVITROPISMO
Objetivo: estudiar la influencia de la gravedad sobre la dirección del crecimiento de la raíz y del brote, cuando la semilla es plantada en diferente orientación.
Orientaciones posibles del embrión de una semilla de maíz:
Material: (por grupo) 18 semillas de maíz (previamente embebidas), 1 sobre germinador, regla y
transportador .
Procedimiento
a) Distribuir 15 semillas en el sobre germinador, en la dirección correspondiente a su grupo.
b) Después de una semana, retirar 5 semillas y medir el tamaño (regla) y la dirección (transportador) de la raíz y del brote. Registrar los valores en la Tabla 1.
c) Repetir el punto anterior en la segunda y en la tercer semana. d) Anotar los datos en la Tabla 1.
Discusión
¿Cómo interpreta los resultados obtenidos?
La regulación es una característica importante de los seres vivos. ¿Cómo ilustra este experimento dicha propiedad? ¿Debe un agricultor preocuparse por la orientación en que planta las semillas?
Tabla 1: Los datos
Orientación de la semilla: __________________________________
Variable Semana 1 Semana 2 Semana 3 Tamaño de la raíz (mm)
Orientación de la Raíz (0)
Tamaño del brote (mm)
2.2. FOTOTROPISMO
Como la respuesta a la luz, el crecimiento hacia abajo de la raíz y hacia arriba del tallo son comportamientos necesarios para la supervivencia de una planta. En esta actividad intentaremos responder dos cuestiones: ¿Qué estímulo es más fuerte, la luz o la gravedad? ¿Cuáles son los tipos de luz que estimulan una respuesta más fuerte?
Material: Cajas de película de 35 mm opacas o tubos de PVC, tapas, celofán de color, agujereadora, cinta
adhesiva transparente, cinta adhesiva oscura, algodón, gas, semillas de mostaza.
Respuesta al estímulo simultáneo de la luz y de la gravedad
a) Preparar 2 cámaras abriendo una ventana en la parte lateral de la caja como se indica en el esquema.
b) Cubrir las ventanas con celofán transparente. Fijar el celofán con cinta transparente. ¿Por qué? c) Colocar algodón mojado en las tapas y sembrar 3 semillas de mostaza en cada una.
d) Cerrar las cajas y colocarlas en la luz.
e) Tres a cuatro días después abrir la cámara y observar el crecimiento de las plantitas.
Respuesta al estímulo de luces de diversos colores
a) Preparar una cámara abriendo 3 ventanas en la parte lateral de la caja como se indica en el esquema.
b) Cubrir las ventanas con celofán rojo, azul y verde. Fijar el celofán con cinta transparente. ¿Por qué?
c) Colocar algodón o una esponja mojada en las tapas y sembrar semillas de mostaza.
d) Cerrar las cajas y colocarlas en la luz.
e) Una semana después abrir la cámara y observar el crecimiento de las plantitas.
Describa el comportamiento de las plantitas en los dos casos. ¿Cuál de los dos estímulos es más fuerte, la luz o la gravedad? ¿Cuál de los colores estimuló un comportamiento más fuerte? Justifique
3. NUTRICIÓN MINERAL E HIDROPONÍA
Por medio del cultivo en soluciones nutritivas de diferente composición, se pueden investigar cuáles son los elementos químicos indispensables para el desarrollo de una planta. También se pueden estudiar las alteraciones de dicho desarrollo causadas por la falta o cantidad insuficiente de alguno de ellos.
Una solución nutritiva que contenga todos los elementos esenciales es llamada solución completa; en caso contrario, será incompleta, y los vegetales cultivados en ella evidenciarán síntomas de carencia característicos, tales como clorosis, necrosis, deformaciones, raquitismo, etc. Existen diferencias de comportamiento, dependiendo de las especies vegetales, tanto en la forma en que se presentan los síntomas de carencia, como en la tolerancia a la misma.
En esta actividad, serán testeadas plantas jóvenes de tomate, maíz, girasol y/o Tradescantia , para la observación del comportamiento de las mismas en soluciones completas e incompletas.
Material: una vez leída y analizada cuidadosamente la información complementaria, cada grupo
preparará la lista correspondiente.
Procedimiento
a) Preparación de las soluciones nutritivas. Utilizando la información de la tabla anexa, cada grupo preparará los 4 tipos de soluciones (solución completa, solución carente de hierro, solución carente de potasio y solución carente de nitrato). Los frascos serán tapados, etiquetados y conservados en la heladera envueltos en papel de aluminio.
Tabla: Composición de las soluciones nutritivas
Sustancia Medio completo Ausencia de fosfato Ausencia de potasio Ausencia de nitrato Agua destilada 1 L 1 L 1 L 1 L Nitrato de potasio 1 g 1g - - Nitrato de sodio - - 1 g - Cloruro de potasio - 1g - 1g Fosfato de potasio 0,5 g - 0,5 g Fosfato de sodio - - 0,5 g - Sulfato de calcio 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g Sulfato de magnesio 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g Cloruro de hierro 0,05 g 0,05g 0,05 g 0,05 g
Armado del experimento. Envuelva con algodón la región mediana de la planta (Figura 1), colóquela en el frasco junto con un tubito y ciérrelo. No deje que el algodón toque la solución (Figura 2). Coloque los frascos en un ambiente iluminado.
b) Mantenimiento de los cultivos. Será realizado durante 1 mes, aireando frecuentemente (con una bomba de pecera) y cambiando las soluciones 1 vez por semana.
c) Seguimiento del experimento. 1 vez por semana anotando las observaciones sobre el desarrollo de las plantas.
d) Organizar las observaciones en la tabla.
DÍA SOLUCIÓN
COMPLETA SIN FOSFATO SIN POTASIO SIN NITRATO
¿Cuándo y cómo aparecen los primeros síntomas de deficiencias? ¿Cuáles son esos síntomas?
Discusión
¿Cuál es el significado del rótulo NPK en los fertilizantes comerciales?
¿Cuál es el papel de cada nutriente inorgánico esencial en el metabolismo y en la estructura de las plantas?
4. MICROPROPAGACIÓN DE TEJIDOS VEGETALES
Algunas plantas superiores pueden multiplicarse o propagarse por vía vegetativa, por ejemplo, a través de mudas, estacas, gemas o injertos. Las plantas hijas, que se desarrollan a partir de regiones vegetativas, son idénticas a la planta madre y entre sí, ya que son transplantadas de un mismo individuo. Un grupo de individuos como este, genéticamente uniforme y derivado de un único individuo por propagación asexuada, es denominado “clon”.
