Espectroscopía ultrasónica resonante sin contacto y su aplicación al estudio de tejidos vegetales en estructura multicapa = Non-contact resonant ultrasound spectroscopy and its application to study multilayered vegetal tissues

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(1)UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS DE TELECOMUNICACIÓN. ESPECTROSCOPÍA ULTRASÓNICA RESONANTE SIN CONTACTO Y SU APLICACIÓN AL ESTUDIO DE TEJIDOS VEGETALES EN ESTRUCTURA MULTICAPA. TESIS DOCTORAL. Lola Fernández-Caballero Fariñas Máster en Ingeniería Biomédica. 2016.

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(3) Departamento de Tecnología Fotónica y Bioingeniería Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Telecomunicación Universidad Politécnica de Madrid. Tesis Doctoral. Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto y su Aplicación al Estudio de Tejidos Vegetales en Estructura Multicapa. Ph.D. Thesis Non-Contact Resonant Ultrasound Spectroscopy and its Application to Study Multilayered Vegetal Tissues. Autor María Dolores Fernández-Caballero Fariñas. Máster en Ingeniería Biomédica. Director Tomás E. Gómez Álvarez-Arenas. Año 2016. Doctor en Ciencias Físicas.

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(5) Tribunal Maurizio Mencuccini (presidente). U. of Edinburgh / U. A. de Barcelona. José Javier Serrano Olmedo (secretario). Universidad Politécnica de Madrid. Richard O’leary (vocal). University of Strathclyde. José Vicente García Pérez (vocal). Universitat Politècnica de València. Margarita González Hernández (vocal). Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Milagros Ramos Gómez (suplente). Universidad Politécnica de Madrid. Jorge Camacho Sosa Dias (suplente). Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Revisores Internacionales Sergio Sanabria (Suiza). ETH, Swiss Federal Institute of Technology. Jose Brizuela. C. N. de Investigaciones Científicas y Técnicas. (Argentina).

(6) "Eighty percent of success is showing up." Woody Allen On Language; The Elision Fields. The New York Times. August 13, 1989..

(7) Agradecimientos Tiene gracia que lo último que vaya a escribir de esta tesis sean los agradecimientos. Y es que, me cuesta ponerme a hacerlo. Si estáis leyendo estas líneas es porque una copia habrá llegado a vuestras manos, y si eso es así, espero no haber entrado en el selecto grupo de gente que habiendo defendido la tesis, han conseguido suspender. Entonces, suponiendo que ya sea doctora, me pongo a agradecer como es debido. Es verdad que aquí están resumidos gran parte de los conocimientos científicos y técnicos que he adquirido en estos últimos años. Pero lo que también es cierto, es que es una pena que aquí no quede reflejado todo lo que he aprendido. Cuando me preguntan por la utilidad de una tesis doctoral y percibo cierto tono de escepticismo, suelo contestar que no sirve para mucho -en un ejercicio de hipocresía tal, que se me puede reprochar justamente-. Esta hipocresía oculta en realidad mi incapacidad para separar la utilidad mercantilista, por la que creo que me preguntan, de la utilidad personal que ha supuesto para mí realizar este trabajo y que, sin duda, eclipsa del todo a la anterior. La persona que soy hoy en día es muy diferente a la que era hace cuatro años y, desde toda la objetividad del que habla de sí mismo, creo que he mejorado. El número y riqueza de las experiencias que me ha brindado la realización de esta tesis es tal, que a menudo me he sentido culpable por tener tanta suerte. Pero, como dice mi mentor, la vida es en ocasiones ya bastante injusta como para lamentarte también cuando tienes suerte. Y es que, yo soy mucho de quejarme. Y de repetir las cosas (no sé de quién habré aprendido esto –mamá-). Dicho esto, me gustaría agradecer en primer lugar, a los que han invertido más en mí y no sólo económicamente: a mis padres, que supieron inculcarme la importancia del respeto, la humildad y la educación, así como me ayudaron a entender que ser artista -teniendo en cuenta mi falta de preparación en tales disciplinas- era un poquito arriesgado cuando acabé el instituto. En segundo lugar, a mi hermano (y a Itziar, a la que también he recurrido en repetidas ocasiones), que siempre ha sido el más inteligente de la familia, el más ultrafondista, el que mejores regalos hace y sobretodo, el menos pesado. En tercer lugar a Tomás, si no hubiera sido él el encargado de guiarme por este camino, no creo que hubiese llegado al final (claro que igual ahora mismo, protagonizaría mi propio espectáculo en Broadway). En cuarto lugar, a todos los que ya estaban ahí antes de que comenzara esta tesis y a todos aquellos que aparecieron por y durante ella; gracias por atender mis preocupaciones -muy especialmente por escuchar aquellas que sólo tenían sentido en mi cabeza de persona que está siempre preocupada por algo- y, en definitiva, gracias por aportar a mi vida. Por último, gracias a todos los que de un modo directo o indirecto, han “patrocinado” la realización de esta tesis doctoral: la ciencia es más importante de lo que podía imaginarme antes de comenzar este camino y ahora tengo la responsabilidad moral de hacerlo entender. Sin más, me despido esperando impaciente a que la próxima vez que tenga que escribir tantos agradecimientos sea porque esté nominada por la Academy of Motion Picture Arts and Sciences - lo mejor que tiene esto, es que no me tendrán que dar un Doctorado de estos Honoris Causa a posteriori, que yo ya iré con el mío colgando -.. Lola.

(8) “Nada me parece más acertado para definir una biografía, que esos rostros compuestos por pequeños retratos de infinidad de personajes. Las vidas se asemejan a esas páginas en blanco con puntitos que uno ha de juntar con líneas para que aparezca el dibujo. En la existencia de cada uno de nosotros, los puntos son personas que en alguna circunstancia se entrelazaron con nuestros sentimientos.” Guillermo Fésser Tras los pasos de Miguel de la Quadra-Salcedo. El Huffington Post. Mayo 24, 2016..

(9) Prefacio La presente memoria de tesis doctoral tiene su punto de partida en la línea de investigación iniciada en 2008 y desarrollada por la colaboración entre investigadores del Departamento de Sensores y Sistemas Ultrasónicos del Instituto de Tecnologías Físicas y de la Información del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (ITEFI – CSIC) y de la Unidad de Recursos Forestales del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA). Este trabajo se encuentra recogido en las publicaciones referenciadas en la descripción del estado del arte; asimismo, una parte de estos trabajos previos también se pueden consultar en la tesis del Dr. Domingo Sancho-Knapik (Sancho-Knapik 2013). Estos trabajos presentan la técnica de Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto (NCRUS) como una herramienta con gran potencial para el estudio y caracterización del tejido vegetal en las hojas de plantas. Además muestran que los parámetros ultrasónicos, íntimamente ligados a la mecánica de las hojas de plantas, están también estrechamente relacionados con variables ecofisiológicas de gran interés en este campo. Sin embargo, estos trabajos anteriores se limitaban al estudio de las propiedades de la hoja en la dirección normal al plano de la misma, la consideraban como un material homogéneo e isótropo y fueron realizados siempre con hojas separadas del resto de la planta. Pese al potencial mostrado por la técnica, estas restricciones limitaban enormemente las posibilidades de la misma. La investigación desarrollada en el marco de la tesis doctoral que se presenta en esta memoria, tiene como objeto superar las limitaciones comentadas de la técnica empleando: i) modelos estratificados para considerar de manera explícita las diferentes capas de tejido presentes en la hoja, ii) direcciones de propagación diferentes a la normal, lo cual permite generar ondas de cizalla y ondas guiadas en la plano de la hoja y iii) hojas que permanecen unidas al resto de la planta mientras son medidas. Todo esto supone una mejora significativa de la técnica que permite obtener un conocimiento mucho más profundo y completo de las propiedades ultrasónicas de los tejidos vegetales y su relación con variables ecofisiológicas. Así pues, el marco en el que se ha desarrollado esta tesis es puramente multidisciplinar, desde ámbitos como la física aplicada y caracterización de materiales hasta la biología y ecofisiología vegetal. La introducción tratará de presentar de una manera breve los conceptos básicos necesarios para realizar una aproximación al campo de la biología. Igualmente, se contextualizará y expondrá el estado del arte de los dos ámbitos destacados implicados en esta tesis: los ultrasonidos en la caracterización de materiales y los métodos para la estimación del estado hídrico empleados en ecofisiología de plantas. En el capítulo 2, se describirán las técnicas experimentales así como los diferentes métodos teóricos utilizados. Los capítulos 3, 4, 5 y 6 recogen comunicaciones científicas realizadas durante el desarrollo de la tesis doctoral en formato de artículos científicos. Finalmente, se exponen las conclusiones generales derivadas de este trabajo además de las perspectivas futuras. Con el fin de dar una idea del trabajo del doctorando de una forma más global, se han i.

