Evaluación Morfológica del bazo del sapo gigante Rhinella marina expuesto a una mezcla de contaminantes en una zona de Coatzacoalcos, Ver

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Texto completo

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E

VALUACIÓN MORFOLÓGICA DEL BAZO DE SAPO GIGANTE

(

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HINELLA MARINA

),

EXPUESTO A UNA MEZCLA DE CONTAMINANTES EN

LA ZONA DE

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EVALUACIÓN MORFOLÓGICA DEL BAZO DE SAPO GIGANTE

(

R

HINELLA MARINA

),

EXPUESTO A UNA MEZCLA DE CONTAMINANTES EN

LA ZONA DE

C

OATZACOALCOS

,

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ESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS AMBIENTALES

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3

PROYECTO REALIZADO EN:

DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL Y DEPARTAMENTO DE

BIOQUÍMICA

DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ.

CON FINANCIAMIENTO DE:

ESTUDIO DE LA MORFOLOGÍA DEL BAZO DE

R

HINELLA MARINA (SAPO GIGANTE) EXPUESTO A MEZCLAS DE CONTAMINANTES EN LA ZONA DE COATZACOALCOS,

VERACRUZ.

C09-FAI-03-16.16

MONITOREO AMBIENTAL, DETERMINANTES DE LA EXPOSICIÓN Y EFECTOS DE

CONTAMINANTES CRÍTICOS EN HUMANOS Y BIOTA EN COATZACOALCOS,

VERACRUZ.

INE/A1-047/2007

(4)

4

Contenido

1 INTRODUCCIÓN ... 9

1.1 Compuestos tóxicos: situación global. ... 9

1.1.1 Contaminantes en México. ... 10

1.2 Ecotoxicología. ... 16

1.2.1 Biomarcadores. ... 17

1.3 Los anfibios. ... 22

1.3.1 Características fisiológicas y comportamiento. ... 22

1.3.2 Sapo gigante (Rhinella marina). ... 23

1.4 El bazo. ... 26

1.4.1 Descripción. ... 26

1.4.2 Morfología. ... 26

1.4.3 Función ... 27

2 JUSTIFICACIÓN ... 28

3 HIPÓTESIS ... 28

4 OBJETIVO GENERAL ... 29

5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 29

6 MATERIAL Y MÉTODOS ... 29

6.1 Muestras biológicas. ... 29

6.2 Equipo. ... 29

6.3 Reactivos. ... 30

6.4 Metodología. ... 31

6.4.1 Descripción de la zona de estudio. ... 31

6.4.2 Muestreo. ... 32

6.4.3 Análisis histológico. ... 34

6.4.4 Análisis morfométrico. ... 35

7 RESULTADOS ... 36

7.1 Análisis histológico. ... 36

7.1.1 Análisis cualitativo... 38

7.1.2 Análisis morfométrico. ... 44

(5)

5

8 DISCUSIÓN ... 54

9 CONCLUSIONES ... 60

10 ANEXO I ... 62

10.1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ... 62

10.1.1 Fijador ... 62

10.1.2 Preparación de alcoholes. ... 62

10.1.3 Preparación de laminillas. ... 62

10.1.4 Técnica de Hematoxilina-Eosina. ... 63

10.1.5 Técnica de Fontana-Masson. ... 64

10.1.6 Técnica de Perls... 65

10.1.7 Técnica de Gomori. ... 66

11 ANEXO II ... 68

11.1 Preparación de laminillas. ... 68

12 ANEXO III ... 69

12.1 TINCIONES. ... 69

12.1.1 Técnica de Hematoxilina – Eosina. ... 69

12.1.2 Técnica de Fontana-Masson. ... 69

12.1.3 Técnica de Perls (1867). ... 70

12.1.4 Técnica de Gomori (1950). ... 71

13 NOMENCLATURA ... 72

(6)

6

Índice de figuras

Figura 1. Diagrama esquemático de la producción de hemosiderina……………….………20

Figura 2. Sapo gigante adulto. ……….………...24

Figura 3. Distribución mundial del sapo gigante. ...……….…………..24

Figura 4. Ubicación anatómica del bazo en sapos gigantes……….………...26

Figura 5. Representación esquemática de la histología del bazo….……..………..26

Figura 6. Localización de Coatzacoalcos, Veracruz, México……….………..……...31

Figura 7. Localización de zonas de muestreo ……….………..33

Figura 8 Diagrama de procesamiento de muestras………..………..….34

Figura 9. Metodología para el análisis de imágenes…..………..……….………..35

Figura 10. Fotomicrografías de la morfología general del bazo de sapo gigante.……….36

Figura 11. Fotomicrografías de los CMM en el bazo de sapo gigante. ………..37

Figura 12. Bazo de sapo gigante de la zona rural.. ... 38

Figura 13. Bazo de sapo gigante de la zona urbana-industrial.. ... 39

Figura 14. Bazo de sapo gigante de la zona industrial. ... 40

Figura 15. Fotomicrografías de bazo de sapo gigante de la zona rural.. ... 41

Figura 16. Bazo de sapo gigante de la zona urbana-industrial. ... 42

Figura 17. Bazo de sapo gigante de la zona industrial.. ... 43

Figura 18. Bazo de sapo gigante……….……….44

Figura 19. Gráfica de NCMMM: número de CMM con melanina por tipo de sitio.……….…….45

Figura 20. Gráfica de %ACMMM: porcentaje de área ocupada por CMM con melanina por tipo de sitio……….46

Figura 21. Gráfica de TCMMM: tamaño promedio de los CMM con melanina por tipo de sitio.…..…….47

Figura 22. NCMMH: Número de CMM con hemosiderina por tipo de sitio………..….……48

Figura 23. %ACMMH: Porcentaje de área ocupada por CMM con hemosiderina por tipo de sitio……….……49

Figura 24. TCMMH: Tamaño de CMM con hemosiderina por tipo de sitio………...…..49

Figura 25. NCMML: Número de CMM con lipofuscina por tipo de sitio. ……….…..50

Figura 26. %ACMML: Porcentaje de área ocupada por CMM con lipofuscina por tipo de sitio...…………51

Figura 27. TCMML: Tamaño de CMM con lipofuscina por tipo de sitio. ……….……….51

Figura 28. Gráfica de correlación entre pigmentos..………..……….52

(7)

7

Índice de tablas

(8)

8

RESUMEN

Los centros de melano macrófagos (CMM) son acumulaciones de células pigmentadas,

que pueden encontrarse en el parénquima de órganos como el hígado, el riñón, el bazo y las

gónadas de peces, anfibios y reptiles. Se ha reportado que los CMM de peces, se ven

incrementados como consecuencia de la exposición a sustancias tóxicas, así como por la edad,

época del año, periodo reproductivo, nutrición y enfermedades. Los pigmentos que contienen

son: melanina, hemosiderina y lipofuscina. (Agius y Roberts, 2003).

Los anfibios como el sapo gigante, se caracterizan por poseer una piel permeable y porque

su ciclo de vida es tanto acuático como terrestre. Ecológicamente, los sapos ayudan a controlar

ciertas plagas, ya que se alimentan de insectos, así como de otros objetos (Zug y Zug, 1979);

por lo que estos organismos, representan una parte fundamental del ecosistema, así como

varias vías y rutas de exposición.

Se realizó la cuantificación de los CMM en cortes histológicos del bazo de los sapos

gigantes de la zona de Coatzacoalcos, Veracruz, (N=70), teñidos con tres técnicas

histoquímicas para identificar los pigmentos que contienen. Las muestras se agruparon en tres

tipos de sitios de acuerdo con el tipo de actividad que se desarrolla en cada uno: industrial,

urbano-industrial y rural. No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los CMM

de los tres grupos antes mencionados (ANOVA P>0.05) para ninguno de los pigmentos, sin

embargo, se observó que en la zona industrial, los resultados de hemosiderina y la lipofuscina

tienden a presentar mayor variabilidad, siendo la zona rural donde los datos se presentaron de

forma más homogénea. Mientras que en el caso de la melanina, la zona urbana-industrial es

donde se presenta la mayor variabilidad en los resultados. Es importante mencionar que la

dispersión de los resultados, hace referencia a la variabilidad de exposición y a la

susceptibilidad de los individuos en las zonas impactadas.

