Cycling Dof Factors: Molecular and functional characterization of Arabidopsis thaliana AtCDF3 and tomato (Solanum lycopersicum L.) SlCDF3 in response to abiotic stress

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(1)UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA Y GENÓMICA DE PLANTAS. CYCLING DOF FACTORS: MOLECULAR AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF Arabidopsis thaliana AtCDF3 AND TOMATO (Solanum lycopersicum L.) SlCDF3 IN RESPONSE TO ABIOTIC STRESS.. TESIS DOCTORAL ALBA ROCÍO CORRALES DUCUARA Licenciada en Biología Madrid, 2014.

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(3) UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID (UPM) DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA Y GENÓMICA DE PLANTAS, CBGP (UPM-INIA) ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS. CYCLING DOF FACTORS: MOLECULAR AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF Arabidopsis thaliana AtCDF3 AND TOMATO (Solanum lycopersicum L.) SlCDF3 IN RESPONSE TO ABIOTIC STRESS. Memoria presentada por Alba Rocío Corrales Ducuara para optar al grado de Doctor en el programa de doctorado “Biotecnología y Recursos Genéticos de Plantas y Microorganismos Asociados” Departamento de Biotecnología (UPM). Trabajo realizado en el CBGP (grupo consolidado “Respuestas a condiciones de estrés abiótico y señalización energética en plantas”), bajo la dirección de Dr. Joaquín Medina Alcázar y el Profesor Jesús Vicente-Carbajosa.. Madrid, Noviembre 2014. V°B° LOS DIRECTORES. Dr. Joaquín MedinaAlcázar Profesor Jesús Vicente-Carbajosa. LA DOCTORANDA. Alba Rocío Corrales Ducuara.

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(5) UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID. Tribunal nombrado por el Magfco. y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de Madrid el día de Noviembre de 2014 Presidente: Secretario: Vocal: Vocal: Vocal: Suplente: Suplente:. Realizada la defensa y lectura de Tesis el día Agrónomos.. EL PRESIDENTE LOS VOCALES. EL SECRETARIO. de 2015 en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros.

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(7) RECONOCIMIENTOS. Este trabajo ha sido realizado en el Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Departamento de Biotecnología de la E.T.S.I Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid (UPM), en el marco del proyecto de investigación dirigido por el Doctor Joaquín Medina Alcázar, financiado por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA) proyecto (INIA, RTA 2009-00042-C02-02) de cuya Beca de Formación de Personal Investigador (FPI-INIA) he sido beneficiaria. En primer lugar quiero agradecer a mis directores de tesis, Dr. Joaquín Medina Alcázar y al Profesor Jesús Vicente Carbajosa, por brindarme la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación, así como su orientación científica y enseñanza. A la profesora Rosa Victoria Molina, al Doctor Sergio Gonzalez Nebauer y a todo su grupo de investigación de la Universidad Politecnica de Valencia (UPM), por permitirme realizar una estancia en su laboratorio y aprender a realizar ensayos de tolerancia a estrés abiótico con las líneas transgenicas de tomate, también por su acogida y ayuda durante esta tesis. A la Doctora Laura Carrillo Gil, por su continua supervisión, orientación y apoyo durante el desarrollo de esta tesis. Al Doctor Jan Zouhar, por haber leído y aportado sugerencias a esta tesis. Al profesor Stephan Pollmann y a su grupo de investigación, por haberme permitido aprender a realizar los distintos análisis metabolomicos realizados en este trabajo. Al Doctor Abdelhafid Bendahmane y a todo su equipo de la Unidad de Investigación de Genomica Vegetal (URGV) del Instituto Nacional de Investigación Agronómica de Francia (INRA), por su gran acogida y por haberme permitido tabajar con la población mutagenizada de tomate (M82) de la plataforma de Tilling para la identificación de líneas de tomate mutagenizadas. A Mar González Ceballos, por su colaboración en la obtención de las líneas transgenicas de 35S::AtCDF3 y 35S::AtCDF3-stop de Arabidopsis..

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(11) ÍNDICE RESUMEN............................................................................................................................. .......................iv SUMMARY…………………………………………………………………………………………………...….…..vi ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………………......viii 1.- INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................................................................11 1.1.- EL TOMATE, Solanum lycopersicum L. ........................................................................................1 1.1.1.- Origen, taxonomía y morfología. ............................................................................................1 1.1.2.- El tomate como planta modelo. ..............................................................................................4 1.2.- IMPORTANCIA ECONÓMICA DEL TOMATE. ..............................................................................5 1.2.1.- Importancia económica en el mundo. .....................................................................................5 1.2.2.- Importancia económica del tomate en España. ......................................................................6 1.2.3.- Impacto del estrés abiótico en el cultivo de tomate.................................................................7 1.3.- ESTRÉS ABIÓTICO. ..................................................................................................................11 1.3.1.- Generalidades del estrés abiótico en plantas. ......................................................................11 1.3.2.- Efectos de la salinidad, las bajas temperaturas y la sequía sobre el crecimiento de la planta. ......................................................................................................................................................12 1.3.3.- Respuesta de la planta a la salinidad, las bajas temperaturas y la sequía. ...........................15 1.3.4.- Respuesta metabólica al estrés por salinidad, bajas temperaturas y sequía. ........................18 1.3.5.- Respuesta metabólica al estrés por salinidad, bajas temperaturas y sequía en tomate.....19 1.4.- REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA..................................................................................20 1.4.1.- Regulación de la transcripción. ............................................................................................20 1.5.- FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN PLANTAS. .....................................................................21 1.6.- EXPRESIÓN GÉNICA Y REGULACIÓN BAJO ESTRÉS ABIÓTICO...........................................25 1.6.1.- Complejidad de la expresión génica y regulación. ................................................................25 1.6.2.- Factores de transcripción involucrados en la respuesta a estrés abiótico. ............................27 1.6.2.1.- Regulon CBF/DREB. ........................................................................................................27 1.6.2.2.- Regulon NAC y ZF-HD. ....................................................................................................29 1.6.2.3.- Regulon AREB / ABF. .......................................................................................................29 1.6.2.4.- Regulon MYB / MYC. ........................................................................................................30 1.6.3.- Expresión génica en respuesta a estrés abiótico en tomate. ................................................32 1.6.4.- Factores de transcripción involucrados en la respuesta estrés abiótico en tomate. ...............34 1.6.4.1.- Regulon CBF/DREB. ........................................................................................................34 1.6.4.2.- Regulon NAC y ZF-HD. ....................................................................................................35 1.6.4.3.- Regulon AREB / ABF. .......................................................................................................35 1.6.4.4.- Regulon MYB / MYC. ........................................................................................................36 1.7.- FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE TIPO DOF. ....................................................................38 1.7.1.- Diferenciación de tejido........................................................................................................40 1.7.2.- Desarrollo de semilla. ..........................................................................................................41 1.7.3.- Regulación del metabolismo. ...............................................................................................42 1.8.- CYCLING DOF FACTORS (CDFS). ...........................................................................................44 i.