(10) anexado otros trabajos en los que ha colaborado y que han supuesto también parte importante en su formación.. ii.

(11) Resumen La caracterización de materiales mediante una técnica no invasiva sin contacto, constituye un hito particularmente en aquellos casos en los que existen fuertes restricciones a este respecto: supervisión en procesos de fabricación de materiales no curados, situaciones en las que se tiene un acceso limitado a la muestra, caracterización de materiales cuyo comportamiento es sensible de ser alterado bajo contacto, etc. El perfeccionamiento de transductores ultrasónicos capaces de trabajar acoplados en aire, ha favorecido el desarrollo de técnicas como la Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto (NC-RUS). Dicha técnica, se empleó con éxito en la caracterización mecánica de hojas de plantas. Asimismo, se demostró que algunas de las propiedades acústicas efectivas obtenidas considerando el tejido como homogéneo, podían ser usadas como indicadores del estado hídrico de las hojas con gran precisión. Sin embargo, el gran potencial de la técnica quedaba limitado por una serie de consideraciones no contempladas, a saber: heterogeneidad en los tejidos que componen las hojas, incidencia oblicua de la onda de ultrasonidos sobre la hoja y casos en los que la hoja no ha sido escindida del resto de la planta. Por tanto, este trabajo se centra en la aplicación de esta técnica en situaciones no estudiadas hasta el momento como: cuantificación de las variaciones en parámetros acústicos in vivo de hojas de plantas de distintas especies sometidas a cambios en factores abióticos (como luz y agua), establecimiento de relaciones entre parámetros elásticos medidos mediante técnicas ultrasónicas y la microestructura de tejidos vegetales, extracción de parámetros mecánicos provenientes de las diferentes capas que componen materiales estratificados de uso industrial común, así como en tejidos biológicos (hojas de plantas) y generación y detección de ondas de cizalla en tejidos vegetales. Los resultados recogidos en la realización de esta tesis doctoral indican la existencia de una variación mecánica detectable a frecuencias ultrasónicas de las hojas unidas al resto de la planta, a consecuencia de su respuesta frente a variaciones a factores tales como luz o agua. Por otro lado, valores elásticos recogidos empleando otras técnicas ultrasónicas que, además de longitudinales, excitan ondas guiadas y de cizalla en los tejidos vegetales, ponen de manifiesto la relación existente entre estos y las diferentes microestructuras que los forman. Asimismo, se han extraído parámetros mecánicos, tanto en incidencia normal como en oblicua en banda ancha ([0.1 – 1.6] MHz), relativos a las diferentes capas que forman materiales estratificados tanto del ámbito industrial como en el de las hojas de plantas. Las conclusiones derivadas de este trabajo apuntan a la aplicación de la Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto como una técnica de gran potencial en la caracterización, monitorización y control de cultivos de plantas en el ámbito de la ecofisiología. Asimismo, se constata que el método desarrollado en esta tesis es de gran valor en la caracterización mecánica no sólo de materiales sintéticos, sino también en iii.

(12) tejidos biológicos de hojas de plantas, permitiendo además, inferir parcialmente su microestructura de un modo inmediato, no destructivo y completamente no invasivo.. iv.

(13) Abstract Non-contact and non-invasive materials characterization constitutes an important milestone especially in cases where strong restrictions are mandatory, such as: monitoring of fabrication processes in uncured materials, testing samples under limited access, characterizing materials that can be altered due to contact, etc. As consequence of the advance in air-coupled ultrasonic transducers, a technique such as Non-Contact Resonant Ultrasound Spectroscopy (NC-RUS) was developed. This technique has been successfully applied in plant leaves characterization. Consequently, it was proved that effective parameters of plant leaves obtained using Non-Contact Resonant Ultrasound Spectroscopy enables an accurate estimation of plant water status. Nevertheless, the great potential shown by this technique was limited regarding some concerns not yet studied, such as: heterogeneity in leaf tissues, oblique incidence of the ultrasonic wave in the leaves and measurements on leaves attached to the plant. Therefore, this work is focused on the application of this technique in cases not studied so far, such as: quantifying and monitoring leaf acoustic parameters of different species while inducing changes in abiotic factors such as light and water, establishing the relationship between elastic parameters obtained by ultrasonic measurements and the microstructure of plant tissues, extracting mechanical parameters of each layer within the leaf and generating and detecting shear waves in plant tissues. Results collected in this work show the variation in the mechanical of plant leaves attached to the plant at ultrasonic frequencies, as a consequence of their response under light and watering alterations. Furthermore, elastic values obtained using ultrasonic techniques that propagate shear and guided waves in plant tissues reveal a link between them and the microstructure observed. Additionally, acoustic parameters from different layers within the sample at ultrasonic frequencies were extracted, both at normal and oblique incidence in wideband ([0.1 – 1.6] MHz). This was demonstrated not only in plant leaves but also in synthetic materials. From this work, we conclude that Non-Contact Resonant Ultrasound Spectroscopy (NC-RUS) technique is a powerful tool for characterization, monitoring and control of plants in the ecophysiology field. Moreover, it demonstrates that the NC-RUS technique and procedures developed in this thesis work, adds a significant value to materials characterization not only in synthetic materials but also in biological tissues such plant leaves, where it is possible to infer the microstructure in a non-destructive and non-invasive way.. v.

