Viroides de los cítricos: Implementación de técnicas moleculares de detección y determinación de infección natural en el campo

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(1)

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DIVISION ESTUDIOS DE POST-GRADO

VIROIDES DE LOS CTTTUCOS: IllPLEMENTACIOíW DE TECNICAS MOLECULARES DE DETECCION Y

DETERMINACION DE INFECCION NATURAL EN EL CAMPO

T E S I S

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN

BIOTECNOLOGIA

POR:

M. C. OMAR GUADALUPE ALVARADO GOMEZ

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POR

T. C . O M A R G U A D A L I P E A L V A R A D O G O M E Z VIA

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U N I V E R S I D A D A U T O N O M A D E N U E V O L E O N FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DIVISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

VIROIDES DE LOS CITRICOS: IMPLEMENTACION DE TECNICAS MOLECULARES DE DETECCION Y

DETERMINACION DE INFECCION NATURAL EN EL CAMPO

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGIA

POR

M. C, OMAR GUADALUPE AL VARAD O GOMEZ

COMISION DE APROBACION DE Ti

Dr. Mario A Rocha Peña Director de Tesis

Dr. Juan Pablo Martínez Soriano Co-di rector

Dr. Benito Pereyra Alférez Asesor

Dr. Rafael Rivera Bustamante Asesor

Dr. Richard F. Lee Asesor

Dra. Ma. Julia Verde Star Subdirector a de Postgrado

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(7)

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

D I V I S I O N DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

VIROIDES DE LOS CITRICOS: IMPLEME NT ACION DE TECNICAS MOLECULARES DE DETECCION Y

DETERMINACION DE INFECCION NATURAL EN EL CAMPO

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGIA

POR

M. C. OMAR GUADALUPE ALVARADO GOMEZ

COMISION DE EXAMEN

Dr. Mario Alberto Rocha Peña President«

Dr. Benito Pereyra Alférez Secretario

Dr. Juan Manuel Alcocer González _ Vocal

Dra. Katiushka Arévalo Niño Vocal

Dra. Lilia Hortencia Morales Ramos Vocal

(8)

CONTENIDO

Pág.

Dedicatoria I Agradecimientos II Biografía del autor IV Abreviaturas y simbología V

Lista de Cuadras VII Lista de Figuras IX

RESUMEN XII

ABSTRACT XIII

I. INTRODUCCION

1.1 Hipótesis 2 1.2 Objetivos 2

II. REVISION DE LITERATURA

2.1 Identidad de los viroides 3 2.2 Ocurrencia, distribución e importancia en la agricultura 3

2.3 Caracterización 5 2 4 Viroides causantes de enfermedades en cítricos 5

2.4.1 Exocortis 6 2.4.2 Cachexia o xiloporosis 7

2 4.3 Otros viroides de cítricos 9

2.5 Extracción del RNA 11 2.5.1 Cromatografía del RNA en celulosa (CF-11) 11

2.6 Detección de viroides 11 2.6.1 Bioensayos en plantas indicadoras 12

2.6.2 Análisis de electroforesis en geles de poliacri lamida

(PAGE) 12 2.6.3 Transcripción inversa y reacción en cadena de la

(9)

Pág. III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Fuente de viroides y material vegetal 16

3.2 Extracción del RNA 19 3.2.1 Cuantificación de la cantidad y calidad del RNA 22

3.3 Análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida 23

3.3.1 Establecimiento de la técnica 23 3.3.2 Comparación de métodos de extracción del RNA en la

detección directa 27 3.3.3 Validación de la técnica 27

3.4 Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa 27 3.4.1 Selección, análisis y síntesis de iniciadores (primers) 27 3.4.2 Establecimiento de las condiciones de reacción para el

viroide cachexia 28 3.4.3 Establecimiento de las condiciones de reacción para el

viroide exocortis 30 3.4.4 Validación de la técnica 30

3.5 Ensayo de hibridación por mancha de punto (dot blot) 30 3.6 Bioensayos de transmisión de viroides y pruebas de

patogenicidad 30

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Extracción del RNA 32 4.2 Análisis del RNA por electroforesis en geles de poliacrilamida 37

4.2.1 Establecimiento de la técnica 37 4.2.2 Comparación de métodos de extracción del RNA para la

detección directa de viroides por electroforesis secuencia!

(sPAGE) 39

4.3 RT-PCR 42 4.3.1 Cachexia 42

4.3.2 Exocortis 45 4.4 Hibridación molecular 45 4.5 Transmisión de viroides y pruebas de patogenicidad 47

4.6 Validación integrada de técnicas moleculares en diversos

hospedantes 49 4.6.1 Naranjo dulce de Nuevo León 49

(10)

Pág.

4.6.3 Limón Persa de Yucatán 54

4.6.4 Limón Persa de Tamaulipas y Veracaiz 57

V CONTRIBUCIONES Y RELEVANCIA 60

VI. CONCLUSIONES 62

VII. LITERATURA CITADA 63

VIII. APENDICE

€.1 Selección, análisis y dilución de iniciadores para la detección del

viroide cachexia 74 8.1.1 Selección de iniciadores y simulación de PCR 74

8.1.2 Formación de dímeros, dúplex y 'hairpin' según el programa

OLIGO 76 8.1.3 Temperaturas de apareamiento (Tm) estimadas con el

programa OLIGO 77 8.1.4 Características de dilución de los iniciadores 78

8.2 Selección, análisis y dilución de iniciadores para la detección deí

viroide exocortis 80 8.2.1 Selección de iniciadores y simulación de PCR 80

8.2.2 Formación de dímeros, dúplex y hairpin' según el programa

OLIGO 81 8.2.3 Temperaturas de apareamiento (Tm) estimadas con el

programa OLIGO 83 8.2.4 Características de dilución de los iniciadores 84

8 3 Mapa gráfico de restricción de los viroides cachexia y exocortis de

(11)

V'Z'ÙICXfTOXJA.

A mi esposa,

Teresa Sigma fFCores

A mis Hyos,

Omar Marco

Irvin SlCejandro

A (a mtmoria de mis padres,

(12)

AGRADECIMIENTOS

A La Facultad de Agronomía de la UANL, por ésta gran oportunidad de superación académica; a su director el Ing. Cesáreo Guzmán Flores, por todo su apoyo en la etapa final de mis estudios de Doctorado.

A la Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL, por su aceptación al Programa de Doctorado en Ciencias con especialidad en Biotecnología, en especial al Dr. Luis J. Galán Wong, coordinador de este Programa.

A la Unidad de Investigación en Biología Celular y Molecular del Convenio INIFAP-UANL, que mediante sus laboratorios de Virología Vegetal y Patología Molecular, me permitieron la capacitación y realización del trabajo de investigación. Al M.C. Jorge Cantú Vega, Director de Coordinación y Vinculación del INIFAP en el estado de Nuevo León.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por la beca-crédito otorgada para manutención durante el período de estudios.

Al Dr. Mario Alberto Rocha Peña, por sus sabias enseñanzas, por todas las facilidades concedidas en su laboratorio y en la red nacional de cítricos del INIFAP que preside, por su comprensión en los errores cometidos y sobre todo por su acertada dirección.

Al Dr. Juan Pablo Martínez Soriano, quién despertara en mi el interés por ésta interesante área del conocimiento, por su ejemplo de dinamismo, y por abrirme las puertas de su laboratorio, de su conocimiento y de su amistad.

Al Dr. Benito Pereyra Alférez, por sus enseñanzas durante el doctorado y por haber aceptado formar parte del comité de tesis.

Al Dr. Rafael Rivera Bustamante, del CINVESTAV-Unidad Irapuato, por su disponibilidad para colaborar en este proyecto.

(13)

Agradecimientos/ I I I

A la Ora. Katiushka Arévalo Niño y a la Dra. Lilia Hortencia Morales, por aceptar participar como miembros del examen de grado.

Al M.C. Nabor González Garza, por su buena disposición.

Al Dr. Pablo Zapata Benavidez, Dr. Juan Manuel Alcocer, Dra. Diana Sara Leal y M.C. Magdalena Iracheta Cárdenas, por la capacitación, apoyo y sugerencias al trabajo de laboratorio.

A todas aquellas personas como el Ing. Pablo Ruiz Beltrán, M.C. Juan Jasso, M.C. Sergio Silva Vara, y otros, que de manera anónima colaboraron en este proyecto realizando los muestreos en localidades.

A mis compañeros de laboratorio, Alberto Morales, Humberto Almeyda, Ma. Irene Avila, Norma Patricia Cázares, Eleazar Moreno, Leobardo Iracheta, Edgar Gallardo, Elisa María, Olga Isadora, Irma Olivia, Tomás Rangel y Sra. Mirthala Páez.

