Caracterización de estructuras auto-organizadas de un sistema Lecitina/Perfluorocarbono/Agua
Texto completo
(2) CARACTERIZACIÓN DE ESTRUCTURAS AUTOORGANIZADAS DE UN SISTEMA LECITINA/PERFLUOROCARBONO/AGUA. DAVID EDUARDO TORRADO BELTRÁN Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero Químico. ASESORES JUAN CARLOS BRICEÑO, PhD.. JOHANNA G ALINDO ÁLVAREZ, PhD.. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA 2009.
(3) Dedicatoria. Este trabajo está dedicado a mis padres Ana Lucía y Juan de Dios quienes siempre estuvieron a mi lado y me apoyaron en todo momento. Sin ellos esto no hubiera sido posible. A mis her manos Juan Manuel y Julián Andrés quienes me brindaron su apoyo incondicional.. I.
(4) Agradecim ientos. A Dios, por acompañarme desde el inicio de esta carrera, y porque me ha brindado todo lo que tengo.. A mi familia, siempre estuvieron conmigo, apoyándome en los momentos de mayor alegr ía y dificultad. No ser ía nada sin el apoyo incondicional de ellos. Los quiero con todo mi corazón.. A mis directores, Johanna Gali ndo y Juan Carlos Briceño, por su paciencia y confianza. Ellos me apoyaron durante el transcurso del proyecto, enseñándome como ser un mejor ingeniero y guiándome de la manera adecuada.. A m is asesores, Camila Castro, Andrés González Máncera y Oscar Álvarez por su tiempo, y por sus s iempre bien intencionados comentarios s obre m i trabajo, y s us recomendaciones siempre orie ntadas a m ejo rar como inves tigador. A mis amigos de Ingenier ía Química: Alejandro Múnera, Andrés Guerra, Andrés García, Juan Pablo Chotzen, Daniela Flórez, Juanita Moreno y. Andrew Shalá por su. preocupación y apoyo durante el desarrollo del proyecto.. A mis amigos que conozco desde el colegio: Adriana Flórez, Laura Celis, Lina Soler, Alejandra Ruiz, Mar ía Piedad Murillo, Nathaly Chaparro, Vanessa Gil, Daniel Flórez, Miguel Flórez, Juan Galvis, Andrés Hernández, Jairo Tulande, Johann González, Esteban Martínez, Iván Samudio y Santiago Vargas, por su preocupación y apoyo desde el inicio de la carrera. Y en general a todos mis amigos y personas que aunque no mencioné siempre estuvieron conmigo.. II.
(5) Contenido 1.. PLANTEA MIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................ 1. 2.. OBJETIVOS .................................................................................................................... 3 2.1 Objetivo General ........................................................................................................... 3 2.2 Objetivo Específicos ..................................................................................................... 3 ESTADO DEL A RTE ...................................................................................................... 4. 3.. 3.1 Introducción................................................................................................................... 4 3.2 Emulsiones.................................................................................................................... 4 3.3. Liposomas .............................................................................................................. 13. 3.4. Hemosustitutos. ..................................................................................................... 14. 4. M ATERIAL ES Y M ÉTODOS. ......................................................................................... 24 4.1 Preparación del sistema Lecitina/Agua ...................................................................... 24 4.2 Preparación de la Emulsión........................................................................................ 24 4.3. Caracterización de la dispersión lecitina/agua y de la emulsión .......................... 25. 4.4. Métodos de Caracterización.................................................................................. 26. 5.. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS........................................................ 30. 5.1. Pre-experimentación.................................................................................................. 30. 5.1.1. Determinación Tiempo de Centrifugación............................................................. 30. 5.1.2. Determinación Sedimentación de la Lecitina........................................................ 30. 5.1.3. Determinación de Ciclos en el MicroFluidizador para el sistema Lecitina Agua. . 30. 5.1.4. Determinación de rompimiento acelerado de la emulsión.................................... 31. 5.1.5. Determinación de los índices de refracción de las fases continua y dispersa ..... 31. 5.2. pH............................................................................................................................... 32. 5.3. Osmolaridad............................................................................................................... 36. 5.3.1. Caso de Sistema Lecitina/Agua Hiperosmolar...................................................... 36. 5.3.2 Seguimiento de Osmolaridad en Emulsión y Sistema Lecitina/Agua Normoosmolar.37 5.4. Potencial Z ................................................................................................................. 39. 5.4.1. Seguimiento de Potencial Z................................................................................... 39. 5.4.2. Comparación de Potencial Z con pH..................................................................... 41. 5.5 5.5.1. Espectroscopía Infrarroja Cercana ........................................................................... 42 Espectros Infrarrojos .............................................................................................. 42 III.
(6) 5.5.2 5.6. Cambio de Picos en la Segunda derivada del Espectro Infrarrojo....................... 49 Diámetro de Partícula................................................................................................ 52. 7.. CONCL USIONES ......................................................................................................... 58. 8.. BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................. 60. ANEXOS ............................................................................................................................... 64. IV.
(7) Lista de Figuras. Figura 1. Tipo de emulsiones. [10 ] 6 Figura 2. Mecanismos de inesta bilidad en una emulsión. [14] 10 Figura 3. Inestabilida d de los Lipos omas [33 ] 14 Figura 4. Equipo de medición de tamaño de partícula. 27 Figura 5. Vibarciones en e l es pectro infrarrojo cercano. ¡Error! Marcador no definido. Figura 6. Seguimiento del pH para muestras con PFC. 33 Figura 7. Seguimiento del pH para muestras sin PFC 33 Figura 8. Seguimiento del pH e n e l tiempo para mues tras con PFC, Réplica 2. 34 Figura 9. Seguimiento del pH e n e l tiempo para mues tras sin PFC, Réplica 2. 34 Figura 10. Seguimiento del pH e n e l tiempo para el sobrena dante de la Em ulsión Repe tición 1. 35 Figura 11. Seguimiento del pH e n e l tiempo para el sobrena dante de la Em ulsión Repe tición 2. 35 Figura 12. Seguimiento de la Osmolaridad para un S istema Lecitina/Agua Hiperosm olar. 36 Figura 13. Seguimiento de la Osmolaridad promedio de las réplicas 1 y 2 para los Sistemas con PFC. 38 Figura 14. Seguimiento de la Osmolaridad un Sis temas Lecitina/Agua Normosm olar. 38 Figura 15. Seguimiento del Potencial Z e n e l tiempo para los sistemas con PFC en la Réplica 1. 39 Figura 16. Seguimiento del Potencial Z e n e l tiempo para los sistemas s in PFC en la Réplica 1. 40 Figura 17.Seguimiento del Pote ncia l Z e n el tiempo para todos los sis temas estudiados en la Réplica 2. 40 Figura 18. Comportamiento del Potencial Z con respecto al pH para los sis temas. 41 Figura 19. Espectro Infrarrojo Cercano del Sistema con PFC e n 2 meses de es tudio. 42 Figura 20. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano Completa del S istema con PFC en 2 meses de estudio. 43 Figura 21. Espectro Infrarrojo Cercano para la Fase Leve del S istema con PFC ce ntrifugado e n 2 meses de estudio. 44 Figura 22. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano para la Fase Leve del Sis tema con PFC centrifugado en 2 meses de es tudio. 45 Figura 23. Espectro Infrarrojo Cercano para la Fase Leve del S istema con PFC ce ntrifugado e n 2 meses de estudio. 46 Figura 24. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano para la Fase Pesada del S istema con PFC centrifugado en 2 meses de es tudio. 47 Figura 25. Espectro Infrarrojo Cercano de l Sistema sin PFC e n 2 m eses de estudio. 48 Figura 26. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano del Sis tema s in PFC en 2 meses de estudio. 49 Figura 27. Cambio de Absorbancia e n la segunda derivada del es pectro para todos los sistemas a 1398 nm. 49 Figura 28. Cambio de Absorbancia e n la segunda derivada del es pectro para todos los sis temas a 1860 nm. 50 Figura 29. Cambio de Absorbancia e n la segunda derivada del es pectro para todos los sistemas a 1536 nm. 51 Figura 30. Cambio de Absorbancia e n la segunda derivada del es pectro para el siste ma sin PFC a 1680 nm y a 1744 nm. 51 Figura 31. Curvas Multimodales de las partículas e n e l sobrenadante de la em ulsión. 52 Figura 32. Seguimiento del diáme tro en el tiempo para el s istema de Lecitina/Agua. 53 Figura 33. Seguimiento del diáme tro en el tiempo para el s istema de Lecitina/PFC/Agua en e l sobrenadante. 54. V.