Las técnicas de propagación tradicional pueden ser realizadas en el laboratorio, en una escala en miniatura y en condiciones asépticas. La propagación clonal in vitro es denominada micropropagación. Además de la capacidad de las plantas para multiplicarse rápido, la micropropagación también ofrece un medio de eliminación de muchas enfermedades en las plantas cultivadas. Las principales aplicaciones de la micropropagación se encuentran en el cultivo de plantas ornamentales y hortalizas, y también en la silvicultura.
La técnica de cultivo de tejidos vegetales está basada en el concepto de totipotencia, es decir la capacidad de una célula de regenerar nuevas réplicas del mismo organismo, completo y diferenciado, del cual proviene. Las células de las plantas en fases relativamente tempranas de desarrollo, tales como algunas células de parénquima o de los meristemas, tejidos de tipo vascular y tejidos embrionarios se encuentran en un estado que denominamos “indeterminado”. Estas células son capaces de modificarse hacia otras vías metabólicas de desarrollo, dependiendo de las condiciones ambientales que se les imponen. También pueden proliferar rápidamente (des-diferenciarse) para producir masas celulares o callos.
Las células vegetales indeterminadas presentan mucha plasticidad en su respuesta a estímulos fisiológicos y ambientales. Esta característica puede atribuirse, en las plantas vasculares, a la necesidad de responder de manera versátil al ataque de herbívoros, plagas y patógenos. En el caso de las plantas perennes, esta característica permitiría la supervivencia a través de la propagación vegetativa cuando las condiciones ambientales se tornan desfavorables.
Una vez establecidos, los cultivos pueden ser utilizados en:
Técnicas básicas de propagación (organogénesis, embriogénesis, cultivo de brotes apicales y axilares). Técnicas especializadas (producción de metabolitos secundarios, bioensayos, aislamiento y fusión de
protoplastos, transformación genética o producción de nuevas variedades vegetales).
Además de permitir la micropropagación y facilitar el mejoramiento vegetal, las técnicas de cultivo de tejidos vegetales han posibilitado la eliminación de enfermedades (ej.: papa) y la producción de metabolitos secundarios (ej. : shikonina), logros de gran importancia desde el punto de vista industrial.
4.1. DIFERENTES TIPOS DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
Cultivo de plantas enteras
La semilla es cultivada in vitro dando origen a una plántula que se transformará en una planta (Ej.: orquídeas). En el caso del CULTIVO DE EMBRIONES, el embrión, maduro o inmaduro, es cultivado in vitro después de que se retira el resto de la semilla. Ej.: cebada, centeno, poroto, manzana, cereza, tomate, etc.
Cultivo de órganos aislados
Generalmente, se aisla y cultiva un trozo de la planta (= explante). El explante puede ser extraído de un tejido o un órgano. Ej.: meristemas, gemas o brotes, raíces, anteras, etc.
Un brote de aproximadamente 1 mm o más de ancho se inserta en el explante o meristema apical, los primordios foliares y el tejido caulinar subapical; por ello el cultivo de brotes ha sido utilizado para la propagación rápida de muchas plantas de importancia económica.
Cuando se limita el explante al meristema apical o de la raíz, la técnica permite la eliminación de virus y patógenos. Por ello, los brotes derivados de los cultivos de meristemas apicales han sido usados para preservación de germoplasma y la producción de estacas libres de virus.
Cultivo de callos
Denominamos callo a una masa de células que crece a partir de un explante; el callo está formado por células vacuoladas irregularmente diferenciadas entre las cuales se observan algunas células meristemáticas.
Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede ser subdividido cada tres o cuatro semanas y mantenido indefinidamente en el mismo medio nutritivo. Las subdivisiones también pueden ser transferidas a medios de cultivo con diferentes concentraciones de hormonas, para inducir la embriogénesis o la organogénesis.
Una característica del cultivo de callos es que a medida que las células proliferan, pueden ocurrir cambios genéticos tales como poliploidía, aneuploidía y cambios en la estructura cromosómica (variación somatoclonal). A pesar de haber más variaciones en dichas células del callo que en las plantas regeneradas a partir de ellas, se han obtenido mediante esta técnica nuevas variedades de plantas con característica útiles.
Aplicaciones: dendé, zanahoria, tomate, maíz, papa, batata (boñato), ñame.
Cultivo de células aisladas
Una suspensión que contiene células aisladas y pequeños agregados celulares puede obtenerse colocando un callo en medio líquido e incubándolo en agitación (shaker). A medida que se forman nuevas células, la agitación las separa del callo.
Como las células cultivadas son genéticamente inestables se puede hacer una selección para obtener linajes celulares diferentes. Además del aislamiento de mutantes, el cultivo en medio solidificado con agar, de células aisladas y de pequeños agregados, permite estudios sobre la tolerancia al estrés y variación somatoclonal.
Aplicaciones: producción de metabolitos secundarios en fermentadores industriales (alcaloides, perfumes, enzimas, hormonas, etc.); estudio de organelas celulares y embriogénesis.
En el cultivo de protoplastos, las células que sufren digestión enzimática de la pared son cultivadas y utilizadas en experimentos de Ingeniería genética. La fusión de protoplastos posibilita la hibridación somática; la tecnología de ADN recombinante permite combinaciones genéticas nuevas.
4.2. FUNDAMENTOS TÉCNICOS
Para los técnicos, el cultivo de tejidos puede ser definido como “un proceso a través del cual, pequeños fragmentos de tejido vivo (explantes) son aislados de un organismo y cultivados asépticamente, por períodos indefinidos en un medio nutritivo semi-definido o definido”. Así como el medio nutritivo y los factores fisiológicos de crecimiento, determinadas características del material experimental (es decir, el tipo de planta estudiada) pueden influir en el crecimiento y desarrollo in vitro de un explante.
Las principales etapas son las siguientes: SEPARACIÓN DE LOS EXPLANTES
ESTERILIZACIÓN DE LA SUPERFICIE
VARIOS LAVADOS EN AGUA DESTILADA
DISECCIÓN FINAL Y ESTABELECIMIENTO DEL CULTIVO
INCUBACIÓN
SUBCULTIVO O REPIQUE
4.2.1. SELECCIÓN DEL MATERIAL EXPERIMENTAL
Las principales características del material experimental que influyen sobre el crecimiento in vitro son el genotipo, la edad de la planta, órgano y/o tejido, el estado fisiológico, el estado de salud, las condiciones en que la planta creció en el campo, el tamaño y la posición del explante en la planta y la posición del explante en el cultivo.
