En la mitosis
En la mitosis
los
los
microtú
microt
úbulos
bulos
ensamblan
ensamblan
el
el
aparato
aparato
mit
mitó
ó
tico
tico
,
,
estructura
estructura
que
que
es
es
esencial
esencial
para
para
distribuir
distribuir
el
el
material
El
aparato mitótico
consiste de tres tipos de microtúbulos,
astrales, del cinetocoro y polares
Los MTs astralesirradian desde el centrosoma (en amarillo). Contribuyen a la separación de los polos y al posicionamiento del huso. Los MTs del cinetocoro(en rojo) forman ramilletes (fibras del cinetocoro) que se unen a los cinetocoros de los cromosomas. Los MTs polares(en azul) se interdigitan en el ecuador del huso y permiten generar fuerzas que regulan la separación entre los polos.
Microtúbulos
dinámicos
moléculas
motoras
formación del huso
captura y alineamiento de cromosomas
transporte de cromátides hacia los polos
En las células animales el aparato mitótico se ensambla
a partir de MTs nucleados en los
centrosomas
Los centrosomas se duplican antes de comenzar la mitosis, al final de la fase G1. Se requiere de la actividad de Cdk2 y de las ciclinas A y E (activas durante G1/S y S).
En interfase el centrosoma ocupa una posición perinuclear
El centrosoma consiste en un par de
centríolos
inmersos en una pericentriolar matriz fibrosa
El complejoγ-TuRC consiste de proteínas que estabilizan un anillo de subunidades de tubulinaγa partir del cual se ensamblan los heterodímerosα/β. Los microtúbulos ensamblados a partir del centrosoma poseen una polaridad uniforme, con su extremo de rápido crecimiento (+) distal.
La matriz fibrosa pericentriolar contiene numerosas copias del
En profase, los microtúbulos incrementan el dinamismo e invaden el centro de la célula
Los complejos Cdk-ciclinas mitóticas (= MPF) incrementan el dinamismo de los microtúbulos durante profase mediante la fosforilación y activación de catastrofinasy la inactivación de MAPsestabilizadoras.
Las catastrofinasson proteínas que se unen a los extremos (+) de los MTs (ej. miembros de la familia de kinesinas 13 como MCAK=XKMC1) e incrementan los eventos de catástrofe. Las MAPs(ej. MAP2, tau) se asocian a la pared de los MTs y disminuyen la inestabilidad dinámica. En general la fosforilación de las MAPs por Cdks provoca su disociación del MT.
Los MTs de metafase son mas
Kinesinas-C contribuyen a alinear los MTs polares y traccionan sobre los centrosomas
Las kinesinas-Cposeen las cabezas motoras en el terminal carboxilo y se translocan hacia el extremo (-) de los microtúbulos.
Lodish et al., 2004
La actividad de kinesinas-C contribuye a alinear los MTs polares y además tracciona sobre los polos.
Kinesinas bipolares
(tetraméricas)
y dineínas contribuyen a la separación de los centrosomasBimC, Eg5 son kinesinas bipolares que se unen a MTs polares antiparalelos y se translocan hacia el extremo + de los MTs.
Lodish et al., 2004
Junto a las las dineínas corticales las kinesinas bipolares separan los polos en prometafase y forman el huso bipolar.
dineína cortical
La inactivación de la kinesina bipolar Eg5con la droga monastrol produce un huso monopolar. Los microtúbulos se marcaron empleando tubulina unida a rodamina (en rojo). El DNA se marcó con Hoechst (azul).
huso normal huso monopolar
+ monastrol
T. Mitchison lab
El rol de kinesinas en el ensamble del huso mitótico ha sido examinado in vitro a partir de extractos de huevos de
Xenopus
La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad
coordinada y combinatorial de diferentes motores
Sharp et al, Nature 2000 interfase/profase
prometafase/metafase
La asociación de kinesinas bipolares (+) a los MTs antiparalelos en la zona media contribuye a una nueva elongación del huso hasta alcanzar un estado estacionario.
Dineínas corticales que actúan sobre los MTs astrales y kinesinas-C (-) que actúan sobre los MTs polares antiparalelos de la zona media generan fuerzas opuestas que determinan la longitud del huso.
La ruptura del balance de fuerzas entre motores de distinta polaridad altera la longitud del huso
(B) células de levaduras normales
(C) células que sobreexpresan la kinesina-C Kar3p, de polaridad (-) exhiben el acortamiento del huso. (D) células que sobreexpresan la kinesina bipolar Cin8p, de polaridad (+) revelan el alargamiento del huso.