(8) Figura 34. Seguimiento del diáme tro en el tiempo para el s istema de Lecitina/PFC/Agua en e l sedimento. 55 Figura 35. Seguimiento del diáme tro en el tiempo para la fase leve del sistema Lecitina/PFC/Agua sometido a centrifugación leve. 56 Figura 36. Seguimiento del diáme tro en el tiempo para la fase pesada del sis tema Lecitina/PFC/Agua sometido a centrifugación leve. 57 Figura 37. Seguimiento del pH e n e l tiempo para el sobrena dante de la Fase Leve de la Emuls ión centrifugada. 64 Figura 38. Seguimiento del pH e n e l tiempo para el Siste ma Lecitina/Agua Repetición 1. 64 Figura 39. Seguimiento del pH e n e l tiempo para el Siste ma Lecitina/Agua Repetición 2. 65 Figura 40. Seguimiento de la Osmolaridad e n el tiempo para todos los sis temas con PFC de la Réplica 1. 65 Figura 41. Seguimiento de la Osmolaridad e n el tiempo para todos los sis temas de la Réplica 2. 66 Figura 42. Espectro Infrarrojo Cercano Com pleto del Sistema con PFC en 2 meses de es tudio. 66 Figura 43. Espectro Infrarrojo Cercano Com pleto para la Fase Leve de l Sis tema con PFC centrifugado en 2 meses de es tudio. 67 Figura 44. Espectro Infrarrojo Cercano Com pleto para la Fase Pesada del Siste ma con PFC centrifugado en 2 meses de estudio. 67 Figura 45. Espectro Infrarrojo Cercano Com pleto del Sistema s in PFC en 2 meses de estudio. 68 Figura 46. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano Completa del S istema con PFC en 2 meses de estudio. 68 Figura 47. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano Completa para la Fase Leve de l Sis tema con PFC centrifugado en 2 meses de estudio. 69 Figura 48. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano Completa para la Fase Pesada del Siste ma con PFC centrifugado en 2 meses de es tudio. 69 Figura 49. Segunda Derivada del Es pectro Infrarrojo Cercano Completa del S istema s in PFC en 2 meses de estudio. 70. VI.
(9) Lista de Tablas. Tabla 1. Tamaño de los liposomas [33]...........................................................................................14 Tabla 2. Formula ción de una emulsión de perfluorocarbonado típica [12]. ..........................................20 Tabla 3. Diámetro efectivo de las partículas para cada número de ciclos en el m icrofluidizador. .............31 Tabla 4. Índices de Refracción para cada una de las fases. .................................................................32. VII.
(10) 1. PLANTEAMIENTO DEL P ROBLEMA En las últimas décadas se han buscado sustitutos de sangre que puedan transportar gases como el oxígeno y el dióxido de carbono. Además de poder transportarlos es necesario la entrega y la absorción de estos gases en los tejidos. Se hace necesaria la búsqueda de sustancias que transporten el oxígeno debido a los problemas que conlleva en algunos casos las transfusiones de sangre y las distintas situaciones sociales, económicas, médicas que hacen que las soluciones encontradas hasta el momento no sean suficientes [1]. En Estados Unidos se presentan 5 millones de transfusiones de sangre al año, en donde los hemosustitutos pueden ayudar a abarcar una demanda tan grande de sangre [2,3]. El primer problema que hace necesario la búsqueda de portadores de oxígeno es la probabilidad de contagio de enfermedades a través de la sangre, en especial el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Exis ten enfermedades que son trans mitidas con más frecuencia media nte transfusiones de sangre, tales como la hepatitis. Como segundo problema, debe existir una compatibilidad entre el donante y la persona que recibe la donación, ya que pueden existir respuestas alérgicas o inflamatorias debido a una respuesta inmunológica a la presencia de células rojas distintas a las del hospedero, además que debe existir una compatibilidad entre el grupo sanguíneo y el RH de la persona. El tercer problema que existe es que las transfusiones de sangre alteran el sistema inmunológico del paciente y retarda la respuesta a agentes externos, esto ocasiona que halla mayor probabilidad de infección y es una situación muy peligrosa después de una operación, en donde el paciente ya se encuentra debilitado. El cuarto problema que se presenta es el aumento de necesidades de sangre y la disminución del almacenamiento de las mis mas. La reducción de almacenamiento es una respuesta al aumento de los costos de adquisición de la sangre, pruebas y mantenimiento. El aumento de demanda de sangre se ve afectado debido al incremento de terapias y cirugías en los pacientes. Por ejemplo, en los Estados Unidos, un 50% de las transfusiones realizadas son para pacientes de más de 65 años, en donde se espera que esta población se incremente en los próximos años. Existe un quinto problema, así se adicionen sustancias como citrato de sodio, glucosa, citrato-fosfato-dexstrosa y se almacene de forma adecuada en recipientes de plástico (normalmente de PV C o PET), el mantenimiento de la sangre es complicado y tiene un límite de almacenamiento no mayor a 45 días. Por 1.
(11) último, al almacenar sangre se presentan cambios en las propiedades como la viscosidad, cambio del pH o dis minución de la afinidad por el oxígeno, condición que se da por efectos de lesión de almacenamiento [1, 4, 5, 6,7]. Existen principalmente dos tipos de transportadores de ox ígeno que pueden reemplazar a la sangre en algunos casos, los transportadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOC´s) o las emuls iones de perfluorocarbono (PFC´s).. Los HBOC’s se basan. sustancias con hemoglobina modificada que tienen mejores capacidades de diluir y transferir oxígeno a los tejidos. Este tip o de soluciones buscan estrategias para modificar la hemoglobina nativa, llegar a estabilizarla, darle las propiedades de manejo de oxígeno que tienen las hemoglobinas de basadas en eritrocitos y per mitir una duración deseable intravascularmente. Aunque estas sustancias tienen propiedades similares a las basadas en células rojas, se tiene que existen problemas de poca duración de vida útil en la que tienen la capacidad de transportar oxígeno, además de problemas de activación del sistema inmunológico, efectos de coagulación, infección bacterial y presencia de reacciones peroxidativas. Los PFC’s son moléculas aromáticas o alifáticas inertes que tienen la capacidad de disolver gases como el ox ígeno. El principal problema que tienen las emulsiones de perfluorocarbonos es la estabilidad de las mis mas, además que en la preparación de la emulsión influyen muchas variables (formulación y proceso) que pueden afectar las propiedades de la sustancia. Tanto las sustancias basadas en Hemoglobina como las emulsiones perfluorocarbonadas deben. tener. unas. características especiales para. poder ser. utilizados como. transportadores de oxígeno. Estas sustancias deben tener una vida media de duración en circulación larga, se debe asegurar estabilidad de la sustancia antes de ser usada en el paciente, debe presentar la menor cantidad de efectos secundarios sobre el paciente, debe presentar un buen transporte de oxígeno y deben liberarlo en el tejido de manera efectiva. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar las estructuras presentes dentro de una emulsión perfluorocarbonada, ya que en el protocolo de preparación puede existir un exceso de Lectina, cuya naturaleza en agua permite la formación de liposomas. La formación de liposomas dificulta la descripción de los fenómenos de estabilidad de la muestra, para lo cual la caracterización de estas estructuras permitirá generar soluciones para evitarlas.. 2.
(12) 2. OBJ ETIV OS. 2.1 Objetivo General Caracterización de. las. estructuras. presentes. en. un. sis tema. Lecitina/Perflurocarbono/Agua.. 2.2 Objetivo Específicos • Caracterización de un blanco compuesto por Lecitina/Agua mediante la deter minación del diá metro de partícula, pH, os molaridad y potencial Z. •. Comparación del blanco con respecto a la fase liviana de la emulsión obtenida después de una centrifugación leve.. •. Caracterizar la fase pesada obtenida después de una centrifugación leve mediante la determinación de diámetro de partícula.. 3.
