Actividad antibacteriana de aceites esenciales y R(-)carvona frente a Leuconostoc mesenteroides MS1.

Regional:  Facultad Regional San Francisco 

Actividad antibacteriana de aceites esenciales y R(-)carvona frente a

Leuconostoc mesenteroides

MS1

Mónica SERRA, Micaela PAIRONE, Andrés TESTA, Florencia PISANI, Guillermo

LUBATTI

Departamento de Ingeniería Química (Avenida de la Universidad 501, San Francisco), Facultad Regional San Francisco, UTN

E-mail de autores: monicaserra@hotmail.com, micaelapairone@gmail.com, andrestesta95@gmail.com, flopyta_55@hotmail.com , guillelubatti@gmail.com

Este trabajo ha sido realizado bajo la dirección de la Dra. Alfonsina Ester Andreatta, en el marco del proyecto “Inhibición de bacterias del género Leuconostoc a partir del uso de extractos vegetales naturales”. (2015 – 2017 / sin prórroga) y “Valoración de biomasa para la obtención de materiales activos y biodegradables” (2018 – 2020).

R e s u m e n

En el presente trabajo se obtuvieron las concentraciones mínimas inhibitorias y concentraciones mínimas bactericidas de cuatro aceites esenciales y compuestos puros frente a la cepa Leuconostoc mesenteroides MS1, utilizando el método in vitro de macrodilución en caldo. Los aceites que se estudiaron fueron obtenidos a partir de Aloysia polystachya, Citrus lemon Eucalyptus cinerea, Laurus nobilis y el compuesto puro evaluado fue la carvona. Los cuatro primeros se obtuvieron con el método de extracción por arrastre con vapor, mientras que el último compuesto que se corresponde al componente mayoritario del aceite esencial de Aloysia polystachya, se compró comercialmente. Como resultado de este trabajo, se han encontrado valores pequeños de concentraciones mínimas inhibitorias y concentraciones mínimas bactericidas de los aceites esenciales y del compuesto puro evaluado, lo que significa que la bacteria en estudio es sensible a los mismos.

Palabras Claves: Inhibición; Leuconostoc mesenteroides; Macrodilución; Antimicrobiano

1. Introducción.

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fibra de naranja no presentan inhibición frente a Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides 824 y Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum 882. Por el contrario, aceite y extracto acuoso de romero (Herbalox ® Type W); extracto acuoso de romero (Duralox®), extracto de aceite de romero (Herbalox® Type HTO) presentan inhibición frente a estos dos tipos de bacteria siendo mayor efecto con el extracto de aceite de romero.

La aplicación de extractos de productos naturales como antimicrobianos, recibe un particular interés por los “green consumers” principalmente porque representan una alternativa a los conservantes alimentarios comunes de síntesis química y porque son productos con menor impacto ambiental (Settanni et al., 2012; Burt, 2004). Además la resistencia de las bacterias patógenas a los clásicos conservantes y la reducción del contenido de sal en la elaboración de alimentos, determinan un alto interés en contar con agentes antimicrobianos alternativos (Burt, 2004).

En estudios previos de este grupo de trabajo en ensayos de sensibilidad antimicrobiana, se determinó la sensibilidad del Leuconostoc mesenteroides MS1 frente a los diferentes extractos a los cuales se lo expuso. En este sentido, aceites esenciales de Laurus nobilis, Citrus lemon, Aloysia polystachya y Eucalyptus cinerea, concentraciones de eugenol/aceite de girasol mayores al 18.5% P/P, ácido salicílico 0.75% P/P, hidroquinona 0.75 %P/V y aceites esenciales comerciales Just de lavanda, menta y geranio, han demostrado un efecto bactericida frente a Leuconostoc mesenteroides MS1 (Serra, Garnero, Nicolau, & Andreatta, 2018). Continuando estos estudios, es que se procede en este trabajo a hallar las concentraciones mínimas inhibitorias y las concentraciones mínimas bactericidas de los aceites esenciales de Aloysia polystachya,Citrus lemon, Eucalyptus cinerea, Laurus nobilis y del compuesto puro de la carvona (compuesto mayoritario del aceite esencial de la Aloysia polystachya) con el objeto de poder determinar frente a cuál de los extractos es más sensible el microorganismo estudiado.