Se agradece el financiamiento otorgado para la realización de este proyecto a las siguientes instituciones:

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Proyecto 4030N

Insituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Fundación Produce Nuevo León

(14)

mOQ^/lJ^Í MJLjIVTOK

81 autor de este trabajo nació en la ciudad de Monterrey el 12 de

diciembre de 1961. t'stá casado con Teresa Segura -Jlores y tienen 2 hijos:

Ornar Marco de 7 años e Irvin jllejandro de apenas 1 año. t'studió la

carrera de Ingeniero ,/lgrónomo -fiitotecriista en la Jacuitad de

.Agronomía de la L¡/I--\J1_ (•:///?///-A /V durante el período comprendido

entre los años 1977-1982. De 198-3 a 1986 fue Maestro Ordinario y

./I LUCÍ lar de Investigación en Mejoramiento (¡enético de Maíz en la

-/ // i i/I- \ £ posteriormente, de 1986 a 1990 realizó estudios de Maestría

en Ciencias con especialidad en Genética en el Centro de Genética del

Colegio de Vostgraduados ubicado en Montecillo, estado de México, ¿n

1990 se reincorporó a sus actividades de docencia e investigación en la

-f/lll/l-M^liasta 1994, año en que ingresó al Programa de Doctorado en

Ciencias en la especialidad de Biotecnología, en la •facultad de C iencias

Biológicas de la lj/1- concluyendo su investigación satisfactoriamente

(15)

ABREVIATURAS Y SIMBOLOGIA

AMV Transcriptasa inversa obtenida del Virus Mieloblaslosls Aviar

aprox. Aproximadamente

cat. Catálogo

CCaVd Viroide causante de caetiexia en los cítricos

CCaVdc Forma circulardel viroide causante de cachexia en los cítricos cDNA Acido desoxirribonucleico complementario

CEGET Campo Experimental General Terán

CEVd Viroide causante de exocortis en los cítricos

CEVdC Forma circulardel viroide causante de exocortis en los cítricos

CF-11 Celulosa

cm Centímetros

cols. Colaboradores

Comp. Complementario

cRNA RNA complementarlo

cv Cultivar

OEPC Dietil pirocarüonato

DNA Acido desoxirribonucleico

dNTP's Desoxinudeósidos trifosfatados

dPAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizante

DTT Ditiatreitol

ELISA Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima

E.U. Estados Unidos de América

FAO Organización para la Alimentación y la Agricultura

Fig. Figura

g Gramos

GPS Solución amortiguadora a base de glicina, Fosfato de sodio y cloruro de sodio

ha Hectáreas

H/nfl Enzima que reconoce la secuencia 5-G4-ANTC

Homö. Homólogo

IBPGR Consejo Internacional para los Recursos Genéticos Vegetales INEGI Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática

INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias JA-20 Modelo del rotor para centrífuga

Kcal Kilocalorías

km Kilómetro

M Concentración molar o molaridad

m Marcador de peso molecular

mA Miliamperíos

min Minutos

ml Mililitros

mM Concentración milimolar

mm Milímetros

M-MLV Transcriptasa inversa obtenida del Virus de la Leucemia Murina de Moloney Na2EOTA Acido etilendiaminotetracético, sal disódica

NCBI National Center for Biotectinology Information

ng Nanog ramos

N.L. Nuevo León

nm Nanómetros

nM Concentración nanomalar

nmoles Nanomoles

NO. Número

Päg Página

PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida

Pb Pares de bases

(16)

pg Picogramos

PH Potencial hidrógeno

PM Peso molecular

pmoles Pico moles

re pe Repetición

RNA Acido ribonucleico

rpm Revoluciones por minuto

RT Transcripción inversa

SDS Dodecil sulfato de sodio

SLS Sarcosina lauril de sodio

sPAGE Electroforesis secuencial

STE Solución amortiguadora a base de tris, cloruro de sodio y NajEDTA TAE Solución amortiguadora a base de tris, acetato de sodio y Na2EDTA

Taq Enzima termoestable que polimeriza DNA. proviene de Thermus aquaticus

TBE Solución amortiguador? a base de tris, ácido bórico y Na2EDTA

Tm Temperatura de apareamiento

Tris TRIZMA® Base. Tris(Hidroximetil]aminometano

UANL Universidad Autónoma de Nuevo León

UDO Unidades de densidad óptica

USA Estados Unidos de América, siglas en idioma inglés

UV Ultravioleta

V Voltios

VTC Virus Tristeza de los Cítricos

v/v Volumen/volumen

X Número de veces con respecto a la concentración original

W Microgramos

vi Microlitros

\xM Concentración micromolar

BC Grados Celsius

% Por ciento (medida de cantidad)

Minutos (medida de tiempo)

Segundos (medida de tiempo)

4S. 5S, 7S. 18S, 28S Acidos ribonucleicos ribosomales con coeficientes de sedimentación 4, 5. 7,18 y 28 1a. Primera

(17)

USTA DE CUADROS

1. Descubrim iento cronológico de viroides 4

2. Variantes conocidas del viroide exocortis de los cítricos 7

3. Variantes conocidas del viroide enanismo del lúpulo 8

4. Catálogo consenso de viroides de cítricos 9

5. Transmisión e intensidad sintomatológica de viroides de cítricos en

especies herbáceas 10

6. Especies vegetales utilizadas para la detección y transmisión de

RNAs patogénicos de plantas 16

7. Colectas de limón Persa y naranjo dulce efectuadas en diferentes

localidades 17

8. Soluciones necesarias para la preparación de geles nativos de poliacrilamida al 5% (A) y al 7% desnaturalizante con urea 8 M (6)

dependiente del volumen a utilizar 24

9. Rendimiento estimado del RNA total (ng g- 1) extraído de corteza y

hojas de cítricos por 5 métodos 32

10. Relación de absorbancias 260/280 nm obtenidas en RNA extraído

de corteza y hojas de cítricos por 5 métodos 34

11. Transmisión de viroides a diferentes especies vegetales a partir de

(18)

Lista de Cuadras / V i l i

12. Detección de viroides por sPAGE y RT-PCR a partir de RNA obtenido de muestras de limón Persa colectadas en los estados de

Tamaulipas y Veracruz 57

13. Capacidad de apareamiento estimada entre diferentes variantes del viroide cachexia y los iniciadores seleccionados según la simulación

realizada con el programa Amplify 75

14. Capacidad de apareamiento estimada entre diferentes variantes del viroide exocortis y los iniciadores seleccionados según la simulación

(19)

LISTA DE FIGURAS

1. Esquema general del procedimiento realizado para la implementación y validación de técnicas moleculares de detección

de viroides en cítricos 15

2. Esquema con las características de la electroforesis en geles

nativos de poliacrilamida al 5% (1a. dirección) 25

3. Esquema con las características de la electroforesis en geles de

poliacrilamida desnaturalizantes con urea 8 M (2a. dirección) 26

4. RNA obtenido por 5 métodos de extracción a partir de corteza de

cidra Etrog visualizado en un gel de agarosa al 0.8% 35

5. Electroforesis secuencial en un gel de poliacrilamida al 7% desnaturalizante (urea 8 M) con aislamientos de viroides

sem i purificados 38

6. Comparación de 5 métodos de extracción del RNA en la sensibilidad de detección del viroide exocortis en un gel de poliacrilamida al 7%

desnaturalizante (urea 8 M) 40

7. Amplificación del cDNA del viroide cachexia visualizado en un gel de

agarosa al 1.3% 43

8. Amplificación del cDNA del viroide cachexia sintetizado a partir de diferentes concentraciones de RNA y visualizado en un geí de

poliacrilamida al 5% 44

9. Reacción de hibridación para el viroide tubérculo fusiforme de la

(20)

10. Separación en un gel de agarosa al 0.8% del RNA obtenido de muestras de naranjo dulce de un lote de variedades tempranas del

CEGET, N.L 49

11. Separación del RNA obtenido de muestras de naranjo dulce en un

gel de poliacrilamida nativo al 5% 50

12. Electroforesis secuenciaI del RNA extraído a partir de muestras de árboles de naranjo dulce del lote de variedades tempranas

colectadas en el CEGET, N.L 51

13. Productos de PCR obtenidos con iniciadores específicos para

exocortis en 7 muestras de naranjo dulce 52

14. Electroforesis secuencia) del RNA extraído a partir de muestras de

limón Persa colectadas en Tabasco 53

15. Amplificación enzimàtica con iniciadores específicos para exocortis del RNA obtenido de muestras de limón Persa colectadas en

Tabasco 53

16. Amplificación enzimàtica con iniciadores específicos para cachexia del RNA obtenido de muestras de limón Persa colectadas en

Tabasco 54

17. Electroforesis secuencial del RNA extraído de 5 muestras de limón

Persa de la 1a colecta en Yucatán 55

18. Amplificación enzimàtica del cDNA de los viroides exocortis y

cachexia en muestras de limón Persa de la 1a. colecta en Yucatán 55

19. Electroforesis secuencial del RNA extraído de 8 muestras de limón

(21)