Aunque los resultados obtenidos, no fueron contundentes en cuanto a la utilidad de los

CMM como biomarcadores en los sapos gigantes; no se descarta la utilidad de estos, ya que

probablemente la exposición a los contaminantes, fue similar entre los sitios, ya que las

condiciones ambientales (temperatura, humedad, etc.) y las características fisicoquímicas de

los contaminantes favorecen su dispersión de un lugar a otro. (Walker, 2009). Aunado al hecho

de que los CMM son biomarcadores inespecíficos y que por tanto pueden estar respondiendo a

otros factores tanto internos como externos. (Montero y cols., 1999; Jordanova y cols., 2006;

(9)

9

1 INTRODUCCIÓN

1.1.1 Compuestos tóxicos: situación global.

El desarrollo tecnológico ha traído consigo grandes beneficios para la humanidad:

energía, electricidad, aumento en la producción de alimentos, salud, entre otros. Sin embargo,

todos estos avances conllevan un costo ambiental, como la emisión de gases y compuestos de

desecho al medio ambiente, contaminando así el aire, el suelo y el agua, lo que puede

ocasionar daños severos en los seres vivos incluyendo el hombre. (Commoner, 1992). Algunas

sustancias de desecho pueden ser tóxicas para los organismos que se encuentran en contacto

con ellos. Un compuesto tóxico, es aquel que tiene la capacidad de ocasionar daño, de

intoxicar o en casos extremos hasta de causar la muerte de un organismo vivo. Sin embargo,

esta capacidad depende de diversos factores como: el tiempo y la ruta de exposición, la dosis,

las condiciones del individuo receptor, etc. (Nebel y Wright, 2000).

En la actualidad existen una gran variedad de agentes tóxicos, algunos de forma natural

como los metales pesados, entre ellos Pb, Hg, Cd, Mn y metaloides como el As, por ejemplo.

Sin embargo, a partir de la revolución industrial y el inicio de la química orgánica en 1828 con

los experimentos de Wöhler, se produjo un incremento masivo en la cantidad y el número de

sustancias nuevas y nocivas en el mundo. (Commoner, 1992).

Se ha calculado que en el año 2000 existían 70 000 sustancias químicas en el mercado,

muchas de ellas son capaces de ingresar al organismo y causar efectos nocivos. Se ha

reportado que una persona estadounidense común presenta en su tejido graso al menos 700

sustancias exógenas. (Thornton, 2000).

El Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos (USNTP, por sus siglas en

inglés) realiza evaluaciones y perfiles toxicocinéticos de 10 a 20 compuestos nuevos cada año,

sin embargo la forma acelerada con la que aparecen nuevas sustancias impide un avance real,

ya que la industria química del mundo produce de 500 a 1000 químicos nuevos por año. Esto

implica que de la mayoría de los nuevos compuestos químicos producidos, se desconocen sus

efectos o bien están subestimados. (Thornton, 2000).

A pesar de los intentos por desarrollar tecnologías y procedimientos que reduzcan las

emisiones y mitiguen los impactos de los contaminantes en el ambiente, en muchas ocasiones

(10)

10

contaminantes de forma global, que no son selectivos y que pueden dañar la biosfera.

(Thornton, 2000).

1.1.2 Contaminantes en México.

Se estima que en México se utilizan alrededor de cien mil compuestos químicos para

diferentes fines, y que de éstos únicamente entre mil y dos mil, resultan peligrosos. Sin

embargo, resulta muy arriesgado decir que el resto de las sustancias son inofensivas y que no

representan riesgo alguno para la salud, si no se cuenta con bases científicas que lo confirmen.

Las empresas que pertenecen al Padrón de Generadores de Residuos Peligrosos (27 465

industrias) reportaron que para el periodo de 2004 a 2008, se generaron un millón veinticinco

mil ciento veintiocho toneladas de residuos peligrosos, dentro de los que se encuentran las

sustancias tóxicas. (SEMARNAT, 2009).

Para el año 2004, se tenían registrados 297 zonas contaminadas con compuestos

peligrosos, de los cuales 119 estaban caracterizados y 12 de ellos estaban rehabilitados o en el

proceso. Cuatro años después, en el 2008, se incrementó el número de sitios contaminados a

333. La industria química y petroquímica del país aporta la mayor parte de la materia prima

para otras industrias, tan solo en el año 2006 el 40.5 % de los 19.6 millones de toneladas de

compuestos químicos corresponden a petroquímicos de PEMEX. (SEMARNAT, 2009).

Además de la industria química y petroquímica, la minería representa otra importante

fuente de contaminantes. Aunado a esto, se presentan diversos accidentes o derrames de

compuestos tóxicos durante el transporte y manejo de la producción. Se calculó que entre 1997

y 1999 se presentaron alrededor de 550 de estas emergencias al año en el país, donde el 40%

correspondieron al manejo del petróleo crudo y otro 27% a los combustibles. (INE, fuentes de

contaminación en México, 2010).

En la zona aledaña al río Coatzacoalcos, se ubican diversos complejos de PEMEX de

gran importancia para el país debido a la magnitud de su producción, así mismo, este sitio ha

sido considerado como uno de los más contaminados del país, debido a las emisiones,

(11)

11

1.1.2.1 Problemática ambiental de Coatzacoalcos.

La instalación de los complejos petroquímicos e industriales, así como el crecimiento de

las zonas urbanas ocasionaron la pérdida de las condiciones naturales en los alrededores del

río Coatzacoalcos. El sistema de ductos, el transporte de los hidrocarburos y los accidentes

han ocasionado graves problemas al sitio. (Bozada y Bejarano, 2006).

Actualmente, la zona de Coatzacoalcos se considera como uno de los centros

industriales más importantes del país, donde destacan las industrias químicas y petroquímicas.

A continuación se mencionan algunas de ellas y sus productos:

Tabla 2. Industrias presentes en la zona de Coatzacoalcos y sus productos. (Bozada y Bejarano,2006; PEMEX, 2010).

EMPRESA

PRODUCTO

PEMEX

Petroquímica:

los

complejos

de

Cangrejera, Morelos y Pajaritos.

PEMEX Refinación

PEMEX Gas y Petroquímica Básica.

Petróleo crudo e hidrocarburos

derivados.

Además

de:

Acetaldehído, estireno, etileno,

oxígeno, polietileno, óxido de

etileno y cloruro de vinilo II y III.

Agronitrogenados, S.A.

A.W. Troy, S.A.

Agroquímicos y fertilizantes.

Cloro de Tehuantepec, S.A.

Industrias Químicas del Istmo, S.A.

Cloro y sosa cáustica.

Grupo Idesa

Celanese Mexicana, S.A.

Industrias Cydsa-Bayer, S.A.,

Resirene, S.A.

Productos Químicos Coin, S.A.

Producción y distribución de

productos

químicos

y

petroquímicos.

Sales del Istmo

Producción de sal.

El crecimiento industrial, ha traído consigo el desarrollo de la zona urbana y los

desechos generados por la población han sido vertidos a las aguas del río Coatzacoalcos, por

lo que, estudios microbiológicos realizados a sus aguas, han demostrado la presencia crónica

de contaminación microbiológica; hay que añadir la problemática de los incendios forestales en

la zona de los humedales, además del uso de plaguicidas para el control de vectores. (Bozada

y Bejarano, 2006).