Los métodos de dilución son los más adecuados para la determinación de los valores de las concentraciones mínimas inhibitorias (CIM) y las concentraciones mínimas bactericidas (CBM), ya que ofrecen la posibilidad de estimar la concentración del agente antimicrobiano analizado en el agar (dilución en agar) o en el medio de caldo (macrodilución o microdilución) (Cockerill et al., 2012). Existen muchas pautas aprobadas para la dilución de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias fastidiosas o no fastidiosas, levaduras y hongos filamentosos. Los estándares más reconocidos son proporcionados por el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) y el Comité Europeo sobre Ensayos de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST) (Balouiri, Sadiki, & Ibnsouda, 2016).

2. Metodología.

Los aceites esenciales utilizados se obtuvieron con la técnica arrastre con vapor a partir de hojas de Aloysia polystachya (burro), Eucalyptus cinerea (Eucalipto medicinal), Laurus nobilis (laurel), secadas a temperatura ambiente y de cáscaras frescas para el aceite esencial del Citrus lemon (limón).

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volátiles del material vegetal, por adición de la presión de vapor del agua. Los vapores que salen de la columna rectificadora condensan en el refrigerante, separándose el agua de un aceite esencial más denso. El agua retorna al balón a través del conducto inferior que sale del decantador, mientras que el aceite se acumula en el tubo que conecta a la válvula de descarga. En estos ensayos, se partió de muestras de 100 g de material, dejando el equipo en funcionamiento por el término de 120 min una vez comenzada la ebullición. Los extractos se conservaron en viales cerrados herméticamente con tapa de goma y precinto de aluminio y se guardaron en la heladera hasta su posterior utilización.

R(-)Carvona (Sigma-Aldrich, 98 %) es el compuesto puro que además de los aceites esenciales fue evaluado en este trabajo y se corresponde al compuesto mayoritario del aceite esencial de la Aloysia polystachya.

El aislamiento de la bacteria se realizó a partir de paquetes envasados al vacío de salchicha tipo Viena que mostraron indicios de deterioro por hinchazón como consecuencia de la formación de gas. Se procedió al hisopado de la superficie de la salchicha mediante un hisopo estéril y se inoculó en caldo MRS (Man Rogosa Sharpe) con campana de Durham invertida. Se los incubó a 30°C por el término de 72 hs. Los tubos positivos que presentaron turbidez y formación de gas fueron repicados en MRS agarizado con posterior incubación en microaerofilia por 72 hs. Posteriormente, se aislaron colonias sospechosas y se continuó con la tipificación bioquímica que se realizó de acuerdo al procedimiento presentado por Mulet et al., (2010) y la tipificación molecular de la cepa que se realizó mediante la identificación de microorganismos por secuenciación de un fragmento del gen que codifica el 16S rRNA en el Instituto de Lactología Industrial de la Universidad Nacional del Litoral (Santa Fe, Argentina).

La técnica de dilución en caldo se puede utilizar para medir cuantitativamente la actividad in vitro de un agente antimicrobiano. En este sentido, se procedió a la preparación de una serie de tubos de ensayo con tapa a rosca con distinto volumen de caldo MRS, para lograr las diluciones requeridas, a los cuales se les agregó el antimicrobiano (aceite esencial ó carvona). Dada la insolubilidad entre el aceite esencial y el medio de cultivo acuoso, se elaboró una emulsión con cada uno de los antimicrobianos a evaluar. Para lograr esta emulsión, el aceite esencial ó carvona se mezcló con una solución de lecitina de soja en agua destilada. Con esta proporción se calculó la concentración inicial del aceite esencial o carvona en % m/V y se prepararon las sucesivas diluciones teniendo en cuenta que el volumen final mínimo requerido en cada tubo es de 1 mL. Además, se utilizó un tubo control conteniendo únicamente el medio de cultivo.

Luego se inocularon cada uno de los tubos con una suspensión estandarizada del microorganismo en estudio teniendo en cuenta que el tiempo empleado no debe ser superior a 15 minutos entre la preparación del inóculo y su colocación en el tubo. El mismo se realizó con una anzada del inóculo estandarizado en cada uno de los tubos con antimicrobiano y al control, con posterior homogeneización de la mezcla. Este último, se preparó siguiendo el método de suspensión directa de colonias en solución salina (0.85 % de NaCl) para obtener una turbidez de 0.5 en la escala de Mc Farland; que se corresponde, aproximadamente con una concentración de 1.5 x 108 _UFC/mL.