20. Amplificación enzimática del cDNA de los viroides exocortis (A) y cachexia (6) en muestras de limón Persa de la 2a. colecta en

Yucatán 56

21. Síntomas asociados con infección por viroides en limón Persa y

pepino 59

22. Simulación de amplificación por PCR del viroide cachexia utilizando la accesión U02527 como secuencia molde, los iniciadores HSV y el

programa Amplify 74

23. Características de dilución de los iniciadores sintetizados para la

detección del viroide cachexia 79

24. Simulación de amplificación por PCR del viroide exocortis utilizando la accesión U21126 como secuencia molde, los iniciadores CEV y el

programa Amplify 80

25. Características de dilución de los iniciadores sintetizados para la

detección del viroide exocortis 85

26. Mapa gráfico de restricción del viroide cachexia simulado con el

programa DNA Strider 86

27. Mapa gráfico de restricción del viroide exocortis simulado con el

(22)

RESUMEN

El diagnóstico rutinario de las enfermedades exocortis y cachexia de los cítricos se ha realizado en México mediante bioensayos en plantas indicadoras, cidra Etrog para exocortis y mandarino Parson's Special para cachexia; sin embargo, este método de detección es lento y requiere condiciones estrictas de temperatura así como amplio espacio en invernaderos. Debido a la necesidad de tener métodos rápidos y sensibles para determinar la sanidad de los árboles, se planteó el presente trabajo con el objetivo general de implementar metodologías moleculares para la detección de viroides, y su aplicación en la identificación de los viroides causantes de las enfermedades exocortis y cachexia de los cítricos. Después de probar diferentes factores involucrados en la separación y tinción del RNA en geles de poliacrilamida,

(23)

ABSTRACT

In Mexico, the current method for diagnosing citrus exocortis and cachexia diseases is by reactions on indexing hosts, Etrog citron for exocortis and Parson's Special mandarin for cachexia. However, this method of detection is slow and require strict control of temperature and space in greenhouse. Due necessity in to have speed and sensitive methods for tree health determination, the general objective of this work was implementing molecular methods for viroids detection and its application to identifing the viroids causing citrus exocortis and cachexia diseases. After trying différents factors affecting RNA separation and polyacrylamide geies staining, the sequential polyacrylamide geles electrophoresis technique (sPAGE) for detection of exocortis (CEVd) and cachexia viroids (CCaVd) was established. After comparing five methods of RNA isolation for direct detection of exocortis viroid by sPAGE, there were no differences between those. Satisfactories results had obtained with all five testing methods, however, Lee (1995) method overcome the others in quantity of total RNA. Otherwise, reaction conditions for the amplification of complemetary DNA to sequences of the exocortis and cachexia viroids were established from semipurified controls and RNA getting from Indicator plants. Better results were obtained with a disacoupled process of RT-PCR obtaining a 300 base pair (bp) fragment and a sensitivity of 100 ng of total RNA in the case of CCaVd, and a 370 bp fragment with CEVd. In both cases no amplification signs were observed when using RNA isolated from healthy controls. In the validity tests of sPAGE and RT-PCR techlnques with Persian lime samples from field trees colected in Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, and Yucatan states, and an orchard of orange cultivars in Nuevo Leôn, both viroids (CEVd and CCaVd) were found by RT-PCR in Persian lime in most of the samples with différents levels of symptoms, but only CEVd was detected in the same samples by sPAGE. CEVd and CCaVd viroids from sweet orange and Persian lime were transsmited to tomato, cucumber, sour orange, sweet orange Pineapple, Cleopatra mandarin, Troyer citrange, and Etrog citron, for verifying the infectivity of pathogens. The results obtained suggests that both techinques (sPAGE and RT-PCR) are

(24)

L INTRODUCCION

Los cítricos representan el grupo de frutales con mayor superficie cultivada en México. En 1995 fueron reportadas 422,000 ti a sembradas con naranja y limón, cifra superada únicamente por el café y la caña de azúcar (INEGI, 1995). En la citricultura de México predomina el naranjo agrio (Citrus aurantium L.) como portainjerto. Las plantas injertadas sobre éste, por una parte son altamente susceptibles al virus de la tristeza de los cítricos (VTC), y por la otra son asintcmáticas a infecciones tanto por exocortis como por cachexia, propiciando una situación irreal en la sanidad de las plantaciones. En un muestreo realizado en Nuevo León, se determinó que uno de cada dos árboles (56%) está infectado por el viroide que causa la enfermedad exocortis (Sánchez-Salas, 1980) y una situación similar parece ocurrir en Tamaulipas (Robles Serna, 1985). Con relación a cachexia, aunque se desconoce su ocurrencia en México, es muy probable que esté presente, pero el uso generalizado del naranjo agrio oculta su presencia (Rocha-Peña y cois., 1995).

La ausencia de síntomas por exocortis en las plantaciones de cítricos ha ocasionado que su importancia haya sido subestimada durante algún tiempo por los citricultores y personas relacionadas con este cultivo; sin embargo, la prevalencia de esta enfermedad en forma asintomática constituye un riesgo y limita el empleo de otros portainjertos como alternativa al naranjo agrio de uso actual, los cuales son susceptibles a viroides. En México, debido a las detecciones del VTC efectuadas en varios estados de país en los últimos años, desde 1993 existe la tendencia de una gran cantidad de citricultores, de sustitución del naranjo agrio como portainjerto en el establecimiento de nuevas plantaciones. Los patrones tolerantes al VTC más utilizados son los citranges Carrizo y Troyer, y el citrumelo Swingle, los cuales son susceptibles a exocortis; asimismo, también existe cierta tendencia para utilizar el mandarino Cleopatra, el cual existen reportes de su susceptibilidad a cachexia (Rocha-Peña y Padrón-Chávez, 1992).

(25)

por la ausencia de síntomas acentuados (Roistacher, 1991). Ante esta problemática surge la necesidad de contar con métodos de detección rápidos y altamente sensibles para determinar la sanidad de los árboles principalmente en lotes donadores de yemas, ya que de no efectuarse lo anterior se corre el riesgo de propagar yemas infectadas por viroides con el consiguiente deterioro de las futuras plantaciones y escaso rendimiento del cultivo.

1.1 Hipótesis

Es posible utilizar las técnicas moleculares electroforesis secuencial y transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa para la detección rápida, precisa y sensible de los viroides exocortis y cachexia de los cítricos.

Existen diferencias en la selectividad del RNA viroidal dependiendo del método de extracción utilizado.

1.2 Objetivos

i) Implementación de la técnica electroforesis secuencial en geles de poliacrilamida (sPAGE) para la detección directa de viroides.

ii) Comparación de 5 métodos de extracción del RNA para la detección de viroides en cítricos.

iii) Establecimiento y optimización del método de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para amplificar el DNA complementario (cDNA) al RNA viroidal causante de las enfermedades exocortis y cachexia de los cítricos

iv) Validación de las técnicas sPAGE y RT-PCR en plantas con infección natural de

(26)

H. REVISION DE LITERATURA

2.1 Identidad de los viroides

Los viroides son los patógenos más pequeños conocidos en la actualidad; fueron descubiertos en 1971 por Theodor Diener y son moléculas de RNA con 246-372 nucleótidos de longitud (excepto uno que tiene 463), de cadena sencilla de bajo peso molecular, cerrados covalentemente, con una estructura secundaria circular que les permite adoptar configuraciones de tipo doble cadena. Algunas otras propiedades conocidas son su replicación autónoma al ser introducidos artificialmente en diferentes especies vegetales causando la aparición de síndromes (Oiener, 1979; Martinez-Soriano, 1992; Riesner y Gross, 1985).

2.2 Ocurrencia, distribución e importancia en la agricultura

Desde su descubrimiento en 1971, día con día se ha reportado la ocurrencia de nuevos viroides así como formas o variantes de éstcs, en diferentes especies vegetales, de tal manera, que actualmente se conocen 28 viroides y 207 variantes de ellos (Lafontaine y cois., 1998; Catálogo de viroides ver internet http://www.callisto.si.usherb.ca/-jPPerra; GenBank versión 105.0+, abril 1998, ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

(27)

Cuadro 1. Descubrimiento cronológico de viroides.