4.2.2. LA SEPARACIÓN DEL EXPLANTE
Piérik (1988), Dodds y Roberts (195) y Smith R.A. (1997) describieron las siguientes etapas:
LIMPIAR: con agua y detergente, eliminando la parte externa si esto fuera necesario; DESINFECTAR
Sumergir la pieza en etanol 70% durante algunos segundos para eliminar las burbujas. Evitar el uso de
etanol 96% que produce deshidratación de los tejidos.
Sumergir 10-30 minutos en NaClO 1% con algunas gotas de detergente (0,08 a 0,012%), manteniendo la agitación; (Observación: El agua lavandina (lejía) contiene generalmente concentraciones de 1,5 a 2% de materia activa o NaClO).
Observación: Como algunos autores relatan que basta una concentración de 20% de agua lavandina (lejía) para la obtención de un alto porcentaje de plantas decontaminadas, podríamos considerar que la concentración adecuada de agua lavandina como agente desinfectante estaría entre 20 y 50%. Sin embargo, en diferentes países, existen variaciones en la concentración de NaClO presente en al agua lavandina (lejía). Cabe recordar aquí que el tiempo de desinfección y la concentración del desinfectante varían con el tipo de explante.
LAVAR: 3 veces en agua de grifo estéril durante 2, 5 y 15 minutos;
CORTAR EL MATERIAL: en condiciones estériles, utilizando instrumentos esterilizados antes de iniciar el trabajo (para eliminar esporas); durante el trabajo las condiciones estériles son mantenidas sumergiéndolos en etanol 95%; el flameado sólo debe ser utilizado con mucho cuidado y cuando se trabaja en mesada abierta.
4.2.3. COMPOSICIÓN DEL MEDIO NUTRITIVO
Los principales nutrientes necesarios para el crecimiento del explante figuran en el cuadro siguiente: A AGUA
SUSTANCIAS ORGÁNICAS: Azúcares, Aminoácidos, Vitaminas, Reguladores: auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abcísico, etileno.
MACRO ELEMENTOS: N, P, K, Ca, Mg, S
MICRO ELEMENTOS: Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I.
MEZCLAS DE SUSTANCIAS POCO DEFINIDAS: Extracto de levadura, Leche de coco, Extractos vegetales, Hidrolizado de caseína, Peptona y triptona.
Un explante necesita básicamente agua, azúcar y sales minerales. El agua debe ser destilada o bi-destilada. El azúcar puede ser sacarosa (c = 0 2 a 3%), glucosa o fructosa y debe agregarse a los medios nutritivos porque los tejidos verdes no son suficientemente autotróficos in vitro. Los minerales también son indispensables y se agregan a los medios a partir de soluciones madres de macro y micro-sales. A pesar de que la mayor parte de las plantas son capaces de sintetizar vitaminas in vitro, a veces estas son agregadas al medio. También se agregan mezclas de composición mal definida como leche de coco, peptona o extracto de levaduras como fuente de nitrógeno y vitaminas.
Las hormonas regulan la distribución de sustancias elaboradas por la planta así como el crecimiento relativo de sus órganos. En los cultivos in vitro se acostumbra usar los siguientes:
HORMONAS EFECTO EJEMPLOS AUXINAS Alargamiento celular y expansión de los tejidos, división
celular y formación de callos, formación de raíces adventicias, inhibición de la formación de vástagos axilares y adventicios y, frecuentemente, embriogénesis en los cultivos en suspensión.
IAA, IBA, NAA, 2,4 D
CITOCINAS Diminuyen la dominancia apical estimulando la formación de vástagos axilares; retardan el envejecimiento.
Cinetina, BA, 2iP e PBA
IAA: ácido indol-acético; NAA: ácido naftaleno-acético; 2,4 D: ácido 2,4- diclorofenoxiacético; cinetina 2iP: 2-isopentiladenina; PBA: benzilaminopurina
Los medios pueden ser solidificados con agar en una concentración de 0,6 a 0,8%. El pH debe variar entre 5 y 6,5 siendo ideal el valor de pH = 6. El medio debe ser autoclavado para su esterilización. Si es necesario, algunos de los componentes son esterilizados por filtración. En el anexo figura la composición de algunos de los medios más utilizados en los cultivos in vitro de tejidos vegetales.
Cuando no se conoce la fórmula ideal para determinado cultivo, un diseño experimental permite escoger la mejor concentración de los componentes de un medio. En este diseño, 4 grupos de sustancias (azúcares, macro-sales, auxinas y citoquininas) varían en 3 concentraciones (baja, media, alta) como se indica en el cuadro.
SUSTANCIA CONCENTRACIÓN Pueden obtenerse así 34=81 combinaciones de
las cuales será escogida la que presente mejores resultados.
Analice la composición de algunos medios usuales, que figuran en la página siguiente
AZÚCAR (sacarosa) 1-2-4% MACRO-SALES (MS) 1:4; 1:2 ; 1:1
AUXINA 0,01-0,5-5 mg/l CITOCININA 0,01-0,5-5,0 mg/l
4.2.4. INFLUENCIA DE ALGUNOS FACTORES FÍSICOS
Generalmente los cultivos son incubados con luz artificial, ya que la necesidad de luz es variable hasta para la germinación de las semillas. Poco se sabe sobre la duración del día in vitro, pero generalmente se elije un período lumínico de 14-16 horas o continuo. La temperatura se conserva entre 24 y 26 ºC aceptándose que la temperatura ideal in vitro es 3 a 4 ºC mayor que in vivo. Debido a la propia composición del medio, ni la humedad ni la disponibilidad de agua son factores limitantes y la humedad relativa alcanza 90-100%. Finalmente, se debe garantizar la aireación para una buena oxigenación.
4.3. ESTABELECIMIENTO Y MANTENIMIENTO DE LOS CULTIVOS
Mantell et al. (1994) definen al cultivo de tejidos como “un proceso a través del cual pequeños fragmentos de tejido vivo (explante) son aislados de un organismo y cultivados asépticamente, por períodos indefinidos en un medio nutritivo semidefinido o definido”.