(13) 3. ESTADO DEL ARTE. 3.1 Introducción Los hemosustitutos son sustancias capaces de llevar gases como oxígeno o dióxido de carbono y poder liberarlos a los tejidos de manera eficaz. El nombre de sustitutos de sangre no es el apropiado para estas sustancias, ya que estas sustancias no cumplen con ciertas características que tiene la sangre, tales como propiedades inmunológic as, no cumplen con funciones metabólicas, ni reguladoras ni defensivas. Por lo cual un nombre que representa mejor este tipo de productos son los transportadores de oxígeno. [1] Debido. a. que. en. este. trabajo. se. tratará. específicamente. las. emulsiones. perfluorocarbonadas, se empezará definiendo y describiendo las propiedades de las emulsiones, los tipos de emulsiones, las formas de caracterización, la estabilidad de las emulsiones y los agentes emulsionantes utiliz ados. Por último se tratarán las sustancias perfluorocarbonadas, sus propiedades, características de uso y formas de preparación. 3.2 Emulsiones. Definición y característic as de las emulsiones: Una emulsión es una dispersión de gotas de un líquido inmiscibles en otro líquido, en los que se hace necesario el uso de una sustancia activadora de superficie o conocida como surfactante. En estas sustancias se definen dos fases, una fase continua que representa la sustancia que se encuentra en mayor proporción dentro de la mezcla, y una fase dispersa que es representada por las gotas de la segunda sustancia inmiscible. [8] La adición del surfactante es necesaria para asegurar la reducción de la tensión superficial en la interfase de las fases continua y dispersa, que evita los fenómenos de coalescencia y mejora la estabilidad de la sustancia [9]. Las emulsiones son obtenidas realizando una mezcla entre las dos sustancias y el agente tensoactivo para estabiliz ar el producto final. Además es necesario proporcionarle energía al sistema para lograr la formación de gotas en la fase continua y reduciendo el tamaño de las mismas para asegurar estabilidad [9]. Esto debido a que el tamaño de gota es inversamente proporcional a la estabilidad de la emulsión. Esto se puede explicar debido a que cuando dos gotas de la fase dispersa se encuentran a una distancia pequeña, existe una fuerza de atracción de Van de Waals y una fuerza de repulsión sobre las dos. 4.
(14) La fuerza de Van de Waals es directamente proporcional a la masa de la gota y las fuerzas repulsivas dependen de las propiedades interfaciales del surfactante utilizado. Al depender de las propiedades interfaciales del surfactante, se tiene que las fuerzas repulsivas dependen del área superficial de la gota a la que esta expuesto el agente tensoactivo. El área superficial de una gota por unidad de volumen de una emulsión monodispersa se puede expresar como: [8]. σ=. 4πR 2 3 = (1) 4 3 R πR 3. Donde R es el tamaño de la partícula. Esto quiere decir que al dis min uir el tamaño de gota el área interfacial aumenta para una emulsión monodispersa, lo que representa un aumento de las fuerzas repulsiv as con respecto a las fuerzas atractivas. Por esta razón se agrega energía en forma de agitación, para reducir el tamaño de gota y lograr que predominen las fuerzas repulsiv as sobre las fuerzas atractivas. Nor malmente se representa que las fases se encuentran compuestas por agua (W) y por aceite (O), ya que así no sean específicamente estas sustancias, son una forma de simbolizar una fase polar y no fase no polar. Así, se definen las emulsiones directas como una dispersión de gotas de aceite en agua (O/W) y una emulsión en donde existen gotas de agua dispersas en aceite se conocen como emulsiones inversas (W/O). Existen emulsiones múltiples cuando dentro de una gota se encuentra dispersa una gota más pequeña de la fase continua. Como se observa en la figura 1. Las emulsiones múltiples pueden ser dispersiones de agua en gotas de aceite (W/O/W) o dispersiones de aceite en gotas de agua (O/W/O) [8, 10, 11]. Las cantidades relativas de cada una de las fases dentro de la emulsión afectan directamente las propiedades de la misma. Por lo cual se hace necesario hacer una clasificación de estas sustancias según las cantidades de cada una de las fases dentro del sistema. Para una emulsión en la que se tiene menos de un 20% de la fase dispersa, se habla de una emulsión de bajo contenido de la fase interna, que se conoce también como una emulsión diluida.. 5.
(15) Figura 1. Tipo de emulsiones. [10]. Estas sustancias tienen muy poca interacción entre gotas que genera que el análisis de estos sistemas sea más sencillo, y que con el tensoactivo indicado y una cantidad necesaria, se puede asegurar de manera mejor la estabilidad. Por otro lado, se encuentran las emulsiones concentradas, que se definen como aquellas que están compuestas entre un 60% a un 70% en volumen de la fase interna. Cuando se tiene que la fase interna ocupa un volumen mayor al 75%, se habla de emulsiones altamente concentradas. [10] Dependiendo de los componentes que componen la emulsión y de la cantidad relativas de cada uno de ellos, se agrega en porcentaje cierta cantidad de agente emulsionante. Pero generalmente existen dos límites que se deben tener en cuenta para esta sustancia. Cuando se agrega una concentración menor a 0.1%, no existe suficiente agente emulsionante para garantizar la estabilidad de la emulsión. Del lado contrario, si se agrega más de una concentración de 5% de agente emulsionante puede suceder que no existan cambios en la estabilidad de la sustancia o que se este favorenciendo los fenómenos de perdida de estabilidad de la emulsión. [10] Cuando se agrega energía mecánica, se generan gotículas debido a la deformación de la interfase entre los dos componentes. La deformación es opuesta a la presión de Laplace, que es provocada debido a que la presión del lado cóncavo de la interfase, donde la tensión interfacial se representa por γ , es mayor que la del lado convexo. Esta presión tiene un valor que esta dado por [12]:. ∆P = (. 1 1 2γ + ) *γ = (2) R1 R2 R 6.
(16) Para la formación de gotículas, el gradiente de presión debe ser mayor que la presión de Laplace. Las dos formas de generar esto son la aplicación de una presión externa que logre la condición anterior mente mencionada, o que se realicen fuerzas viscosas entre los líquidos inmiscibles a una tasa de esfuerzo viscoso que sea cercana a la presión requerida [12, 13]. Estos procesos son logrados mediante la aplicación de una fuerza externa conocida en forma de agitación. Como se había mencionado anter iormente, la aplicación de agitación externa provoca que el área interfacial (∆A) crezca y por ende la energía libre de la interfase crece en una cantidad igual a. E = γ∆A (3) La cantidad de energía a proporcionar es alta debido a que el gradiente de Presión también lo es, lo que representado en agitación, repercute en grandes costos de potencia requerida [12, 13]. Estabilidad de las Emulsiones: La noción de estabilidad es una medida relativa, pero se refiere a una poca presencia de cambio dentro de la emulsión dentro de cierto intervalo de tiempo que está directamente relacionado con la aplicación de la sustancia [10]. Las emulsiones cambian sus propiedades al perder su estabilidad, como por ejemplo la consistencia, la viscosidad, la homogeneidad, entre otros. Es por esto que es necesario predecir los fenómenos que involucran estos cambios para lograr evitarlos. En el estudio de la estabilidad de las sustancias se debe presentar un almacenamiento acelerado para predecir la estabilidad en intervalos de tiempos largos [14]. Los principales métodos acelerados que existen son la aplic ación de fuerzas centrif ugas que hagan que las dos fases se separen debido a la diferencia de densidades entre ellas, aplicación de cambios de temperaturas (pueden ser cambios cíclicos) a la muestra y aplicación de vibraciones a la muestra. Pero existe el problema que estos métodos son limitados y las predicciones con el tiempo no son tan acertadas. Por lo cual actualmente se prefieren los métodos a largo plazo en los cuales se estudia la inestabilidad en largos tiempos de almacenamiento (suele estudiarse en mínimo 6 meses de almacenamiento y máximo 12 meses) [14].. 7.
(17) La estabilidad de una emulsión puede verse afectada debido a factores externos como el pH, la contaminación, microorganis mos y la temperatura. Pero debe entenderse que las emulsiones tienden a ser sustancias inestables que se separan en el tiempo, por lo cual deben utilizarse métodos para estabilizarlas. Existen principalmente dos métodos para estabilizar las emulsiones, el primero es estabilización electroestática, que se da cuando se utilizan surfactantes aniónicos que son absorbidos por las gotas de aceite, logrando que exista la formación de una capa de carga negativa rodeada por una segunda de capa contraria. Por otro lado se tiene la estabilización estérica, que se da cuando se utilizan emulsificantes de tipo polimérico o no iónico, donde los efectos de los efectos estéricos se ven representados en forma de repulsiones de Van der. Waals [15]. Existen principalmente 5 métodos de inestabilidad de las emulsiones: 1. Cremaje o Sedimentación: En estos dos procesos no existe un cambio en el tamaño de las gotas, sino una acumulación de ellas debido a una diferencia de densidades y a la acción de la gravedad. [12] El cremaje ocurre cuando la fase interna es más ligera que la fase continua, mientras que la sedimentación es el caso contrario. Estos procesos siguen la ley de Stokes, de donde se puede determinar que para disminuir la velocidad de bajada o subida de las gotas es necesario disminuir el radio de las gotas, disminuir la diferencia de densidades e incrementar la viscosidad de la fase externa. [16] 2. Floculación: Existe cuando se presentan fuerzas atractivas entre gotas que logran formar un agregado de gotas que no pierden su identidad. Dependiendo de la intensidad de la fuerza neta, la floculación puede ser reversible o irreversible. [14, 16] La floculación puede ser reducida si se crean barreras entre las gotas que evitan el acercamiento entre ellas cuando las fuerzas de Van der. Waals son lo suficientemente grandes. [14] 3. Coalescencia: Es un proceso ir reversible que se basa en el transporte de materia entre gotas, lo que quiere decir que dos gotas más pequeñas se unen para formar una más grande. Este fenómeno es instantaneo cuando las fuerzas son lo suficientemente grandes y la película que las separa se ha adelgazado lo suficiente que las perturbaciones interfaciales son capaces de romperla.. 8.