Viroide/enfermedad Abreviatura Referencia Tubérculo fusiforme de la papa PSTVd Diener (1971)

Exocortis de los cítricos CEVd Semancik y Weathers (1972) Enanismo del crisantemo CSVd Diener y Lawson (1973) Fruto pálido del pepino CPFVd Van Dorst y Peters (1974)

Sänger y cols. (1976) Cadang-Cadang del cocotero CCCVd Randies (1975)

Randies y cols. (1976) Enanismo del lúpulo HSVd Sasaki y Shikata (1977) Viroide latente de Coiumnea CLVd Owens y cols. (1978) Mancha solar del aguacate ASBVd Palukaitis y cols. (1979)

Thomas y Mohamed (1979) Enanismo apical del tomate TASVd Walter (1981)

Kiefer y cols. (1983) Planta macho del tomate TPMVd Galindo y cols. (1982) Cicatriz de la piel de la manzana

(apple scar skin)

ASSVd Hasimoto y Koganezawa (1987)

Tinanangaja del cocotero CTiVd Keeseycols, (1988) Viroide latente del lúpulo HLVd Puchtaycols. (1988) Cachexia de los cítricos CCaVd

CVd-llb

Semancik y cols. (1988a, 1988b)

Moteado amarillo de la vid GYSVd Koltunow y Rezaian (1988) (grapevine yellow speckle)

Moteado amarillo de la vid-2, vid 1B GYSVd-2 Koltunow y Rezaian (1989) (grapevine yellow speckle-2) G1 BVd

Koltunow y Rezaian (1989)

Viroide de la vid Australiana AGVd Rezaian (1990)

Viroide del Coleus blumei CbVd Spieker y cols. (1990) Viroide IV de los cítricos CVd-IV Puchta y cols. (1991) Enrollamiento foliar de los cítricos CBLVd Ashulin ycols (1991) Viroide I de los cítricos CVd-l

Cáncer y ampollas del peral (pear blister canker)

PBCVd Hernández y cols. (1992)

Mosaico latente del duraznero PLMVd Hernandez y Flores (1992) Moteado de la manzana (dapple

apple)

DAVd Hadidi (1993) no publicado

Viroide III de los cítricos CVd-lll Rakowski y cols. (1994) Stasysycols. (1995)

Viroide de la papita mexicana MPVd Martinez-Soriano y cols. (1996) Viroide de Iresine IrVd Spieker, R.L. (1996)

Hoyuelo del fruto del manzano ADFVd Di Serio y cols. (1996) (apple dimplefnjit)

(28)

Entre las especies vegetales hospedantes de viroides se pueden citar a los frutales (aguacatero, cítricos, manzano, peral y duraznero), hortalizas (tomate, pepino y papa), cultivos industríales (lúpulo, cocotero y vid) y ornamentales (crisantemo, Coleus blumei Benth., y Columnea erythrophaea Decne ex HoulL), todas ellas con importancia agrícola. Lo anterior resulta crítico considerando el efecto detrimental que ocasionan los viroides en ciertos hospedantes.

A pesar de su descubrimiento desde 1971, poco se conoce sobre el origen y evolución de los viroides; sin embargo, es evidente su distribución cosmopolita, favorecida por la propagación asexual de algunas especies lo cual seguramente contribuyó a su diseminación geográfica. Tampoco se sabe de su ocurrencia en otras formas de vida diferentes a las plantas superiores, su mecanismo de replicación, así como la forma en que causan alteraciones metabólicas en algunos de sus hospederos (Diener, 1979). Un poco alentador parecen las tendencias actuales de investigación encaminadas a la introducción a vegetales de genes que codifican para ribozimas, las cuales son enzimas capaces de degradar al RNA viroidal (Atkins y cois., 1995; Yang y cois., 1997). Otra línea de investigación para la inhibición de infecciones viroidales es el uso de RNAs antisentido en plantas transgénicas (Becker y cois., 1994; Matousek y

Rakousky, 1993).

2.3 Caracterización

Los viroides pueden ser caracterizados por métodos físicos, biológicos y moleculares. La caracterización física puede efectuarse según la movilidad electroforática, por afinidad a la celulosa en cromatografía y por hibridación con sondas de RNA complementario (cRNA). Los métodos biológicos se basan en el ámbito de hospederos y en la expresión de síntomas, en tanto que los métodos moleculares se basan en la secuencia de sus bases nucleotídicas (Duran-Vila y cois , 1988a, 1988b).

2.4 Viroides causantes de enfermedades en cítricos

(29)

viroide dentro de cada grupo. A pesar de lo anterior, sólo se conocen dos enfermedades en cítricos causadas por estos viroides: exocortis y cache* i a (Roistacher, 1991).

2.4.1 Exocortis. Los primeros reportes de la ocurrencia de exocortis en cítricos se realizaron a finales de los años 40's por Fawcett y Klots en 1948, y por Benton y cois, en 1949 (Klots, 1973). Ellos reconocieron la existencia de la enfermedad la cual inicialmente consideraron de origen viral- Desde 1968, Semancik y Weathers investigaron la naturaleza del agente causal de la enfermedad exocortis encontrando que éste tenía bajas tasas de sedimentación y era sensible a ribonucleasas. Al observar al microscopio electrónico tejido infectado por exocortis, no identificaron partículas virales. Posteriormente, en 1972 con base en las evidencias anteriores además de una movilidad en geles de poliacrilamida, concluyeron que exocortis es un viroide. También mostraron que su densidad flotante corresponde a la esperada para un RNA (Semancik y Weathers, 1972).

La exocortis es una enfermedad que causa enanismo y descortezamiento en plantas injertadas sobre portainjertos susceptibles como naranjo trifoliada, citranges, citrumelos y limero Rangpur; se transmite por injerto y por el uso de utensilios agrícolas como navaja, arado, machete y tijeras podadoras (Gamsey y Jones, 1967). El viroide causante de exocortis afecta también otras especies cultivadas de cítricos, asi como especies emparentadas y hospedantes no cítricos (Yang y cois., 1992) Entre los principales hospedantes reconocidos se encuentran la cidra Etrog (Citrus medica L.) y las herbáceas Gynura aurantiaca DC, crisantemo (Chrysanthemum morifoüum Ram ), pepino (Cucumis sativas L.) y tomate (Lycopersicon esculentum Mili.) (Duran-Vila y cois., 1988a, 1988b). En cidra, la exocortis induce enanismo severo, epinastia de las hojas y necrosis en las nervaduras (Roistacher, 1991). Los árboles de naranjo injertados en patrones susceptibles afectados por exocortis pueden reducir su rendimiento hasta en un 40% (Sánchez-Salas, 1930).

(30)

Con respecto al efecto ambiental, se sabe que temperaturas de 3QCC ocasionan

un incremento en la concentración de CEVd comparado con 20°C, favoreciendo la expresión de síntomas tempranos en Gynura aurantiaca (Diener, 1979), y algo similar ocurre en cidra (Semancik y cois., 1988a),

Hasta la fecha, se han secuenciado 18 variantes del viroide exocortis en diferentes hospedantes (Cuadro 2).

Cuadro 2. Variantes conocidas del viroide exocortis de los cítricos (GenBank versión 105.0+, abril 1998)

Registro de entrada Hospedante Referencia

J 0 2 0 5 3 Gynura Gross y cols.(1982) M34917 cítricos Visvander y cols.(1982) K00964 naranjo/cnsantemo Visvander y Symons (1983) K00965 naranjo/crisantemo Visvander y Symons (1983) M30868 cítricos Visvander y Symons (1985) M30869 cítricos Visvander y Symons (1985) M30870 cítricos Visvander y Symons (1985) M30871 cítricos Visvander y Symons (1985)

Y00328 vid García-Arenal (1987)

X53716,S50398 tomate Mishraycols.(1991) S67437 cidra Semancik y C O I S . ( 1 9 9 3 ) S67438 Gynura Semancik y cols.(1993) S67440 tomate Semancik y cols.(1993) S67441 tomate Semancik y cols.(1993) S67442 tomate Semancik y cols.(1993) S67446 tomate (callos) Semancik y cols.( 1993)

U21126 Citrus paradisi Macf. Bar-Joseph (1995) sin publicar

S79831 haba Fagoaga y cois.(1995)

2.4.2 Cachexia o xiloporosis. Childs en 1950 reportó por primera vez la ocurrencia de esta enfermedad a la que denominó cachexia, cuyo significado viene del griego kakos=malo y hexis=condición. La cachexia de los cítricos afecta principalmente mandarino (Citrus reticulata Blanco) y algunos de sus híbridos como tángelos (C.

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Roistacher y Gamsey, 1988). Muchas variedades de cítricos incluyendo toronja, C.

paradisi Macf.; naranjo dulce, C. sinensis (L.) Osb. y limón, C. limón (L.) Burm. f. son portadoras asintomáticas de cachexia (Roistacher, 1988). Al igual que la exocortis, la cachexia se transmite por injerto y por el uso de utensilios agrícolas como navaja, arado, machete y tijeras podadoras (Roistacher, 1988,1991).