Vimos anteriormente como explantes adecuados (gemas, tejidos de reserva, secciones del callo o semillas en germinación) pueden ser limpiados, desinfectados, lavados y disecados antes de ser colocados en el medio de cultivo de composición adecuada y en estado semisólido o líquido. A intervalos frecuentes se preparan los sub-cultivos mediante subdivisión de un cultivo madre único en varios cultivos hijos.
4.4. ¿CÓMO PASAR DEL CULTIVO IN VITRO A TIERRA?
Para el desarrollo de la planta puede ser necesario la transferencia a otro recipiente con un medio nutritivo de composición igual o diferente. Algunas veces son necesarios varios de estos repiques para regenerar una planta a partir de un callo.
Se trata de una etapa delicada, porque en algunos aspectos las plantas cultivadas in vitro son diferentes a las plantas cultivadas in vivo. La cutícula (cera) está poco desarrollada, las hojas son fotosintéticamente poco activas y puede haber una conexión vascular débil entre las hojas y la raíz. Son plantas criadas como heterótrofas que se deben adaptar al modo de vida autótrofo.
Cuando el desarrollo de la planta justifica su traspaso a tierra, se debe eliminar el agar y todo vestigio de azúcar y transferir la planta a un suelo estéril finamente tamizado y pobre en sales. La aclimatación es una etapa que debe ser acompañada muy de cerca.
5. CRECIMIENTO in vitro DE EMBRIONES DE MAÍZ
El maíz (Zea mays) es un cereal de la familia Graminaceae originaria del continente americano y actualmente cultivado en casi todo el mundo.
Como en todas las monocotiledóneas, el cotiledón tiene como función la transferencia de nutrientes del endosperma a la plántula en desarrollo. En el cultivo in vitro, el medio nutritivo sustituye al endosperma, ya que el embrión es retirado junto con el cotiledón.
En Biotecnología vegetal, esta modalidad de cultivo in vitro permite rescatar embriones híbridos, resultantes de cruzamientos incompatibles. También se utiliza para sacar de la dormición a las semillas acortando así el ciclo de vida de algunas plantas. Se trata de un buen modelo para estudios fisiológicos ligados a la germinacion de las semillas y al desarrollo de las plántulas.
Así como otros órganos de las plantas, los embriones pueden ser cultivados en un medio nutritivo que contiene agua, sales minerales, azúcar y agar.
Materiales: 1 trozo de espiga de maíz, tubos de ensayo con medio nutritivo* estéril, 1 cuchillo o 1 bisturí,
palitos estériles, agua lavandina diluida al medio, 3 frascos de agua destilada estéril, alcohol 960, alcohol
700, mechero Bunsen (opcional). Los alumnos trabajarán en parejas.
* El medio nutritivo (Murashige & Skoog, Taji o Knop) es una solución de sales minerales a las que se agrega sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco.
Procedimiento
La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 700. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los
antebrazos con agua y jabón, antes de pasarse alcohol 700. Cuidado! El alcohol es inflamable.
Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.
1. Desinfección de los explantes
o Separar con un cuchillo los granos de maíz.
o Desinfectar los granos con la solución de agua lavandina (15 minutos), agitando suavemente. o Lavar los granos tres veces con agua destilada estéril (1, 3 y 5 minutos)
2. Extracción del embrión
o Cerca del mechero Bunsen y con mucho cuidado, presionar suavemente el grano de maíz para facilitar la salida del embrión. o Tomar el embrión con un palito estéril
(Participante A). El procedimiento puede ser visto en el video Extracción y sembrado del
3. Sembrado del embrión
o Abrir el tubo de ensayo que contiene medio de cultivo estéril y flamear la boca del tubo (Participante B).
o Dejar caer el embrión dentro del tubo (Participante A).
o Flamear nuevamente la boca del tubo y cerrarlo (Participante B).
o A continuación, verificar que el embrión se encuentre en contacto con el medio. Se no queda así, agitar suavemente el tubo de modo de acomodar el embrión en el medio.
4. Incubación
En presencia de luz, a temperatura ambiente. 5. Establecimiento del cultivo
Resultados
Seguir semanalmente midiendo la altura (mm) del epicótilo.
Semana 1 2 3 4
Altura del epicótilo (mm)
Representar gráficamente la altura (mm) del epicótilo en función del tiempo. Interpretar los datos.
6. EL CULTIVO DE CALLOS DE ZANAHORIA
El consumo de la raíz de zanahoria (Daucus carota, familia Apiaceae ) data del tiempo de los Romanos. Documentos del período medieval muestran que las zanahorias eran blancas o rojas. En el siglo XVI, una mutación dio origen a una variedad de color naranja, seleccionada por los horticultores holandeses como homenaje a la casa de Orange. Hoy en día esa variedad es la que se encuentra con mayor frecuencia. En 1958, cultivando explantes de zanahoria en agua de coco, dentro de un dispositivo rotatorio, F.C. Steward mostró la totipotencia de las células vegetales. Ese trabajo innovador abrió las puertas al cultivo de tejidos vegetales y a la regeneración de plantas modificadas por ingeniería genética.
Muchas de las plantas cultivadas pueden ser propagadas directamente por multiplicación vegetativa. Sin embargo, los explantes de raíz colocados en un medio con los nutrientes adecuados pueden dar origen a un callo, que es una masa de células no diferenciadas. En el callo aparecen eventualmente embrioides que pueden ser transferidos a un medio de diferente composición, donde se desarrollarán regenerando una planta entera.
Un corte longitudinal de zanahoria (Figura 1) muestra una epidermis fina con pelos radiculares, el córtex de tejidos fundamentales y el endodermo. El cilindro vascular está rodeado por el periciclo, que forma las raíces laterales. Dentro se encuentran los vasos del xilema y del floema y tejido parenquimatoso.
Figura 1. Corte longitudinal de raíz de zanahoria
Objetivo: Cultivar explantes de tejidos de zanahoria, in vitro.
Materiales
Zanahoria, cuchillo, azulejo, frasco desinfectante con agua lavandina 50%, 3 frascos con agua estéril, pinzas, papel toalla, vaso de precipitados con alcohol 95º, dos placas de Petri con papel toalla estéril, 4 frascos con medio nutritivo estéril*, palitos estériles, alcohol 70º, mechero Bunsen (opcional).
* El medio nutritivo (Murashige & Skoog o Taji) es una solución de sales minerales a las que se agrega sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco.
Pelos radiculares Cilindro vascular Exoderme Córtex Endoderme
Procedimiento
La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70º. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los
antebrazos con agua y jabón, antes de pasarse alcohol 70º. Cuidado! El alcohol es inflamable. Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.