(12) 2.- OBJETIVOS ......................................................................................................................................47 3.- Arabidopsis CYCLING DOF FACTOR 3 CDF3 REGULATE DROUGHT AND LOW TEMPERATURE STRESS RESPONSE AND FLOWERING TIME IN Arabidopsis thaliana .............................................50 3.1.- INTRODUCTION. .......................................................................................................................50 3.2.- MATERIAL AND METHODS. ......................................................................................................54 3.2.1.- Plant material and growth conditions. ...................................................................................54 3.2.2.- Plasmid constructs and Arabidopsis transformation..............................................................55 3.2.3.- Tomato transformation. ........................................................................................................55 3.2.4.- Histochemical GUS staining and subcellular localization of AtCDF3 protein. ........................56 3.2.5.- Protoplast transformation and GUS assays. .........................................................................57 3.2.6.- RNA isolation and expression analysis by real-time RT-qPCR..............................................57 3.2.7.- Germination and post-germinative growth assay. .................................................................58 3.2.8.- Photosynthesis and leaf fluorescence measurement. ...........................................................59 3.2.9.- Drought and cold stress tolerance assay. .............................................................................60 3.2.10.- Microarray analysis. ...........................................................................................................60 3.2.11.- Metabolomic analyses. ......................................................................................................61 3.3.- RESULTS. ..................................................................................................................................62 3.3.1.- Abiotic stress response and expression pattern of AtCDF3. .................................................62 3.3.2.- AtCDF3 protein localize to the cell nucleus and display specific DNA-binding and activation properties .......................................................................................................................................65 3.3.3.- Overexpression of AtCDF3 enhanced drought and low temperature tolerance in Arabidopsis. ......................................................................................................................................................68 ......................................................................................................................................................71 3.3.4.- AtCDF3 overexpression increased photosynthesis and stomatal aperture. ...........................72 3.3.5.- The effect of AtCDF3 on drought tolerance is related to its transcriptional activity. ................73 3.3.6.- Transcriptome analysis of transgenic Arabidopsis overexpressing AtCDF3. .........................75 3.3.7.- The overexpression of AtCDF3 promotes important metabolic changes in vegetative tissues. ......................................................................................................................................................80 3.3.8.- Overexpression of AtCDF3 in tomato enhance osmotic and low temperature tolerance. .......82 3.4.- DISCUSSION. ............................................................................................................................85 3.4.1.- AtCDF3 involvement in abiotic stress responses. .................................................................85 3.4.2.- AtCDF3 as a regulatory link between carbon and nitrogen metabolism. ................................87 3.4.3.- AtCDF3 is involved in the cross-talk of abiotic stress responses and flowering time. .............88 4.- CHARACTERIZATION OF TOMATO CYCLING DOF FACTORS REVEALS CONSERVED AND NEW FUNCTIONS IN THE CONTROL OF FLOWERINGTIME AND ABIOTIC STRESS RESPONSES………………………………………………………………………………………………………..93 4.1.- INTRODUCTION. .......................................................................................................................93 4.2.- MATERIAL AND METHODS. ......................................................................................................96 4.2.1.- Database searches for the identification of DOF family members in .....................................96 Solanum lycopersicum L.................................................................................................................96 4.2.2.- Subcellular localization of tomato CDF proteins....................................................................97 4.2.3.- DNA-binding specificity of CDF proteins using the yeast one-hybrid assay. ..........................97 4.2.4.- Protoplast transformation and GUS assays. .........................................................................98 4.2.5.- Plant growth conditions and quantification of CDF gene expression in tomato. .....................98 4.2.6.- Plasmid constructs and plant transformation. .......................................................................99 4.2.7.- RNA measurements by RT-qPCR in Arabidopsis. .............................................................. 100 4.2.8.- Salt and drought stress tolerance tests. ............................................................................. 100 ii.

(13) 4.2.9.- Metabolomic analyses. ...................................................................................................... 101 4.3.- RESULTS. ................................................................................................................................ 101 4.3.1.- Identification of CDF proteins in tomato plants. .................................................................. 101 4.3.2.- Tomato SlCDF1-5 proteins localize to the cell nucleus and display distinct DNA- binding and activation properties. .................................................................................................................... 105 4.3.3.- Expression of tomato SlCDFs follows a circadian rhythm. .................................................. 107 4.3.4.- Expression of tomato SlCDF1-5 genes is differentially regulated during development. ...... 109 4.3.5.- SLCDF1-5 GENES ARE DIFFERENTIALLY INDUCED IN RESPONSE TO ABIOTIC STRESS CONDITIONS. .............................................................................................................................. 110 4.3.6.- Overexpression of tomato SlCDF3 promotes late flowering in transgenic Arabidopsis plants. .................................................................................................................................................... 110 4.3.7.- Overexpression of SlCDF1 and SlCDF3 has an impact in drought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis plants. ...................................................................................................... 113 4.3.8.- Overexpression of SlCDF3 in transgenic Arabidopsis plants induces metabolic changes and accumulation of specific compounds. ............................................................................................ 117 4.4.- DISCUSSION. .......................................................................................................................... 120 4.4.1.- SlCDFs share a high degree of sequence similarity but display different DNA-binding affinities and diverse transcriptional activation capabilities. ......................................................................... 120 4.4.2.- Expression of SlCDFs follows a circadian rhythm with two different patterns. ..................... 121 4.4.3.- Expression of tomato SICDF genes in Arabidopsis unveils a conserved function in the control of flowering time. .......................................................................................................................... 122 4.4.4.-SlCDFs involvement in abiotic stress responses. ................................................................ 123 4.4.5.- Impact of SlCDFs expression on C/N metabolism. ............................................................. 124 4.4.6.- CDFs at the interplay between environmental conditions and flowering time. ..................... 125 5.- CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 127 6.- BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 131 SUPPLEMENTARY .............................................................................................................................. 155. iii.

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(16) Resumen. RESUMEN. El tomate (Solanum lycopersicum L.) es considerado uno de los cultivos hortícolas de mayor importancia económica en el territorio Español. Sin embargo, su producción está seriamente afectada por condiciones ambientales adversas como, salinidad, sequía y temperaturas extremas. Para resolver los problemas que se presentan en condiciones de estrés, se han empleado una serie de técnicas culturales que disminuyen sus efectos negativos, siendo de gran interés el desarrollo de variedades tolerantes. En este sentido la obtención y análisis de plantas transgénicas, ha supuesto un avance tecnológico, que ha facilitado el estudio y la evaluación de genes seleccionados en relación con la tolerancia al estrés. Estudios recientes han mostrado que el uso de genes reguladores como factores de transcripción (FTs) es una gran herramienta para obtener nuevas variedades de tomate con mayor tolerancia a estreses abióticos. Las proteínas DOF (DNA binding with One Finger) son una familia de FTs específica de plantas (Yangisawa, 2002), que están involucrados en procesos fisiológicos exclusivos de plantas como: asimilación del nitrógeno y fijación del carbono fotosintético, germinación de semilla, metabolismo secundario y respuesta al fotoperiodo pero su preciso rol en la tolerancia a estrés abiótico se desconoce en gran parte.. El trabajo descrito en esta tesis tiene como objetivo estudiar genes reguladores tipo DOF para incrementar la tolerancia a estrés abiotico tanto en especies modelo como en tomate. En el primer capítulo de esta tesis se muestra la caracterización funcional del gen CDF3 de Arabidopsis, así como su papel en la respuesta a estrés abiótico y otros procesos del desarrollo. La expresión del gen AtCDF3 es altamente inducido por sequía, temperaturas extremas, salinidad y tratamientos con ácido abscísico (ABA). La línea de inserción T-DNA cdf3-1 es más sensible al estrés por sequía y bajas temperaturas, mientras que líneas transgénicas de Arabidopsis 35S::AtCDF3 aumentan la tolerancia al estrés por sequía, osmótico y bajas temperaturas en comparación con plantas wild-type (WT). Además, estas plantas presentan un incremento en la tasa fotosintética y apertura estomática. El gen AtCDF3 se localiza. iv.