La naturaleza viroidal de cachexia fue reportada por Semancik y cois, en 1988, para un viroide de 299 nudeótidos (Semancik y cois. 1988a, 1988b; Semancik y Duran-Vila, 1991). En un ensayo de hibridación con otros viroides de cítricos, incluyendo el viroide exocortis, se obtuvieron resultados negativos. En estudios posteriores (Albanese y cois., 1991; Davino y cois., 1991; Sano y cois., 1988), se determinó una homología superior del 95% entre el viroide cachexia y el viroide del enanismo del lúpulo (HSVd), lo cual ha ocasionado que se considere al viroide cachexia como variante del HSVd (Sano y cois., 1988; Shikata, 1990). Actualmente, se han reportado 34 secuencias nucleotídicas distintas para el HSVd (GenBank versión 105.0+, abril 1998), de las cuales al menos 3 infectan cítricos (Shikata, 1990).

A continuación se presentan las 34 variantes reportadas para el viroide enanismo del lúpulo (Cuadro 3), el cual es homólogo al viroide cachexia.

Cuadro 3. Variantes conocidas del viroide enanismo del lúpulo (GenBank versión 105.0+, abril 1998).

Registro de entrada Hospedante Referencia

X00009 lúpulo Ohno y cois. (1983) X00524 pepino Sano y cois. (1984) M35717 vid Sano y cois. (1986) X06718 cidra Sano y cois (1988) X06719 cidra Sano y cois. (1988) X07405 pepino Puchta y cois. (1988) X12537 lúpulo Lee y cois. (1988) X06873 vid Puchta y cois. (1988) X15330 vid Puchta y cois. (1989) X13838 toronja Puchta y cois. (1989) D13765, D00480 durazno Sano y cois. (1989) D00479, D13764 durazno y ciruelo Sano y cois. (1989)

U02527 cidra Hsuy cois. (1993), Owens (1993) sin publicar X69518 cidra Levy y Hadidi (1994)

X69519 naranjo dulce Levyy Hadidi (1994)

(32)

X87928 vid Gross, H.J. (1995) sin publicar X87923 vid Gross, H.J. (1995) sin publicar X87925 vid Gross, H.J (1995) sin publicar X8792S vid Gross, H.J. (1995) sin publicar X87927 vid Gross, H.J. (1995) sin publicar Y08438 durazno Kofalvi y cois. (1997)

Y08439 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09343 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09344 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09345 durazno Kofalvi y cois. (1997) YQ9346 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09347 durazno Kofalvi y cois, (1997) Y09348 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09349 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09350 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09351 durazno Kofalvi y cois. (1997) Y09352 durazno Kofalvi y cois. (1997)

Y14050 vid Palkovics, L. (1997) sin publicar

2.4.3 Otros viroides de cítricos. En adición a los viroides exocortis y cachexia, se han encontrado otros viroides asociados a plantas de cítricos (Cuadro 4) (Duran-Vila y cois., 1988a, 1988b; Semancik y cois., 1988b; Semancik y Duran-Vila, 1991); tales viroides se han encontrado en infecciones mixtas en plantas afectadas ya sea por exocortis o por cachexia y su patogenicidad se ha determinado para algunos de ellos (Hadas y Bar-Joseph, 1991; Polizzi y cois., 1991; Roistacherycols., 1991, 1993).

Cuadro 4. Catálogo consenso de viroides de cítricos (Semancik y Duran-Vila, 1991) Grupo Viroide Nucleótidos

CEVd CEVd 371

I CVd-la 340

I

CVd-lb 330

I

CVd-lc 317

II CVd-lla 302 II

CVd-llb (CCaVd) 299 II

CVd-llc 298 (Australia) II

CVd-llc 297 (California) III CVd-llla 292

III

CVd-lllb 290 III

CVd-lllc 285 III

CVd-llld 280

(33)

Para el ordenamiento de los viroides en 5 grupos distintos, además de la talla molecular, se ha utilizado la capacidad de infectar a un grupo de plantas herbáceas diferenciales (Cuadro 5), asi como su reactividad entre ellos a hibridización con sondas marcadas (Semancik y Duran-Vila, 1991).

Cuadro 5. Transmisión e intensidad sintomatológica de viroides de cítricos en especies herbáceas (Semancik y Duran-Vila, 1991).

Grupo Viroide Cidra Crisantemo Gynura Pepino

CEVd CEVd + + + + + + + + + + + + +

l CVd-la + + l

CVd-lb + + - -

-II CVd-lla + + + + + + II

CVd-l Ib + + + _ + + II

CVd-llc + + + + +

III CVd-llla + + + _

III

CVd-l IIb + + + III

CVd-l lie + + + -

-III

CVd-l lid + + + - -

-IV CVd-IV + + + - - +

++++ sintomático severo, +++ moderado, ++ débil, + asintomático infectado, -asintomático no infectado

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2.5 Extracción del RNA

El éxito final en la detección de viroides por cualquier método basado en la extracción

del RNA, depende de la calidad de la preparación obtenida del tejido infectado, por lo

tanto la composición del medio de extracción debe ser a la medida de la especie y el tejido en estudio. En el caso de métodos de detección basados en la técnica de

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un factor limitante para el diagnóstico

rutinario es la preparación de buena calidad de ácidos nucleicos libres de inhibidores de la reacción. La mayoría de los procedimientos de extracción no remueven

contaminantes del tipo polisacáridos, ni compuestos fenólicos en plantas, los cuales

pueden tener efectos inhibitorios directos en la amplificación por PCR (Henson y French, 1993; MacKenzieycols., 1997).

2.5.1 Cromatografía del RNA en celulosa (CF-11). Esta técnica puede ser utilizada

rutinariamente como un procedimiento preparativo para la remoción de DNA y otros

componentes pigmentados contenidos en la fracción soluble extraída. La unión selectiva del RNA viroidal a cierta concentración de etanol puede ser explotada en la

recuperación de viroides a partir de extractas de tejidos (Semancik y cois., 1975). La

cromatografía en celulosa CF-11 fue usada por Semancik para caracterizar diferentes RNAs viroidales mediante una elución seriada con gradientes de etanol la cual también

podría ser utilizada para remover RNA hospedero contaminante así como para separar viroides individuales por elución selectiva con diferentes concentraciones de etanol

(Semancik, 1986).

2.6 Detección de viroides

Existen varios métodos para la detección de agentes infecciosos en material de propagación de cítricos, entre los que se pueden citar el ensayo de inmunoadsorción

ligado a enzima (ELISA), electroforesis secuencial (sPAGE), aislamiento de procariotes

en medio de cultivo (bacterias, espiroplasmas, etc), análisis de RNA de doble cadena, microscopía electrónica de inmunoadsorción y la hibridación con ácidos nucleicos

(FAO-IBPGR, 1991; Roistacher, 1991); sin embargo, para el caso de viroides se aplican

el uso de plantas indicadoras (Roistacher, 1991), el análisis electroforético en geles de poliacrilamida (Baksh y cois., 1984; Boccardo y cois., 1984; Duran-Vila y cois , 1988a,

(35)

hibridación molecular (Diener y cois., 1988; Semancik y Duran-Vila, 1991) y la amplificación enzimàtica de ácidos nucleicos (Yang y cois., 1992).

La técnica serológica ELISA que es considerada como rápida y económica para detecciones virales, no ha podido ser aplicada en la detección de viroides por ser entidades biológicas de RNA de cadena circular sencilla desprovista de cápside protéica (Flores, 1988). A continuación se describen los métodos utilizados en el diagnóstico de enfermedades de origen viroidal en cítricos.

2.6.1 Bioensayos en plantas indicadoras. Calavan y cois. (1964) desarrollaron un método para la detección del viroide exocortis el cual se basa en la producción de epinastia y enanismo en la planta cidra Etrog (Citrus medies L.). Posteriormente, este método fue mejorado por Roistacher y cois. (1977) utilizando una selección de cidra del cv Arizona, lo cual redujo el tiempo para la expresión de síntomas (Roistacher, 1991). Actualmente aún se utiliza este método por ser sencillo y sensible, pero tiene la desventaja de que la manifestación de los síntomas aparece entre los 3 y 6 meses después de la inoculación (Garnsey y Jones, 1967); sin embargo, exiten razas débiles dei patógeno que podrían pasar desapercibidas por la ausencia de síntomas acentuados. Asimismo esta técnica requiere de espacio considerable en el invernadero así como un riguroso control de la temperatura de! mismo (Roistacher, 1991).

Para la detección de cachexia, el indicador biológico empleado rutinariamente es el mandarino Parson's Special injertado sobre limón rugoso (C. jambhiri Lush.), con un período de incubación de 12-18 meses. La determinación de cachexia se lleva a cabo efectuando una insición rectangular en la corteza para observar la aparición de pequeñas acanaladuras con exudación de goma en la madera (Roistacher, 1991).

Para llevar a cabo el cultivo de viroides in planta, se utilizan plántulas de cidra (C.

medica LJ de la selección Arizona 861 -S1, la cual es más sensible a CEVd y se crece en altas temperaturas de invernadero (40°C) para promover la multiplicación de los viroides y expresión sintomática en algunos de ellos (Semancik y cois., 1988b).