1. Esterilización de la superficie de la zanahoria
o Sobre un azulejo bien limpio, cortar con un cuchillo un trozo de zanahoria de 3 a 6 cm, descartando ambas extremidades de la raíz.
o Raspar para retirar la epidermis y marcar con algún corte la extremidad inferior de la raíz.
o Desinfectar durante 20 a 30 minutos en agua lavandina (hipoclorito de sodio) diluida al medio (50%) y con una gota de detergente.
o Lavar 3 veces en agua estéril durante 1, 3 y 5 minutos, teniendo la precaución de limpiar previamente el frasco y la tapa con alcohol.
o Agitar suavemente durante todo el procedimiento.
2. Obtención de los explantes
o Siempre en condiciones asépticas, transferir el trozo de zanahoria a una placa de Petri con papel toalla estéril para eliminar las partes quemadas, con un cuchillo o bisturí estéril.
o Transferir nuevamente el trozo de zanahoria a una segunda placa de Petri con papel de filtro estéril y cortar una rodaja fina de 1 a 2 mm de espesor.
o Separar el cilindro vascular y cortarlo en 4 partes, como se indica a continuación: o
Descartar Conservar Descartar
3. Establecimiento del cultivo
En condiciones asépticas, sembrar los cuatro explantes manteniendo la polaridad, en los frascos con medio nutritivo.
4. Incubación
A 25 0 C, en la oscuridad.
5. Subcultivo o repique
Siempre en condiciones asépticas, descartar mensualmente el tejido necrosado y transferir los explantes a medio nuevo. Después de un tiempo, transferir los explantes a un medio nutritivo con sales minerales y sin agua de coco, e incubar en presencia de luz.
Resultados
7. EL CULTIVO DE MERISTEMAS DE AJO
El ajo (Allium sativum, familia Amaryllid aceae) es una monocotiledónea originaria de Asia. El bulbo, o cabeza, está formado por bulbillos o dientes de ajo (Figura 1). Debido a las propiedades aromáticas conferidas por la alicina, dichos bulbillos se han convertido en un condimento indispensable en la cocina de varios pueblos.
Con algunas propiedades antimicrobianas, el ajo también es utilizado en la medicina popular para el control de la presión sanguínea, del colesterol, de enfermedades coronarias y de la aterosclerosis. La propagación es asexual, a partir de los bulbillos. En el ajo-semilla se consigue eliminar los virus por cultivo in vitro de los meristemas próximos al disco caulinar basal. Existen diversas estrategias de mejoramiento genético, basadas en la información existente en los Bancos de Germoplasma.
Figura 1. EL AJO alho (Allium sativum).
Arriba: corte de la cabeza de ajo; abajo: corte longitudinal de un diente de ajo, mostrando el disco caulinar basal.
Materiales
Un diente de ajo, bisturí o cuchillo afilado, azulejo, frasco desinfectante con agua lavandina diluida al medio, 3 frascos con agua destilada estéril, pinzas, papel toalla, una placa de Petri con papel toalla estéril, 4 frascos con medio nutritivo estéril *, palitos estériles, alcohol 700, mechero Bunsen (opcional).
El medio nutritivo es una solución de sales minerales a las que se agrega sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco.
La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 700. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y
jabón, antes de pasarse alcohol 700. Cuidado! El alcohol es inflamable.
Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.
Disco caulinar basal
1. Separación de los explantes
Descascar el bulbillo (diente de ajo) y cortar toda la parte seca de la base, como se observa en la figura de abajo.
2. Desinfección de la superficie de los explantes
Esterilizar el bulbillo por inmersión, durante 20 minutos, en agua lavandina diluida al medio adicionada con una gota de detergente.
3. Lavados en agua destilada estéril
Realizar 3 lavados de 1, 3 y 5 minutos, agitando suavemente.
4. Establecimiento del cultivo
o En condiciones asépticas, colocar los dientes de ajo en una placa de Petri que contiene papel toalla estéril.
o Con un bisturí afilado, separar una lámina de 2 mm del disco basal y cortarlo al medio.
o Transferir los dos explantes al frasco con medio de cultivo estéril, manteniendo la polaridad de uno de los fragmentos e invirtiendo la del otro.
5. Seguimiento
8. LA ABSORCIÓN DE AGUA
La embebición consiste en la absorción de agua por las células, debido al poder higroscópico de los coloides existentes en el protoplasma.
En esta actividad estudiaremos la variación de peso y superficie de fragmentos de algas debido a la embebición en diferentes condiciones.
8.1. INFLUENCIA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
Material (por grupo): kombu, tijeras, 5 placas de Petri, agua destilada, 100 mL de c/solución de NaCl (5,0
M, 2,0 M, 1 M, 0,5 M), papel milimetrado, papel de filtro, papel manteca, espátula, balanza.
a) Cortar 15 cuadraditos de 2 cm de lado de "kombu"; b) Dividir los cuadraditos en 5 grupos y pesarlos;
c) Colocar el primer grupo en una placa de Petri con 20 ml de agua destilada, el segundo grupo en 20 ml de NaCl 0,5M, el tercer grupo en 20 ml de NaCl 1,00 M y el cuarto grupo en 20 ml de NaCl 2,0 M, el quinto grupo en NaCl 5,0 M. Dejar en reposo dos horas;
d) Determinar la variación de peso (referido al 100%) y de la superficie del material; e) Después de anotar los datos, construir el gráfico correspondiente.
CONCENTRACIÓN DE NaCl 0 0,5 M 1 M 2 M 5 M SUPERFICIE INICIAL (mm2) SUPERFICIE FINAL (mm2) VARIACIÓN DE SUPERFICIE (%) MASA INICIAL (mg) MASA FINAL (mg) VARIACIÓN DE PESO (%)
8.2. INFLUENCIA DEL pH
Material: kombu, tijeras, 9 placas de Petri, agua destilada, 100 mL de solución de NaOH 0,1 N, 100 mL de
solución HCl 0,1 N, probetas y pipetas, papel indicador de pH, papel milimetrado, papel de filtro, papel manteca, espátula, balanza.
a) A partir de soluciones 0,1 N ya existentes, preparar 20 ml de cada una de las siguientes soluciones de NaOH y HCl: 0,01, 0,001 y 0,001 N;
b) Colocar en diferentes placas de Petri, 20 ml de cada una de las soluciones indicadas anteriormente. En otra placa colocar 20 ml de agua destilada. Determinar el pH de cada solución usando papel indicador universal;
c) Preparar 9 lotes de Kombu, cada uno con 3 cuadraditos de 2 x 2 cm de peso conocido. Colocar un lote en cada placa de Petri;
d) Luego de aproximadamente una hora verificar las variaciones de peso y de superficie de los cuadraditos.