(17) Resumen. en el núcleo y que muestran una unión específica al ADN con diferente afinidad a secuencias diana y presentan diversas capacidades de activación transcripcional en ensayos de protoplastos de Arabidopsis.. El dominio C-terminal de AtCDF3 es esencial para esta localización y su capacidad activación, la delección de este dominio reduce la tolerancia a sequía en plantas transgénicas 35S::AtCDF3. Análisis por microarray revelan que el AtCDF3 regula un set de genes involucrados en el metabolismo del carbono y nitrógeno. Nuestros resultados demuestran que el gen AtCDF3 juega un doble papel en la regulación de la respuesta a estrés por sequía y bajas temperaturas y en el control del tiempo de floración.. En el segundo capítulo de este trabajo se lleva a cabo la identificación de 34 genes Dof en tomate que se pueden clasificar en base a homología de secuencia en cuatro grupos A-D, similares a los descritos en Arabidopsis. Dentro del grupo D se han identificado cinco genes DOF que presentan características similares a los Cycling Dof Factors (CDFs) de Arabidopsis. Estos genes son considerados ortólogos de Arabidopsis CDF1-5, y han sido nombrados como Solanum lycopersicum CDFs o SlCDFs. Los SlCDF1-5 son proteínas nucleares que muestran una unión específica al ADN con diferente afinidad a secuencias diana y presentan diversas capacidades de activación transcripcional in vivo. Análisis de expresión de los genes SlCDF1-5 muestran diferentes patrones de expresión durante el día y son inducidos de forma diferente en respuesta a estrés osmótico, salino, y de altas y bajas temperaturas. Plantas de Arabidopsis que sobre-expresan SlCDF1 y SlCDF3 muestran un incremento de la tolerancia a la sequía y salinidad. Además, de la expresión de varios genes de respuesta estrés como AtCOR15, AtRD29A y AtERD10, son expresados de forma diferente en estas líneas. La sobre-expresión de SlCDF3 en Arabidopsis promueve un retardo en el tiempo de floración a través de la modulación de la expresión de genes que controlan la floración como CONSTANS (CO) y FLOWERING LOCUS T (FT). En general, nuestros datos demuestran que los SlCDFs están asociados a funciones aun no descritas, relacionadas con la tolerancia a estrés abiótico y el control del tiempo de floración a través de la regulación de genes específicos. y. a. un. aumento. v. de. metabolitos. particulares..

(18) Summary. SUMMARY Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the horticultural crops of major economic importance in the Spanish territory. However, its production is being affected by adverse environmental conditions such as salinity, drought and extreme temperatures. To resolve the problems triggered by stress conditions, a number of agricultural techniques that reduce the negative effects of stress are being frequently applied. However, the development of stress tolerant varieties is of a great interest. In this direction, the technological progress in obtaining and analysis of transgenic plants facilitated the study and evaluation of selected genes in relation to stress tolerance. Recent studies have shown that a use of regulatory genes such as transcription factors (TFs) is a great tool to obtain new tomato varieties with greater tolerance to abiotic stresses. The DOF (DNA binding with One Finger) proteins form a family of plant-specific TFs (Yangisawa, 2002) that are involved in the regulation of particular plant processes such as nitrogen assimilation, photosynthetic carbon fixation, seed germination, secondary metabolism and flowering time bur their precise roles in abiotic stress tolerance are largely unknown.. The work described in this thesis aims at the study of the DOF type regulatory genes to increase tolerance to abiotic stress in both model species and the tomato. In the first chapter of this thesis, we present molecular characterization of the Arabidopsis CDF3 gene as well as its role in the response to abiotic stress and in other developmental processes. AtCDF3 is highly induced by drought, extreme temperatures, salt and abscisic acid (ABA) treatments. The cdf3-1 T-DNA insertion mutant was more sensitive to drought and low temperature stresses, whereas the AtCDF3 overexpression enhanced the tolerance of transgenic plants to drought, cold and osmotic stress comparing to the wild-type (WT) plants. In addition, these plants exhibit increased photosynthesis rates and stomatal aperture. AtCDF3 is localized in the nuclear region, displays specific binding to the canonical DNA target sequences and has a transcriptional activation activity in Arabidopsis protoplast assays. In addition, the C-terminal domain of AtCDF3 is essential for its localization and activation capabilities and the deletion of this domain significantly reduces the tolerance to drought in transgenic 35S::AtCDF3 overexpressing plants. Microarray analysis revealed that AtCDF3 regulated a set of genes involved in nitrogen and carbon vi.

(19) Summary metabolism. Our results demonstrate that AtCDF3 plays dual roles in regulating plant responses to drought and low temperature stress and in control of flowering time in vegetative tissues.. In the second chapter this work, we carried out to identification of 34 tomato DOF genes that were classified by sequence similarity into four groups A-D, similar to the situation in Arabidopsis. In the D group we have identified five DOF genes that show similar characteristics to the Cycling Dof Factors (CDFs) of Arabidopsis. These genes were considered orthologous to the Arabidopsis CDF1 - 5 and were named Solanum lycopersicum CDFs or SlCDFs. SlCDF1-5 are nuclear proteins that display specific binding to canonical DNA target sequences and have transcriptional activation capacities in vivo. Expression analysis of SlCDF1-5 genes showed distinct diurnal expression patterns and were differentially induced in response to osmotic, salt and low and high temperature stresses. Arabidopsis plants overexpressing SlCDF1 and SlCDF3 showed increased drought and salt tolerance. In addition, various stress-responsive genes, such as AtCOR15, AtRD29A and AtERD10, were expressed differently in these lines. The overexpression of SlCDF3 in Arabidopsis also results in the late flowering phenotype through the modulation of the expression of flowering control genes such CONSTANS (CO) and FLOWERING LOCUS T (FT). Overall, our data connet SlCDFs to undescribed functions related to abiotic stress tolerance and flowering time through the regulation of specific target genes and an increase in particular metabolites.. Director.. Director.. Dr. Joaquín MedinaAlcázar. Profesor. Jesús Vicente-Carbajosa. Alba Rocío Corrales Ducuara vii.

(20) Abreviaturas. ABREVIATURAS %: Porcentaje 3-AT: 3-aminotriazol. ABA: Ácido abscísico. aa: Amino acidos ABRE: ABA responsive element - Elemento de respuesta a ABA. bp: Pares de bases. bZip: Basic Leucine Zipper CaMV: Cauliflower mosaic virus – Virus del mosaico de la coliflor. CDF1: Cyclin Dof Factor 1 CO: Constans COR: COLD REGULATED CRE: cis-regulatory element- Elemento regulador en cis. DL: Día largo DC: Día corto DOF: DNA binding with one finger- Unión a DNA con un dedo de Zinc. DRE: Dehydration-responsive element- Elemento de respuesta a deshidratación ELF3: EARLY FLOWERING 3 FAO: Food and Agriculture Organization- Organización para la Alimentación y la Agricultura. FKF1: (Flavin-binding, Kelch repeat, F-box-1) GABA: γ-amino butírico GI: GIGANTEA DAG: DOF Affecting Germination genes R: Genes de resistencia GUS: β-Glucoronidasa HMG: High Mobility Group Ha: Hectáreas LI: Línea de Introgresión OBP1: OBF- binding factor-1 PSII: Fotosistema II PEPC: C4 Fosfo-Enol-Piruvato-Carboxilasa viii.

(21) Abreviaturas PK: Piruvato quinas QTLs: Quantitative trait loci. ROS: Especies reactivas de oxígeno. RT-qPCR: Real Time Quantitative PCR-PCR cuantitativa a tiempo real. Rubisco: (Ribulosa-1,5-bifosfato) RD29A: RESPONSIVE TO DEHYDRATION 29A TF: Transcription Factor- Factor de Transcripción Tn: Toneladas WT: Wild type-Fenotipo Silvestre Y1H: Hibrido de levadura. ix.

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(23) 1 INTRODUCCIÓN GENERAL.