(18) La coalescencia se puede presentar después de presentarse fenómenos de floculación, sedimentación o cremaje, en donde las gotas se encuentran aglomeradas y las atracciones entre ellas se incrementan. La coalescencia se puede disminuir si se usan surfactantes mixtos, que reducen los efectos de las fluctuaciones. Por otro lado se puede evitar debido a la formación de una fase líquida cris talina lamelar en la interfase O/W. [14] 4. Ostw ald Rippening: Este proceso ocurre debido a una diferencia de solubilidad entre gotas grandes y gotas pequeñas. De esta manera, se forma unión de gotas pero no debido a la coalescencia, sino a que el sistema intenta llegar al equilibrio debido a la diferencia de potencial entre las gotas pequeñas y las gotas grandes, que se soluciona cuando todas tienen el mismo tamaño. Las formas de evitar este fenómeno son la reducción de tensiones interfaciales y el mejoramiento de la elasticidad de Gibbs, definido por la letra E como:. E=. ∂γ (4) ∂ ln A. Donde el lado derecho de la ecuación representa el gradiente de tensión interfacial. La elastic idad de Gibbs puede ser mejorada si se agrega un surfactante polimérico que se adsorba fuertemente en la interfase O/W. [14] 5. Inversión de fases: Este fenómeno se presenta cuando la fase externa se convierte en la fase interna, y la fase interna se convierte en la fase externa. Estos procesos pueden ocurrir de manera simultánea, lo cual genera que la descripción y análisis de la inestabilidad de la emulsión sea más difícil. En la Figura 2 se representa cada uno de los fenómenos de inestabilidad de una emulsión.. 9.
(19) Figura 2. Mecanismos de inestabilidad en una emulsión. [14]. Agentes emulsionantes Los agentes emulsionantes son sustancias anfífilas que muestran una fuerte tendencia a migrar a la interfase que exis te entre dos fluidos de propiedades distintas y que se encuentran en contacto. Las sustancias anfífilas son sustancias que poseen una doble afinidad, es decir, tienen una afinidad polar-apolar. El grupo polar tiene comúnmente heteroátomos de O, N, P ó S, mientras que el grupo apolar es normalmente un grupo hidrocarbonado alquil o alquil-benceno. De esta forma, el grupo polar se encontrará en contacto con el agua y el grupo apolar se encontrará en contacto con un solvente orgánico o algún tipo de aceite. [17] Los surfactantes son sustancias que tienen una actividad superficial o interfacial, donde estas sustancias deben tener cierto equilibrio entre la afinidad polar y la afinidad no polar. De esta manera, la principal función de estas sustancias es reducir en el mínimo la tensión interfacial y lograr estabilizar las emulsiones creando barreras que formen repulsión entre gotas al acercarse entre ellas. Cuando se agrega una gran cantidad de tensoactivo, se forman agregados conocidos como mic elas. Las micelas afectan directamente las propiedades de la emulsión, tales como la solubilidad de hidrocarburos, la viscosidad o la solubilidad de aceites en la solución acuosa. Los surfactantes pueden dividirse en [17]: 1. Aniónicos: presentan una cabeza hidrófila de carga negativa y contra iones positivos. A este grupo pertenecen los detergentes sintéticos, los agentes 10.
(20) espumantes y los humectantes. Se debe a que se disocian en un anión anfífilo y un catión. 2. Catiónicos: se disocian en una solución acuosa como un catión orgánico anfífilo y un anión generalmente de tipo halogenuro. En otras palabras la cabeza hidrofílica tiene carga positiva y contra iones negativos. Son excelentes agentes antiestátic os, hidrofobantes e inhibidores de corrosión. 3. No iónicos: Son aquellos que en solución acuosa no se ionizan. Son utilizados cuando se necesitan compuestos de muy baja toxicidad. 4. Zw itteriónicos: Contienen cargas positivas y negativas en la mis ma molécula sin contra-iones. Estas son de vital importancia, ya que como su nombre lo dice, “tensoactivo”, son sustancias que afectan la tensión interfacial y reducen la energía de Gibbs en el sistema, logrando que el sistema sea termodinámicamente estable [17]. Para el presente trabajo es importante recalcar que es necesario que el agente emulsificantes sea biocompatible con la sangre, y sea estable dentro del torrente sanguíneo. La eliminación de estas sustancias debe ser de tipo renal, además que la coalescencia dentro del cuerpo puede provocar taponamiento del ducto sanguíneo (vena o artería). Deben tenerse dos reglas en cuenta cuando se habla del manejo del tensoactivo. La primera se conoce como la regla de Bancroft, en donde se establece que el tensoactivo tiene una mayor afinidad por una de las fases y esta normalmente es la fase continua. La segunda regla a tener en cuenta es la de Ostw ald, que propone que normalmente la fase continua es la que se encuentra en mayor proporción volumétr ica dentro de la emulsión [12]. Debido a que el agente emuls ificante es de vital importancia para la estabilidad de la emulsión, es necesario hacer gran énfasis en su selección, según su afinidad a la fase continua [12]. Selección del agente emulsionante La selección del surfactante depende de muchas variables del sistema, pero generalmente se basa en la naturaleza de cada una de las sustancias que componen las fases, del tipo de emulsión a preparar y de la afinidad del surfactante con cada una de las 11.
(21) fases. Existen varios métodos cuantitativos para la selección del surfactante según la afinidad del mismo con cada una de las fases. Principalmente estos métodos son el balance hidrofílico - lipofílico (HLB), la temperatura de inversión de fases, el parámetro de Windsor y la diferencia hidrofílico – lipofilico (HLD). [8] Lecitina como estabilizador La lecitina es una mezcla de glicolípidos, triglicéridos y fosfolípidos. Está presente en la mayor ía de las membranas celulares de organis mos eucariotas, en donde protege a las células de la oxidación por sustancias nocivas [19]. Esta función que se da naturalmente ha sido objeto de numerosos estudios para entender sus propiedades físico químicas y desarrollar suplementos a partir de este compuesto. De todos las investigaciones realizadas hasta el momento se ha encontrado que las lecitinas tienen efectos benéficos en el sis tema circulator io (evitando la congestión arterial) y sistema nervioso (Protegiendo las membranas cerebrales). A partir de estos resultados se han generado fármacos a base de lecitina y estos ya han sido aprobados por la FDA en Estados Unidos [20]. Por otra parte, se ha encontrado también que la lecitina tiene efecto en procesos de emulsificación para aplic aciones alimenticias y a nivel clínico [20]. La fuente de lecitina en estos casos es la yema de huevo o granos de soya [21]. En el segundo caso, la lecitina es extraída mediante lixiviación con hexano como solvente [22]. Las lecitinas ya han sido probadas como surfactantes para hemosustitutos [22, 23, 24]. A partir de estos estudios se ha demostrado que el tipo de surfactante empleado es una de las variables más importantes para la estabilidad de las emulsiones. De hecho, se ha mostrado que la lecitina Epicuron® hace que las emulsiones sean más estables en el tiempo. Sin embargo, las lecitinas son susceptibles a la hidrólisis y oxidación, factores que deben ser tomados en cuenta para la correcta formulación de las emulsiones. Además es necesario decir que exis te un efecto en la osmolaridad dependiendo del tipo de surfactante [23]. Un estudio riguroso a nivel de estos tipos de surfactantes, donde se tengan en cuenta aspectos reológicos y físico químicos de las emulsiones formadas puede marcar la ruta para la correcta formulación del hemosustituto.. 12.