CUIDADOS: Remover los cuadraditos con espátula. Secarlos rápidamente antes de pesarlos, entre dos hojas de papel de filtro. Usar papel manteca para pesarlos. Para verificar las variaciones de superficie, colocar papel milimetrado sobre la placa de Petri.
e) Anotar los datos en la tabla:
SOLUCIONES SUP. INICIAL (mm2) SUP. FINAL (mm2) MASA INICIAL (mg) MASA FINAL (mg)
HCl 0,1 N HCl 0,01 N HCl 0,001 N HCl 0,0001 N H2O NaOH 0,0001 N NaOH 0,001 N NaOH 0,01 N NaOH 0,1 N
Con los datos obtenidos construya una curva cuyo eje de las ordenadas corresponda a las variaciones de peso y el de las abcisas a los valores de pH. Interprete.
9. LA ESTRUCTURA DE LA RAÍZ Y DEL TALLO
9.1. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE PREPARADOS LISTOS
9.2. LA RAÍZ
Observe la variación morfológica de las raíces y complete el cuadro siguiente:
PLANTA TIPO DE RAÍZ CARACTERÍSTICA PRINCIPAL
9.3. EL TALLO
Observe los diversos tipos de tallo y complete el cuadro siguiente:
10. TRANSPORTE A TRAVÉS DEL TALLO
El agua y las sales minerales suben por las raíces y las hojas y desde ahí se dirigen a todas las partes de la planta. Resulta un hecho sorprendente que columnas de agua puedan subir 10 metros o más a través del tronco de un árbol muy alto. La cantidad de agua transportada y la velocidad con que se realiza el transporte dependen de varios factores externos e internos. El más importante de los factores internos es la estructura anatómica.
Utilizando sus conocimientos sobre la estructura del tallo, explique por qué la remoción de una parte circular de la corteza del un árbol podrá resultar en la muerte del mismo.
En los vegetales circulan dos tipos de savia que son de composición química diferente. Mencione las sustancias que componen cada una de ellas.
Varias teorías intentan explicar el ascenso de la savia bruta por la planta. Comente las causas que se consideran actualmente como responsables de dicho ascenso.
EL ASCENSO DE LA SAVIA (OBSERVACIÓN)
Material: 2 frascos de 100 mL, solución de azul de metileno a 0,1%, solución de eosina a 0,1%, hoja de
afeitar, recipiente con agua, portaobjetos y cubreobjetos, microscopio, plantas de tallo herbáceo envasadas.
Procedimiento
a) Colocar, en un frasco, un poco de la solución de eosina y, en otro, la de azul de metileno.
b) Tomar una planta herbácea y, con las raíces y parte del tallo sumergido en un recipiente con agua, seccionar transversalmente la región entre la raíz y el tallo, con una hoja de afeitar.
c) Dejar la planta en posición vertical, dentro del recipiente. Cuidado en no mojar las hojas. d) Repetir el procedimiento anterior con otra planta de igual tamaño.
e) Retirar las dos plantas del recipiente, cuidadosamente, en posición vertical, sumergiendo la extremidad seccionada de cada una en la solución de cada frasco (una en la solución de eosina, la otra en la solución de azul de metileno).
f) Observar y anotar el tiempo de ascenso de las soluciones en cada planta hasta llegar a las hojas. g) ¿Cuál de las soluciones sube más rápido?
Se sabe que la celulosa, en contacto con el agua, presenta carga eléctrica negativa en su superficie. El azul de metileno tiene carga eléctrica negativa, y la eosina tiene carga positiva. Considerando estos hechos, explique por qué ocurre una diferencia de velocidad en el ascenso de las soluciones usadas.
h) Utilizando los tallos del experimento, realizar cortes transversales y longitudinales, colocándolos sobre el portaobjetos con agua y observando al microscopio, para comprobar el ascenso de la savia hasta las hojas.
11. LA TRANSPIRACIÓN
11.1. DETECCIÓN DE LA TRANSPIRACIÓN
Después de leer atentamente las instrucciones preparar una lista y separar el material necesario.
Preparación del papel de cobalto; cortar tiras de papel de filtro de 2 x 6 cm, sumergirlas en solución acuosa de CoCl2 5 %; colocarlas estiradas sobre una placa
de vidrio y ponerlas en la estufa a 80. Una vez secas, guardarlas en un desecador.
a) Tomar cintas de papel de cobalto secas (color azul) y colocarlas en contacto con la epidermis inferior y superior de varias hojas. Esto se hace con ayuda de una madera (pinza de ropa).
b) Examinar las hojas y anotar el tiempo necesario para que cambie el color original del papel de cobalto.
Organice sus resultados en una tabla.
11.2. LOS ESTOMAS Y LA TRANSPIRACIÓN
La estructura de las hojas favorece la pérdida de agua por evaporación. Los estomas son estructuras foliares que se abren y cierran permitiendo la modulación de la transpiración. En esta actividad verificaremos el grado de apertura estomática en hojas de diversos tipos.
Después de leer atentamente las instrucciones, preparar una lista y separar el material necesario.
a) Separar los siguientes líquidos: éter de petróleo, xilol, alcohol etílico absoluto, vaselina líquida. Estos líquidos tienen la capacidad de infiltrarse a través de las hendiduras estomáticas, y la serie indicada esta dispuesta de acuerdo con su capacidad decreciente de penetración a través de hendiduras pequeñas (orden creciente de viscosidad).
b) Tomar hojas de la planta de la cual se quiere verificar el grado de apertura estomática, y depositar sobre la misma una pequeña gota de uno de los líquidos indicados, observando inmediatamente. Si hubiera infiltración, deberán aparecer manchas que se verán a contra luz.