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(27) Introducción General. 1.1.- EL TOMATE, Solanum lycopersicum L. 1.1.1.- Origen, taxonomía y morfología. El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una especie perteneciente a la familia de las solanáceas al igual que la patata y el pimiento. El centro de origen del género Solanum, es la región andina que incluye partes de Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia y Chile (Nuez y Prohens, 2008). El lugar donde se produjo su domesticación ha sido motivo de controversia. Sin embargo, antes de su introducción en Europa y Asia ya presentaba un cierto grado de domesticación caracterizado por la forma, acostillado, tamaño y color de los frutos (Nuez, 1995).. La introducción y difusión del tomate en Europa data del siglo XVI, pero hasta el siglo XVII no presentó un incremento en su producción y consumo en Italia y la Península Ibérica (Nuez y Prohens, 2008). Comerciantes españoles y portugueses difundieron el tomate por Oriente Medio, África y Filipinas a través de sus colonias ultramarinas (Nuez, 1995), y a partir del comercio en estos países el tomate llego a establecerse en China, Japón e India, permitiendo así difusión por Asia. El tomate, es una planta dicotiledónea perteneciente a la familia Solanaceae. Esta gran familia está compuesta por 96 géneros y más de 2800 especies distribuidas en tres subfamilias Solanoideae (en la cual se encuentra el género Solanum), Cestroideae y Solanineae (Foolad, 2007) su taxonomía aceptada es:. REINO:. Plantae. Subreino:. Traqueobinta. Superdivisión:. Spermatophyta. Clase:. Magnoliopsida. Subclase:. Asteridae. Orden:. Solanales. Suborden:. Solanineae. Familia:. Solanaceae. Subfamilia:. Solanoideae. Género:. Solanum. Especie:. lycopersicum. 1.

(28) Introducción General. En la primera clasificación taxonómica, el tomate cultivado fue llamado Solanum lycopersicum por Linnaeus (1953). En 1754, Miller designo el género Lycopersicon y la especie esculentum para el tomate cultivado, esto ayudó a que el tomate fuera aceptado como alimento de consumo. La distinción entre el género Lycopersicon y el Solanum, se basó inicialmente en caracteres diferenciales en hojas y anteras. Así, en el género Lycopersicon su dehiscencia se produce en el lateral de las anteras y sus hojas son generalmente pinadas. Mientras que en el género Solanum su dehiscencia se produce en el extremo de las anteras y sus hojas son simples. Relaciones filogenéticas entre los géneros Lycopersicon y Solanum han sido tema de debate a lo largo del tiempo algunos investigadores sugieren que Lycopersicon es un género distinto, mientras que otros argumentan que este debía estar unido al Solanum. Así, basados en estudios moleculares y morfológicos, se ha re adoptado el nombre Solanum lycopersicum para el tomate cultivado (Foolad, 2007). Así mismo, otras especies del género Lycopersicon han sido asignadas al Solanum. El tomate es una planta perenne de porte arbustivo que se cultiva como anual, puede desarrollarse de forma rastrera, semierecta o erecta, su crecimiento puede ser limitado en algunas variedades determinadas e ilimitado en variedades indeterminadas (Figura 1.1A). Su sistema radicular, está constituido por la raíz principal, las raíces segundarias y las raíces adventicias. El tallo principal es un eje de 2-4 cm de grosor en su base, sobre el que se desarrollan los tallos secundarios (ramificación simpodial). La hoja es compuesta e imparipinnada con foliolos peciolados y lobulados con bordes dentados y recubierta de pelos glandulares. Una hoja típica de tomate cultivado tiene aproximadamente 0,5 m de largo con un gran foliolo terminal y varios foliolos laterales (Figura 1.1B). La flor de tomate es regular e hipógina y consta de 5 ó más sépalos y pétalos dispuestos de forma helicoidal. Los estambres que se alternan con los pétalos forman un cono estaminal que envuelve el gineceo (con un ovario bi o plurilocular) (Figura 1.1C). Las flores se agrupan en inflorescencias de tipo racimoso unidas al eje floral por un pedicelo articulado que contiene la zona de abscisión (Nuez, 1995) (Figura 1.1D). El número de flores en cada inflorescencia depende de factores ambientales como la temperatura (Rost, 1996).. 2.

(29) Introducción General. A. B. C. D. E. F. G. Figura 1.1. Características generales de la planta de tomate (Solanum lycopersicum L.) A) Planta entera, B) Hoja, C) Flor, D) Inflorescencia, E) Fruto bilocular, F) Fruto plurilocular, G) Fruto adulto. Adaptado de C.M Jones http://tgrc.ucdavis.edu/Data/Acc/taxon_images.aspx.. El fruto de tomate es una baya bi o plurilocular que se desarrolla a partir de un ovario aproximadamente de unos 5-10mg (Figura 1.1 E-F). Un fruto adulto está constituido por: pericarpo, que se compone de pared externa, pared interna y paredes radiales, tejido placentario y semillas (Figura 1.1G). El desarrollo del fruto tarda aproximadamente de 7 a 9 semanas en función del cultivar, la posición en el racimo y las condiciones ambientales. El crecimiento del fruto se ajusta a una curva sigmoide simple que se divide en tres periodos (Nuez, 1995; Cuartero y Muñoz., 1999): i.. El primer periodo, denominado crecimiento lento, puede durar 2 ó 3 semanas y se produce fundamentalmente por división celular. La transición del primer periodo al segundo requiere una estimulación hormonal que es normalmente provista por el crecimiento del tubo polínico y la fertilización del ovulo.. ii.. El segundo periodo, de crecimiento rápido, dura entre 3-5 semanas prolongándose hasta el inicio de la maduración. En esta etapa el crecimiento de fruto se produce por aumento del tamaño de las células preformadas. El tamaño de las vacuolas también aumenta y se. 3.

(30) Introducción General. produce una acumulación de almidón, ácidos orgánicos y otros componentes que darán características al fruto maduro. iii.. Por último, un periodo de crecimiento lento que se extiende durante 2 semanas y en el que no hay un aumento significativo del tamaño del fruto pero por el contrario se producen los cambios metabólicos propios de la maduración. El tamaño del fruto está estrechamente correlacionado con el número de semillas y el número de lóculos.. 1.1.2.- El tomate como planta modelo. El tomate es considerado un buen sistema modelo para estudios genómicos y de desarrollo del fruto, por su facilidad de cultivo bajo un amplio rango de condiciones medioambientales, ciclo de vida corto, elevado potencial reproductivo, fácil polinización y propagación vegetativa (Foolad, 2007). Además, su uso en investigación está ampliamente aceptado por ser una especie diploide, con 2n=2x=24 cromosomas, con un genoma relativamente pequeño (950 Mbp) del cual un 75% corresponde a heterocromatina, en cambio una gran proporción de genes se agrupan en grandes regiones eucromáticas que se localizan en las regiones distales de los brazos cromosómicos (220 Mb). Esta característica permitió la estrategia de secuenciamiento solo de regiones eucromáticas, para cubrir la mayor parte del genoma (Mueller y col., 2005). En el año 2012, la iniciativa de secuenciación del genoma de tomate completo la secuenciación de la línea LA1589 de Solanum pimpinellifolium L. dentro del Proyecto Internacional del Secuenciamiento del Genoma del Tomate (SOL) (The tomato genome consortium 2012).. Estudios recientes han demostrado que la base para obtener el tomate moderno ha sido a partir de los diferentes procesos de domesticación. Análisis evolutivo de 333 accesiones de tomate (S. pimpinellifolium, S. lycopersium var. cerasiforme y S. lycopersicum), que representan varios orígenes geografícos, tipos de consumo y especies mejoradas. Al igual que 10 accesiones de especies wild-type (WT), incluyendo algunas donadoras de genes de resistencia (genes R) a enfermedades y 17 híbridos comerciales modernos (F1). Demuestran que la domesticación y la mejora del cultivo de tomate, se ha. 4.