(22) 3.3 Liposomas Los liposomas son estructuras construidas por moléculas lipídicas amfotéricas autoorganizadas en solución acuosa en estructuras esféricas y cerradas. Éstas consisten en una o más membranas concéntricas; donde sus tamaños se encuentran desde 20 nm hasta varios micrómetros, donde el grosor de la membrana es cercano a 4 nm. [31] Los liposomas pueden ser hechos de manera artif icial o pueden producirse naturalmente. De esta manera los liposomas artificiales son llamados vesículas. Estos pueden ser producidos en el laboratorio por varios métodos, entre ellos se encuentra la evaporación reversa de fases, la diálisis por detergente y la extrusión. Los liposomas tienen aplicaciones en la investigación como modelos de membranas y en la industria farmacéutica como transportadores de drogas, vacunas, enzimas y material genético, hablando de nano escala [32]. Los liposomas presentan baja estabilidad durante almacenamiento, lo que ocasiona problemas en aplicaciones médicas. Se han intentado desarrollar alternativas para el mejoramiento de la estabilidad de los liposomas en el almacenamiento. Una de las soluciones es el uso de surfactantes fluorocarbonados debido a sus características estabilizadoras. De esta manera los estudios se encuentran enfocados en la predicción y control de procesos de inestabilidad de las dispersiones de liposomas [32]. La energía total de un sistema disperso puede llega a ser disminuida mediante la reducción del área interfacial de las estructuras. Estas tendencias de agregación que sufren los liposomas se atribuyen a las fuerzas de atracción de Van der Waals, en donde no existe unión total de los liposomas, sino exis te una proximidad de los liposomas para reducir la energía del sistema. Estructuras. Simbolo. Tamaño (Micrometros). Unilamelares. SUV. 0.02-0.1. Unilamelares. LUV. 0.1-1. Liposomas Multilamelares. MLV. 0.1-100. Liposomas Gigantes. GV. 50-100. Liposomas. Oligolamelares. SOV. 0.02-0.1. Oligolamelares. LOV. 0.1-1. Liposomas Pequeños Liposomas Grandes. Pequeños Liposomas Grandes. 13.
(23) Tabla 1. Tamaño de los liposomas [33].. Los liposomas unilamelares son aquellos que se encuentran compuestos por una única bicapa lipidica, en donde pueden estar caracterizados en pequeños o grandes según literatura (Tabla 1). Los liposomas Multilamelares son aquellos que se encuentran compuestos por más de una capa lipídica de los componentes de la bicapa de otros liposomas que se destruyeron y se aglomeran en liposomas unilamelares.. Figura 3. Inestabilidad de los Liposomas [33]. Los liposomas son hechos artif icialmente mediante métodos de impacto, en los cuales se pueden l egar a obtener liposomas unilamelares pequeños. Como se observa en la figura 3, los liposomas. unilamelares. pequeños pasan. de ser liposomas. grandes. o. multilamelares, mientras que los liposomas grandes solamente se vuelven liposomas Multilamelares. Los liposomas multilamelares tienden a sedimentarse en el tiempo. 3.4 Hemosustitutos.. La sangre es un tejido líquido vital en el funcionamiento de los procesos fisiológic os que se llevan a cabo en los organis mos animales. La función más importante de esta es brindar los nutrientes. a los tejidos e igualmente remover de estos los productos de. desecho[ 25] . El oxigeno es transportado desde los alveolos pulmonares por la sangre para ser entregado a los tejidos. A nivel celular, es fundamental para que se l eve a cabo la fosforilación oxidativa realizada a nivel mitocondrial, la cual culmina con la generación de ATP, fuente de energía utilizada para todos los procesos que se llevan a cabo en el organismo [25]. Debido que el oxigeno es un gas poco soluble en plas ma solo una pequeña cantidad se encuentra diluido en este, y el restante se trasporta unido a la hemoglobina. La unidad fundamental de la sangre es el glóbulo rojo, una célula anucleada en cuyo interior se encuentra la hemoglobina, cuya función primordial es cargar el oxigeno que es 14.
(24) transportado por los glóbulos rojos en la sangre. La hemoglobina es una molécula con estructura cuanternaria formada por una porción proteica y una porfirina unida al hierro llamada grupo hemo, cuatro subunidades proteicas componen una molécula de hemoglobina. Cada molécula de hemoglobina puede unir y cargar hasta cuatro moléculas de oxigeno [25] . Múltiples patologías que involucran problemas cualitativos y cuantitativos de la sangre han sido descritas en la medicina contemporánea, entre estas. se destacan las anemias. hemolíticas, ferrepénicas, las secundarias a hemorragia, las hemoglobinopatías, etc. En busca de soluciones alternativas a estas patologías la investigación se ha centrado en el desarrollo de sustitutos de la sangre que puedan remplazar la sangre en una o más de su funciones, particularmente en trasportar oxigeno a los tejidos. Un hemosustituto es una sustancia que complementa la oxigenación y debe ser capaz de cargarse de oxigeno rápidamente en su paso por los capilares pulmonares, para luego trasportarlo a los tejidos y capaz de liberarlo rápida y eficazmente. Estas sustancias no deben incrementar el requerimiento de oxigeno y deben ser capaces de trasportar CO2. Su vida debe ser prolongada, libre de bacterias, virus, toxinas, microorganismos. Debe ser estéril e igualmente no apto para el desarrollo de patógenos, ni deben tener efectos colaterales. Tampoco pueden inferir en la coagulación, el sistema inmune, ni en las demás funciones de los órganos [26]. Además deben ser sustancias de fácil manejo y almacenamiento, listas para usar, y de efectividad inmediata. Deben ser de fabricación sencilla para ser viables industrial y comercialmente, y principalmente deben mantener sus propiedades estables a lo largo del tiempo a condiciones estándar preferiblemente. Entre las principales aplicaciones se encuentran: cirugía general, cirugía de bypass cardio-pulmonar y emergencias. En el primer caso se emplea en conjunción con sangre autóloga para desempeñar el procedimiento de manera mas efectiva, al conseguir una hemodilución mas agresiva y con mayor control sobre el paciente. En cirugía de bypass cardio-pulmonar con frecuencia se presenta. disfunción neurológica, aparentemente. debida a la formación de pequeñas burbujas de aire en el circuito del bypass que ingresan al sistema circulatorio y causan embolismo, por lo que se busca un hemosustituto capaz de liberar oxigeno y disolver las burbujas de aire. En el último caso expuesto, en. 15.
(25) emergencias, la obtención de un trasportador de oxigeno listo para usar de efecto inmediato es de gran valor pues ayuda a estabilizar al paciente en espera de transfusión y durante el recorrido en ambulancias. Además tiene potencial para el empleo en desastres naturales, uso militar y pacientes con restricciones religiosas en cuanto a las trasfusiones de sangre [26]. 3.4.1. Clases de hemosustitutos. A lo largo de las investigaciones se han propuesto varias sustancias, algunas sin resultados satisfactorios. Los hemosustitutos se han clasificado según el mecanismo de trasporte de oxigeno, existen dos grupos principales: El primero tiene un mecanis mo en el cual el oxigeno esta unido de forma covalente al trasportador (productos derivados de hemoglobina modificada o encapsulada, estos se denominan sustitutos basados en hemoglobina ( HB-OCs). El segundo tiene un mecanismo de trasporte en el cual el oxigeno esta físicamente disuelto en el trasportador (emulsiones de PFC que disuelven oxigeno y son inertes biológicamente) se denominan hemosustitutos basados en perfluorocarbono (PFC-OCs). Las principales diferencias entre estos dos grupos radican en la estructura molecular, la reactividad química y bioquímica, los perfiles de liberación de O2 y CO2, el mecanismos de trasporte, los parámetros que gobiernan el transporte, la naturaleza de las materias primas, el proceso de manufactura. Actualmente se realizan investigaciones que incluyen ambos grupos [26]. Ambas aproximaciones presentan ventajas sobre la hemoglobina natural, ya que estos mater iales no presentan antígenos para una posible reacción inmunológica y no son susceptibles a contamin ación por bacterias [23]. Sin embargo, ambas aproximaciones deben superar varios aspectos para ser usados, como la estabilidad de estos materiales y la interacción con el sistema circulatorio. En cualquiera de los dos casos un hemosustituto ideal debe cumplir con las siguientes características [23] : (i). No requerir un test de compatibilidad.. (ii). Poder ser almacenados por un tiempo largo, preferiblemente a temperatura. ambiente.. 16.
(26) (iii). Tener la capacidad de per manecer un tiempo considerable en el torrente. sanguíneo (tiempo de residencia alto). (iv ). No generar efectos colaterales.. (v). Ser estériles (libres de patógenos).. (vi). Cumplir satisfactoriamente. la función de trasportador y a su vez liberar. correctamente el ox ígeno a los tejidos. De lo anterior es evidente que el desarrollo optimo de un hemosustituto depende además de sus propiedades intrínsecas, también de su proceso de síntesis y su interacción con el medio sanguíneo. 3.4.2. Hemosustituros basados en Hemoglobina (HBOC’s). La hemoglobina libre fue la primera en ser estudiada por ser la responsable del trasporte del oxigeno en el organis mo. Se obtuvieron resultados desfavorables como efectos vasoconstrictores, toxicidad, activación del sis tema in mune, defectos en la coagulación y potencial de infección bacteriana [26]. Las infusiones de hemoglobina libre de estromas, produjeron varios efectos secundarios tóxicos, atribuidos a la coagulación intravascular causada por fragmentos de estromas presentes en los glóbulos rojos. También se postulo la fabricación de células artificiales a partir de caucho de silicona y globulos rojos, estos presentaron un desempeño eficiente en el transporte de oxigeno pero con la dificultad de que no sobreviven a la circulación. La síntesis de hemosustitutos basados en hemoglobina es más compleja, ya que requiere la consecución de grandes cantidades de sangre, la separación de las células rojas de los demás componentes, la extracción y purif icación de la hemoglobina, además tiene menor rendimiento que los basados en PFC [26]. Las primeras transfusiones de hemoglobina pura fueron realizadas entre los años 1934 con animales y a finales de los 40 se hizo en seres humanos sin mucho existo; los pacientes presentaron severos síntomas de reacción alérgica, toxicidad renal severa e hipertensión, lo que deslumbró el reto se tenía por delante respeto a los hemosustitutos basados en hemoglobina, y que hoy en día se esta enfrentando. Dentro de estos retos están, su disponibilidad, propiedades inmunológicas, corta vida media, afinidad excesiva con el oxigeno y propiedades vasoactiv as [23]. 17.