En un estudio realizado por la red internacional para la eliminación de los compuestos

orgánicos persistentes (IPEN, International POPs Elimination Network) en las zonas aledañas

(12)

12

el lugar presentan altos niveles de dioxinas, bifenilos policlorados (PCBs) y hexaclorobenceno

(HCB), esto muy por encima de los niveles observados en Europa y los establecidos por

Estados Unidos de América.

El análisis químico de sedimentos de la zonas aledañas al complejo petroquímico

Pajaritos, realizado por Stringer y cols., (2001) observaron que aguas arriba de la zona de

descarga de desechos, las concentraciones de los contaminantes son bajas y en algunos

casos no detectables, encontrando únicamente zinc, manganeso y 1,4-diclorobenceno. Las

muestras de sedimento obtenidas aguas debajo de la zona de descargas mostraron la

presencia de: 1,2-diclorobenceno, 1,4-diclorobenceno, dietil ftalato, hexaclorobenceno (HCB) y

9 hidrocarburos alifáticos además de mercurio, cobre, zinc, cromo y plomo. Siguiendo ese

curso aguas abajo, la muestra de sedimento registró un aumento en la concentración de

contaminantes sobre todo en lo que se refiere a mercurio, cobre, plomo y zinc, además de que

se reportan más de 100 compuestos orgánicos detectables de los cuales se identificaron 9

clorobencenos, 3 PCBs y diversos hidrocarburos. Los análisis en diferentes puntos en los

alrededores del complejo petroquímico Pajaritos muestran variaciones en la composición de la

mezcla de contaminantes, sin embargo es claro que las aguas y sedimentos en las zonas

arriba de la descarga presentan una menor cantidad de contaminantes y a concentraciones

menores. (Stringer y cols., 2001).

Ruelas-Inzunza y cols., (2007), estudiaron peces que habitaban en el río Coatzacoalcos

y encontraron plomo en músculo, branquias e hígado, así como en almejas. Donde las

concentraciones más altas encontradas se registraron en el riachuelo San Francisco, mientras

que las más bajas se presentaron en la laguna El Ostión, considerada como sitio de referencia.

También se realizó la determinación de plomo en tejidos de almejas, y se demostró que las

concentraciones más altas se presentaron en las muestras recolectadas del río Calzadas,

comparadas con el sitio de referencia (Hidalgotitlán).

El informe técnico del proyecto: “Diseño y aplicación de una metodología para la

evaluación integrada de riesgos ambientales en sitios contaminados de México: caso de

estudio Coatzacoalcos, Veracruz” INE, (2007), reportó la presencia de los siguientes metales

en suelo y sedimento: Al, As, Be, Cd, Cr (VI), Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Se, Ti y V, sin embargo

ninguno de ellos se encontró por arriba de los niveles de la NOM-147-SEMARNAT/SSA-2004.

Además se detectó la presencia de los siguientes compuestos orgánicos persistentes (COPs):

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13

químico de las muestras biológicas demostró que la mayor parte de estos contaminantes se

encuentra en forma biodisponible.

La presencia de metales y COPs en Coatzacoalcos (aun en niveles por debajo de la

norma) sugieren la presencia de una mezcla muy compleja de contaminantes.

1.1.2.1.1 Contaminantes orgánicos.

Cuando se habla de contaminación por compuestos orgánicos, se hace referencia

principalmente a sustancias químicas creadas de forma sintética por el hombre. Existen

además otros contaminantes orgánicos que se pueden encontrar de forma natural, como los

hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) o la forma orgánica del mercurio. (Walker, 2009).

Dentro del grupo de los compuestos orgánicos, podemos encontrar a los COPs, los cuales son

químicos sintéticos que pueden persistir por largo tiempo en el ambiente, bioacumularse y

biomagnificarse, así como causar efectos tóxicos en los organismos expuestos. (UNEP,

consultado 2010). La bioacumulación es un término utilizado para referirse a la concentración

de un compuesto o elemento químico (generalmente orgánico) que presenta un organismo, y

que suele ser mayor a la concentración presente en el medio en el que habita. La magnitud a la

que un agente tóxico puede bioacumularse depende de la absorción y la vía por la cual se llevó

a cabo, los procesos de metabolismo y excreción, el contenido graso del organismo, la

polaridad de la sustancia, otros factores biológicos, físicos y ambientales. Se pude decir de

forma general que cuanto mayor sea la hidrofobicidad de una sustancia, su bioacumulación

aumentará de forma proporcional, si se expresa través del coeficiente de partición octanol-agua

(Kow), tanto mayor sea su valor, el compuesto tendrá una mayor bioacumulación. (USGS,

bioaccumulation, 2010). Por otro lado, la biomagnificación es el término usado para referirse a

la bioacumulación de una sustancia a través de la red trófica, es decir, los organismos que se

encuentran en los últimos niveles (consumidores terciarios), van a presentar mayores

concentraciones de éste compuesto en su organismo que aquellos que son su alimento.

(USGS, biomagnification, 2010).

Algunos de los COPs fueron creados intencionalmente, sin embargo otros son

productos alternos de diferentes procesos y tienen usos diversos, sobretodo como plaguicidas

y algunos aditivos. (EPA, POPs, 2010). Originalmente, los compuestos considerados como

COPs por el convenio de Estocolmo son: aldrín, clordano, dieldrín, dioxinas, DDT, endrín,

(14)

14

recientemente a la lista: clordecano, hexabromodifenil, hexabromodifenil éter,

heptabromodifenil éter, α-HCH, β-HCH, γ-HCH, pentaclorobenceno, ácido perfluorooctano

sulfónico, fluoruro perfluorooctano sulfonil, tetrabromodifenil éter y pentabromodifenil éter.

(Stockholm convention on persistent organic pollutants POPs, consultado 2010).

Los efectos tóxicos de los contaminantes orgánicos, son muy diversos y dependen de

varios factores como son: la duración, frecuencia, dosis, vía y ruta de exposición, así como las

propiedades fisicoquímicas del compuesto; y en los organismos influye el sitio de acción

(órgano blanco), tipo de metabolismo, así como el sitio de almacenamiento. (Walker, 2009).

Los PAHs son productos de la combustión incompleta de materia orgánica, debido a ello

son contaminantes ubicuos. Éstos tienen la capacidad de bioacumularse sin embargo, debido a

que se metabolizan rápidamente en el organismo, no se biomagnifican. (IARC monographs,

consultado 2010). Pueden ocasionar problemas reproductivos en ratas expuestas durante la

gestación, así como en sus crías. También, éstas pueden presentar defectos congénitos y bajo

peso al nacimiento. (ATSDR, 1996).

Por otro lado, estudios de laboratorio han demostrado una serie de alteraciones

inmunológicas (atrofia del timo y del bazo, baja respuesta de los anticuerpos y susceptibilidad a

infecciones virales), en organismos expuestos a la mezcla comercial de PCBs (Aroclor).

(ATSDR, 2001). Bursian, y cols., (2006), reportan la proliferación de células escamosas en

mandíbulas y maxilar de peces juveniles de la especie Mustela vison, expuestos a PCBs (0.96

µg/g de alimento) y la equivalencia tóxica de la dioxina TCDD (9.2 pg/g de alimento), además

sugieren que un aumento de la dosis, podría ocasionar la pérdida de los dientes, lo cual

disminuiría la supervivencia de éstos organismos. La Agencia Internacional para la

Investigación del Cáncer, (IARC, por sus siglas en inglés) y la Agencia de Protección del

Ambiente de los Estados Unidos de América (EPA, por sus siglas en inglés) los han clasificado

como probables cancerígenos para seres humanos. (ATSDR, 2001).

Dentro de los compuestos orgánicos volátiles podemos encontrar al benceno, el cual

está clasificado como un agente cancerígeno por la IARC y la EPA, se sabe que en humanos

puede ocasionar leucemia mieloide aguda. (ATSDR, 2007).

El mercurio es un elemento metálico que se encuentra de forma líquida en la naturaleza.