(31) Introducción General. enfocado sobre dos grupos independientes de QTLs (Quantitative trait locus), que han permitido obtener un cultivar ~100 veces más grande en comparción con su ancestro (Lin y col., 2014). De esta manera, la domesticación y mejora ha incrementado la productividad del cultivo de tomate, pero ha disminuido su base genetica. En la actualidad, se han realizado introgresiones de genes R de especies WT en cultivares comerciales. Un ejemplo de ello es la introgresión del gen Tm-2a de Solanum peruvianum L. (PI 128650) sobre el cromosoma 9 (51.7-54.7 Mb) de tomate, este gen confiere resistencia al Virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus; ToMV) (Tanksley y col., 1998). Por otra parte, otras dos grandes introgresiones sobre el cromosoma 6 de tomate han sido importantes para la tolerancia a patógenos. La introgresión del gen Mi-1 de S.peruvianum L. (PI 128657) que confiere resistencia a nematodos, y el gen Ty-1 de Solanum chilense L. (LA1969) que conlleva resistencia al Virus del rizado amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV) han sido útiles para aumentar la resistencia a plagas y enfermedades. Ambas introgresiones ocupan la misma región genómica, impidiendo la recombinación de ambos genes en un mismo cultivar. Otros estudios con diferentes líneas de introgresión (LIs) de Solanum pennelli y Solanum lycopersicum cv. M82 han identificado genes candidatos para la tolerancia a estrés abiótico y han proporcionado evidencia que son elementos transportables y presentan un rol en la evolución de estas características (Bolger y col., 2014). Sin embargo, son pocas las variedades comerciales que se conocen hasta en momento que responden eficazmente en la tolerancia a estrés abiótico.. 1.2.- Importancia económica del tomate. 1.2.1.- Importancia económica en el mundo. El tomate, es el segundo cultivo vegetal más importante en el mundo después de la patata (Solanum tuberosum L.) en términos de consumo per cápita (Pandey y col., 2011). En las últimas décadas, la producción de tomate (fresco y cultivado) se ha incrementado alrededor de un 300% (Costa y Heuvelink, 2005). 5.

(32) Introducción General. Según datos de la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations, www.fao.org), en el año 2012 la producción mundial de tomate alcanzó 161,7 millones de toneladas (Tn) con un superficie cultivada de más de 4,8 millones de ha. Los países con mayor producción en Tn a nivel mundial fueron: China (50 millones) seguido por India (17 millones), Estados Unidos (13 millones), Turquía (11 millones) y Egipto (8 millones). España ocupa el noveno lugar a nivel mundial con 4,0. Millones de Tn. millones de Tn al año y un área de 48.800 ha (FAOSTAT, 2012; Figura 1.2). 50000000 45000000 40000000 35000000 30000000 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0. *. Figura 1.2. Producción mundial de tomate. Ranking de los principales países productores en el mundo en millones de (Tn) (FAOSTAT, 2012).. En Europa, la producción de tomate está dividida en dos grandes sistemas. En el norte el sistema de producción es intensivo bajo invernadero para obtener grandes cosechas de tomate fresco. Por otra parte, en el Mediterráneo el sistema de producción está enfocado en zonas abiertas para el tomate procesado y bajo estructuras cubiertas para el tomate fresco (Harvey y col, 2002).. 1.2.2.- Importancia económica del tomate en España.. El tomate es un producto básico de la horticultura Española, ocupa el 14% de la superficie de cultivo y aporta un 23% del valor de la producción del sector (Nuez, 1995). Entre los países productores 6.

(33) Introducción General. europeos, España es el segundo después de Italia (Tabla 1.1). Sin embargo, a diferencia de la situación italiana, gran parte de la producción española se dedica al mercado fresco (Pazos, 2003). En el territorio Español, el tomate es uno de los cultivos hortícolas de mayor producción. Según el Anuario de Estadística Agraria (2011), el 65 % de la superficie cultivada es de cosecha al aire libre y el resto bajo invernadero. Tabla 1.1 Producción, superficie y rendimiento de los principales países productores de la Unión Europea en 2012 (FAOSTAT, 2012).. Países. Producción (Tn). Superficie (ha). Rto (Kg/ha). España. 4.007.000. 48.800. 821,106.56. Italia. 5.131.977. 91.850. 558,734.57. Francia. 588.660. 6.369. 924,258.13. Grecia. 979.600. 16.000. 612,250. Portugal. 1.392.700. 15.400. 904,350.65. Total UE. 15.133.447. 506.583. 408.493.57. En la actualidad, las provincias con mayor producción son: Extremadura (1.275.368 Tn), Almería (892.510 Tn) y Murcia (311.065 Tn), que en los últimos años han emergido como una competitiva e importante área en la producción y exportación de tomate fresco bajo invernadero (Costa y Heuvelink., 2005).. 1.2.3.- Impacto del estrés abiótico en el cultivo de tomate. Como se ha mencionado anteriormente, el tomate (S. lycopersicum L.) es el segundo cultivo hortícola más importante del mundo después de la patata (S. tuberosum L.). Sin embargo, su productividad está influenciada por diferentes tipos de estrés abiótico (Pandey y col., 2011). El tomate puede adaptarse a casi a todos los climas y regiones del mundo, su crecimiento y desarrollo es sensible. 7.

(34) Introducción General. a diferentes estreses medioambientales como: salinidad, sequía, temperaturas extremas y polución ambiental (Foolad, 2005).. Entre los diferentes tipos de estrés abiótico que afectan la producción de tomate, el déficit hídrico o estrés por sequía es el factor más devastador (Boyer, 1982). Las pérdidas en la producción agrícola a causa de la sequía exceden a las producidas por otras causas, creando graves problemas a la tercera parte de las áreas cultivables en el mundo (Blum, 1998; Kramer, 1980; Schonfeld y col., 1988; Foolad 2005; Bruce y col., 2002). España es uno de los países afectados por el fenómeno de la sequía; durante el periodo de 1880-2000 más de la mitad de los años se han calificado como secos o muy secos. El estrés por sequía afecta a todo el territorio español, aunque las zonas donde las precipitaciones anuales no superan los 600mm como Andalucía, son los que sufren en mayor medida sus efectos.. La necesidad de agua en el cultivo de tomate varía en función de su estado de desarrollo. Al principio del cultivo, la masa vegetal es muy pequeña y el consumo de agua es mínimo. Sin embargo, este incrementa paulatinamente hasta el inicio del cuajado. Durante el cuajado del tomate las necesidades hídricas aumentan considerablemente debido que la planta sigue produciendo hojas y tallos nuevos, a la vez que van creciendo los frutos. En el periodo de maduración, las necesidades de agua disminuyen (en variedades con floración y fructificación agrupadas) (Cuartero y col., 1995). Así, el tomate de industria puede dejarse de regar cuando se tiene un 29-30% del fruto maduro sin que la cosecha disminuya (Cuartero y col., 1995).. El crecimiento y desarrollo de la planta depende en gran parte de la absorción de agua que realice el sistema radicular. La planta de tomate responde al estrés hídrico aumentando la relación raíz/parte aérea; plantas cultivadas con déficit hídrico reducen su sistema radicular en comparación con plantas cultivadas en condiciones control, pero en un grado menor que la reducción del desarrollo de la parte aérea, (Brouwer, 1981). Una de las causas de este crecimiento diferencial reside en que la distribución de agua en el suelo no es homogénea. El contenido de agua en el suelo repercute en la distribución del. 8.