En las figuras se muestran los husos mitóticos de células de levadura marcadas con un anticuerpo anti-tubulina (en verde)
overexpression of kinesin-C
overexpression of bipolar kinesin normal spindles
captura
captura
de
de
cinetocoros
cinetocoros
por
por
microt
microt
ú
ú
bulos
bulos
del
del
huso
huso
transporte
transporte
y
y
alineamiento
alineamiento
de
de
cromosomas
cromosomas
en la
en la
placa
Prometafase: la inestabilidad dinámica de los microtúbulos y la actividad de motores (+) son esenciales para la captura de los cinetocoros
dinámica de los microtúbulos
rol de motores de polaridad (+)
Lodish et al., 2004
CENP-E
Prometafase: los cromosomas transportados a la placa ecuatorial exhiben un movimiento oscilatorio
Lodish et al., 2004
Los movimientos oscilatorios resultan de la actividad de: a) motores asociados al cinetocoro y a centrosomas, que al actuar sobre los MTs del cinetocoro traccionan los cromosomas hacia los polos; b) motores unidos a la cromatina que se translocan hacia el extremo (+) de los MTs polares y empujan los brazos de los cromosomas hacia la placa de metafase; c) eventos de polimerización y depolimerización de los MTs del cinetocoro.
(b)
El cinetocoro es un complejo proteico ensamblado sobre la región centromérica de los cromosomas
MCAKes una kinesina-M asociada a la capa externa del cinetocoro y que depolimeriza el MT.
CENP-Ees una kinesina (+) asociada a la corona fibrosa del cinetocoro.
Lodish et al., 2004 (MCAK: Mitotic Centromere-Associated Kinesin) Proteínas de control o
checkpoint mitótico también se localizan en el cinetocoro.
DNA centromérico. Levaduras
En metafase el cinetocoro de cada cromátide ancla
microtúbulos del correspondiente polo
Inmunolocalización de cinetocoros (rojo)
cromosomas
microscopía electrónica de
barrido de cromosoma de metafase
centrómeros
MTs
Metafase: los microtúbulos de los cinetocoros exhiben un estado dinámico de
"treadmilling"
fotoactivación de la fluoresceína unida a la tubulina mediante un pulso de UV suministrado dentro de la región marcada (verde) DNA
1.5min
2.5min En el "treadmilling"la adición de subunidades de
tubulina en el extremo (+) es balanceado por el desensamble de subunidades en el extremo (-).
Demostración experimental del treadmilling. Se muestra un huso mitótico ensamblado in vitro. Los MTs se marcaron con tubulina-rodamina (rojo) y los cromosomas con Hoechst (azul). La marca verde representa una fracción de tubulina-fluoresceína activable por un pulso de luz. Note que la fluoresceína activada se desplaza hacia el polo izquierdo.
Visualización del ¨treadmilling¨ de MTs de metafase empleando ¨trazas¨de tubulina fluorescente
En (A) se esquematiza un microtúbulo marcado con ¨trazas¨(speckles) de tubulina fluorescente (en rojo). En (B) se muestra una fotografía del huso marcado marcado con las trazas de tubulina fluorescente. La posición de las marcas fluorescentes individuales en función del tiempo se visualizan en franjas (slices) alineadas del huso, registradas por videomicroscopía (asterisco) (C). La velocidad calculada de translocación de la tubulina en los microtúbulos es de 0.75 μm/min.
Mitchison & Salmon, Nature Cell Biol 2001
La técnica consiste en agregar a la preparación de tubulina “trazas” de tubulina fluorescente (rojo), de modo que ésta se incorpora a los microtúbulos con baja frecuencia, generando un patrón de trazas o “speckles” fluorescentes.
distancia
A B C
*
pendiente de la línea formada por la posición de las trazas a
tracci
tracci
ó
ó
n
n
de
de
los
los
cinetocoros
cinetocoros
hacia
hacia
los
los
polos
polos
Anafase A:
Anafase A:acortamiento de la fibra del cinetocoro en ambos extremos de los MTs
Anafase B:
Transición metafase
anafase
separación de las cromátides
metafase
ANAFASE A:
ANAFASE A:Depolimerización de los
MTs de los cinetocoros
en los cinetocoros y en los polos.
ANAFASE B:
ANAFASE B:Deslizamiento entreMTs antiparalelos polaresen el plano ecuatorial mediado por kinesinas (+). También fuerzas de tracción ejercidas por
dineínas corticales.
Distintas fuerzas gobiernan el movimiento de los cromosomas durante la anafase
Gorbsky et al JCB 1988
Evidencia experimental del acortamiento de los MTs de los cinetocoros en el extremo (+).