Notación para el grado de apertura: - = infiltración nula
+ = infiltración dudosa o débil (puntuaciones raras) ++ = infiltración reducida (puntos dispersos )
+++ = infiltración regular (manchas pequeñas e interrumpidas) ++++ = infiltración intensa (manchas completas)
c) Anotar los datos en las tablas:
Fecha: Hora: Temperatura: Humedad relativa:
PLANTA EPIDERMIS ÉTER XILOL ALCOHOL VASELINA Superior
Inferior
Fecha: Hora: Temperatura: Humedad relativa:
PLANTA EPIDERMIS ÉTER XILOL ALCOHOL VASELINA Superior
Inferior
Fecha: Hora: Temperatura: Humedad relativa:
PLANTA EPIDERMIS ÉTER XILOL ALCOHOL VASELINA Superior
Inferior
Compare sus resultados con los obtenidos en la actividad anterior. Realice la crítica del método. ¿Este método es aplicable a todas las plantas?
Complemente esta actividad con la observación microscópica de preparados.
11.3. MEDICIÓN DE LA TRANSPIRACIÓN
11.3.1. MÉTODO DE LA BALANZA
Material (por grupo): plantas envasadas (varias especies), cordón. Para la clase: balanza.
Cada grupo trabajará con un tipo de planta.
Procedimiento
a) Tarar la balanza.
b) Retirar una hoja de una de las plantas envasadas y pesarla lo más rápido posible. Anotar el valor en el cuadro que siguiente.
c) Atar, con un cordón, el pecíolo de la hoja y sostenerlo, de modo que ambas caras tengan las mismas condiciones de aireación. No debe haber incidencia directa de luz solar sobre la hoja.
d) Hacer lo mismo con una hoja de cada una de las otras plantas (siempre una por vez);
e) Pesar, de 10 en 10 minutos, las hojas utilizadas en el experimento, teniendo cuidado de retirar, previamente, el cordón;
Planta: Tiempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 Masa (mg) Planta: Tiempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 Masa (mg) Planta: Tempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 Massa (mg)
g) Construir un gráfico con los datos obtenidos. h) Interpretar.
¿Cuál de las plantas transpiró más en el mismo lapso de tiempo? ¿Qué causas podrían ser consideradas como responsables de una mayor o menor intensidad de transpiración en las plantas utilizadas?
11.3.2. FOTOMETRÍA
Material (por grupo): 1 erlenmeyer, plastilina, parafina, algodón, espátula, un tubo de vidrio curvado en
90·, mechero Bunsen, rama de arbusto con varias hojas, foco de luz.
Procedimiento
a) Llenar, completamente, el frasco con agua;
b) Colocar una rama en uno de los orificios de la tapa y en el otro, la pipeta; c) Tapar el frasco. No debe haber ninguna burbuja de aire en todo el conjunto;
d) Secar los orificios y el borde de la tapa, y cerrarlos con algodón y con parafina derretida, o con plastilina.
e) Marcar el nivel de agua en la pipeta e iluminar la planta; f) Observar el descenso del nivel del agua en la pipeta.
¿Por qué las hojas de la rama usada en el experimento no deben estar mojadas? ¿Qué conclusiones pueden obtenerse con respecto de este experimento?
MONTAJE OTRO MONTAJE ALTERNATIVO
11.4. GUTACIÓN (demostración)
Material: 3 plantas jóvenes de maíz (de 6 a 8 días),
envasadas, cuyo suelo esté bien seco, agua de grifo de 35 a 40C, agua de grifo a 0C, termómetro, 3 frascos de boca ancha.
Procedimiento
a) Etiquetar cada uno de los vasos que contienen las plantas con las siguientes indicaciones: A = solo seco; B = agua de 35 a 40C; C = agua a 0C
b) Regar, abundantemente, los vasos II y III con agua a las temperaturas indicadas; c) Cubrir cada una de las plantas con un frasco invertido;
d) Observar el comportamiento de cada una de las plantas.
¿Cuál de las plantas realizó la gutación? ¿Qué condiciones ambientales posibilitaron la gutación en este experimento? ¿En qué región de la hoja se observó la gutación? Identifique las estructuras 1, 2, 3 y 4 de la figura anexa, representando un corte transversal de la hoja. ¿Los hidátodos eliminan apenas el agua pura? ¿Por qué?
12. LOS PIGMENTOS DE LOS VEGETALES
La gran mayoría de los seres vivos depende directa o indirectamente de la fotosíntesis. El producto primario de la fotosíntesis es la glucosa, un azúcar, que además de servir como fuente de energía en los procesos vitales, puede ser convertido en diversos tipos de sustancias que la planta utiliza.
En los vegetales superiores, se encuentran pigmentos en los plastos, como las clorofilas y los carotenoides, y en las vacuolas, como las antocianinas.
Estos pigmentos tienen capacidad de absorber algunas de las franjas del espectro luminoso y reflejar otras. Las radiaciones absorbidas son particularmente importantes por la cantidad de energía que pueden producir en las reacciones intracelulares, destacándose las clorofilas entre las demás, mientras que las radiaciones reflejadas determinan variaciones de la coloración presentada por las mismas.
¿Cuáles son las franjas del espectro luminoso que son absorbidas y reflejadas, respectivamente por las clorofilas a y b? Estructuralmente, ¿en qué difieren las moléculas de clorofila a y b? Explique la relación que existe entre la longitud de onda y la cantidad de energía de la radiación luminosa. Dentro de los pigmentos vegetales, ¿cuáles participan directamente en la fotosíntesis?
En esta actividad vamos a separar pigmentos de hojas de vegetales.
Material (por grupo): Hojas verdes y de otros colores (de diversos vegetales), bisturí u hoja de afeitar.
Para la clase: placa de calentamiento, varilla de vidrio, pipetas Pasteur, vaso de precipitados con agua, placas de Petri, discos de papel de filtro, tubos de ensayo, estante, pinzas para tubo de ensayo, foco de luz, solución débil de un ácido, solución débil de una base, alcohol 80, acetona.
Procedimiento
a) Cortar las hojas verdes (grama) en trozos bien pequeños y colocarlos en tubos de ensayo que contengan alcohol 80 (2/3 del tubo).
b) Colocar los tubos de ensayo en baño María, hasta que el alcohol haya disuelto los pigmentos de las hojas.
c) Decantar el líquido en otro tubo de ensayo.
d) Observar la coloración presentada por el extracto de hojas verdes sobre la acción de la luz directa y reflejada.
e) Marcar el centro de un disco de papel de filtro con un punto (con lápiz, NO usar tinta ni doblar ni arrugar el papel).
f) Colocar el disco de papel de filtro sobre una placa de Petri.
g) Colocar un poco de extracto con una pipeta, en gotas, en el punto marcado del disco. Esperar la difusión de los pigmentos.
h) Colocar, si el disco de papel presenta círculos azulados o rojizos, una gota de solución básica o ácida
sobre los mismos. Observar.