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(15) Índice Prefacio ............................................................................................................................. i Resumen ......................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................ v Índice ............................................................................................................................. vii Índice de Figuras ............................................................................................................ xi CAPÍTULO 1. Introducción: Motivación y Objetivos ................................................... - 1 1.1.. Motivación ............................................................................................................ - 3 -. 1.2.. Ultrasonidos y Tejido Vegetal............................................................................... - 4 -. Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto............................................... - 6 Excitación y Detección de Resonancias Espesor .................................................. - 7 Modelado y Resolución del Problema Inverso para el Ajuste de Datos ............... - 8 1.3.. Materiales Biológicos .........................................................................................- 10 -. 1.3.1.. La Célula Vegetal ........................................................................................- 10 -. El Citoesqueleto......................................................................................................- 10 La Pared Celular .....................................................................................................- 11 La Presión de Turgencia ........................................................................................- 12 1.3.2.. El Tejido Vegetal .........................................................................................- 13 -. 1.3.3. La Hoja, la Planta, y el Agua ...........................................................................- 15 1.4.. Objetivos Generales ...........................................................................................- 18 -. CAPÍTULO 2. 2.1.. Métodos Teóricos y Técnicas Experimentales.................................. - 19 -. Métodos Teóricos ...............................................................................................- 21 -. 2.1.1. Modelos de Propagación Ultrasónica en Hojas y Establecimiento de Resonancias ...............................................................................................................- 21 2.1.1.1. El Modelo de Una Capa .........................................................................- 21 2.1.1.2. El Modelo Multicapa ..............................................................................- 22 Incidencia Oblicua ..............................................................................................- 23 2.1.2. 2.2.. El Problema Inverso: Optimización............................................................- 24 -. Técnicas Experimentales ...................................................................................- 27 -. 2.2.1.. Técnicas de Ultrasonidos ...........................................................................- 27 -. 2.2.1.1. Sin Contacto ...........................................................................................- 27 Transmisión Directa ...........................................................................................- 28 vii.

(16) Incidencia Normal (Ondas Longitudinales)...................................................- 28 Incidencia Oblicua (Ondas de Cizalla) ...........................................................- 29 Pitch & Catch ......................................................................................................- 29 Incidencia Oblicua (Ondas Guiadas) .............................................................- 29 2.2.1.2. Con Contacto ..........................................................................................- 29 Transmisión Directa ...........................................................................................- 30 Incidencia Normal: Ondas Longitudinales ....................................................- 30 Incidencia Normal: Ondas de Cizalla ............................................................- 30 Pitch & Catch ......................................................................................................- 30 2.2.2.. Otras Técnicas ............................................................................................- 30 -. 2.2.2.1. Medidas de Espesor y Densidad ...........................................................- 30 2.2.2.2. Curvas de Presión – Volumen ...............................................................- 31 2.2.2.3. Contenido Relativo de Agua en la Hoja ................................................- 31 2.2.2.4. Conductividad Estomática .....................................................................- 31 2.2.2.5. Sensores Comerciales ...........................................................................- 31 2.2.2.6. Imagen ....................................................................................................- 31 Microscopía Óptica .............................................................................................- 31 Microscopía Electrónica de Barrido por Congelación ......................................- 31 CAPÍTULO 3. Propagación de Ondas de Cizalla en Tejidos Vegetales mediante la técnica NC-RUS ............................................................................................................. - 33 CAPÍTULO 4.. Aplicación de la técnica NC-RUS a Hojas de Plantas in vivo ............. - 47 -. CAPÍTULO 5. Caracterización de los Diferentes Tejidos que Constituyen las Hojas de. Phormium tenax ............................................................................................................ - 69 CAPÍTULO 6. Extracción de Parámetros Acústicos de Materiales Multicapa Empleando NC-RUS ...................................................................................................... - 85 CAPÍTULO 7. Conclusiones ................................................................................... - 129 Conclusiones Generales............................................................................................... - 131 General Conclusions..................................................................................................... - 133 CAPÍTULO 8. Prospectiva ...................................................................................... - 135 CAPÍTULO 9. Referencias ..................................................................................... - 139 ANEXO I: Otras Publicaciones, Relacionadas con la Tesis, en Revistas Científicas Indexadas..............................................................................................................................I Ultrasonidos en Tejidos Biológicos ...................................................................................... III NC-RUS Aplicado a Materiales No Biológicos ................................................................... XXI ANEXO II: Otras Comunicaciones a Congresos Internacionales Relacionadas con la Tesis ......................................................................................................................................I Ultrasonidos en Tejidos Biológicos ...................................................................................... III vi.

(17) Ultrasonidos en Materiales No Biológicos ........................................................................... V. vii.

(18) viii.

(19) Índice de Figuras Figura 1. Magnitud y fase del coeficiente de transmisión simulados (de arriba abajo): Lámina A, 2 mm de espesor y 2.55 MRayl de impedancia acústica; Lámina B, 1 mm de espesor y 1.26 MRayl de impedancia acústica; la combinación de ambos materiales con acoplamiento perfecto. ............................................................................................................ - 7 Figura 2. Fotografía a microscopio óptico de Phormium tenax que ilustra la gran variedad de células vegetales: a, Colénquima; b, Esclerénquima; c, Mesófilo Esponjoso; d, Haces Vasculares y Vaina Fascicular. ..............................................................................................- 11 Figura 3. Diagrama de Ashby en el que se representa densidad frente a velocidad longitudinal de propagación de ondas ultrasónicas en diversos tipos de materiales medidos durante la realización de esta tesis doctoral: 1, Ferraro et al. 2016; 2, Sekisui Alveo. Alveolit®; 3, Álvarez-Arenas 2003; 4, Álvarez-Arenas et al. 2002; 5, Sancho-Knapik, Peguero-Pina, Medrano, et al. 2013; Fariñas et al. 2013; 6, Necumer, Necuron®; 7, IEEE International Ultrasonic Symposium 2016. .........................................................................- 14 Figura 4. Representación esquemática del corte transversal de una hoja con mesófilo en disposición bifacial. Fuente: elaboración propia. ................................................................- 15 Figura 5. Valores típicos de potencial hídrico a lo largo de la vía de movimiento de agua (Hillel 1980) ............................................................................................................................- 17 Figura 6 A la izquierda, el modelo de una capa ajustado en la banda de frecuencia entorno a la resonancia fundamental. A la derecha, se muestra la señal medida en banda ancha junto con los ajustes del modelo de una y dos capas (círculos: datos experimentales; línea azul: ajuste del modelo de una capa; línea verde: ajuste del modelo de dos capas). ......- 22 Figura 7. Amplitud y fase del coeficiente de transmisión de hojas de Epipremnum aureum en frecuencia a, de arriba abajo, incidencia normal y oblicua en ángulos de: 10º, 20º y 35º. Puntos: datos experimentales; Líneas: valores obtenidos mediante el ajuste al modelo acústico de dos capas. ..........................................................................................................- 24 Figura 8. Diagrama de flujo que indica el proceso que sigue el algoritmo de Descenso de Gradiente Estocástico (SGD) para el ajuste de un coeficiente de transmisión (cT) dado al modelo cuyos parámetros son li, vi, pi, αi, ni. ........................................................................- 26 Figura 9. Configuraciones experimentales principales: a, sin contacto y transmisión directa; b, en contacto y transmisión directa; c, sin contacto y pitch & catch; d, en contacto y pitch & catch. ...................................................................................................................................- 27 Figura 10. Respuesta al impulso y curva de sensibilidad en frecuencia de los pares de transductores en aire utilizados contacto con excitación del Pulser/Reciever Panametrics 5088P con medio ciclo negativo de onda cuadrada, frecuencia de repetición de 200 Hz y amplitud de 100 V. ................................................................................................................- 28 Figura 11 Fotografía de las pinzas de transductores ultrasónicos empleadas para medir en transmisión directa e incidencia norma y cuyas características aparecen en la Figura 10. .. 29 Figura 12 Respuesta al impulso y curva de sensibilidad en frecuencia del par de transductores de 0.25 MHz en contacto con excitación del Pulser/Reciever Panametrics. ix.

(20) 5077 con medio ciclo negativo de onda cuadrada centrada en 250 kHz; amplitud 100 V y recepción -19 dB. ...................................................................................................................- 30 -. x.

(21) CAPÍTULO 1. CAPÍTULO 1. Introducción: Motivación y Objetivos. -1-.