(27) Otro de los problemas claros en el uso de estos sustitutos reside en el hecho de que la hemoglobina libre puede unirse al óxido de nitrógeno, el cual actúa en el sis tema vascular como agente vasoactivo. Esto genera una liberación de endotelina, la cual incrementa la sensibilidad por parte de neuronas adrenérgicas [23]. De la mis ma manera, la dis minución del oxido nítrico ( NO) en el plasma genera un incremento en la presión sanguínea (incluye presión diastólica y sistólica), lo cual puede ser de alguna manera ventajoso para pacientes con problemas de hipotensión. Ante esto, Tsai et al.[30] ha sugerido que al no estar la hemoglobina dentro del eritrocito, hay una gran cantidad de ox ígeno liberado a la microcirculación. Dado que el eritrocito es una barrera efectiva contra la dif usión,. lo que se genera finalmente es un efecto. vasoconstrictor. El hecho de tener la hemoglobina libre en el plasma también tiene un efecto sobre la presión osmótica coloidal, alterando el volumen intravascular [30]. Además de lo expuesto anterior mente, La oxidación de la Hemoglobina soluble produce perdida de grupos heme, formación de radicales libres y oxidación de lípidos, lo que resulta en esfuerzos sobre el endotelio. Este mis mo hecho tiene efectos sobre el material sustituyente. La hemoglobina fuera del eritrocito se disocia en monómeros y dímeros, los cuales pueden ser filtrados en el glo mérulo. Esto disminuye la vida media debido al sistema haptoglobina retículo endotelial (RES). Para esto se han desarrollado sustitutos que. evitan la filtración renal.. Además de evitar este problema de toxicidad, estos. mater iales mejoran el problema de la alta afinidad por el ox ígeno [23]. Varios problemas para la aplicación del material se han dado a nivel inmunológico. Los primeros sustitutos de este tipo activaban el sistema de complemento, el cual incluye el complejo de ataque a membrana ( MAC) por pare de anticuerpos. Esto se daba debido al contenido residual de fosfolípidos de membrana que traían los procesos de síntesis del mater ial. Sin embargo, un refinamiento en las técnicas de producción del material mejoró este aspecto, aunque dejo por solucionar el problema de la respuesta específica. Para este segundo aspecto, se encontró que la mejor ruta de administración del material era la venosa, en donde la población de linfocitos es baja [23]. Los hemosustitutos basados en la hemoglobina son una realidad y ya han pasado varias de las pruebas clínicas (Etapas I, II y III). Sin embargo, los retos a superar para su aplicación en humanos son el reducido tiempo de residencia intravascular y su baja capacidad para oxigenar tejidos en comparación a la hemoglobina nor mal. 18.
(28) 3.4.3. Hemosustitutos basados en Perfluorocarbonados. Los perfluorocarbonos PFCs con sustancias organicas sinteticas inertes, en las cuales todos los hidrogenos han sido remplazados por atomos de fluor, algunas veces contienen bromo o nitrógeno, con gran afinidad a los gases respiratorios, son apolares por lo cual para ser usados en hemosustitutos, debe prepararse emulsiones con medio continuo acuoso [1]. En la investigación de solventes no polares como perfluoroquímicos (PFC) y fluidos de silicona se observo su capacidad de disolver grandes cantidades de oxígeno, la idea de generar sustitutos de la sangre de manera artificial empezó a generar gran interes. Clark y Gollan encontraron que los ratones eran capaces de sobrevivir bajo períodos largos de tiempo cuando eran sumergidos en perfluoroquímicos oxigenados [12]. Estos compuestos presentan ventajas como buena estabilidad en procesos quirúrgicos, accesibilidad inmediata y no presentan proble mas de hepatitis. Debido a su alta lipofobia (la cual está dada por el tamaño de los átomos de flúor), los perfluorocarbonados deben ser emulsificados para su administración cardiovascular, la cual se hace mediante una ventilación líquida parcial de los pulmones o mediante inyección directa [23]. Esto genera dos problemas claves en la consecución del hemosustituto; por una parte la emulsión generada puede ser inestable si no se administra un surfactante correcto, por otra, la dis minución en la concentración debido a la emulsificación, disminuye considerablemente la solubilidad del ox ígeno. Otro aspecto relevante es el diámetro de partícula de las emulsiones. Este debe ser suficiente para lograr la estabilidad y no generar problemas de obstaculización de las vías circulatorias. Se ha demostrado que el diámetro de partícula debe estar en el orden de 0,5 a 1 µm [23]. La emulsific ación debe ser hecha en presencia de un surfactante, para lo cual ha sido común el uso de lecitinas generadas a partir de yema de huevo o semillas de soya [21]. Para la preparación de estas emulsiones es usual el empleo de microfluidizadores, que reducen el tamaño de las partíc ulas, en los que la presión es elevada a tal punto que se genera turbulencia y cavitación. Esto genera partículas de tamaños deseables. La Tabla 2 muestra los componentes de los que se encuentra hecha una emulsión típica de PFC:. 19.
(29) Sustancia. Cantidad. Aceite de perfluorocarbono. 20 mL. Pluronic F68. 2,2 g. Carbohid rato Hidroxietil. 3,0 g. Glucosa. 100 mg. Cloruro de potasio. 32 mg. Cloruro de M agnesio. 7 mg. Fosfato monobásico de sodio. 9,6 mg. Cloruro de Sodio. 54 mg. Carbonato de sodio. Hasta pH de 7,44. Agua. Hasta 100 mL. Tabla 2. Formulación de una emulsión de perfluorocarbonado típica [12].. Varios aspectos fisicoquímicos hacen que estos compuestos sean usados para sustituir a la hemoglobina. Las fuerzas de interacción de Van der Waals entre el O2 y el PFC son mucho más débiles que las del enlace covalente entre el O2 y el Fe II de la hemoglobina. La molécula tiene enlaces extremadamente fuertes e interacciones intermoleculares débiles. Así mismo, la densidad electrónica de los átomos de flúor permite una baja interacción molecular y una baja tensión superficial. Una clara diferencia de estos compuestos con respecto a la hemoglobina es que los primeros presentan una relación lineal (Dada por la ley de Henry) en cuanto a la capacidad de solvatar el ox ígeno, mientras los segundos presentan una unión cooperativa que depende además de otros factores como el PH y la concentración de 2,3DPG [23]. Sin embargo, uno de los problemas principales de estos sustitutos es la estabilidad tanto a nivel de almacenamiento, físic o-químico y fis iológico. Los procesos de coalescencia y de “Ostw ald-Rippening” se hacen presentes tanto a nivel de almacenamiento como en el torrente sanguíneo. Estos sistemas han mostrado ser metaestables, lo que hace que la estabilidad y equilibrio sean logrados en condiciones muy particulares. Aunque ya se han encontrado surfactantes apropiados para la aplicación, un estudio riguroso de estas emulsiones a nivel ter modinámico y de trasporte no ha sido realizado hasta ahora.. 20.