En un estudio controlado realizado por Devlin, (2006), en el cual se expuso a embriones de

(15)

15

registró el desarrollo de deformaciones de la columna vertebral de los peces, así mismo, tejido

desorganizado en la aleta media, edema en el pericardio, malformaciones cardiacas,

mandíbula inferior más pequeña y microoftalmia. Meinelt, y cols., (1997), reportan la existencia

de correlación positiva entre la concentración de metil mercurio y el número de centros de

melano macrófagos (CMM) en hígado, bazo y riñón de peces de la especie Esox lucius del río

Oder.

Existe una gran cantidad de plaguicidas, que incluyen los insecticidas, herbicidas,

fungicidas, acaricidas, etc. (Walker, 2009). Químicamente podemos mencionar los

organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, etc. Muchos plaguicidas, sobre

todo los organoclorados, son altamente persistentes y por lo tanto se bioacumulan y

biomagnifican comúnmente. Por ejemplo, el DDT y sus metabolitos pueden ocasionar daños en

los procesos reproductivos y de desarrollo, debido a que tienen actividad estrogénica. Se ha

registrado que en algunas aves como el águila calva el DDT ocasiona el adelgazamiento de los

cascarones de huevo, infertilidad y fetotoxicidad. (EPA, POPs, 2010).

Shenoy, y cols., (2009), realizaron un estudio con larvas de la especie Rana pipens,

exponiéndolas de forma controlada y por separado a endosulfán (organoclorado) y mancozeb

(carbamato) (0.2 µg/L y 16 µg/L, respectivamente) y encontraron que a esas concentraciones

inhiben el desarrollo de las larvas y pueden ser letales. Un estudio realizado por Hayes y cols.,

(2006), reportan daño en el timo e inmunosupresión en ranas de la especie Rana pipens como

consecuencia de la exposición a nueve plaguicidas (cuatro herbicidas, dos fungicidas y tres

insecticidas), los mismos plaguicidas fueron administrados individualmente, y se observó que

algunos disminuían el desarrollo de las larvas, sin embargo, comparando con los efectos

generados por la mezcla, éstos fueron menores.

1.1.2.1.2 Metales pesados.

Poleksic, y cols., (2009), estudiaron peces de la especie Acipenser ruthenus, que

habitan el Río Danubio. Los peces se colectaron en tres sitios diferentes y se analizaron las

concentraciones de Cd, As, Pb, Cr, Hg, Cu, Ni, Fe, Mn, y Zn, en branquias, músculo, hígado e

intestino, así como la histología de los tejidos. Se reportó que la presencia de alteraciones

histopatológicas, correlaciona de forma positiva con la concentración de metales.

El plomo es un metal pesado que puede provocar alteraciones hematológicas y del

(16)

16

alterar la calidad espermática. (EPA, toxicity profiles, 2010). Un estudio controlado de

laboratorio, demostró que la exposición de embriones de la especie Bufo arenarum a 30 mg de

Pb /L, después de 72 horas, ocasiona que se detenga el desarrollo y crecimiento además de

deformidad del eje céfalocaudal. Cuando las concentraciones fueron de 10 a 20 mg de

plomo/L, nuevamente el desarrollo se vio afectado, disminuyendo la talla (comparado con los

controles) así como el desarrollo de branquias y aletas. (Sandoval y cols., 2004).

Suresh, (2009), realizó un estudio en el cual se expusieron peces de la especie Tilapia

mossambica a 20.93 mg/L de cloruro de cadmio por 120 h, reportando que el número y tamaño

de los CMM fueron mayores que en los peces control. Un estudio realizado por James y Little,

(2003), reporta una disminución en la supervivencia y la metamorfosis, en larvas de sapos de la

especie Bufo americanus, cuando han sido expuestos a concentraciones de 540 µg/L de

cadmio, mientras que a concentraciones de 5 a 54 µg/L se reporta un aumento en el

crecimiento de los organismos comparado con el grupo control.

Es importante resaltar, la gran cantidad de efectos adversos ocasionados por los

contaminantes ambientales anteriormente mencionados, además de que se ha reportado que

los efectos de una mezcla química difieren de los efectos que provocan cada uno de sus

componentes de forma individual. (Pestizid Aktions Netzwerk, 2007).

1.2 Ecotoxicología.

La ecotoxicología estudia el impacto de las sustancias tóxicas en los procesos normales

de los ecosistemas naturales, como son el intercambio de materia y energía, la estructura de

las redes tróficas, la composición de las poblaciones y de las comunidades. (Clements y Rohr,

2009; Galloway y Depledge., 2001). Ésta ciencia, proporciona las bases técnicas y científicas

para la evaluación de riesgo ecológico, identificando y caracterizando los posibles efectos

ocasionados por la presencia de compuestos y sustancias tóxicas en los ecosistemas, lo cual

es de gran utilidad para poder diseñar las medidas de prevención y disminución del riesgo.

(Calow y Forbes, 2003). Cuando se estudian ecosistemas, se debe tomar en cuenta que los

contaminantes tóxicos no se presentan de manera aislada sino en mezclas, o bien combinados

con agentes nocivos físicos y biológicos. Además de lo anterior, los escenarios que se evalúan

suelen ser ampliamente complejos debido a procesos naturales como son: cambios en la

(17)

17

ambiente y la estructura de la red trófica, además de los diferentes niveles de organización

biológica. (Eggen, y cols., 2004). Para evaluar los efectos ocasionados por los agentes tóxicos,

se utilizan diversas herramientas como son los biomarcadores.

1.2.1 Biomarcadores.

Un biomarcador, es un parámetro biológico que proporciona un valor cualitativo o

cuantitativo como respuesta a la exposición a un agente tóxico. (Chambers y cols. 2002; Handy

y cols., 2002). La respuesta generada por la exposición a un agente químico depende de

factores como la herencia genética del organismo, su tipo de alimentación, su comportamiento,

las propiedades fisicoquímicas del compuesto, la dosis, duración y frecuencia de la exposición,

así como la vía y ruta de exposición. (EHC 155, 1993).

Los biomarcadores pueden estudiar las alteraciones en los diferentes parámetros

biológicos de los organismos, por ejemplo, la modificación de factores fisiológicos, histológicos,

bioquímicos y en ocasiones los genéticos, que pueden relacionarse con susceptibilidad. (Afshar

y cols., 2008; Handy y cols., 2003). La aplicación de los biomarcadores se lleva a cabo en

evaluaciones de riesgo en salud, el diagnóstico clínico, así como en los estudios de

biomonitoreo. (EHC 155, 1993).

Los biomarcadores pueden clasificarse en:

o Biomarcadores de exposición, los cuales permiten demostrar que un organismo

o población se encuentra expuesto a un compuesto tóxico o un agente

estresante.

o Biomarcadores de efecto, que se encuentran directamente relacionados con el

mecanismo de acción del compuesto tóxico en un organismo. (Chambers, y

cols., 2002).

o Biomarcadores de susceptibilidad, indican la capacidad innata o adquirida de un

organismo, para responder adecuadamente cuando se encuentra expuesto a

algún xenobiótico. (EHC 155, 1993).

Los biomarcadores de exposición pueden evaluar la dosis externa (concentración de

(18)

18

organismo), y la interna, que es la concentración o cantidad del compuesto químico absorbido

por el organismo en un tiempo determinado. (EHC 155, 1993; Gil y Pla, 2001).