(22) M.D. FARIÑAS, 2016. “You can't build a reputation on what you are going to do." Henry Ford. -2-.

(23) CAPÍTULO 1. 1.1. Motivación La Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto (NC-RUS, por sus siglas en inglés) ha demostrado ser una técnica muy efectiva para la caracterización de materiales que, en el caso particular del estudio de hojas de plantas, nos da información relevante acerca de los tejidos que las constituyen y que, en algunos casos, puede relacionarse con medidas obtenidas mediante métodos alternativos. Estas medidas además, aportan información sobre parámetros ecofisiológicos de gran importancia, que atañen generalmente a asuntos hídricos de la planta. La técnica que aquí se describe, presenta una serie de ventajas respecto al resto conocidas, y que se comentarán más en detalle a continuación (ver La Presión de Turgencia): como la cámara de presión, los test mecánicos clásicos, la indentación o la microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés). En primer lugar, el estudio se realiza a altas frecuencias (0.1 – 1.6 MHz) y longitud de onda considerablemente mayor que el tamaño de las células. Por ende, el campo de deformaciones producido por la onda puede considerarse homogéneo a estas escalas. Los desplazamientos causados, son de escala menor que el tamaño de las células, así que pueden entenderse en el rango lineal. Finalmente, cabe asumir que no hay cambios en el contenido de fluido de la célula pues el tiempo de relajación poroelástico es mayor que el período de la onda mecánica. Destaca, en consecuencia, el uso de esta herramienta para obtener entre otras, la contribución mecánica del agua en el tejido medido. En definitiva, la técnica de NC-RUS permite realizar medidas sobre hojas de plantas sin contacto, de forma no invasiva y no destructiva, siendo estas características que reunidas, no presenta ninguna de las técnicas estudiadas en la bibliografía. Por tanto, esta tesis doctoral afrontará las limitaciones observadas en la NC-RUS, con el fin de desarrollar la técnica de manera que permita la monitorización sobre hojas de plantas in vivo, la obtención de parámetros acústicos diferenciados para las distintas capas de tejido y la propagación y detección de ondas en direcciones diferentes a la normal y modos no longitudinales.. -3-.

(24) M.D. FARIÑAS, 2016. 1.2. Ultrasonidos y Tejido Vegetal La cuantificación de propiedades mecánicas de forma no destructiva en sólidos (Agrawal et al. 2016) es fundamental para establecer valores constantes del material. En varias aplicaciones puede incluir además, la identificación de muestras y la cuantificación de la calidad de las mismas. Las acústicas han demostrado ser, dentro de estas técnicas de caracterización, una de las más fiables para extraer las propiedades fundamentales de un modo no destructivo. Los métodos de pulso-eco ultrasónicos, se han venido utilizando para determinar la velocidad del sonido en sólidos, donde un único pulso corto de alta frecuencia incide normalmente a la superficie y la onda reflejada por el sólido se analiza para estimar una velocidad de sonido, que viene dada por una distancia recorrida en un trayecto de ida y vuelta. Los métodos para estimación de la velocidad del sonido se encuentran descritos en varias revisiones en la bibliografía (Truell, Elbaum y Chick 1969). Como aspectos negativos, aunque las técnicas de pulso-eco pueden ayudar en casos en los que la muestra a inspeccionar tenga un acceso limitado, se precisa de un buen acoplamiento entre el transductor y la muestra. También pueden encontrarse limitaciones con respecto a la relación señal a ruido (SNR) debido a imprecisiones en la medida de fase, especialmente en medios dispersivos y con alta atenuación -como en el caso que tratamos: el tejido vegetal- (Levy, Agnon y Azhari 2006). En casos donde estas restricciones puedan ser limitantes, cobra sentido el uso de técnicas que comprenden excitación de modos resonantes en la muestra bajo estudio. Estos métodos que se basan en la excitación y análisis a varias frecuencias (en lugar de en una única medida de amplitud o fase) no están limitados por los mismos problemas prácticos que las medidas en pulso-eco de las que hablábamos anteriormente. La Espectroscopía Ultrasónica de Banda Ancha (Gericke 1979) se comenzó a usar como método para obtener información del tamaño y orientación de defectos en componentes metálicos a principios de los 60, cuando se desarrolló el análisis de onda reflejada sobre láminas delgadas. Posteriormente, Brekhovskikh estudió métodos teóricos para el análisis de ondas acústicas transmitidas y reflejadas en medios estratificados (Brekhovskikh 1980). Durante los 70 y 80 (Kline 1984), hubo un intenso desarrollo en los métodos digitales de procesamiento de las señales, lo cual aumentó la capacidad para medir fase y amplitud en láminas delgadas de diferentes materiales industriales. Este análisis de la señal digitalizada sería más efectivo de cara a pequeñas variaciones que el tradicional método discreto usado. En concreto, se podían medir espesores de las láminas que forman un material estratificado, incluso de aquellas a las que no se tenía acceso directo (Haines, Bell y MCIntyre 1978). Dichas medidas permitían detectar casos de daño producido por fatiga, determinar parámetros de estrés o relajación en polímeros, cambios en el curado de resinas epoxy, evaluación de adhesión de interfaces, control de degradación de materiales, monitorización de respuesta a variaciones de temperatura de materiales y determinación de tamaños y distribución de granos en materiales metálicos. Posteriormente, se introdujo el análisis en amplitud del espectro (Pialucha 1989), el cual permite obtener la velocidad de fase en el material incluso cuando las reflexiones de la onda llegan juntas en el dominio del tiempo, lo cual es muy útil en el caso de láminas delgadas. Asimismo, concluyen que la combinación de ambos métodos, fase y amplitud, dará mejores resultados. Finalmente, se aplica esta. -4-.

(25) CAPÍTULO 1 misma técnica utilizada en la dispersión de ondas longitudinales para el caso del análisis de ondas de cizalla (Wu 1996). La aplicación de ultrasonidos a tejidos vegetales aparece en la bibliografía en el último medio siglo, cuando se utilizó este tejido para realizar estudios sobre los efectos biológicos de los ultrasonidos a frecuencias relevantes para uso médico (Miller 1979). Posteriormente, se trató ya de relacionar de un modo no destructivo el contenido de agua del tejido con sus propiedades acústicas (Torii, Okamoto y Kitani 1988). Para ello, se midieron velocidades ultrasónicas, diámetro y transpiración en diferentes tipos de tallos. Se concluyó que el estado hídrico de la planta puede positivamente ser estimado de un modo cuantitativo usando una velocidad normalizada. Tras esto, Zebrowski mediría también la velocidad ultrasónica en tallo y vaina de cereales a diferentes estados de desarrollo, relacionando las adaptaciones de los cereales ante las diferentes cargas medioambientales no sólo en su morfología anatómica sino también en la heterogeneidad en los componentes de la pared celular (Żebrowski 1992). A continuación, King y Vincent se interesaron por las propiedades mecánicas de fibras vegetales como las encontradas en hojas monocotiledóneas de Phormium tenax (King y Vincent 1996). Este interesante estudio y la sugerencia del propio J.L.F. Vincent inspirarían el trabajo incluido en el capítulo 5. Siguiendo con la aplicación de los ultrasonidos en hojas, Fukuhura determina propiedades acústicas de estas sumergidas en agua (Fukuhara 2002; Fukuhara, Okushima y Matsuo 2005). La principal limitación de este método reside en que las características determinadas sólo pueden establecerse en un estado alterado de la hoja. Es en este contexto, en el que tiene sentido la aparición de una técnica que permitiera caracterizar tejidos vegetales de un modo no invasivo y no destructivo. Es en 2009, cuando Álvarez-Arenas publica el primer trabajo en el que se analizan medidas de espectro de magnitud y fase del coeficiente de transmisión en incidencia normal de hojas de plantas. Para ello, se excitan mediante ultrasonidos las resonancias espesor de las muestras usando transductores acoplados por aire. La resolución del problema inverso considerando la hoja como un material homogéneo permite obtener parámetros ultrasónicos de muestras de Ligustrum lucidum, Prunus laurocerasus, Populus x euroamericana y Platanus x hispánica (Álvarez-Arenas et al. 2009). En 2010, se realizaron medidas utilizando la misma técnica descrita para diferentes niveles de contenido relativo de agua en las hojas. Al mismo tiempo, se tomaron medidas de potencial hídrico empleando la cámara de presión tipo Scholander mientras que se monitorizaba el primer máximo del coeficiente de transmisión a incidencia normal en frecuencia. Se concluyó, que el punto de pérdida de turgencia de la hoja puede ser obtenido de una manera precisa empleando esta técnica ultrasónica (Sancho-Knapik et al. 2010). También, se relacionaron las variaciones en los parámetros ultrasónicos observados con los cambios estructurales que experimentaban las hojas en el proceso de deshidratación. Para ello, se tomaron imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido por Congelación de cortes transversales de hojas de Quercus muehlenbergii. Se concluye que el parámetro c33 (módulo de elasticidad en la dirección espesor de la hoja) explica la caída en la frecuencia normalizada antes del punto de pérdida de turgencia, así como los cambios físicos en el mesófilo observados en las micrografías explican el comportamiento tras el punto de pérdida de turgencia (SanchoKnapik et al. 2011). La técnica empleada en estos trabajos es la llamada Espectroscopía -5-.