(35) Introducción General. sistema radicular haciéndolo más profundo en el caso de presentarse déficit o más superficial cuando el potencial hídrico del suelo es cercano a cero (Bierhuizen, 1981; Cuartero y col., 1995). Un bajo potencial hídrico afecta a la expansión y división celular (Kirkham y col., 1991) afectando directamente al desarrollo del fruto. Además, el déficit hídrico provoca cambios en el tamaño del fruto a corto plazo. Estudios realizados por Johnson y colaboradores (1992), han demostrado que el diámetro del fruto puede aumentar o disminuir según el sentido del gradiente de déficit hídrico entre el tallo y el fruto. Teniendo en cuenta que el potencial hídrico del fruto permanece relativamente constante, las variaciones en el potencial hídrico del tallo durante el día explican el aumento o disminución del diámetro del fruto.. Por otra parte, la salinidad es otro de los mayores estreses abióticos que afectan a la productividad de cultivos en el mundo (Munns y Tester 2008; Peleg y col., 2012; Apse y Blumwald, 2002; Foolad, 2004). Diferentes cultivos de interés agronómico incluido el tomate, S. lycopersicum son sensibles a la salinidad (Foolad, 2004; Passam y col., 2007). Una alta salinidad en la zona radicular de la planta impide un adecuado crecimiento y desarrollo, dando lugar a una reducción o pérdida total de la cosecha. Según Foolad (2004), de los 14 billones de ha disponibles sobre la tierra, se estima que 6,5 billones de ha pertenecen a regiones áridas y semiáridas y a su vez 1 billón son suelos salinos. Aproximadamente, el 22% de la tierra agrícola es salina (FAO, 2004) con un incremento de la tasa salinización del 10% por año (Foolad, 2005). El problema de la salinidad en España es especialmente importante en sistemas cerrados del sureste peninsular. La escasa disponibilidad de agua de óptima calidad y la búsqueda de la misma origina altos costes de producción que afectan a la rentabilidad del cultivo. Algunos cultivares de tomate son moderadamente sensibles a la salinidad en todos los estados de desarrollo de la planta incluyendo: germinación de semilla, crecimiento vegetativo y crecimiento reproductivo (Jones y col., 1988; Maas, 1986; Mass, 1990; Bolarin y col., 1993).. La salinidad del suelo se relaciona con un exceso de entre 0.20 y 0.25% de sodio, calcio, magnesio, cloratos, sulfatos o carbonatos (Pandey y col., 2011). Se considera que un suelo es salino cuando la conductividad eléctrica (CE) del extracto de saturación en la zona radicular excede 4 dSm -1 a 9.

(36) Introducción General. 25ºC (Foolad, 2004; FAO: Rome 2005). En la raíz, el estrés salino genera cambios en el crecimiento, morfología y fisiología modificando así la absorción de agua e iones y la producción de moléculas señalizadoras (hormonas). La salinidad produce un efecto negativo en la cantidad de biomasa. Una de las razones por la que el crecimiento de la raíz se reduce en condiciones de estrés salino es que presenta una disminución del crecimiento celular causada por: el bajo potencial de agua del medio externo, la interferencia de iones salinos con los nutrientes esenciales o la toxicidad debida a la acumulación de iones que conducen a la muerte celular. Además, la salinidad disminuye el crecimiento de los brotes de tomate y causa una disminución del área foliar. La reducción en la tasa de crecimiento de la hoja está relacionada con una reducción de la turgencia celular y de la tasa fotosintética (Cuartero y Muñoz., 1999). Niveles de salinidad iguales o superiores de 8ds/m afectan el número de frutos por planta. La disminución del número de frutos podría ser debido a la reducción del número de flores y/o del cuajado de las mismas, que a su vez puede deberse a una disminución de la cantidad y/o fertilidad del polen (Cuartero y col., 1995). El tamaño del fruto también se ve afectado por la salinidad ya que esto limita el transporte de agua hacia el fruto produciendo un aumento de la tasa de acumulación de materia seca (Johnson y col., 1992). En condiciones de salinidad (CE= 3-9 dSm-1) la reducción del tamaño del fruto es la principal causa de la disminución de la producción (Van-Ieperen, 1996).. Por otra parte, el tomate es una planta termo-periódica (Went, 1994), requiere fluctuaciones de temperatura entre el día y la noche. Se estiman como óptimas las diferencias térmicas noche/día de 67ºC (Verter, 1957). A su vez, las temperaturas óptimas están relacionadas con la iluminación (Calvert y Slack, 1975). En condiciones mediterráneas, temperaturas diurnas de 21ºC a 27ºC (según radiación) y nocturnas de 12ºC -15ºC se consideran las adecuadas para el cultivo (Brun y Lagier, 1984). El tomate es altamente sensible al estrés por bajas temperaturas o chilling ya que en esas condiciones se produce una inhibición de la germinación de semillas y del desarrollo reproductivo causando transformaciones homeóticas florales (Lozano, 1998). Las bajas temperaturas afectan al desarrollo del fruto, pero la temperatura mínima a la que planta sufre daño es difícil de precisar, debido a que depende del estado de desarrollo de la planta, de su potencial hídrico y de la condición hídrica del suelo. Temperaturas alrededor 10.

(37) Introducción General. de 1ºC producen síntomas de heladas en hojas (Cuartero, 1995), sin embargo, no es el principal problema. Las fases más sensibles al frío son la germinación de la semilla y el cuajado del fruto, esta última debida principalmente a una disminución de la fertilidad del polen y a una dificultad en la dehiscencia de las anteras (Cuartero y col., 1995; Cuartero y Fernández-Muñoz, 1999).. 1.3.- ESTRÉS ABIÓTICO. 1.3.1.- Generalidades del estrés abiótico en plantas.. Las plantas durante su desarrollo se enfrentan a condiciones ambientales adversas que afectan negativamente a su crecimiento y productividad (Screenivasulu y col., 2007; Seki y col., 2007). El estrés abiótico es la principal causa de las pérdidas de cultivos en el mundo, reduciendo su rendimiento en más de un 50% (Bray y col., 2000), lo que supone pérdidas de cientos de millones de dólares cada año. En términos generales los estreses abióticos más comunes son: salinidad, sequía, bajas y altas temperaturas. La disminución de la disponibilidad de agua y las condiciones ambientales adversas, sumado al incremento de la población humana están produciendo serios cambios en la agricultura mundial (Mittler y Blumwald, 2010; Peleg y col., 2012). Recientes estudios han mostrado que para el año 2050 la población mundial necesitara un aumento de entre 70 a 100% más de alimento (World Development Report 2008) principalmente en cultivos como: arroz (Oryza sativa L.), trigo (Triticum aestivum L.) y maíz (Zea mays L.) (Godfray y col., 2010). Este incremento de la población mundial aumenta la necesidad de producir estos cultivos en áreas donde las condiciones climáticas adversas son un factor limitante (Pennisi, 2008; Nakashima y col., 2014).. Las plantas responden y se adaptan al estrés abiótico a través de mecanismos bioquímicos, moleculares y fisiológicos que permiten su desarrollo y supervivencia (Munns, 2002; Chaves y col., 2003; Osakabe y col., 2013; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2005). Las respuestas a uno o más estreses varían dependiendo de la especie y el genotipo. Sin embargo, la respuesta al estrés también depende de. 11.