Experimentos de fotodestrucción (photobleaching) de la fluorescencia revelan la depolimerización de los MTs en el cinetocoro, evento que no requiere de ATP y actividad motora.
región fotodestruída
El acortamiento de los MTs del cinetocoro también es demostrado empleando proteínas fluorescentes fotoactivables
Tubulina conjugada a fluoresceína fotoactivable es microinyectada en células e incorporada al huso. Al comienzo de la anafase, la fluoresceína es activada (zona verde). Note el avance de los cromosomas sobre la marca y también el movimiento hacia el polo (indicado con una flecha).
Zhai et al JCB 1995
MCAK es una kinesina asociada al cinetocoro que promueve la depolimerización del extremo (+) de los MTS. CENP-E es una kinesina que mantiene unidos los cromosomas a los MTs durante su acortamiento.
Rogers et al, Nature 2004
En este experimento, se demuestra que la kinesina KLP10A
es requerida para el flujo de tubulina hacia los polos. La inhibición de KLP10A con un anticuerpo, inhibe el flujo.
pole pole
En estas kimografías de MTs con trazas de tubulina-rodamina se demuestra que la kinesina KLP59Ces requerida para el movimiento de los cinetocoros (en verde). La inhibición de KLP59C con un anticuerpo, inhibe el efecto de “pac-man”.
Identificación de kinesinas que inducen el desensamble de los MTs en el cinetocoro y los polos
Kinesinas-M, como por ejemplo MCAK, XKCM1, KLP10A y KLP59C, se unen a los extremos de los MTs e inducen su desensamble.
disassembly
anafase B
La inactivación de las kinesinas-C (-), y la acción de las kinesinas bipolares (+) en conjunto con dineínas corticales contribuyen a la separación de los polos en la anafase B.
En la anafase B el huso es elongado por la acción
coordinada de kinesinas y dineínas
Deslizamiento entre microtúbulos antiparalelos en la zona media del huso
Síntesis de las distintas funciones de las proteínas motoras en la mitosis Motores (+) unidos a los brazos de los cromosomas
(cromokinesinas) transportan a los cromosomas hacia la placa ecuatorial.
Motores (-) anclados a la corteza celular (dineínas) contribuyen a elongar el huso.
La movilidad del cinetocoro involucra dos tipos de motores: 1) motores (-) asociados a la corona fibrosa traccionan los cromosomas hacia los polos; 2) motores en el interior del cinetocoro promueven el desensamble de los MTs y el anclaje de los cromosomas al extremo (+).
(1) (2)
(
(
Divisi
Divisi
ó
ó
n
n
del
del
citoplasma
citoplasma
)
)
Dos mecanismos aseguran que la citoquinesis ocurra al finalizar la mitosis: 1. La inactivación de Cdk-ciclinas M mediada por APC-Cadh1.
2. La asociación de MTs antiparalelos en la región central del huso que es requerida para el ensamble del anillo contráctil.
Microscopía electrónica de barrido mostrando el surco de clivado en la superficie de una célula huevo de anfibio
El primer cambio morfológico visible de la citoquinesis en una célula animal es la aparición de un surco en la superficie
La estructura molecular que subyace el surco superficial de clivado es un anillo contráctil de actina y miosina
actina
Dos
Dos modelosmodelosproponenproponen roles roles opuestosopuestos de de loslos microtmicrotúúbulosbulos en la
en la formaciformacióónn del del anilloanillo contrcontrááctilctil
El modelo de relajación astral propone que los microtúbulos astrales inhiben la contractilidad en la región adyacente a la corteza de los polos. Esto, sin embargo, permitiría la contracción en la corteza ecuatorial de la célula. El modelo alternativo de la estimulación astral propone que los microtúbulos astrales suministran una señal positiva que induce la contracción en la corteza ecuatorial.
microscopía electrónica de barrido mostrando dos células a punto de finalizar la citocinesis
microscopía electrónica de transmisión mostrando el cuerpo medio
matriz densa
MTs de la zona media
La asociación de MTs antiparalelos en la zona media del huso (en verde) es mediada por la kinesinaZEN-4. La unión de ZEN-4 a los MTs es inhibida por fosforilación mediada por Cdk-ciclinas M. Posterior a la anafase, las Cdks-ciclinas M son degradadas y ZEN-4 es defosforilada por la fosfatasaCdc14.
Cdk-M ZEN-4 Cdc14 APC
La asociación de microtúbulos polares antiparalelos en la zona media es esencial para la citoquinesis
Cdh1
Experimento que demuestra el rol de la miosina II en la citocinesis
La miosina II es inhibida por fosforilación mediada por CDK-ciclinas M. Durante telofase, la activación de la fosfatasa Cdc14 y del complejo APC-Cdh1 y promueven la defosforilación de la miosina y su asociación con el anillo de actina. La contracción del anillo forma el surco de clivado.