(26) M.D. FARIÑAS, 2016 Ultrasónica Resonante Sin Contacto, que se explicará con más profundidad a continuación (ver Espectroscopía Resonante Sin Contacto). Por otro lado, también se han aplicado los ultrasonidos al estudio de tejidos vegetales en pastos. Las propiedades mecánicas de éstos son fundamentales en diversos ecosistemas. Wilson se centró en el estudio de hierbas marinas a baja frecuencia usando resonadores acústicos (Wilson y Dunton 2009). Posteriormente, también se ha estudiado la capacidad de absorción acústica de las plantas, la cual depende predominantemente de la densidad superficial de la hoja y su orientación (Horoshenkov, Khan y Benkreira 2013; Nilsson, Bengtsson y Klaeboe 2014).. Espectroscopía Ultrasónica Resonante Sin Contacto La Espectroscopía Ultrasónica Resonante (RUS) (Migliori y Darling 1996) es una técnica que permite obtener constantes elásticas de materiales sólidos con una geometría muy definida que posibilite un análisis de las frecuencias de resonancia en sus diferentes modos de vibración (Migliori et al. 1993). Mientras que la RUS tradicional supone condiciones de contorno libres en la muestra, en el caso concreto que tratamos en este trabajo la aproximación es a través de la consideración de láminas delgadas inmersas en un medio acoplante. De esta forma aunque incrementa la complejidad en la resolución el hecho de no considerar vacío, el contrapunto lo marca la geometría de la lámina. Esta técnica acoplada por aire, es la central de esta tesis doctoral y podríamos denominarla Espectroscopía Ultrasónica Resonante Acoplada por Aire, o simplemente, Sin Contacto (NCRUS). Cabe destacar que en este caso particular, nos enfrentamos a un problema unidimensional (dirección espesor de la lámina) y disponemos del espectro del coeficiente de transmisión del material en el aire. Dada la naturaleza del material analizado (hojas de plantas), no será posible ver más que un número limitado de resonancias excitadas a consecuencia, principalmente, de la atenuación en el tejido. Aunque en la Espectroscopía Ultrasónica como método de ensayo no destructivo se ha venido utilizando como acoplante agua o gel acústico, paralelamente se fue sucediendo el desarrollo de transductores ultrasónicos acoplados por gas. Ciertamente, la diferencia de impedancia acústica entre cualquier medio sólido y gas es generalmente muy alta pero aun así, el uso de estos transductores se fue incorporado en el entorno industrial para aplicaciones muy concretas con altas limitaciones en la manipulación. Principalmente, se han empleado dos tipos de transductores: electrostáticos y piezoeléctricos. En el caso de estos últimos, de cara a minimizar las pérdidas por desacoplo de impedancias entre el piezoeléctrico (composite cerámico) y el aire, se emplea una conectividad 1-3 con diferentes capas de adaptación (Álvarez-Arenas et al. 2012). Con el fin de usar este tipo de transductores acoplados por aire en técnicas de espectroscopía, se precisa de un diseño que garantice un compromiso entre sensibilidad y ancho de banda de trabajo. Sin duda, el desarrollo de este tipo de transductores dentro del grupo donde se ha llevado a cabo el trabajo del doctorando, ha sido pieza clave para la implementación de la técnica que tratamos y que se ha venido usando para estudiar diversos materiales (Álvarez-Arenas 2010; Álvarez-Arenas et al. 2002; Álvarez-Arenas 2003). La NC-RUS comprende fundamentalmente dos etapas: por un lado, la toma o simulación de medidas de coeficiente de transmisión en magnitud y fase de la muestra a caracterizar excitando resonancias espesor a frecuencias de ultrasonidos y por otro, el. -6-.

(27) CAPÍTULO 1 modelado de dicha muestra y la resolución del problema inverso para el ajuste del modelo a la curva de datos considerados de coeficiente de transmisión.. Excitación y Detección de Resonancias Espesor De cara a la toma de medidas, se busca excitar resonancias espesor de la muestra. El recurso de la excitación de resonancias en materiales laminados está bien representado en la bibliografía (Veksler 1993). El fenómeno de resonancia aparece cuando se cumple una condición de naturaleza fundamentalmente geométrica. Suponiendo una lámina de material con una impedancia acústica Zl, una velocidad de propagación del sonido v y un espesor l; situada entre dos medios con impedancias Z1 y Z2, las resonancias de espesor aparecerán en el espectro del coeficiente de transmisión obtenido a incidencia normal a las frecuencias fn; siendo n el orden de resonancia a una de estas dos condiciones (sin considerar posible dispersión o muy alta atenuación): 𝑓𝑓𝑛𝑛 =. 𝑓𝑓 𝑛𝑛 =. 𝑣𝑣 (2𝑛𝑛 2𝑙𝑙 𝑣𝑣 𝑛𝑛, 2𝑙𝑙. [1]. − 1), 𝑛𝑛 = 1,2,3 …. [2]. 𝑛𝑛 = 1,2,3 …. La ecuación [1] representa las series de resonancias asociadas a λ/4, las cuales corresponden a la condición de resonancia asimétrica: 𝑍𝑍1 < 𝑍𝑍𝑙𝑙 < 𝑍𝑍2 ó 𝑍𝑍1 > 𝑍𝑍𝑙𝑙 > 𝑍𝑍2. [3]. 𝑍𝑍1 < 𝑍𝑍𝑙𝑙 > 𝑍𝑍2 ó 𝑍𝑍1 > 𝑍𝑍𝑙𝑙 < 𝑍𝑍2. [4]. La ecuación [2] por su parte, representa las series de resonancias asociadas a λ/2, las cuales corresponden a la condición de resonancia simétrica:. Figura 1. Magnitud y fase del coeficiente de transmisión simulados (de arriba abajo): Lámina A, 2 mm de espesor y 2.55 MRayl de impedancia acústica; Lámina B, 1 mm de espesor y 1.26 MRayl de impedancia acústica; la combinación de ambos materiales con acoplamiento perfecto.. En la Figura 1, se muestra el caso concreto de dos láminas rodeadas de aire a ambos lados. La lámina A posee una impedancia acústica mayor (2.55 MRayl) que la lámina B -7-.