(30) A nivel fisiológico se ha encontrado una rápida eliminación del material via pulmonar y renal, hechos que deben ser tratados a profundidad. Sin embargo, no se han encontrado problemas mayores a nivel inmunológico, comparado con los sustitutos basados en hemoglobina[23]. Los efectos colaterales como evolución de fiebre y dolor de cabeza se han hecho presentes cuando estos mater iales son administrados, sugiriendo un mecanismo activado por citoquinas. Esto se da debido al hecho de que las partículas de PFC son eliminadas por el sis tema RES [23]. De la misma manera se ha observado una disminución en el número de plaquetas, sugiriendo alguna interacción del material [23]. La solubilidad del oxígeno en estos materiales depende. extensamente del tipo de. perfluorocarbono empleado. Por ejemplo el empleo de Fluosol ® ha mostrado que este solo alcanza una solubilidad poco mayor al del plas ma [23]. El perfluoro-octyl bromuro ha mostrado un incremento en la solubilidad del doble del plas ma. Uno de los productos más prometedores es Oxycyte ® el cual ha mostrado la mayor solubilidad por el ox ígeno. En este orden de ideas, una variable que mide la eficacia del hemosustituto es la cantidad de oxígeno liberado a los tejidos. Sin embargo, pocos estudios se han realizado. Por otra parte, las potenciales aplicaciones clínicas de estos materiales son diversas. Sin embargo una limitante a la aplicación yace en la observación de que para el correcto funcionamiento del PFC se requiere un alto porcentaje de oxígeno inspirado (FiO2). Parece entonces que la utilid ad de estos compuestos se restringen a condiciones limitadas donde hay un ambiente controlado, como también en aplicaciones de corto plazo [23]. Por tanto, estos pueden ser útiles en condiciones de Shock y trauma respiratorio, para la realización de un bypass pulmonar, perfusión de tejidos, eritropoyesis (para pacientes con anemia pulmonar), cáncer y retiro de oxido nítrico (NO) [23]. Los estudios realizados sobre la aplicación de estos sustitutos han sido diversos [21,22, 23,24, 28] y con diferentes propósitos. Cuervo [21] ha estudiado el efecto de la presión osmótica y la viscosidad en el tamaño de partícula de un perfluorocarbonado. Para ello a realizado un diseño experimental factorial variando el tipo de lecitina ( Epicuron 170 y Ovothin 160) la viscosidad de la emulsión (alta o baja, según la concentración de glucosa) y la osmolaridad (Alta o baja dependiendo de la cantidad de sodio en la fórmula), teniendo como variable respuesta el diámetro de partíc ula. Para el tamaño deseado de partícula,. 21.
(31) se asumen gotas esféric as y se calcula la cantidad de lecitina que se emplea para recubrir una gota de PFC. El protocolo de preparación de las emulsiones incluye un ambiente de realización estéril, un proceso de premezclado y microfluidización. Finalmente Cuervo [21]. obtiene la. distribución de tamaño de partícula mediante un dispositivo adecuado. Sus muestran que la osmolaridad cambia según el tipo de lecitina, y que con Epicuron 170 ® el diámetro de partícula es mayor y más estable en el tiempo. Por su parte, Cabrales [23] ha realizado un trabajo dirigido a deter minar la cantidad de oxígeno liberado a los tejidos y a la aplicación de los PFC como diluyentes. Para el primer propósito ha usado la microcirculación epidérmica como modelo para medir el transporte. Esto lo ha hecho pues la circulación cutánea es representativa de otros tejidos, además de que la técnica empleada es poco invasiva. De esta manera, realiza dos dosis de las emulsiones (4 y 8 g/kg masa corporal), con un diámetro de partícula de 2µm. Además somete al modelo animal ( Hamster) a diferentes condiciones de dilución y de FiO2. Por último emplea una metodología para la visualización de la circulación cutánea.. Los. resultados muestran un aumento en la presión parcial del oxígeno en la sangre con el aumento de la dosis. El aumento de FiO2 tiene un efecto marcado sobre la liberación de ox ígeno a la circulación cutánea, aunque su aumento disminuye considerablemente la velocidad sanguínea. De la mis ma manera, muestra que la presencia de PFC a un FiO2 del 100% aumenta el transporte de oxígeno desde los pulmones hasta los tejidos. Además encuentra que bajo estas condiciones no se genera vasoconstricción, lo cual debe estar dado por el aumento de la viscosidad del plasma. Por otra parte, en el estudio de hemodilución Cabrales [23] encuentra que cuando el PFC es usado como diluyente, la dilución sanguínea puede ser extendida por debajo del valor del hematocrito. Por esta y otras razones le de validez al empleo de estos compuestos para esta aplicación. En el contexto de medir la capacidad de li beración de oxígeno Toshio et al [12] ha evaluado la administración intraabdominal de perfluorocarbonados saturados con oxígeno en la oxigenación sanguínea arterial y portal. Para ello ha utilizado ocho conejos a los cuales se les ha colocado catéteres a nivel intravascular, intrajejunal e intraperitoneal.. 22.
(32) Cada grupo recibió el perfluorocarbono FTPA. ya sea saturado o no saturado con. oxígeno. Los resultados indican que la adminis tración del PFC aumenta significativamente la presión parcial de oxígeno en sangre arterial y venosa, sin cambios significativos en la presión parcial de dióxido de carbono. El estudio de Toshio et al [28] concluye con que la administración intraabdomnal permite la correcta oxigenación de la vena porta y de la sangre arteria l. Por otra parte la aplicación del sustituto para perfusión de tejidos e incluso órganos ha sido estudiada. Sheule et al [27] ha mostrado la preservación de corazones que no laten provenientes de donadores en estado termin al (NHBD’s). Estos donadores son personas que llegan muertas a los hospitales por causas diferentes a las cardiacas, que no pueden ser resucitadas luego de un infarto. También se incluyen pacientes con muerte cerebral. En el estudio se aplica el PFC a ocho corazones provenientes de estos casos. Los resultados son asombrosos. Los ocho corazones presentan una recuperación funcional, aunque tres de estos mostraron embolis mo coronario. La formación de radicales libres durante los primeros cinco minutos de perfusión fueron también disminuidos. El empleo de los PFC como hemosustitutos presenta un panorama optimista para aplicaciones clínicas. Sin embargo, varios obstáculos deben ser superados para generar un protocolo correcto para que se permita su empleo; dentro de los cuales se encuentra la estabilidad de las emulsiones bajo condiciones sanguíneas, el aumento del tiempo de vida media de la emulsión, el. tiempo de residencia en el cuerpo y el incremento de la. solubilidad por el oxígeno. La diferencia principal en la carga y entrega del oxigeno entre los hemosustitutos basados en hemoglobina y los basados en perfluorocarbonos es que los primeros se pegan a la molécula de oxigeno y los segundos la disuelven, lo que traza una línea amplia entre las dos clases de hemosustitutos.. 23.
(33) 4. MATERIALES Y M ÉTODOS. 4.1 Preparación del sistema Lecitina/Agua La preparación del blanco de Lecitina/ Agua consiste en lograr obtener un sistema en el que se formen únicamente liposomas. Para este objetivo se sigue el mismo procedimiento que en el protocolo [34], omitiendo el mezclado del PFC. Lo que quiere decir que no se agrega perfluorocarbono al sistema. Este proceso es conocido como el proceso de premezcla, en donde se prepara la fase acuosa, en donde se agregan las sustancias buffer di–Sodio hidrogenofosfato dihidratado (Sodio dibasico) y el Sodio hidrogenofosfato monohidratado (Sodio monobásico) de Merck, a agua destilada (Quib i) con glicerol USP (Sigma) y un antioxidante, el alfatocoferol (Sigma). Todo se coloca en agitación en una plancha de calentamiento hasta los 60°C. El tamaño de liposomas a obtener inicialmente debe ser cercano a 20 nm (cantidad de pasadas por el microfluidizador a determinar en pre-experimentación). Según la clasificación de liposomas por tamaño [33], se iniciará de SUV (vesículas unilamelares pequeñas) para determinar si existe crecimiento a LUV (vesículas unilamelares largas) o sedimentación a MUV (vesículas multila melares). 4.2 Preparación de la Emulsión La preparación de la emulsión consis te principalmente de 4 pasos: el premezclado, la mezcla, la microfluidización y la adición de agentes. El proceso de premezcla consiste en preparar la fase acuosa, en donde se agregan las sustancias buffer di–Sodio hidrogenofosfato dihidratado (Sodio dibasico) y el Sodio hidrogenofosfato monohidratado (Sodio monobásico) de Merck, a agua destilada (Quibi) con glicerol USP (Sigma) y un antioxidante, el alfa-tocoferol (Sigma). Todo se coloca en agitación en una plancha de calentamiento hasta los 60°C. En el proceso de mezclado se toma la fase acuosa preparada en el paso anterior y se adiciona lecitina ( Epikuron 170®, DEGUSSA, Alemania) que sirve como tensoactivo, y el perfluorocarbono (perfluorooctil bromuro 99%, Exfluor Research Corp, USA). Esta mezcla se pasa por el Ultra Turrax (IKA T18 basic), para lograr un mezclado homogéneo. Para obtener el tamaño de gota deseado, la mezcla se hace pasar por el microfluidizador (Microfluidizer Processor. Microfluidics). Finalmente, se le adiciona Dextrosa (Baxter) y 24.