(36)

mancha solar del aguacate (Utermohlen y Ohr, 1981). El método consiste en separar las moléculas del RNA viroidal en un gel de poliacrilamida pasando corriente eléctrica a través de éste. Con este principio general, se han desarrollado diferentes modalidades como el PAGE bidimensional descrito por Schumacher y cois. (1983), la electroforesis secuencia! desarrollada por Semancik y Harper (1984), y el retorno a PAGE de Schumacher y cois. (1986), quienes con estos antecedentes realizaron una electroforesis secuencial en cidra, revelando la presencia de RNA viroidales más pequeños que CEVd. Otra aportación importante para separar viroides fue realizada por Rivera-Bustamante y cois. (1986) al implementar un sistema de electroforesis en pH discontinuo el cual separa aún más las formas circulares del resto de los RNAs hospederos.

2.6.3 Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). La reacción en cadena de la polimerasa es un método enzimàtico in vitro de amplificación cíclica de secuencias específicas de DNA (Mullís, 1990). Este método se caracteriza por su especificidad y sensibilidad; sin embargo, debido a que la enzima utilizada Taq

DNA polimerasa no amplifica RNA, es necesario realizar como primer paso una transcripción inversa para formar DNA complemetario (cDNA). La sensibilidad de este ensayo puede ser hasta de un picogramo de RNA del viroide (Yang y cois., 1992).

Mediante una transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) ha sido posible la detección de viroides causantes del cicatrizado de la piel de la manzana (ASSVd), el PSTVd y el HSVd entre otros (Hadidi y Yang, 1990; Yang y cois., 1992). Un aspecto clave es el diseño de iniciadores específicos para lo cual es indispensable el conocimiento de la secuencia nucleotídica del viroide a amplificar. En el caso de CEVd se conoce su secuencia desde 1982, misma que fue publicada en forma simultánea e independiente por Gross y cois. (1982) y Visvander y cois. (1982) en tanto que para cachexia se conoce desde 1983 (Ohno y cois., 1983).

(37)

cois., 1989) utilizando para el marcado biotina, fotobiotina y digoxigenina; este último detectado por inmunoensayo ligado a la enzima, es decir la detección de la molécula blanco se basa en la unión del conjugado fosfatasa alcalina-antiDIG a la digoxigenina y la hidrólisis del sustrato enzimático particular resulta en la elaboración de un producto coloreado o quimoluminicente (Lebedeva y cois., 1993; Singh y cois., 1994).

El uso de sustratos quimoluminicentes ha mejorado la sensibilidad de la detección al doble (Podleckis y cois., 1993) pero se sigue prefiriendo el uso de sustratos colorimétricos porque la prueba no requiere películas de rayos X y procesamiento, y por ausencia de problemas de reacción de fondo que a veces ocurren en pruebas de quimoluminicencia (Singh y cois., 1994).

(38)

III. MATERIALES Y METODOS

El presente trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de Patología Molecular y Virología Vegetal de la Unidad de Biología Celular y Molecular del convenio entre el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL). Los bioensayos se hicieron en el invernadero de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL localizado en Ciudad Universitaria, en el Municipio de San Nicolás de los Garza, y en el invernadero del Campo Experimental General Terán (CEGET) del INIFAP ubicado en General Terán, N.L.

De manera global, el trabajo comprendió: i) la comparación de 5 métodos de extracción del RNA para la detección directa de viroides; ii) la implementación de la técnica de electroforesis secuencial (sPAGE); n i ) el establecimiento de las condiciones de reacción de la transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para la detección de los viroides exocortis y cachexia de los cítricos; iv) así como la validación de las técnicas anteriores utilizando muestras de campo de 5 localidades del país; y el cultivo y conservación in planta de los viroides detectados, en plantas herbáceas y leñosas (Fig. 1).

Fig. 1. Esquema general del procedimiento realizado para la implementación y

(39)

3.1 Fuente de viroides y material vegetal

Inicialmente, para ía implementación de la técnica de electroforesis secuencial se utilizaron viroides de la colección de la Universidad de Florida, Los cuales fueron parcialmente purificados a partir de cítricos y crisantemo, con claves de registro: 2094, 2095, 2158, 2169, 0100, E10, E13, E21 y E21a. Estos aislamientos contienen los viroides causantes de exocortis y cachexia de cítricos, el enanismo del crisantemo y un testigo sano, y fueron donados gentilmente por el Dr. Richard F. Lee de la Universidad de Florida en los E,U. Posteriormente, se utilizaron 9 especies vegetales con 22 cultivares en total, tanto para el establecimiento de las técnicas de detección, como para la validación y transmisión de viroides (Cuadro 6). Algunas de ellas comprendieron muestras de campo con infección natural por viroides, mientras que otras fueron plantas crecidas a nivel de invernadero, las cuales fueron inoculadas con yemas provenientes de plantas infectadas en forma natural en el campo.

Cuadro 6. Especies vegetales utilizadas para la detección y transmisión de RNAs

patogénicos de plantas.

Nombre común Nombre científico

cidra Etrog Citrus medica L. cv Arizona 861

citrange C. sinensis x Poncirus trífoliata cv Troyer

limón Persa C. ¡atifolia Tan.

mandarino C, reticulata Blanco cv Parson's Special

mandarino Cleopatra C. reshni Hort, ex Tan.

naranjo agrio Citrus aurantium L.

naranjo dulce Citrus sinensis (L.) Osb..(14 cultivares)

pepino Cucumis sativus L. cv Poinsett

tomate Lycopersicon esculentum Mill, cv Rutgers

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inoculación con el viroide causante de cachexia. Estos 4 aislamientos fueron obtenidos por extracción del RNA de colectas de plantas mantenidas bajo resguardo en el CEGET. Para los experimentos de validación de las técnicas arriba mencionadas se seleccionó un lote de variedades establecido en el CEGET del INIFAP, compuesto por árboles adultos de 14 variedades de naranjo de producción temprana, con antecedentes de infección asintomática por viroides (Sánchez-Salas, 1980), así como plantas de limón Persa (C. iatifólia Tan.) colectadas en huertos comerciales de los estados de Tamaulipas, Veracruz, Tabasco y Yucatán. Esta especie se incluyó en el estudio, principalmente por la elevada ocurrencia de agrietamientos en tronco principal y ramas, aparentemente relacíondas con viroides (Ochoa y cois., 1996; Salibe y Moreira, 1965). Las colectas de limón Persa fueron realizadas en diferentes épocas del año, sin un orden pre-establecido. En el Cuadro 7 se enlistan los materiales de naranjo dulce y limón Persa utilizados para la validación de los métodos de electroforesis secuencial y pruebas de RT -PCR.

Cuadro 7. Colectas de limón Persa y naranjo dulce efectuadas en diferentes

localidades.

Localidad Fecha de colecta Fecha de recepción Especie No.

Gral. Terán repe-l 2 junio de 1997 3 junio 1997 naranjo dulce 9

Gral. Terán repe-ll • 3 julio 1997 naranjo dulce 14

Gral. Terán repe-lll - 8 julio de 1997 naranjo dulce 13

Gral. Terán repe-IV 14 julio de 1997 14 julio de 1997 naranjo dulce 14

Tabasco - 29 enero de 1996 limón Persa 10

Tabasco - 5 septiembre 1996 limón Persa 36

Tabasco 25 abril de 1997 30 abril de 1997 limón Persa 36

Tamaulipas 17 julio de 1996 17 julio de 1996 limón Persa 7

Veracruz 2 octubre de 1996 5 octubre de 1996 limón Persa 5

Veracruz - 9 octubre de 1996 limón Persa 2

Yucatán - 6 febrero de 1997 limón Persa 5

Yucatán 1 sept. de 1997 3 sept. de 1997 limón Persa 5

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Localidad Tabasco. Localizada en el Municipio de Huimanguillo. La plantación tiene entre 5 y 8 años de establecida y la totalidad de los árboles muestran síntomas de agrietamiento de la corteza en tronco y ramas principales, algunos de ellos mostrando un deterioro considerable en el vigor del árbol. El portainjerto predominante es naranjo agrio. Se seleccionaron 18 árboles con 3 niveles de deterioro en la vigorosidad: 6 árboles vigorosos, con síntomas poco aparentes de agrietamiento en las ramas; otros 6 árboles con un deterioro moderado y síntomas evidentes de agrietamiento en las ramas, y 6 árboles más con un deterioro acentuado y síntomas severos de agrietamiento.