(28) M.D. FARIÑAS, 2016 (1.26 MRayl). En esta situación, el coeficiente de transmisión muestra la serie de resonancias λ/2 por encontrarse en condición de resonancia simétrica. Sin embargo, cuando ambas láminas se encuentran unidas, aparecen las series de resonancias combinadas: la serie λ/2, generada por la lámina de alta impedancia; y la serie λ/4, proveniente de la lámina de baja impedancia que ahora se encuentra ante una situación de resonancia asimétrica (impedancia menor que la de la otra lámina y mayor que la del aire). Prever la situación del patrón de resonancias de un multicapa a priori, entraña gran dificultad y requiere de cierto conocimiento de los materiales implicados. En el caso concreto tratado en esta tesis, el de las hojas de plantas, debido a unas características generales que cumplen los tipos de tejidos vegetales implicados, pueden acotarse las diferentes soluciones posibles a este problema (ver El Problema Inverso: Optimización). El orden en que los diferentes armónicos aparecen a lo largo de la frecuencia está influido por diversos factores, así como su distorsión puede incluso aparecer enmascarada por otros efectos superpuestos, generalmente relativos a la atenuación. También podría suceder que si la incidencia de la onda acústica se produce de forma oblicua a la superficie, otros modos resonantes aparezcan acoplados (ver Incidencia Oblicua). Este es el caso de las ondas de cizalla mientras que el ángulo de incidencia de la onda ultrasónica permanece por debajo del ángulo límite. Cuanto mayor es este ángulo, más energía se acopla en estas ondas de corte que, de provocar reverberación en el material, generaría un patrón de resonancias que se superpondría al patrón de resonancias espesor a consecuencia de la propagación de ondas longitudinales (ver Figura 7).. Modelado y Resolución del Problema Inverso para el Ajuste de Datos La segunda etapa que comprende la NC-RUS, está asentada en el modelado del material a caracterizar y la posterior resolución del problema inverso. Siendo las hojas el material principal bajo estudio, era necesario un conocimiento a priori del tejido en cuestión y los conflictos a tener en cuenta a la hora de caracterizar un material biológico en contraposición a los industriales con los que se venía trabajando. El limitado a la banda de frecuencia entorno a la primera resonancia, empleado en los trabajos anteriores a esta tesis doctoral, supone la estructura de la hoja como una lámina homogénea. Este modelo reproduce fielmente el comportamiento del material medido (ver El Modelo de Una Capa). En el punto de inicio de este trabajo, se planteó como limitación a abordar el hecho de ampliar el rango de frecuencias. En consecuencia, el estudio en banda ancha de estos materiales nos permite ver varios órdenes de resonancia en algunas especies y sujetos. Este espectro presenta comúnmente, una dispersión con respecto al patrón de resonancias esperado para una lámina homogénea. Esto es, la dispersión presente (Szabo 1995), se caracteriza por la aparición de los armónicos siguientes al de orden fundamental a frecuencias superiores a las esperadas (dispersión mayor que uno). Este efecto podría deberse a: dispersión anómala de baja frecuencia (cuando tanto velocidad como atenuación aumentan con la frecuencia, similar a la observada habitualmente en espumas blandas) o bien, a la presencia de capas acústicamente diferentes. Con este interrogante, se ahondó en el estudio de la estructura interna de la hoja con el fin de buscar la causa física que subyace a la dispersión observada (ver El Tejido Vegetal), concluyendo en la necesidad de considerar al menos dos capas de tejido acústicamente diferentes para explicar su comportamiento.. -8-.

(29) CAPÍTULO 1 Una vez alcanzado el modelo adecuado a seguir para el estudio del material a caracterizar con la técnica de NC-RUS, se procede a la resolución del problema inverso esto es: determinar un número finito de parámetros que definen el modelo. Estos parámetros pueden delimitar un parámetro físico directamente (densidad, velocidad de propagación, etc.) o bien, pueden especificar coeficientes u otras constantes que mantienen una relación funcional que describe un proceso físico (exponente de variación de la atenuación con la frecuencia). La resolución del problema inverso ha sido ampliamente utilizada hasta nuestros días en multitud de campos como son, entre otros, las matemáticas (Tarantola 2005), la mecánica (Deraemaeker et al. 2008), la geofísica (Dubovikl y King 2000) o la física médica (Hämäläinen et al. 1993). El proceso de resolución del problema inverso finaliza con al ajuste del modelo a la colección de datos mediante la asignación de valores a los parámetros de este. Aunque sería posible determinar simultáneamente espesor y velocidad de una lámina medida mediante la NC-RUS (Álvarez-Arenas 2010), es preciso realizar este reajuste en los valores de los parámetros que definen nuestro modelo de cara a obtener mejores resultados. Especialmente en el caso del modelo multicapa este paso no es trivial, puesto que de su optimización depende en gran parte el éxito en la consecución de resultados satisfactorios. El algoritmo utilizado en la actualidad es el denominado Descenso de Gradiente Estocástico (SGD, por sus siglas en inglés), cuya rutina se comentará más en profundidad (ver El Problema Inverso: Optimización).. -9-.

(30) M.D. FARIÑAS, 2016. 1.3. Materiales Biológicos La principal particularidad que destaca en los materiales biológicos (Meyers et al. 2008), y de la cual derivan todas las demás, es que “crecen”, en contraposición a la mayoría de sintéticos, que son fabricados generalmente por un objetivo global previamente definido. Este constante crecimiento (auto-ensamblaje) en los materiales biológicos tiene un acusado efecto en su estructura altamente jerarquizada, que se mantiene en constante cambio a consecuencia de posibles alteraciones a su alrededor (diseño mecánico adaptativo y auto-reparación) lo cual, por supuesto, presenta una alta variabilidad entre sujetos a priori similares que puede dificultar el proceso de caracterización. La naturaleza a su vez, es capaz de completar satisfactoriamente multitud de funciones que requieren un amplio rango de propiedades mecánicas usando un número muy reducido de componentes diferentes (combinando 20 aminoácidos). Además, los procesos implicados en conseguir estos requerimientos mecánicos se realizan bajo una serie de limitaciones estrictas como son, una temperatura ambiente y un entorno acuoso. Por lo tanto, esta diversidad en los materiales biológicos radica fundamentalmente en el ingenio de su diseño. En consecuencia, el diseño y composición en los materiales biológicos, van íntimamente ligados en una conexión difícilmente separable. Todas estas premisas no han de perderse de vista a la hora de realizar el ejercicio de caracterizar materiales provenientes de la naturaleza. Conectar nano-, micro- y mesoestructura corresponde a una aproximación que requiere de un esfuerzo multidisciplinar. Sin embargo y a pesar de dicho esfuerzo, se ha demostrado que los resultados obtenidos siguiendo este camino son fructíferos en el desarrollo de nuevos materiales (Kim, Randow y Sano 2015) y arquitecturas (Mazzoleni 2013).. 1.3.1. La Célula Vegetal Existen alrededor de 35 tipos de células vegetales diferentes (ver Figura 2), todas ellas difieren en dimensiones, forma, posición y en las características de su pared. La mayoría de células miden entre 1-100 µm, su interior está en fase líquida (citoplasma) y en él se encuentra un núcleo, una red de microtúbulos, actina y filamentos intermedios (citoesqueleto), también orgánulos de diferentes tamaños y formas, así como otras proteínas. Por su parte, la membrana plasmática que recubre la célula está formada por una bicapa semipermeable de fosfolípidos reforzada por proteínas. Sin embargo, los elementos estructurales que otorgan la forma, el tamaño y la estabilidad a la planta en su conjunto (Geitmann 2006) son: el citoesqueleto, la pared celular y la presión de turgencia (hidroesqueleto).. El Citoesqueleto Mientras que en las células animales el citoesqueleto tiene una función estructural clave puesto que determina la forma celular, en las vegetales no es determinante debido a la existencia de la pared. No obstante, participa de los procesos asociados con la percepción de gravedad así como en la formación del huso mitótico que interviene en la división celular y en su estructura interna. - 10 -.