Usted puede variar el procedimiento utilizando hojas coloreadas y acetona como solvente a temperatura ambiente.
¿Cuál es la coloración presentada por el extracto de hojas verdes bajo la acción de la luz directa o reflejada? ¿Cuál es el comportamiento de los pigmentos bajo la acción de un ácido y de una base? Anexe sectores de papel de filtro mostrando los diferentes pigmentos separados. Escriba la leyenda correspondiente.
Explique el comportamiento de la clorofila bajo la luz directa y reflejada.
¿Qué interpretación podrá darse al comportamiento de los pigmentos bajo la acción de un ácido o de una base?
Algunas hojas son totalmente rojas. En este caso, ¿cómo realizan estas plantas la fotosíntesis? ¿Cómo se explica el cambio de color verde de algunos árboles a rojo, en cierta época del año?
13. LA ESTRUCTURA FOLIAR
La fotosíntesis ocurre en las células que tienen clorofila. Estos pigmentos absorben energía lumínica que en el proceso se transforma en energía química, utilizada en la síntesis de glucosa.
La glucosa es consumida en la respiración de todas las células, con o sin clorofila. De este modo, las células que contienen clorofila, realizan los dos procesos, la fotosíntesis y la respiración, las células que carecen de clorofila, solo realizan la respiración.
Si bien la fotosíntesis ocurre en cualquier órgano con clorofila de los vegetales, es en las hojas, gracias a su estructura, que el proceso es más eficiente. En esta actividad, analizaremos la estructura de las hojas y su relación con la fotosíntesis y la respiración.
13.1. MORFOLOGÍA DE LA HOJA
¿Cuáles son las principales características morfológicas de una hoja?¿Qué células de las hojas realizan fotosíntesis?¿Qué estructura parece adecuada para la entrada de aire en las hojas? Si la hoja está bajo una intensidad luminosa que favorece la fotosíntesis, qué gas absorben las células del parénquima del aire existente en las lagunas? ¿Qué gas eliminan? ¿Corresponde el O2 eliminado hacia las lagunas al total
producido en los protoplastos? Compare la proporción de CO2 y de O2 del aire que entra y sale de la hoja
en esta situación.
En preparados listos o en imágenes, reconocer las estructuras representadas a continuación.
13.2. LOS ESTOMAS Y LA FOTOSÍNTESIS
La estructura de las hojas permite intercambios rápidos de CO2 y O2, resultando órganos perfectamente
adaptados para la fotosíntesis. Por otro lado, la estructura de las hojas favorece la pérdida de agua por evaporación. Los estomas son estructuras foliares que se pueden abrir y cerrar permitiendo la modulación de ambos procesos.
Material (por grupo): 1 hoja vegetal, 1 microscopio, 2 portaobjetos y cubreobjetos, 1 hoja de afeitar,
papel de filtro, pincel, 10 mL de solución de sacarosa 10%.
Procedimiento:
a) Separar con una pinza o con la uña un trozo de la epidermis de una hoja y colocarlo entre el portaobjetos y cubreobjetos, con una gota de agua. Pasar un pincel y observar al microscopio, con un objetivo de aumento medio.
b) Enfocar un estoma y representarlo con un dibujo esquemático. c) Buscar otros estomas y representarlos con un dibujo esquemático.
d) Sustituir el agua del preparado por una solución concentrada de agua y azúcar. Observar al microscopio.
e) Buscar otros estomas en el preparado y observar si presentan el mismo aspecto. ¿Los estomas están
abiertos o cerrados?
Explique el comportamiento de los estomas en agua y solución de sacarosa. ¿Cuál es la importancia de este comportamiento para el intercambio gaseoso? ¿Cuál es la importancia de este comportamiento para el control de la pérdida de agua?
14. LA FOTOSÍNTESIS
14.1. CONCEPTOS BÁSICOS
DESCUBRIMIENTOS DE PRIESTLEY
El descubrimiento de la fotosíntesis es relativamente reciente. Dicho proceso fue mencionado por primera vez en 1772, en un artículo escrito por el químico inglés Joseph Priestley (1733-1804), donde decía: “Me quedé muy feliz al encontrar accidentalmente un método para recuperar el aire enrarecido por la combustión de las velas y descubrir al menos uno de los restauradores que la naturaleza emplea para esa finalidad: la Vegetación”.
En aquella época se sabía que la combustión de las velas o la respiración animal en un ambiente cerrado “agota” el aire, volviéndolo irrespirable. Priestly fue el primero en observar que cuando una planta era introducida en un ambiente “agotado”, después de algún tiempo se volvía nuevamente respirable.
Aire “agotado” Aire “puro”
(irrespirable) plantas (respirable)
Este descubrimiento causó un gran impacto en el mundo científico. El hecho de que la vegetación “recupere” el aire explicaba por qué permaneció respirable durante millones de años, sin deteriorarse con la respiración de los animales y con los procesos de combustión.
DESCUBRIMIENTOS DE INGEN-HOUZS
Otro paso importante en la elucidación del proceso de “recuperación” del aire por las plantas fue dado en 1779, cuando el médico holandés Jan Ingen-Houzs (1730-1799) descubrió que, para realizar la recuperación del aire, las plantas necesitaban estar iluminadas. Así, se agregó al descubrimiento de Priestley un nuevo elemento: la luz.
Aire “agotado” luz Aire “puro”
(irrespirable) plantas (respirable)
Los químicos luego descubrieron que el aire agotado por la respiración era pobre en el gas oxígeno y rico en el gas carbónico, y que las plantas en presencia de luz, invertían esta situación. La ecuación de Priestley pasó a escribirse entonces, de forma más elaborada:
Aire rico en luz Aire rico en
gas carbónico oxígeno (CO2) plantas (O2)
Con esta ecuación, se tenía la impresión de que las plantas descomponían CO2 y liberaban los átomos de
oxígeno de ese gas, en forma de O2. Admitiéndose que fuera así, ¿dónde iban a parar los átomos de
carbono?
En 1776, Ingen-Houzs propuso la hipótesis de que las plantas usaban el carbono del CO2 para fabricar sus
propias sustancias orgánicas; el O2 liberado sería apenas un subproducto de dicha utilización.
A partir de entonces, el proceso pasó a ser llamado fotosíntesis, para indicar que ocurría la síntesis de sustancias de carbono (hoy sabemos que es primariamente glucosa) en presencia de luz.