Localidad Yucatán. Se realizaron colectas de varetas de limón Persa en dos huertas ubicadas en el estado de Yucatán. La primera colecta consistió en muestras de 5 árboles ubicados en una huerta de 5 años, plantada sobre naranjo agrio como portainjerto. Se seleccionaron 2 árboles vigorosos sin síntomas visibles de agrietamiento de las ramas; y 3 árboles con un detrioro moderado en la vigorosidad con síntomas de agrietamiento moderado en el tallo y ramas. Esta misma huerta fue colectada nuevamente 7 meses después. Con respecto a la segunda huerta, corresponde a una plantación en desarrollo de 3 años de edad, injertada en limón macrofila (C. macrophylla Wester), seleccionando 2 árboles vigorosos sin síntomas visibles de agrietamiento de las ramas; y 6 árboles con síntomas de agrietamiento moderado en el tallo y ramas. Los árboles muestreados en ambas huertas estaban plantados en lotes adyacentes; en la huerta plantada sobre limón macrofila como portainjerto, los árboles que mostraban síntomas de agrietamiento en las ramas adicionalmente tenían un tamaño reducido en la copa.

Localidad Tamaulipas. Huerta localizada en el km 144 de la carretera Victoria-Mante en el Municipio de Llera de Canales. Tiene una superficie de 200 ha y los árboles tienen una edad aproximada de 8 años. Se encuentran injertados sobre naranjo agrio y originalmente contenían limón mexicano como copa, el cual fue remplazado por limón Persa. La totalidad de los árboles muestreados en esta localidad mostraban un deterioro acentuado en la copa con síntomas notorios de agrietamiento en las ramas y tronco.

(42)

Para los experimentos de transmisión y conservación

in planta,

se utilizaron especies herbáceas y leñosas. En el primer caso se utilizó tomate y pepino, en tanto que en el segundo caso se realizó la transmisión por injerto de yema a citrange Troyer, mandarino Cleopatra, naranjo agrio, cidra Etrog y naranjo Pineapple.

3.2 Extracción del RNA

Con base en información existente, se seleccionaron para evaluación 5 métodos de extracción del RNA, cuatro de los cuales fueron originalmente diseñados para la detección de viroides en papa, lúpulo y cítricos, y un quinto método para uso más amplio en seres vivos. Todos los métodos fueron ligeramente modificados con respecto a su versión original.

Método Pfannenstiel y cois. (1980). Se pesó 1 g de tejido, se lavó con agua bidestilada y se secó con papel absorvente antes de colocarlo en el mortero para evitar su adhesión al mismo. Se transfirió la muestra al mortero y se le agregó nitrógeno líquido macerando con rapidez hasta pulverizar completamente y luego se transfirió el polvo a tubos de centrífuga (Nalgene, cat. 3119-0050) con capacidad de 50 mi y colocados previamente en hielo. Se le agregó a cada tubo 1 mi de agua tratada con dietil pirocarbonato, DEPC (Sigma), 0 . 4 mi de ácido etilendiaminotetracético sal disódica (Na2EDTA) 0.1 M, 0.4 mi de NH4OH 4 M y 1.2 mi

de LiCI 10 M. Se agitó en vortex cada solución y el coctel descongelando cuando fue necesario. Se agregaron 8 mi de fenol (Sigma) el cual fue saturado en solución de Tris-HCI 0.2 M pH 8 y se agitó en vortex.

(43)

Método de Chomczynski y Sacchi (1987). En un mortero estéril se molió 1 g de tejido vegetal con nitrógeno líquido y se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 mi. Se agregaron 10 mi de solución D (tiocianato de guanidina 4 M, citrato de sodio 25 mM , sarcosyl al 0.5% y 2-mercaptoetanol [Sigma] 0.1 M) y 1 mi de acetato de sodio 2 M pH 4 agitando por 1 min en vortex. Se añadieron 10 mi de fenol saturado y se agitó durante 2 min adicionales en vortex. Se agregaron 2 mi de una mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico 48:1 (v/v) y se volvió a agitar en vortex otros 3 min. Se centrifugó a 10,000 rpm por 20 min a 4°C. Posteriormente se recuperó la fase acuosa y se precipitó el RNA agregando 1 volumen de etanol absoluto (99.9%) frío, se agitó por inversión y se colocó a -20°C por lo menos 1 hora. Luego se centrifugó a 10,000 rpm por 20 min a 4°C, se decantó y se lavó el precipitado en dos ocasiones con etanol al 80%. Finalmente fue resuspendido el precipitado en 1 mi de agua tratada con DEPC.

Método de Pallás y cois. (1987). Debido a que el método original requiere de 20 g de tejido, todas las soluciones fueron ajustadas a la cuarta parte quedando de la siguiente manera: se maceraron 5 g de tejido de corteza en morteros con nitrógeno líquido. Se homogenizó con 4 mi de Tris-HCI 0.2 M pH 8.9, 1 mi de Na2EDTA 0.1 M pH

(44)

Método de Yang y cois. (1992). Un gramo de corteza de tejido fue cortado en piezas pequeñas de aproximadamente 1-2 cm2 y triturado con nitrógeno líquido. Se hizo una

extracción durante 20 min en 6 mi de una solución amortiguadora que contenía glicina-NaOH 0.1 M pH 9, NaCI 50 mM, Na2EDTA, dodecil sulfato de sodio (SDS) al

2% y sarcosina lauril de sodio (SLS) al 1%. Cada extracto de la muestra fue mezclado con 8 mi de fenol saturado con Tris-HCI 0.2 M pH 7.6 conteniendo 8-hidroxiquinoleina al 0.1% y 2-mercaptoetanol al 0.2% durante 15 min. Se agregaron 8 mi de cloroformo y se mezcló en vortex por otros 15 min. Las muestras fueron centrifugadas a 10,000 rpm durante 15 min y se recuperó la fase acuosa en otro tubo precipitándose los ácidos nucleicos por la adición de 2.5 volúmenes de etanol salado manteniéndose la mezcla a -20°C toda la noche.

Al día siguiente, los ácidos nucleicos fueron recuperados por centrifugación a 10,000 rpm durante 30 min en una centrífuga refrigerada (4°C). El precipitado fue disuelto en 1 mi de agua tratada con DEPC y almacenado a -20°C hasta su uso.

Método de Lee (1995). Para cada muestra se preparó un tubo de centrífuga de 50 mi con las siguientes soluciones: 18 mi de solución amortiguadora GPS 2X (glicina 0.2 M, Na2HP04 0.1 M y NaCI 0.6 M) estéril y con pH 9.6,2 mi de SDS al 10%, 200 ^l de

2-mercaptoetanol, 2.4 mi de fenol saturado y 2.6 mi de una solución de cloroformo-alcohol ¡soamílico, 12:1 v/v.

Se usaron 4 g de tejido de corteza joven para cada muestra, se molió con nitrógeno líquido usando un mortero y un brazo de porcelana. Se transfirió el polvo al tubo de centrífuga con los reactivos señalados, se cerró y se colocó en hielo agitando ocasionalmente en un vortex durante los siguientes 15-20 min. Se centrifugó a 10,000 rpm por 15 min. La fase acuosa (fracción superior) fue transferida a otro tubo de centrífuga estéril de 50 mi en el cual se habían colocado 6.8 mi de etanol absoluto (99.9%) y 1 g de celulosa CF-11, se ajustó el volumen a 20 mi con solución GPS 2X. Se cerró el tubo y se colocó en un vortex durante 15-20 min. Después de transcurrido este tiempo, se transfirió la solución a una minicolumna. Una vez que pasó todo el líquido a través de la celulosa CF-11, se lavó con 80 mi de solución amortiguadora STE 1X pH 6.9 (Tris 0.05 M, Na2EDTA 1 mM y NaCI 0.1 M) con 25% de etanol frío. El

(45)

noche a -20°C ó una hora a -70°C. Posteriormente se colectaron los ácidos nucleicos por centrifugación (10,000 rpm por 30 min) eliminando cuidadosamente el sobrenadante, se secó al ambiente y se resuspendieron en 400 \x\ de agua tratada con DEPC estéril. Estos 400 |xl fueron separados en 2 tubos Eppendorf, uno con 380 \i\ y otro con el resto (20 |xl ó más), al primer tubo se le agregaron 2.5 volúmenes de etanol absoluto más 0.1 volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.5. Ambos fueron almacenados a -20°C.

Con los 5 métodos descritos, se probó la variante con y sin purificación a través de una columna de celulosa CF-11 y extracción a partir de hoja y corteza. Se cuantificó la cantidad de RNA total por espectrofotometría y se visualizó en geles de agarosa y poliacrilamida. Adicionalmente se realizó una extracción por el método de Lee (1995) a los 1, 20, 40 y 60 días después de la colecta en una muestra de limón Persa.

Para el caso de la extracción en tubos de 50 mi, se utilizó una centrífuga Beckman modelo J2-21 con rotor JA-20.

3.2.1 Cuantificación de la cantidad y calidad del RNA. Para la cuantificación del RNA se utilizó un espectrofotómetro marca Beckman con luz UV modelo DU650 y se leyó la absorbancia a longitudes de onda de 260 y 280 nm respectivamente. En todos los casos se prepararon 2 repeticiones, una de ellas con el doble de concentración que la otra, dichas repeticiones fueron promediadas.