(31) CAPÍTULO 1 La Pared Celular La existencia de una pared celular es la característica distintiva principal cuando se habla de tejido vegetal en contraposición al animal. La pared, se comporta como un exoesqueleto que determina la forma celular y actúa como barrera protectora frente a agentes patógenos (Vogler et al. 2015). Se distinguen dos estrategias mecánicas principales que sigue la pared: por un lado, la habilidad para resistir tensiones permitiendo que se establezca un hidroesqueleto basado en la presión de turgencia que posibilita, además, transmitir las fuerzas recibidas. Esta capacidad reside fundamentalmente en las paredes primarias. Por otro lado, las paredes secundarias – abundantes en la esclerénquima – son también resistentes a tensión además de a compresión. Las propiedades mecánicas de las paredes celulares están definidas por su composición bioquímica (Gibson 2012) y por las interacciones entre los polímeros que la forman. La pared celular principal es un compuesto complejo, formado por microfibrillas de celulosa embebidas en una matriz de hemicelulosa y pectina. La pared secundaria, cuando existe, es la capa adyacente a la membrana plasmática. Contiene una alta proporción de celulosa y lignina o suberina.. Figura 2. Fotografía a microscopio óptico de Phormium tenax que ilustra la gran variedad de células vegetales: a, Colénquima; b, Esclerénquima; c, Mesófilo Esponjoso; d, Haces Vasculares y Vaina Fascicular.. Aunque obedeciendo a lo comentado sobre los materiales biológicos, las propiedades mecánicas de la célula vegetal no se limitan a su individualidad, sino que también residen en la interacción con el resto que componen el tejido, modificando las propiedades de la pared celular en función de las fuerzas que interaccionan con ella. Por esta razón, aunque se requiere el conocimiento de las propiedades mecánicas de los elementos estructurales que componen la pared, el comportamiento del conjunto del tejido es esencial. Un ejemplo que ilustra esto, es el crecimiento de una típica célula vegetal: tiene una pared flexible y delgada (alrededor de 0.1-1 µm) formada por polisacáridos complejos y proteínas estructurales. Esta fina capa puede verse a microscopio electrónico. A pesar de su delgadez, ya actúa comprimiendo y dando forma al protoplasto. El crecimiento, se producirá a base de muy lentas deformaciones en las paredes (creep): las células se disponen con sus paredes firmemente pegadas unas con otras (lámina media) imposibilitando una migración celular, por lo que la morfogénesis de la planta es más bien una división celular selectiva y una dilatación localizada. Los resultados de este crecimiento pueden ser verdaderamente impresionantes: las células que recubren la superficie de las semillas de algodón pueden multiplicar por 1000 su tamaño antes de alcanzar la madurez (Cosgrove 2005). Esta expansión es en gran parte posible gracias al - 11 -.

(32) M.D. FARIÑAS, 2016 aumento del volumen celular producido principalmente a base de almacenar agua en la vacuola. Este hecho, genera una extensión en la pared celular que estimula que nuevos polímeros se integren en ella para evitar que se vuelva más delgada y más débil. Mucho se conoce de la composición de las paredes celulares. Asimismo, componentes como la celulosa y la pectina con interés comercial, han sido caracterizados ampliamente en la bibliografía (Edge et al. 2000; Jarvis 1984). Con todo, la caracterización mecánica de las paredes celulares en su estado natural supone aún hoy en día un reto, aunque se han venido aplicando grandes tensiones de deformación sobre células aisladas para su estudio (Cosgrove 1989) o en bloques de tejido, utilizando para ello extensómetros o máquinas tradicionales de ensayos mecánicos -. Los resultados obtenidos son de ayuda para entender mejor las propiedades mecánicas de la pared, pero al no haberse realizado en condiciones del todo similares a las reales (por ejemplo, los estreses sólo se aplican en una dimensión, cuando en la situación real son multidireccionales), resulta complicado relacionarlas de un modo directo con procesos como el crecimiento celular que tan influenciados están por estas cargas ausentes en los experimentos. Llegados a este punto, y aunque sin duda los datos obtenidos a este respecto son de gran ayuda, hay varios motivos por los cuales no existe una multitud de trabajos en la obtención de manera cuantitativa de datos mecánicos de paredes vegetales: en primer lugar, las células vegetales en el tejido están fuertemente unidas, haciendo de su separación una tarea que difícilmente puede no dañar su estructura para el posterior análisis. Por otro lado, la manipulación a esas escalas no es algo trivial. Sin embargo, el desarrollo de la micro- y nanomanipulación ha permitido que puedan realizarse ensayos sobre células aisladas (Wang, Wang y Thomas 2004) y analizar su comportamiento haciendo uso de un sencillo modelo. Otro método que se ha usado para determinar el módulo elástico de la pared celular en células vivas es la sonda de presión de turgencia (Tomos y Leigh 1999). Se basa en la cuantificación de la pérdida de volumen celular relativa (vista a microscopio) a medida que una presión de turgencia es aplicada mediante esta sonda. Por otro lado, las técnicas de nanoindentación (Forouzesh et al. 2013) y microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés) (Radotić et al. 2012) buscan obtener información cuantitativa de las paredes celulares. Para ello, se aplica un ciclo de cargadescarga con una duración y fuerza determinadas y se monitoriza la elasticidad y plasticidad de la respuesta en la deformación del material. Son varios los obstáculos que se presentan al llevar a cabo estas técnicas, si bien es cierto que han arrojado luz al hecho de que las paredes celulares no presentan una estructura uniforme. El trabajo de Vanstreels sobre monitorización de cambios en tejido epidérmico vegetal vivo sometido a estreses mecánicos, supone una aproximación a la problemática de relacionar parámetros estructurales celulares y propiedades micromecánicas (Vanstreels et al. 2005).. La Presión de Turgencia El tejido vegetal se encuentra de manera natural, en un entorno acuoso. Al estado energético en el que se halla este agua en las plantas se le denomina potencial hídrico y su definición llevada a nivel celular se puede expresar como el resultado de tres componentes principales: un potencial osmótico consecuencia de la concentración de solutos, un potencial matricial fruto de la posible interacción entre las moléculas de agua y otras - 12 -.