Por otro lado, los biomarcadores de efecto son la medida en la que los parámetros

biológicos, se ven alterados como respuesta a la exposición a ciertos factores ambientales, así

como a agentes tóxicos. (Chambers, y cols., 2002). Es importante resaltar que los mejores

biomarcadores de efecto tóxico, son aquellos que demuestran que hay una alteración en las

funciones normales ya sea de una célula, un tejido u organismo, de forma específica y sensible

a un agente tóxico o a un grupo de ellos. (Handy y cols., 2003). Handy y Depledge, (1999),

sugieren que es mejor realizar una batería de biomarcadores a diferentes niveles de

organización biológica, para evaluar los efectos de la contaminación ambiental, ellos proponen

que se utilicen marcadores moleculares, celulares y fisiológicos, para evaluar la mayor parte de

efectos posibles ocurridos. Es importante que al seleccionar los biomarcadores a utilizar, sean

considerados tanto sus ventajas como sus desventajas. Por ejemplo, el tiempo en el cual los

efectos permanecen en el organismo, cuál es el órgano blanco, además de su sensibilidad y las

posibles variables externas que lo puedan alterar.

En este caso, nos enfocamos a los biomarcadores histológicos. Este tipo de

biomarcador nos permite evaluar los efectos de la exposición a compuestos tóxicos a nivel

tisular. (Adeyemo, 2008). La histología es la ciencia que se encarga del estudio de los tejidos,

los cuales, se pueden definir como conjuntos de células con funciones y origen común, que

realizan actividades especializadas. (Tortora y Grabowski, 2000). Por otro lado, la

histopatología se encarga del estudio de los cambios estructurales y funcionales de las células,

tejidos y órganos que pueden ser causa o consecuencia de enfermedades. (Adeyemo, 2008).

Las características de los biomarcadores histológicos son:

 Permiten evaluar la morfología de los diversos órganos, tejidos y células de

organismos expuestos a agentes tóxicos de forma aguda o crónica.

 Se pueden utilizar tanto para valorar exposición como efecto.

 Ofrecen resultados cualitativos y/o cuantitativos. (Handy y cols., 2003).

Así mismo, los estudios morfológicos pueden proporcionar datos más confiables en lo

que respecta a la salud del organismo, en comparación con algunos parámetros

hematológicos, debido principalmente a que pueden permanecer por más tiempo en el

(19)

19

Handy y cols., (2002), proponen el uso de los biomarcadores histopatológicos en peces,

como un indicador de la calidad del agua en la que habitan. La aplicación de éstos, puede

llevarse a cabo en un campo muy amplio, donde se pueden aplicar a diferentes especies,

distintos órganos y/o tejidos, con diferentes elementos tóxicos, en condiciones controladas de

laboratorio, o bien en condiciones de campo. Por ejemplo, Stehr y cols., (1997), reportan una

relación directa entre las alteraciones hepáticas en peces y su exposición a PAHs, PCBs, DDT,

clordanos y dieldrín en sedimento y tejidos, esto durante un estudio no controlado, mientras

que Adeyemo, (2008), realizó un estudio controlado en laboratorio donde reporta efectos

histológicos adversos en ovarios y agallas de peces expuestos a plomo. Por otro lado, un

estudio realizado en ratas Wistar, demostró una relación dosis dependiente entre el fenitrotion

(plaguicida) y la aparición de efectos histopatológicos. (Afshar y cols., 2008). Por otro lado,

McCoy y cols., (2008), encontraron alteraciones morfológicas en las gónadas de sapos

gigantes, que se encuentran directamente relacionadas con la magnitud de la actividad agrícola

que se desarrolla en la zona de captura.

Por lo tanto, los biomarcadores histológicos, tienen como objetivo identificar o demostrar

si los organismos que han estado expuestos a cierto agente tóxico, están sufriendo daños o no

como consecuencia de la exposición a los agentes tóxicos. (Forbes y cols., 2006).

1.2.1.1 Centros de melano macrófagos (CMM).

Como ya se mencionó anteriormente, los peces se han estudiado para valorar la calidad

del agua en la que habitan, y para ello se utilizan los centros de melano macrófagos como

biomarcadores de daño ambiental ocasionado por exposición a compuestos químicos tóxicos.

(Agius y Roberts, 2003; Spazier y cols., 1992).

Los CMM son acumulaciones de células pigmentadas, generalmente incluidas en la

matriz retículo endotelial de los tejidos hematopoyéticos, como son el bazo, el hígado, los

riñones y en algunos casos en las gónadas; en organismos como peces, anfibios y reptiles.

Estos centros se pueden presentar en conjunto con una reacción inflamatoria crónica y pueden

presentar los siguientes pigmentos: melanina, hemosiderina y lipofuscina. (Agius y Roberts,

2003).

La melanina es un potente antioxidante, que tiene la capacidad de remover y neutralizar

(20)

20

consideraba que los melano macrófagos fagocitaban la melanina, sin embargo, se ha

demostrado que también pueden producirla. (Agius y Roberts, 2003).

Kalashnikova, (2000), indica que la hemosiderina se produce por degradación de la

hemoglobina de los eritrocitos. Durante este proceso, la hemoglobina se disocia en el grupo

hemo y globina, el hierro del grupo hemo interactúa con apoferritina formando ferritina, cuando

ésta interactúa con los lípidos y carbohidratos se convierte en hemosiderina (Fig. 1). Otro

origen de la hemosiderina puede ser por un aumento en la retención de hierro por los

macrófagos como un mecanismo de protección. (Kranz, 1989).

Figura 1. Diagrama esquemático de la producción de hemosiderina.

La lipofuscina se produce por la degradación de membranas celulares, (Kranz, 1989;

Agius y Roberts, 2003; Kranz y Peters, 1984), el exceso de hierro estimula la lipoperoxidación,

proceso en el que los radicales libres reaccionan con los ácidos grasos de la membrana. Los

anfibios requieren un alto contenido de lípidos insaturados para mantener la integridad de su

membrana y conservar sus funciones aún a bajas temperaturas, estos lípidos son susceptibles

(21)

21

En general, los CMM permiten el almacenamiento, reciclaje y detoxicación de desechos

celulares y sustancias exógenas, por lo tanto mantienen libre de estos compuestos al

organismo (Agius y Roberts, 2003; Montero y cols., 1999; Ravaglia y Maggese, 1995; Spazier,

y cols., 1992), además de que son puntos de acción del sistema inmune en contra de los

microorganismos patógenos. Debido a lo anterior, una disminución de la densidad numérica de

los eritrocitos implica una deficiencia en la respuesta inmunológica, así como una alteración de

los procesos metabólicos del bazo. Algunos autores sugieren que cuando hay una

imposibilidad de los melano macrófagos para acumularse, se debe probablemente a una

reducción de la actividad quimiotáctica (capacidad propia de los macrófagos de migrar hacia

donde se presenta un estímulo), aunque se ha observado que no se presenta un aumento de

melano macrófagos dispersos. (Spazier y cols., 1992). Por otro lado, se considera que a bajas

dosis en exposición crónica a los contaminantes, el sistema de defensa celular puede funcionar

de forma efectiva, mientras que a mayores dosis, la fagocitosis falla provocando la disminución

de los CMM. (Sinderman, 2006).

Se ha establecido que los CMM son más numerosos cuando el organismo presenta

alguna alteración del estado fisiológico normal, como ocurre con las enfermedades infecciosas

o bien, la exposición a compuestos tóxicos y en algunos casos por daño térmico. (Hur y cols.,

2006; Kranz y Peters, 1984; Spazier y cols., 1992). Cuando un organismo se encuentra en

condiciones de estrés por contaminación, ocurren una serie de procesos inmunológicas en los

CMM en el bazo, que conllevan una disminución en la cantidad de células sanguíneas que

pueden estar dañadas. (Kranz y Peters, 1984; Agius y Roberts, 2003).

La presencia y la cantidad de CMM en un organismo pueden ser muy variables, de

acuerdo con la especie y el órgano del que se trate. Es importante señalar que los CMM se

pueden ver afectados por factores que alteran el metabolismo directa o indirectamente.