Para el cálculo de la concentración de RNA, se aplicó la siguiente fórmula:

volumen de la celda

RNA (ng/|¿l ó ^g/ml)= X 40 X absorbancia26o volumen de la muestra

de tal forma que:

RNA= 8000 X absorbancia26o para una dilución de 6.5 jil en 1300 [i\, y RNA= 4000 X a b s o r b a n c i a 2 6 0 para una dilución de 13 ni en 1300 ^l

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45 mM y Na2EDTA 1 mM) igual que para la preparación del gel, fraccionándose el RNA a 60 voltios (V) durante 15 mín, y otros 30 min adicionales, a 100 V.

3.3 Análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida

3.3.1 Establecimiento de la técnica. Para el establecimiento de la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida, se efectuaron análisis en geles nativos y geles desnaturalizantes siguiendo como base el procedimiento desarrollado por Rivera-Bustamante y cois. (1986). Junto con la implementación de la técnica, se consideró la optimización de factores involucrados en la separación del RNA, preparación y tinción de los geles. Los factores evaluados fueron: i) grosor del gel (0.75 y 1.5 mm); ii) ubicación de la zona viroidal' en el gel nativo para su corte y separación en un segundo gel; iii) tipo de solución amortiguadora para la preparación del gel y su corrimiento; iv) así como el pH de ambos; v) aplicación de corriente constante para la separación del RNA; vi) variación en las proporciones de los componentes de la solución fijadora (alcohol etílico-ácido acético-agua); vii) así como la tinción a base de bromuro de etidio y nitrato de plata.

En todos los experimentos de electroforesis en geles de poliacrilamida se utilizaron 2 cámaras verticales: una cámara acrílica de fabricación local con dimensiones del gel de 11 x 18 cm, y una cámara Mighty Small II (Hoefer, cat. SE250) con dimensión del gel de 10 X 8 cm; la primera adaptada a una fuente de poder ISS 250 y la segunda a una fuente de poder Hoefer (cat. PS500XT). Una descripción más detallada del procedimiento se describe a continuación.

Previo a la separación del RNA por electroforesis, se prepararon las muestras (RNA total) mismas que fueron colectadas por centrifugación (3 min a 10,000 rpm a temperatura ambiente), posteriormente se les dió un lavado con 200 jal de etanol al 80%, se secaron por inversión del tubo y se resuspendieron en 30 \i\ de agua Mili-Q .

(47)

electroforesis enjuagando los orificios dejados por el peine con solución TAE 1X (Tris 40 mM, acetato de sodio 20 mM y Na2EDTA 1 mM). Se precorríó el gel a 75 V durante 15 min, posteriormente se cargaron los orificios con 15 \i\ de la muestra adicionados de 2 jxl de colorante Halt (azul de bromofenol 0.3% y xilencianol 0.3% en glicerol al 70%) y se aplicó corriente constante de 40 miliamperios (mA) durante 15 min y 54 mA durante 2.5 horas adicionales o hasta que el colorante xilencianol estuvo a punto de salir (0.5-1 cm arriba del borde inferior). Se desensamblaron las placas de cristal y se cortó 1 cm de la parte inferior del gel, se removió el resto del gel y se volvieron a ensamblar los cristales (Fig, 2).

Cuadro 8. Soluciones necesarias para la preparación de geles nativos de poliacrilamida al 5% (A) y al 7% desnaturalizante con urea 8 M (B) dependiente del volumen a utilizar.

Solución/Volumen (mi) 5 10 15 20

Agua bidestilada estéril (mi) 3.63 7.25 10.9 14.5

TAE 10X pH 7.2 (mi) 0.5 1 1.5 2

Poliacrilamida al 30% (mi) 0.83 1.65 2.5 3.3

Temed (jxl) 6.25 12.5 18.8 25

Persulfato de amonio al 10% (|il) 50 100 150 200

(B)

Solución/Volumen (mi) 5 10 15 30

Urea (g) 2.4 4.8 7.2 14.4

Agua bidestilada estéril (mi) 1.4 2.7 4.1 8.2

TAE 3X pH 6.5 (mi) 0.5 1 1.5 3

Poliacrilamida al 30% (mi) 1.1 2.2 3.25 6.5

Temed (ul) 4.2 8.3 12.5 25

Persulfato de amonio al 10% (ni) 42 83 125 250

Se disuelve la urea con calor suave y agitación

(48)

" b r t r t r

muestras y colorante

Composición del gel: agua © TAE 1OX pH 7.2

corriente: 5 4 mA Poliacrilamida al 3 0 % temed

( J ) persulfato de amonio 1 0 % Solución de corrimiento: TAE 1X

i

tiempo: 2.5 horas

" L n _ n _ n

xilencianol

azul de bromofenol

"zona v i r o i d a l "

-7S RNA 5S, 4S

" L T U i r i

Fig. 2. Esquema con las características de la electroforesis en geles nativos de

poliacrilamida al 5% (1a. dirección).

PAGE al 7% desnaturalizante con urea 8 M. Una vez ensamblados los cristales y con un fragmento del gel nativo en la parte inferior, se procedió a mezclar en un vaso de precipitado las cantidades señaladas en el Cuadro 8B, se agitó la solución en una plancha magnética con calor, y una vez disuelta la urea se agregó la solución de poliacrilamida al 30%, el temed y el persulfato de amonio al 10%. Se vertió rapidamente la solución en las placas de cristal y se dejó polimerizar durante 1 hora. Se rellenaron los reservorios de la cámara electroforética con solución amortiguadora TBE 1X (Tris 22.5 mM, ácido bórico 22.5 mM y Na2EDTA 0.5 mM) pH

(49)

CCaVd y CEVd lineales , RNA 7S

C C a V d ^ e l u c i ó n Y

CEVdc prueba de infectividad

CCaVd y CEVd lineales, RNA 7S

CCaVd circular CEVd circular

Composición del gel: urea 8 M agua

TAE 3X pH 6.5

poliacrilamida al 30% temed

persulfato de amonio 10% Solución de corrimiento:TBE 1X pH 8.3

Fig. 3. Esquema con las características de la electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes con urea 8 M (2a. dirección).

Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata. La tinción de los geles con nitrato de plata se realizó tomando como base el procedimiento de Igloi (1983) el cual consiste en los pasos siguientes:

1. Fijar el gel en una solución de alcohol etílico-ácido acético-agua en proporción 50-10-40 durante 60 min o toda la noche.

2. Sumergir el gel en una solución de alcohol etílico-ácido acético-agua en proporción 10-1-89 durante 60 min adicionales.

3. Teñir con nitrato de plata 12 mM (0.2%) durante 60 min. 4. Enjuagar con agua bidestilada 2 ó 3 veces.

5. Revelar con KOH 0.75 M (6.4 g KOH, 1.12 mi de formaldehido y 150 mi de agua) hasta que aparezcan las bandas.

dPAGE 7% urea 8 M

o

corriente: 15 mA

o

"zona viroidal"

tiempo: 2-4 horas

tinción con bromuro de etidio

xilenciam

(50)

6. Cuando fue requerido, la reacción de revelado fue parada con ácido acético al 5% o con Na2C030.07 M.

Para la realización de las pruebas de infectividad, se eluyeron las bandas de los viroides obtenidas en el gel desnaturalizante las cuales fueron cortadas con un grosor aproximado de 5 mm y colocadas en tubos Eppendorf de 1.5 mi al cual se le agregó solución amortiguadora de glicina 0.05 M y K2HPO4 0.03 M pH 9.2 (Morris y

Smith, 1977).

3.3.2 Comparación de métodos de extracción del RNA en la detección directa. En la búsqueda de un método de extracción de RNA con mayor selectividad hacia el RNA viroidal, se compararon los 5 métodos descritos anteriormente a partir de 2 tejidos vegetales (corteza y hoja) de cidra Etrog {Citrus medica L.) con reacción a exocortis por la inoculación previa. Con el fin de homogenizar dicha comparación, después de la extracción original se adicionó un paso final de purificación haciendo pasar el extracto a través de una columna de celulosa CF-11 en todos los métodos. El principal criterio de comparación fue la aparición y resolución del RNA del viroide en el gel desnaturalizante, aunque también se consideró un análisis de la cantidad y calidad del RNA.

3.3.3 Validación de la técnica. Una vez establecida la técnica de electroforesis secuencial y después de definir el mejor método de extracción del RNA para la detección de viroides por electroforesis, se validó la técnica con muestras de naranjo dulce de un lote de variedades del CEGET localizado en General Terán, N.L. y muestras de limón Persa colectadas en los estados de Tamaulipas, Veracruz, Tabasco y Yucatán, tal y como se describió en la sección de Fuente de viroides y material vegetal.

3.4 Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa

Figure

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