(33) CAPÍTULO 1 partículas (provenientes del suelo, en su mayoría) que, en casos particulares, pueden generar gran tensión superficial, y por último, una presión hidrostática o de turgencia (Lange et al. 1982). En el tejido vegetal vivo, manteniendo las paredes celulares en tensión, la turgencia funcionaría como un hidroesqueleto. Las variaciones en la turgencia celular generan estabilidad, movimiento y crecimiento en el tejido. Según Schopfer, el principio básico tras la mayoría de procesos de crecimiento en las células vegetales es el aumento de volumen celular a causa de la absorción de agua (Schopfer 2006). Asimismo como ya se ha comentado, gran parte de los movimientos en las plantas se basan en la habilidad de ciertas células estratégicamente colocadas en aumentar su volumen rápidamente. Por tanto, la turgencia y el movimiento de agua juegan un papel determinante en varias funciones fisiológicas y presentan un gran reto en su método de cuantificación particularmente estudiado en el campo de la ecofisiología. La turgencia se ha venido midiendo con varias técnicas indirectas que se basan en la cuantificación de la diferencia entre la presión osmótica del protoplasto y la presión del medio circundante, ya que a plena turgencia presión osmótica e hidrostática son aproximadamente la misma (Nonami, Boyer y Steudle 1987). Por otro lado, se usaron métodos consistentes en variar las concentraciones del medio circundante para medir la presión osmótica (Kaminskyj, Garrill y Heath 1992). Por último, la bomba de presión (o bomba de Scholander) (Scholander et al. 1965) es un método destructivo con el que medir esta presión de turgencia en tejidos vegetales por la aplicación de una presión externa prolongada hasta que el agua sale del órgano (Turner 1981). Este último método es el más utilizado aún hoy en día por los ecofisiólogos, hecho que puede darnos idea de que, aun con ciertos avances técnicos sobre el planteamiento inicial (portabilidad, seguridad, etc.), no se han producido mejoras tecnológicas sustanciales en el último medio siglo. De cara a hacer una medición de manera más local, se desarrolló un sensor de presión electrónico (Geitmann 2006) que incorporaba un pistón que permitía la variación artificial de la turgencia. Esta técnica junto con un modelo de burbuja de aire (Ley de Boyle) ha permitido obtener parámetros como la conductividad hidráulica, módulo elástico de la pared y tiempo de intercambio de agua, conocer más sobre las células de guarda de los estomas, etc. Aun así, este método precisa de la inserción de una micropipeta en el interior de la célula, por lo que finalmente es invasivo y está sujeto a la aparición de artefactos. Por otro lado, llegó el método de tonometría (Lintilhac et al. 2000) aplicado a tejidos vegetales. Ya no invasivo, pero sólo aplicable en superficies de tejidos cuyas paredes celulares sean suficientemente delgadas. Está basado en un principio similar al usado para medir la tensión intraocular. Se ha aplicado satisfactoriamente en tejido epidérmico, donde los resultados obtenidos por esta técnica son comparables a los provenientes de la sonda de presión.. 1.3.2.. El Tejido Vegetal. Según Niklas, en el sentido más formal, el tejido vegetal habría que considerarlo como una estructura y no como un material (Niklas 1993). Aduce que mientras que el módulo de Young y la tensión de rotura son propiedades mecánicas independientes del tamaño en un material no biológico; en los tejidos vegetales estas propiedades sí son fuertemente dependientes del tamaño. Varían en función de la forma celular, de su dimensión, número de células y estado fisiológico (por ejemplo, La Presión de Turgencia) dentro de cada tipo - 13 -.

(34) M.D. FARIÑAS, 2016 concreto de tejido. A efectos prácticos, esto quiere decir que aun conociendo la composición del tejido vegetal y, por ende, los parámetros mecánicos de cada uno de estos componentes, no puede inferirse directamente el comportamiento mecánico macroscópico. A este respecto, trabajos como el de Ashby y Gibson (Gibson y Ashby 1997), apuntan a la modelización del tejido vegetal como un sólido celular a diversos niveles (en la microestructura de la pared celular, en la estructura a nivel celular, etc.) dando lugar, en consecuencia, a un amplio rango de propiedades mecánicas como conocemos que en realidad existen en los materiales vegetales (ver Figura 3).. Figura 3. Diagrama de Ashby en el que se representa densidad frente a velocidad longitudinal de propagación de ondas ultrasónicas en diversos tipos de materiales medidos durante la realización de esta tesis doctoral: 1, Ferraro et al. 2016; 2, Sekisui Alveo. Alveolit®; 3, Álvarez-Arenas 2003; 4, Álvarez-Arenas et al. 2002; 5, Sancho-Knapik, Peguero-Pina, Medrano, et al. 2013; Fariñas et al. 2013; 6, Necumer, Necuron®; 7, IEEE International Ultrasonic Symposium 2016.. Existen tres sistemas de tejido mayoritario en los órganos de las plantas (ver Figura 4): el tejido epidérmico (incluye a los estomas y a los tricomas), el vascular (xilema y floema) y el sistema fundamental. En el sistema fundamental se distinguen, con objetivos mecánicos, epidermis (ocupando haz y envés de la hoja) y mesófilo (la zona entre epidermis superior e inferior). Este mesófilo es un tejido parenquimático especializado en realizar la fotosíntesis (clorénquima). En función de la diferenciación que se haya producido en las células de clorénquima para la especie en concreto, puede tratarse de un mesófilo homogéneo (típico de monocotiledóneas, especies herbáceas, cereales, etc.); o heterogéneo, en el que distinguiremos principalmente dos tipos de células: •Parénquima de Empalizada: este tipo de células suelen ser alargadas, se localizan muy pegadas unas a otras y su densidad volumétrica, tenderá a ser muy cercana a la de sus componentes principales (agua – 1000 kg/m3 -, celulosa – 1500 kg/m3 -, lignina – 1300 kg/m3 – y ceras – 950 kg/m3-). •Parénquima Lagunar: las células tienden a ser más redondeadas y, en este caso, existen multitud de espacios intercelulares debido a que en esta zona del mesófilo se lleva a cabo el intercambio gaseoso de la hoja. Consecuentemente, la densidad de esta capa en su conjunto tenderá a ser más baja que en la de empalizada a causa de su porosidad. - 14 -.

(35) CAPÍTULO 1 Estas células aparecerán frecuentemente en tres disposiciones: bifacial (cuando la empalizada se sitúa debajo de la epidermis superior e inmediatamente debajo esponjoso), equifacial (cuando el tejido de empalizada se sitúa adyacente a ambas epidermis y el esponjoso se sitúa en el centro) y unifacial (cuando existe gran venación y heterogeneidad de tejidos). De acuerdo a la estructura tisular de las hojas, el modelo multicapa empleado representa dos láminas acústicamente diferentes: una de ellas corresponderá a la epidermis superior y al mesófilo de empalizada, mientras que la otra lo hará con el mesófilo esponjoso y la epidermis inferior. En el caso de aquellas hojas cuya disposición de mesófilo equivale a la llamada equifacial, el modelo utilizado será el de tres capas considerando dos acústicamente diferentes situadas en ambos extremos, a modo de sándwich (ver capítulo 6).. Figura 4. Representación esquemática del corte transversal de una hoja con mesófilo en disposición bifacial. Fuente: elaboración propia.. 1.3.3. La Hoja, la Planta, y el Agua Cada año, más de 40 billones de toneladas de agua circulan a través de hojas de plantas, lo que constituye el 10% del agua que abandona la superficie terrestre (Holbrook y Zwieniecki 2005). Este recorrido del agua en su ciclo hidrológico - el proceso microhidrológico que se desarrolla en el interior de la hoja -, aún comporta ciertos misterios para la ciencia. Cómo el agua fluye a través de las hojas, tiene importantes implicaciones para entender la hidráulica de la planta y su crecimiento, así como la estructura foliar, su función y la ecología.. - 15 -.