(Montero y cols., 1999). En los peces, la acumulación de CMM se ve influenciada por la edad,

ya que no tienen la capacidad de degradarlos. Sin embargo, en los anfibios, los CMM en el

hígado no se presentan de forma acumulativa en el tiempo, ya que tienen la capacidad de

degradarlos. (Kalashnikova, 2000). Como característica importante de los CMM es su origen,

ya que su tamaño, frecuencia y tipo de pigmento puede variar considerablemente de acuerdo

con la desnutrición, enfermedades, estrés ambiental; en algunos casos los efectos se revierten

una vez removido el agente causal. (Kranz, 1989). Según Fournie y cols., (2001), para peces

(22)

22

de siete especies de peces silvestres, colectados en 266 puntos de muestreo en el Golfo de

México.

1.3 Los anfibios.

Duellman y Trueb, (1986) definen a los anfibios como organismos vertebrados

cuadrúpedos, que poseen dos cóndilos occipitales en el cráneo y una vértebra sacral. Su piel

es glandular y carece de anexos como las plumas o el pelo. Su anatomía interna puede

definirse como el punto intermedio entre la de los peces y la de los amniotas (vertebrados

tetrápodos terrestres).

1.3.1 Características fisiológicas y comportamiento.

De forma general, el ciclo de vida de los anfibios comienza cuando son huevos y

habitan en cuerpos de agua, una vez que eclosionan, las larvas continúan viviendo en el agua

hasta llegar a la metamorfosis donde se convierten en adultos, en esta etapa dejan la vida

acuática y prácticamente se vuelven terrestres. (Duellman y Trueb, 1986). Los anfibios que

siguen este ciclo, son susceptibles a diferentes alteraciones que ocurren tanto en el medio

acuático como en el terrestre dependiendo de la fase del ciclo de vida. La etapa de desarrollo

más intensa en los anfibios es la metamorfosis, a diferencia de lo que ocurre en otras especies

donde ésta fase es al final de la etapa embrionaria. (Rowe y cols., 2003).

Cabe resaltar la importancia de las características de la piel de los anfibios. En estos

organismos, este órgano es muy delgado y muy permeable, además de que se encuentra

ampliamente vascularizado y permanece así durante toda su vida, mientras que para otros

vertebrados la piel es prácticamente impermeable. Es importante mencionar que en los anfibios

la piel es un órgano vital que le permite realizar el intercambio gaseoso así como manejar su

equilibrio hídrico y osmótico. (Rowe y cols., 2003).

En todas las etapas de la vida, los anfibios se encuentran susceptibles a la absorción

dérmica de tóxicos en el agua (LeBlanc, 1997), debido a la permeabilidad de su piel, en la que

su estrato córneo es de una sola capa de células. (Duellman y Trueb, 1986). Además de esto,

(23)

23

alteraciones en el ambiente acuático ocasionadas por el hombre, pueden afectar todas las

etapas de desarrollo de éstos organismos, sin embargo es importante resaltar, que los efectos

en los individuos dependen también de sus características fisiológicas y ecológicas. (Rowe y

cols., 2003).

En los ecosistemas, los anfibios conforman gran parte de la biomasa y la biodiversidad

del lugar. Los anfibios pueden encontrarse en diferentes nichos ecológicos interactuando con

otras especies, en cierto momento actuando como presas pero también como depredadores,

por lo que estas relaciones resultan fundamentales para el funcionamiento del ecosistema.

(Boyer y Grue, 1995).

Las alteraciones que los humanos realizan en los ecosistemas naturales, ocasionan que

los anfibios se enfrenten de forma simultánea a cambios tanto en la temperatura, la humedad,

la disponibilidad de presas, etc. (Rowe y cols., 2003).

Dentro de la clasificación de los anfibios, se encuentran las salamandras, las cecilias y

los anuros que corresponden al 87% del total, a éste orden pertenecen las ranas y los sapos.

(Duellman y Trueb, 1986).

1.3.2 Sapo gigante (

Rhinella marina

).

1.3.2.1 Descripción.

El sapo marino o gigante (Rhinella marina) es un anfibio de la familia Bufonidae, se

caracteriza por ser de color café o gris en la parte superior, mientras que en el vientre tiene

manchas más claras, presenta verrugas en el lomo y tienen dos glándulas capaces de producir

toxinas a cada lado de su cuerpo, que son utilizadas como sistema de defensa contra sus

depredadores. (Conant y Collins, 1991). Su tamaño es de alrededor de 152 mm, con un

máximo registrado de 238 mm, y en general las hembras tienden a ser ligeramente más

grandes que los machos. (Fig. 2). En libertad, su esperanza de vida es de 10 a 15 años

aproximadamente. (Zug y Zug, 1979).

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24

Filo: Chordata

Clase: Anfibia

Orden: Anura

Familia: Bufonidae

Género: Rhinella

Especie: marina

1.3.2.2 Hábitat y distribución.

El hábitat natural de esta especie se ubica desde la base del río Amazonas en

Sudamérica, pasando por América Central, hasta el Sur de Texas. (Fig. 3). Los sapos marinos

son muy sensibles a las bajas temperaturas, una limitante para su hábitat. (Zug y Zug, 1979).

Se reporta que la temperatura ideal para el sapo gigante es en promedio de 25.2 °C, teniendo

como mínima y máxima 11 y 41.8 °C, respectivamente. (Duellman y Trueb, 1986). Es normal

encontrarlo en diferentes tipos de vegetación, sin embargo es común que habiten en los

pastizales resultantes de las actividades humanas y también en zonas urbanas. El territorio de

un organismo adulto es de 160 m2 en promedio. (Zug y Zug, 1979). Las zonas aledañas al río

Coatzacoalcos, resultan ser un hábitat natural para esta especie.

Figura 2. Sapo gigante adulto.

(25)

25

1.3.2.3 Características biológicas.

Este sapo es de hábitos nocturnos, y suelen ocultarse durante el día. Son omnívoros, ya

que prácticamente ingieren cualquier cosa que encuentren a su paso y es muy común

encontrar en su tracto digestivo, objetos tales como rocas o restos de plantas. Las hormigas y

los escarabajos son sus presas más comunes aunque esto depende también de su hábitat.

Con el paso del tiempo, los sapos gigantes se han adaptado a la vida urbana, aprovechando

los restos de comida o los alimentos para mascotas. (Zug y Zug, 1979).

El mecanismo por el cual se alimentan estos sapos, es uno de los más avanzados

dentro del orden de los anuros, ya que utilizan su lengua para atrapar a sus presas. Realizan

un movimiento muy rápido impulsando y jalando su lengua, a la cual se adhieren los alimentos,

lo que ocasiona que también se ingieran otros objetos, como rocas, materia orgánica y suelo.

(Duellman y Trueb, 1986).

El sapo gigante es considerado como uno de los anfibios más adaptables, y tolerantes a

distintos ambientes, ya que pueden habitar en zonas selváticas así como en semidesiertos,

puede vivir a nivel del mar o hasta en elevaciones de más de 2000 m. (Duellman y Trueb,

1986). En el caso de los anfibios nocturnos, la temperatura de su cuerpo es prácticamente igual

a la temperatura ambiente durante las etapas de actividad. Por ejemplo, la temperatura

corporal del sapo marino durante el día, es menor a la temperatura ambiente, probablemente

como resultado de la pérdida de calor por evaporación en la superficie corporal, sin embargo

durante la noche su temperatura se aproxima más a la de su entorno. (Zug y Zug, 1979).

La reproducción de éstos comienza cuando tienen un año de edad, tanto en las

hembras como en los machos. Se ha registrado que la densidad de la población de sapos

gigantes es menor en las áreas naturales no perturbadas que en aquellas cercanas a los

asentamientos humanos, esto se debe probablemente a la mayor disponibilidad de alimentos.

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26

1.4 El bazo.

1.4.1 Descripción.

El bazo en los sapos, es un órgano que se sitúa en la cavidad abdominal ligeramente

hacia la derecha, tiene forma redondeada, y su color es rojo oscuro. El tamaño del órgano

puede variar con la edad y el peso del organismo, sin embargo en un adulto de tamaño medio

el bazo mide alrededor de 8 mm de diámetro. (Fig. 4).