(38) Introducción General. la duración y severidad del evento, así como de la edad y del estado de desarrollo de la planta cuando se impone el estrés (Bray, 1997). En plantas de cultivo, la sensibilidad/tolerancia al estrés abiótico es determinada por la pérdida de la cosecha y la tasa de supervivencia (Peleg y col., 2012). Además, en respuesta a estos estreses un número determinado de genes son altamente regulados, mitigando los efectos del estrés y ajustando el entorno celular y la tolerancia de la planta (Mahajan y col., 2005).. Entre los diferentes tipos de estrés abiótico, la salinidad, la sequía y las bajas temperaturas son de las principales causas que limitan la productividad de cultivos en el mundo (Boyer, 1982; Araus y col., 2008; Munns y Tester, 2008). Investigaciones previas, han estudiado los diferentes mecanismos de respuesta a estrés tanto en sistemas modelo, particularmente Arabidopsis thaliana, como en cultivos de interés agronómico. Esto ha sido un punto de partida para el desarrollo de nuevas aproximaciones biotecnológicas de mejora genética, que permitan desarrollar nuevas variedades con mayor producción bajo condiciones de estrés abiótico.. 1.3.2.- Efectos de la salinidad, las bajas temperaturas y la sequía sobre el crecimiento de la planta. La exposición de las plantas a estreses medioambientales como salinidad, sequía y bajas temperaturas causan efectos adversos sobre el crecimiento de plantas y la productividad de cultivos. Estos efectos adversos se deben a alteraciones morfológicas y fisiológicas, a partir de cambios en procesos como la división celular y el metabolismo incluyendo fotosíntesis (Saibo y col., 2009). Las condiciones medioambientales pueden afectar a mecanismos específicos. La salinidad afecta a procesos como el crecimiento, la fotosíntesis, la síntesis de proteínas, y el metabolismo de lípidos. Además, causa efectos hiperosmóticos e hiperiónicos que producen la muerte de la planta. La fase inicial del estrés salino es atribuida a un choque osmótico, similar al estrés causado por exceso de agua, y que es probablemente constituida por un fuerte ajuste osmótico. La segunda fase presenta un periodo más. 12.

(39) Introducción General. extenso en la que se produce toxicidad por iones debido a su acumulación. Además, la salinidad causa problemas a nivel celular: i) alteración del equilibrio iónico, influenciado por la dispersión de Na+; ii) toxicidad de Na+ sobre el metabolismo celular, ya que tiene un efecto deletéreo sobre el funcionamiento de algunas enzimas (Niu y col., 1995); iii) alta concentración de Na +, causa desbalance osmótico, desorganización de membrana, reducción en el crecimiento e inhibición de la expansión celular, reducción de la fotosíntesis y producción de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Peleg y col., 2012; Yeo, 1998). Por último, la salinidad causa efectos significativos sobre el desarrollo, reducción en el tamaño de brotes, altura de la planta, número de hojas por planta y longitud de la raíz (Mohammad y col., 1998). Muy diferentes son los efectos observados en respuesta a bajas temperaturas como por ejemplo: reducción en la expansión de la hoja, marchitamiento, clorosis y necrosis. El estrés por bajas temperaturas afecta al desarrollo reproductivo en el momento de la antesis, produciendo esterilidad en las flores. Además, produce daños a nivel de membrana (Steponkus y col., 1984, 1993), causa principal de una fuerte deshidratación asociada al frío (Mahajan y Tuteja, 2005). Por otra parte, el estrés por bajas temperaturas induce un número de alteraciones en los componentes celulares incluyendo, ácidos grasos insaturados (Crossins, 1994), glicerolípidos (Lynch y Thompsom, 1982), cambios en la composición de carbohidratos y proteínas, activación de canales de iones (Knight, 1996) y acumulación de sacarosa y otros azúcares simples que se generan con la aclimatación al frío y también contribuyen a la estabilización de la membrana (Mahajan y Tuteja, 2005).. En cuanto a los efectos causados por déficit hídrico o estrés por sequía, se presentan cambios fisiológicos y bioquímicos a nivel celular que incluyen, perdida de turgencia, cambios en la composición y fluidez de membrana y cambios en la concentración de solutos (Chaves y col., 2003). El estrés por sequía causa reducción en la actividad fotosintética por la disminución en la actividad de las enzimas fotosintéticas, acumulación de ácidos orgánicos, osmolitos y cambios en el metabolismo de carbohidratos. Estas moléculas que regulan el balance osmótico se acumulan en las células de la planta en respuesta al estrés y posteriormente son degradadas (Valliyodan y Nguyen, 2006; Tabaeizadeh, 13.

(40) Introducción General. 1998). Otros efectos fisiológicos de la sequía sobre la planta es la reducción del crecimiento, en particular, el crecimiento de brotes, debido a una disminución de la actividad de las quinasas dependientes de ciclinas (CDK) que causa reducción de la división celular (Shuppler y col., 1998). Por otra parte, el crecimiento de hojas es más sensible que el crecimiento de raíz. La reducción de la expansión de la hoja es beneficiosa para la planta bajo condiciones de déficit hídrico, debido a que se produce una reducción de la transpiración.. En último término, la sequía, la salinidad y las bajas temperaturas son limitaciones medioambientales que disminuyen la eficiencia fotosintética y afectan al crecimiento y a la productividad de plantas. Estos estreses interfieren con la fotosíntesis en diferentes puntos: difusión de CO 2, eficiencia del PSII, transporte electrónico, formación de ROS, contenido de ribulosa-1,5-bifosfato (RuBP) (dependiente de ATP y NADPH), actividad de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco) y foto respiración. También inducen el cierre de estomas (Wilkinson y col., 2001; Zhu, 2002; Chaves y col., 2003), disminuyen la asimilación de CO2 y consecuentemente reducen la tasa fotosintética (Figura 1.3). El control de la apertura estomatica es un proceso mediado por ABA y posiblemente por otras señales generadas en respuesta a estrés abiotico. Tanto las bajas temperaturas como el deficit hidrico pueden, por diferentes razones, disminuir la sintesis de RuBP que depende de las concentraciones de ATP y NADPH y la actividad de las enzimas del ciclo de Calvin, reduciendo la fotosíntesis y la tasa de asimilación de CO2 (Saibo y col., 2009). Cuando la planta es expuesta a estos estreses medioambientales la disponibilidad de CO2 dentro de la hoja (Ci) es limitado y/o la síntesis de ATP disminuye, la actividad del ciclo de Calvin es reducido pero el PSII permanece activo, por lo que la concentración del aceptor final NADP+ es generalmente baja (Figura 1.3). Por otra parte, la inhibición de la fotosintesis, disfunción metabolica y daño en las estructuras celulares, desencadena una inhibición en la expansión celular que inhibe el crecimiento de la planta, acelerando el desarrollo y senescencia (Chinnusamy y col., 2006; Krasensky y Jonak, 2012; Mahajan y Tuteja, 2005). Bajo estos efectos, una disminución del cultivo es debido a una senscencia prematura en los diferentes tejidos de la planta ya que reducen el crecimiento y así el número los frutos (Albacete y col., 2014). 14.

(41) Introducción General. 1.3.3.- Respuesta de la planta a la salinidad, las bajas temperaturas y la sequía.. Las plantas desarrollan una amplia variedad de mecanismos de respuesta y adaptación a los cambios medioambientales. Estos desencadenan múltiples mecanismos a nivel fisiológico, bioquímico, metabólico como molecular, que ayudan a mitigar los efectos impuestos por el estrés. Entender los mecanismos de respuesta a estrés es de vital importancia para diseñar nuevas estrategias que permitan mejorar la tolerancia de cultivos al estrés abiótico.. En respuesta a la salinidad las plantas desencadenan un ajuste osmótico crucial en la adaptación a este estrés, debido a que permite mantener la turgencia y bajar el potencial hídrico, manteniendo la actividad metabólica y activando el crecimiento cuando los niveles de sal disminuyen. La tolerancia a la salinidad se produce cuando la planta tiene la habilidad de recuperarse del estrés osmótico y mantiene el crecimiento y la fotosíntesis durante periodos prolongados. Las plantas toleran la salinidad del suelo a partir de tres grandes mecanismos: la exclusión de Na+, tolerancia del tejido al Na+ y tolerancia osmótica (Munns y Tester, 2008; Plett y Moller, 2010). Sin embargo, el impacto de cada uno de los mecanismos varía dentro de cada especie y durante el ciclo de vida de la planta (Peleg y col., 2012). Por otra parte, diferentes estudios han mostrado que Ca2+ juega un rol importante en la tolerancia a la salinidad. La aplicación de Ca2+ de forma externa reduce los efectos tóxicos del NaCl. Una alta salinidad incrementa los niveles de Ca2+ en el citosol que es transportado desde el apoplasto a los compartimentos intracelulares (Knight y col., 1997).. Este incremento transitorio de Ca2+ en el citosol inicia la señal por el estrés y la transducción para la adaptación al estrés. Una de las mayores consecuencias del estrés por NaCl es la perdida intracelular de agua. Para contrarrestar esta pérdida de agua y proteger las proteínas celulares, las plantas acumulan metabolitos conocidos como “solutos compatibles”. Estos no inhiben las reacciones metabólicas normales (Ford y col., 1984). Entre los metabolitos observados que facilitan el ajuste osmótico se encuentran: azúcares como fructosa, sacarosa, alcoholes y otros azúcares como trehalosa (Delauney y col., 1993).. 15.