(34) Alginato ácido de sodio (Sigma), los cuales tiene la función de modificar la viscosidad y la osmolar idad de la emuls ión. Al igual que en el paso de premezcla, la agitación se realiza con agitación magnética. Las muestras se mantienen en una nevera y se dividen en muestras más pequeñas para la caracterización. 4.3 Caracterización de la dis persión lecitina/agua y de la emulsión El objetivo del blanco es tener un punto de comparación con respecto al posible exceso de lecitina en la emulsión. Se prepara el blanco de liposomas con una cantidad de lecitina igual a un estimativo del exceso de tensoactivo en la emulsión. Se realizaron 2 réplicas, donde se harán 15 mediciones en el tiempo. La caracterización del blanco se basa en: 1. Obtención de diá metro de liposomas mediante el analizador de partícula basado en difracción de luz dinámica. (Brookhaven 90Plus PArticle Sizer) en el tiempo para determinar cambios. Se encontró en la literatura [29] que si existe un cambio drástico en el diámetro de los liposomas se encontrarán agregados, es decir a cambios hasta 5000 nm.. La adición de sales a una muestra de liposomas puede generar que existan mayores repuls iones, ó dependiendo de las sales pude generar que la degradación se favorezca, por lo cual se estudiaron las siguientes variables para encontrar si la adición de sales en la preparación favorece la estabilidad o la repulsión: 2. Deter minación del pH de la muestra que será medido con el analizador de partícula Brookhaven 90Plus Particle Sizer.. 3. Deter minación de os molaridad con el Os mómetro Fiske One-Ten. 4. Deter minación del potencial Z con el analizador de partícula 90Plus Particle Sizer.. 5. Estudio de la degradación de los liposomas a partir de concentraciones de de lecitina, mediante el metodo de espectroscopía NIR.. 25.
(35) La temperatura es una variable que afecta directamente el tamaño de los liposomas, pero que se mantuvo constante en el experimento para todas las mediciones (6°C). El blanco se caracterizó mediante la deter minación del cambio de todas las variables que puedan afectar la estabilidad del sistema. Es por esto que se realiz ó un seguimiento del tamaño de partíc ula en el tiempo con el analizador de partícula basado en difracción de luz. (Brookhaven 90Plus Particle Sizer). Como se había mencionado en los objetivos, se prepararon dos emulsiones de perflurocorbono siguiendo el protocolo de la Universidad de los Andes y la Fundación Cardio Infatil para la fabricación de estas emulsiones. La diferencia se encuentra en que a una de ellas se sometió a una separación mediante centrifugación leve, en donde se separan dos fase, una leve que debería contener el exceso de Lecit ina y una pesada que debería contener la emulsión sin ningún liposoma. La fase leve se caracterizó igual que el blanco, para poder hacer las comparaciones del caso. Mientras que la fase pesada se caracteriz ó mediante el diámetro de partícula, para realizar un seguimiento de los fenómenos de inestabilidad. La otra emulsión, se almacenó y se analiza la fase clara igual que el blanco y la fase opaca se analizó igual que fase pesada de la primera emulsió n. 4.4 Métodos de Caracterización. 4.4.1. Dynamic Light Scatterng. El método Dynamic Light Scattering es utilizado para la deter minación del diámetro de partículas de gotas y liposomas. Este método mide las fluctuaciones que de luz difractada dependientes del tiempo, de las partículas que sufren movimiento Brow niano. Este tipo de movimiento se presenta debido a las colisiones que existen entre las partículas suspendidas y las moléculas del solvente. La luz dif ractada de una muestra de partículas conduce a una función de correlación de intensidad que se encuentra descrita por: ஶ. ܩሺ ߬ሻ ൌ ܫሺ ݐሻ ܫሺ ߬ ݐሻ݀( ݐ5) Esta ecuación se encuentra relacionada con el coeficiente de Difusión de la manera:. 26.
(36) ܩሺ ߬ሻ ൌ ܤ ି ݁ܣଶᇱఛ (6) Donde I es la intensidad, t es el tiempo y ߬ es la diferencia en tiempo. Las distribuciones multimodales se encuentran relacionadas a una función de correlación que se adapta mejor a un modelo multi-exponencial. El cálculo del coeficiente de Difusión ( D) conduce al cálculo del radio hidrodinámico r h mediante la ecuación de Stokes- Einstein. ݎ ൌ. ் గ. (7). Donde el T es la temperatura, n es la viscosidad del solvente y k es la constante de Boltz man. El radio hidrodinámico es el reportado por el equipo, que está relacionado con un tamaño aparente de una esfera hidratada, y se calcula del radio de una esfera que se difunde a la misma tasa.. Figura 4. Equipo de medición de tamaño de partícula.. En la figura 4 se muestra el equipo 90 plus Particle Analaizer, en el que se realizan las medidas para este experimento. 4.4.2. Near Infrared Spectroscopy. La región infrarroja se encuentra compuesta desde 700 a 106nm, por lo cual se divide principalmente en 3 regiones, cercano, medio y lejano. El espectro infrarrojo cercano se encuentra comprendido entre 700 a 2500nm. Los métodos de espectroscopía infrarroja se basan en la absorción de energía de las moléculas. Para que una molécula absorba radiación electromagnética deben cumplirse dos condiciones. •. La radiación debe tener la energía necesaria para cumplir los requerimientos. energéticos del material. •. Debe cumplirse un acoplamiento entre la radiación y la materia.. 27.
(37) Por lo cual la radiación en el infrarrojo tiene la energía necesaria para generar transiciones vibracionales en las moléculas, además se provoca que en las frecuencias estudiadas exista una coincidencia con la frecuencia fundamental de la vibración de ciertas moléculas. En este espectro se encuentran tres tipos de bandas principalmente: •. Bandas Fundamentales: Cumplen con la vibración del primer estado de equilibrio del enlace.. •. Bandas Transicionales: Son transciones que existen de la banda fundamental, es decir que vibra en otras condiciones de equilibrio.. •. Combinación de Bandas: Vibración de Bandas fundamentales y transicionales al tiempo.. Enlace. Primer. Sobretono. Segundo. Tercer Sobretono (nm). Combi nación de ba ndas (nm). 1100-1200. 800 ap rox. 2300-2350. 1700-1750. 1150-1200. 880 ap rox. 2300-2400. CH2. 1800-1850. 1150-1200. 890-900. 2300-2500. CH. 1600-1700. 1150-1200. 900. R-OH. 1400-1500. 950-1050. 750. C=O. 2000-2100. (nm). (nm). C=C. 1600-1700. CH3. Sobretono. 2000-2100. Tabla 3. Vibraciones en el espectro infrarrojo cercano.. 4.4.3. Potencial Z. La medición del potencial Z se basa en la medición del potencial que se genera debido a la carga de las partículas. De esta manera, este potencial es explicado debido a la doble capa. En donde suponiendo que se tiene una partícula cargada negativamente, se forma una primera capa de contraiones, conocida como capa Stern. Existiran otros iones positivos que se encontrarán atraídos por la partícula pero son repelidos por la capa Stern, que forman la capa difusa. En esta capa se encuentran iones negativos (coiones) que son repelidos por la partícula pero atraídos por la capa Stern. Así, la formación de estas dos capas sobre la superficie de la partícula genera un potencial. El potencial Z se 28.
(38) encuentra definido como el valor de esta variable que se encuentra entre la capa Stern y la capa difusa. La medición de esta variable se basa en generar un campo que hace que las partículas se muevan, según este movimiento se puede relacionar el potencial Z.. 29.
Documento similar
Por lo tanto se introducirán en el programa los valores de la primera derivada (en caso de condiciones de contorno de primer tipo) de la segunda derivada para segundo
Debido al riesgo de producir malformaciones congénitas graves, en la Unión Europea se han establecido una serie de requisitos para su prescripción y dispensación con un Plan
Como medida de precaución, puesto que talidomida se encuentra en el semen, todos los pacientes varones deben usar preservativos durante el tratamiento, durante la interrupción
Para ello, trabajaremos con una colección de cartas redactadas desde allí, impresa en Évora en 1598 y otros documentos jesuitas: el Sumario de las cosas de Japón (1583),
Entre nosotros anda un escritor de cosas de filología, paisano de Costa, que no deja de tener ingenio y garbo; pero cuyas obras tienen de todo menos de ciencia, y aun
Sanz (Universidad Carlos III-IUNE): "El papel de las fuentes de datos en los ranking nacionales de universidades".. Reuniones científicas 75 Los días 12 y 13 de noviembre
(Banco de España) Mancebo, Pascual (U. de Alicante) Marco, Mariluz (U. de València) Marhuenda, Francisco (U. de Alicante) Marhuenda, Joaquín (U. de Alicante) Marquerie,
Cada época, a través de la poesía, avanza sus propias reivindicaciones, y el lector de este libro, ante todo, descubrirá cuán fecunda es hoy en día la lectura de José