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Las pruebas se examinaron después de incubar a 30°C en estufa de cultivo por 48 hs y posteriormente, trascurrido ese tiempo se observó el desarrollo o no desarrollo en los tubos del microorganismo y se procedió a analizar la CIM y la CBM. En los tubos de ensayo en los cuales no dió turbidez, se procedió a realizar la siembra en placa de Petri con el medio MRS agarizado. Posteriormente a esto, las mismas se incubaron a 30ºC por 48 horas y se observó el crecimiento o no crecimiento de la bacteria. De la observación de estas placas se obtienen las CIM y la CBM tal como se detalla en la Figura 1 que representa un diagrama esquemático del método de diluciones empleado.

Los ensayos, se han realizado por triplicado para cada una de las diluciones en cada uno de los aceites esenciales y de la carvona.

Desechamos 1 mL de solución

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CIM CBM

Figura I. Representación esquemática de la obtención de la CBM Y CIM.

3. Resultados y Discusión.

Diferentes diluciones de los aceites esenciales (Aloysia polystachya, Eucalyptus cinerea, Laurus nobilis y Citrus lemon) y del compuesto puro de la carvona se han testeado, de modo de encontrar los valores CIM y CBM. Valores pequeños de CIM y CBM significan que la cepa en estudio presenta una mayor sensibilidad al antimicrobiano dado.

La CIM de los aceites esenciales y del compuesto puro se encontró entre los valores 0.64 y 1.87 mg/mL mientras que la CBM de los mismos se encontró entre los valores 0.76 y 2.41 mg/mL. De los ensayos realizados, podemos decir que los aceites esenciales evaluados aquí, conjuntamente con la carvona presentaron valores bajos de CIM y CBM, lo que significa que son buenos inhibidores/bactericidas frente al Leuconostoc mesenteroides MS1. Sin embargo, se observa que la bacteria en estudio, es más sensible a los aceites esenciales de Aloysia polystachya, Laurus nobilis y del compuesto puro de la carvona mientras que una menor sensibilidad se encontró para los aceites esenciales de Eucalyptus cinerea y Citrus lemon.

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4. Conclusiones.

Diferentes aceites esenciales obtenidos a partir de productos naturales renovables como lo son el Aloysia polystachya, el Eucalyptus cinerea, el Laurus nobilis y el Citrus lemon y el compuesto mayoritario del aceite esencial de Aloysia polystachya (carvona) han sido evaluados para la búsqueda de las concentraciones mínimas inhibitorias y las concetraciones mínimas bactericidas frente a la bacteria Leuconostoc mesenteroides MS1, cuyo crecimiento se manifiesta en el envasado al vacío a partir de dos a tres semanas de almacenamiento bajo refrigeración provocando hinchazón de los envases.

De este estudio, podemos decir que los aceites esenciales evaluados aquí, conjuntamente con la carvona presentaron bajo valores de CIM y CBM, lo que significa que son buenos inhibidores/bactericidas frente al Leuconostoc mesenteroides MS1. Sin embargo, se encontró que el Leuconostoc mesenteroides MS1 es más sensible a los extractos de Aloysia polystachya, Laurus nobilis y del compuesto puro de carvona; por lo que se podrían utilizar como antimicrobianos en la conservación de salchichas tipo Viena.

Con esta investigación, se verifica que los aceites esenciales utilizados como antimicrobianos naturales, representan una alternativa a los conservantes alimentarios comunes de síntesis química para combatir Leuconostoc mesenteroides MS1.

Reconocimientos.

Los autores de este trabajo agradecen a la UTN (PID 3486, 3458, UTI4771TC), CONICET (PIP 0941-CONICET) y FONCyT (PICT2016-3041) de Argentina por ayuda económica recibida. Además, se agradece a la empresa La Piamontesa por facilitar la bacteria en estudio.

Bibliografía.

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JORNADAS

DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

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Trabajo presentado en las Jornadas de Jóvenes Investigadores Tecnológicos de la UTN Fac. Regional Rafaela (JIT 2018) los días 25 y 26 de Octubre de 2018.

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