Figura 4. Ubicación anatómica del bazo en sapos gigantes (flecha).

1.4.2 Morfología.

El bazo es un órgano que se encuentra rodeado por una cápsula de tejido conectivo

denso, con escasa musculatura lisa. Desde la cápsula se extienden trabéculas de tejido

conectivo hacia el interior del parénquima, que le confieren rigidez. A través del hilio, penetran

al órgano los vasos sanguíneos, linfáticos y los nervios. La mayor parte de las células libres son

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27

Histológicamente el parénquima del bazo se divide en pulpa roja y pulpa blanca. (Fig.

5). La pulpa roja está compuesta por grandes vasos sanguíneos irregulares, sinusoides

esplénicos separados por placas o cordones esplénicos, mientras que la pulpa blanca se

observa como pequeñas zonas ovales o redondeadas grisáceas, compuestas por tejido linfoide

difuso y folicular con una arteriola central. (Fig. 5). En los sapos, la pulpa blanca y la pulpa roja

periarteriolar del bazo, están separadas por una capa de células epiteliales. (Tizard, 2009).

1.4.3 Función

En el humano, el bazo se encarga de realizar el catabolismo de las células sanguíneas

dañadas y partículas extrañas, además de que lleva a cabo procesos inmunológicos. (Geneser,

2007; Kranz, 1989). En los anfibios como las ranas, el bazo representa el órgano eritropoyético

principal en la etapa adulta, aunque en algunas especies de clima templado, los eritrocitos

también se producen en la médula ósea durante la primavera (Duellman y Trueb, 1986), lo cual

sugiere que para estos organismos, la pérdida del bazo provocaría una deficiencia en la

(28)

28

respuesta inmunológica, además de desencadenar una alteración hematológica como la

anemia, ocasionada por el déficit de producción de eritrocitos que finalmente podría llevar a la

muerte.

2 JUSTIFICACIÓN

El río Coatzacoalcos ha sido receptor de gran cantidad de contaminantes, lo que ha

conformado una mezcla química compleja con potenciales efectos tóxicos. En este sitio, tanto

la población humana como la biota, se encuentran expuestos a ésta mezcla. Lo cual, hace

indispensable el uso de biomarcadores como los CMM, que permitan evaluar efectos

tempranos en organismos indicadores, para que así, de ser necesario, se busquen alternativas

y opciones de mitigación de los impactos ambientales, que beneficien al ecosistema en

general.

El sapo gigante es una especie endémica y abundante que habita la zona de

Coatzacoalcos, y que actualmente en México no cuenta con ningún estatus de protección.

Estos organismos, debido a sus características ya mencionadas, pueden presentar varias vías

y rutas de exposición a agentes tóxicos durante su ciclo de vida. Aunado a ello, los sapos

gigantes desempeñan varios papeles fundamentales para el funcionamiento del ecosistema, su

ubicación en la red trófica, así como su fisiología, su abundancia y su manejo sencillo los

convierten en organismos apropiados para estudios ecotoxicológicos.

3 HIPÓTESIS

Los sapos gigantes que habitan la zona de Coatzacoalcos, Veracruz, se encuentran

expuestos a una mezcla compleja de contaminantes tóxicos, la cual puede ocasionar un

aumento en el número y el tamaño de los CMM presentes en el bazo de estos organismos,

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4 OBJETIVO GENERAL

Evaluar los efectos histológicos de la mezcla de contaminantes a la cual está expuesto

el sapo gigante (Rhinella marina), a través de los CMM y sus pigmentos como biomarcadores

de efecto.

5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Estandarizar las técnicas histoquímicas para identificar: melanina, hemosiderina y

lipofuscina.

2. Evaluar la morfología del bazo del sapo gigante, para identificar posibles alteraciones,

debidas a la exposición a contaminantes, a través de la técnica de hematoxilina –

eosina.

3. Identificar la presencia de hemosiderina en los CMM de bazo de sapo gigante, a través

de la técnica histoquímica de Perls.

4. Valorar la melanina presente en los CMM del bazo de los sapos gigantes a través de la

técnica histoquímica de Fontana-Masson.

5. Evaluar la presencia de lipofuscina presente en los CMM del bazo de los sapos

gigantes, a través de la técnica histoquímica de Gomori.

6. Realizar el análisis morfométrico (número y tamaño) de los CMM del bazo de sapo

gigante.

6 MATERIAL Y MÉTODOS

6.1 Muestras biológicas.

70 bazos de sapo gigante incluidos en bloques de parafina, provenientes de la zona de

Coatzacoalcos, Veracruz.

6.2 Equipo.

 Balanza analítica y balanza granataria, (OHAUS).

 Medidor de pH, (ORION).

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30

 Sonicador, (Branson 1200).

 Microtomo y placa fría, (Leica).

 Baño de flotación, (TBS Triangle biomedical sciences).

 Estufa de calentamiento, (Ríos Rocha, S.A).

 Dispensador de parafina, Barnstead/Electrothermal.

 Placa de calentamiento, Barnstead/Thermolyne.

 Tren de tinción, (Tissue Tek).

 Jarras Coplin de vidrio, rack para laminillas y cajas de vidrio, (Wheaton).

 Portaobjetos esmerilados, (MADESA).

 Cubreobjetos, (CORNING).

 Navajas de alto perfil, (SAKURA).

 Fotomicroscopio, (Nikon Labophot-2).

 Cámara fotográfica, (Nikon Coolpix S10).

 Software, Image Pro Plus 6.0

 Software, StatSoft STATISTICA 6.

6.3 Reactivos.

 Fijador: fosfato de sodio dibásico anhidro y fosfato de sodio monobásico (JT

Baker), formaldehído (SIGMA-ALDRICH) y agua destilada.

 Alcohol etílico absoluto y xileno (CTR scientific).

 Parafina y polímeros filtrados Paraplast, (McCormick).

 Silanizado: acetona (Monterrey) y silano (SIGMA-ALDRICH).

 Tinciones: permanganato de potasio, ácido clorhídrico, hidróxido de amonio,

ácido sulfúrico (JT Baker), rojo neutro (Spectrum), pararrosanilina clorhídrica,

ferrocianuro de potasio (SIGMA-ALDRICH), acetaldehído (CTR scientific), nitrato

de plata y Hematoxilina (Merck), tiosulfato de sodio (Mallinckrodt), ácido oxálico

(Monterrey), eosina amarillenta (Analit) y agua destilada.

(31)

31

6.4 Metodología.

6.4.1 Descripción de la zona de estudio.

El sitio de estudio se ubica en puntos aledaños al río Coatzacoalcos, el cual se origina

en la Sierra Atravesada, en Oaxaca, en su recorrido recibe aguas de muchos afluentes

pequeños, como las de los ríos: Choapa, Uxpanapa y Calzadas. (Gozada y Páez, 1986). Éste

río tiene 322 km de longitud, su caudal es de 22 500 millones de metros cúbicos, debido a ello,

ocupa el cuarto lugar como uno de los ríos más caudalosos del país. Además de que el puerto

de Coatzacoalcos es el tercer puerto más importante en el Golfo de México. (Fig. 6).

El tipo de clima que prevalece en la zona de Coatzacoalcos, según el sistema de

clasificación climática de Koppen, que fue modificado por García, (1964) es:

 Am(i’)gw: cálido húmedo con lluvias en verano, la cantidad de lluvia invernal es de entre

5 y 10,2 % de la anual, con la precipitación del mes más seco < 60 mm, con poca

oscilación en las temperaturas medias mensuales, de 5 y 7 ºC, comúnmente el mes

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32

más caliente del año es mayo. El régimen de lluvias en verano es por lo menos 10

veces mayor en cantidad, que en la temporada más seca. (Álvarez, 1999).

Los tipos de vegetación que predominan son la vegetación riparia, tular y popal en las

zonas inundables, selva alta perennifolia y mediana subperennifolia en lomeríos y zonas de

acahual en pastizales abandonados y cultivados. (CONABIO, cuenca media y alta del río

Coatzacoalcos, 2010).

En la zona donde el río Coatzacoalcos se une con el Río Jaltepec, se practica la agricultura

de temporal y aguas abajo abunda el manglar. En las cercanías a Minatitlán se encuentran

pastizales y cultivos de temporal principalmente, mientras que en la zona más baja de la

cuenca, el río se extiende a lo largo de planicies, lo que da lugar a la formación de meandros,

lagunetas y esteros hacia la desembocadura. La agricultura en Coatzacoalcos ocupa alrededor

de 1960 Ha, donde el principal cultivo es la copra, mientras que la ganadería se lleva a cabo en

alrededor de 9422 Ha. (Informe Gobierno Municipal: Coatzacoalcos, 2005-2007).

Coatzacoalcos y Minatitlán se consideran como los centros urbanos más importantes en la

zona, seguidos de Las Choapas, Agua Dulce y Cosoleacaque. (Consejo de cuenca de río

Coatzacoalcos, 2010).

6.4.2 Muestreo.

Se capturaron 70 sapos gigantes en la zona de Coatzacoalcos, por medio de trampas

de barrera y embudo, aunque en algunos casos, lo hicieron a mano o con redes. Se

consideraron 7 sitios de muestreo (Fig. 7), en cada uno de los cuales se colectaron diez

individuos.

Como se observa en la figura 7, los sitios señalados en rojo son considerados como

urbano-industriales (Estero del Pantano, Mundo nuevo y Nanchital), ya que tienen como

característica, presentar centros urbanos y también descargas industriales. En azul se

muestran los sitios industriales, ya que Cangrejera se denominó así por su cercanía con el

complejo petroquímico del mismo nombre, mientras que en Minatitlán se encuentra la refinería

Lázaro Cárdenas. Por último, en verde se presentan las zonas consideradas como rurales

(Uxpanapa y Palomas), debido a que presentan ecosistemas bien conservados, así como

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Figura 7. Localización de sitios de muestreo: 1) Estero del Pantano, 2) Mundo Nuevo, 3) Nanchital, 4) Minatitlán, 5) Cangrejera, 6) Palomas y 7) Uxpanapa. (Google earth, 2010).

De los 70 sapos recolectados se obtuvieron los bazos, los cuales fueron procesados por

medio de la técnica histológica hasta su inclusión en parafina. A partir de las muestras incluidas

en parafina, se realizaron cortes de 4 micras a la muestra de bazo. Para llevar a cabo la tinción

con colorantes acuosos, el tejido fue desparafinado y rehidratado. Una vez teñidos, los cortes

deben deshidratarse y aclararse para montar las laminillas de forma permanente con resina

sintética. (Fig. 8).

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6.4.3 Análisis histológico.

Las muestras fueron teñidas por medio de la técnica de rutina de Hematoxilina y Eosina,

así como por tres técnicas histoquímicas para identificar los pigmentos contenidos en los CMM.

6.4.3.1 Tinción de Hematoxilina-Eosina.

La técnica de hematoxilina-eosina, permite evaluar la morfología general del tejido. Ésta

tinción se detalla en el Anexo III.

6.4.3.2 Tinción de Fontana-Masson.

Ésta tinción identifica la melanina contenida en los CMM. Ésta técnica se detalla en el

Anexo III.

6.4.3.3 Tinción de Perls.

La técnica de Perls permite identificar la hemosiderina presente en los CMM. Ésta

tinción se detalla en el Anexo III.

6.4.3.4 Tinción de Gomori.

La tinción de Gomori permite identificar la lipofuscina de los CMM. Ésta tinción se

detalla en el Anexo III.

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6.4.4 Análisis morfométrico.

La cantidad total de muestras fueron 70, las cuales fueron procesadas y se obtuvieron 7

laminillas para cada una. Una laminilla teñida por la técnica de hematoxilina y eosina que

permitió evaluar la morfología general del tejido, una original y un duplicado para cada una de

las técnicas histoquímicas que son: Fontana-Masson, Perls y Gomori, que permiten demostrar

la presencia de melanina, hemosiderina y lipofuscina, respectivamente. De forma estándar,

cada laminilla debía tener al menos tres cortes de bazo (réplicas).

Para realizar el análisis de imágenes se eligió un corte de cada laminilla, como lo

muestra la figura 10. Los criterios de elección incluyeron: óptima preservación del tejido,

ausencia de artefactos (burbujas, pliegues, precipitados, etc.). Posteriormente se realizó la

sesión de fotomicrografías.

El método para analizar las imágenes se estandarizó con las siguientes características:

se capturaron 12 fotomicrografías por corte, todas a un aumento de 20x, lo que da un área total

70 sapos

70 bazos

H y E Melanina Hemosiderina Lipofuscina

Figura 9. Metodología para el análisis de imágenes.

Igual a

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de 2 mm2 por corte, en forma de zigzag. La cuantificación y medición de los CMM se realizó por

medio del Software Image Pro Plus 6.0, como se muestra en la figura 9.

7 RESULTADOS

7.1 Análisis histológico.

Con el fin de realizar una evaluación histológica general del tejido del bazo de sapo

gigante, se realizaron cortes que fueron teñidos con la técnica de rutina hematoxilina y eosina.

Ésta tinción permitió identificar las estructuras que conforman éste órgano: la zona cortical

formada por tejido fibroso, el parénquima constituido por pulpa roja y pulpa blanca (corpúsculos

de Malpighi), ésta última compuesta en su mayoría por tejido linfoide localizado alrededor de

una arteriola central, mientras que en la pulpa roja se encontró la presencia de CMM, que se

observan como acumulaciones de células con gránulos que van desde el amarillo hasta café

muy oscuro. (Fig. 10).

Figura 10. Fotomicrografías de la morfología general del bazo de sapo gigante. A). Parénquima. Pulpa roja (1), pulpa blanca (2) y arteriola central (3). B). Obsérvese la presencia de CMM (flechas). H-E

Escala de barras=100µm.

Es importante mencionar, que los resultados obtenidos del análisis general de la

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excepción de los CMM, que si bien se presentaron en todas las muestras, se observaron

diferencias con respecto a la cantidad y tamaño de éstas estructuras, cuando se llevo el

análisis histológico. Debido a lo anterior, se realizó el análisis morfométrico de los CMM, el cual

se presenta posteriormente.

Como se mencionó anteriormente, los CMM albergan tres tipos de pigmentos: melanina,

hemosiderina y lipofuscina, para la identificación de éstos compuestos, se aplicaron tres

técnicas histoquímicas: Fontana-Masson para melanina, Perls para hemosiderina y Gomori

para lipofuscina. (Fig. 11).

Figura 11. Fotomicrografías de los CMM en el bazo de sapo gigante. A) Tinción H-E. B) CMM positivos para melanina (flechas). Tinción Fontana-Masson. C) Las flechas señalan los CMM con hemosiderina.

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7.1.1 Análisis cualitativo.

7.1.1.1 Melanina.

Figura 12. Bazo de sapo gigante de la zona rural. Nótese el contraste entre la distribución y el tamaño de los CMM con melanina (flechas). A) Uxpanapa. B) Palomas. Tinción de Fontana-Masson. Escala de

barras=50 µm.

La aplicación de las diferentes técnicas histoquímicas nos permitieron conocer que en

todas las muestras experimentales (N=70) de los distintos sitios de estudio, los CMM

contienen: melanina, hemosiderina y lipofuscina, en cantidades variables. El análisis histológico

demostró que estas estructuras presentaron amplias diferencias en número, tamaño y

distribución. En las figuras 12, 13 y 14 se muestran fotomicrografías representativas de las tres

zonas de estudio: rural, urbana-industrial e industrial donde se resaltan estas diferencias y la

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