(42) Introducción General. Figura 1.3. Esquema de los mecanismos relacionados con la fotosíntesis que pueden ser afectados por la salinidad, la sequía y las bajas temperaturas. Las flechas azules y marrónes corresponden a las señales por sequía, salinidad y bajas temperaturas respectivamente. Condiciones ambientales adversas que causa estrés osmótico inducen cierre estomático, limitando la tasa de asimilación de CO2. El ácido abscísico (ABA) está involucrado en la respuesta a salinidad y sequía y puede mediar algunos efectos por bajas temperaturas. Las flechas gruesas representan la señal a la que contribuye. Las líneas discontinuas representan las posibles interacciones. Fotosistemas I (PSI), Fotosistema (PSII), especies reactivas al oxigeno (ROS), 3-fosofoglicerato (3PGA), ribulosa-1,5bifosfato (RuBP), fosfoglicolato (PG), factor de acoplamiento (FC), concentración interna de CO2 (Ci), concentración de CO2 en el cloroplasto (Cc). Adaptado de Saibo y col., 2009.. La exposición de las plantas a las bajas temperaturas resulta en una serie de cambios fisiológicos y bioquímicos. El primer cambio influye en la fluidez de la membrana celular y en la composición de ácidos grasos (Murata y Los, 1997; Suzuki y col., 2001). Estos cambios producen un incremento del contenido de lípidos poliinsaturados esenciales para la supervivencia de la planta cuando es sometida al estrés, debido a los efectos negativos de las bajas temperaturas sobre los procesos metabólicos de la membrana así como la respiración y fotosíntesis (Cossins, 1994). La exposición al frío también induce la acumulación de otras proteínas que no están localizadas en las membranas celulares, y que en algunos casos tienen un rol de protección (Bae y col., 2003; Gao y col., 2009). El contenido de azúcares también 16.

(43) Introducción General. es alterado en la planta en respuesta a bajas temperaturas. Diferentes estudios han encontrado una alta correlación entre los niveles de azúcares y la tolerancia al frío en diferentes especies (Guy y col., 1992; Sasaki y col., 1996; Sundblad y col., 2001). Finalmente, la exposición a bajas temperaturas desencadena cambios estructurales en la planta, como modificaciones en la composición de la pared celular (Wei y col., 2006). La exposición de las plantas a una limitación de agua durante varios estadios del desarrollo desencadena diferentes cambios fisiológicos durante su crecimiento. Estudios recientes han permitido dilucidar los mecanismos de tolerancia a sequía en plantas, a través de aproximaciones moleculares y genómicas con las que se han identificado un número determinado de genes que responden a la sequía a nivel transcripcional (Seki y col., 2002; Guo y col., 2009). Las plantas responden rápidamente para prevenir que la maquinaria fotosintética sufra daños irreversibles. La primera respuesta al déficit hídrico es el cierre estomático para prevenir la perdida de agua por transpiración (Mansfield y col., 2005; Osakabe y col, 2014). El ABA se acumula en el tejido de las plantas sometidas a estrés hídrico y promueve la reducción de la transpiración vía cierre estomático. A través de estos mecanismos, las plantas minimizan la perdida de agua y disminuyen el daño causado por el estrés (Mahajan y Tuteja, 2005). Bajo condiciones severas de sequía también se detecta una disminución de la actividad de la enzima Rubisco. La actividad fotosintética mediada por la cadena de transporte electrónico es ajustada por la disponibilidad de CO2 en la planta y en el fotosistema II (PSII), que disminuye en paralelo bajo condiciones de sequía. Esto indica que la disminución en la tasa fotosintética bajo estrés por sequía es debida principalmente por la deficiencia de CO2 (Loreto y col., 1995; Mahajan y Tuteja, 2005). Por otra parte, las plantas superan el déficit hídrico a través del ajuste osmótico que producen determinados procesos metabólicos. La acumulación de solutos en la célula derivado de estos procesos disminuyen el potencial osmótico facilitando la resistencia a la deshidratación celular y manteniendo la turgencia de la hoja (Ramanjulu y col., 2002; Mahajan y Tuteja, 2005). Estudios recientes han mostrado que la acumulación de azúcares simples como glucosa y fructosa permiten un aumento en la actividad invertasa en hojas de plantas sometidas al estrés por déficit hídrico (Pinhero y col., 2011). 17.

(44) Introducción General. 1.3.4.- Respuesta metabólica al estrés por salinidad, bajas temperaturas y sequía.. La amplia diversidad metabólica en plantas es producto de los continuos procesos de evolución. En la actualidad, se conocen más de 200.000 metabolitos secundarios que participan en gran número de funciones. Las condiciones ambientales afectan el crecimiento de la planta, y el metabolismo está profundamente involucrado en la señalización y en la regulación fisiológica. El estrés abiótico afecta a la biosíntesis, acumulación, transporte y almacenamiento de los metabolitos primarios y secundarios (Fraire y Balderas, 2013). Uno de los mecanismos de defensa de las plantas frente al estrés abiótico es la producción y acumulación de solutos compatibles. Entre los osmoprotectores de bajo peso molecular producidos encontramos amino ácidos (asparagina, prolina y serina), aminas (poliaminas y glicinbetaina), y ácido γ-amino butírico (GABA). Además, otros azúcares son producidos como: fructosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, y polioles (myo-inositol, D-pinitol) (Krasensky y Jonak, 2012; Banu y col., 2010) y otros grupos de antioxidantes como glutatión (GSH) y ascorbato que son acumulados en respuesta a estrés oxidativo (Shabrawi y col., 2010; Phang y col., 2008).. Recientes estudios han mostrado que algunos solutos compatibles han sido conservados a lo largo de la evolución (bacterias, plantas y algas) en respuesta a sequía. Análisis metabólicos con cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-MS) confirman que el musgo Physcomitrella patens presenta una acumulación de solutos compatibles en respuesta a sequía. En este estudio un grupo determinado de metabolitos (maltitol, L-prolina, maltosa, isomaltosa y acido butírico) son diferencialmente afectados, y presentan características similares a los reportados previamente en plantas de Arabidopsis sometidas a déficit hídrico (Erxleben y col., 2012). En respuesta a salinidad importantes rutas metabólicas están implicadas. Perfiles metabólicos realizados en plantas de tabaco sometidas a varios tratamientos de salinidad (50mM de NaCl) han mostrado una acumulación de sacarosa y fructosa vía gluconeogénesis en periodos cortos de tratamiento. Sin embargo, a mayor concentración de sal (500mM de NaCl) durante periodos más largos. 18.

(45) Introducción General. (días) los niveles de prolina, sacarosa y a su vez de glucosa y fructosa son elevados demostrando, que la ruta de biosíntesis de azúcares y prolina son mecanismos metabólicos producidos en la respuesta a salinidad en periodos de tiempo (cortos-lagos) (Zhang y col., 2001; Fraire y Balderas, 2013). Estos estudios demuestran que la respuesta metabólica al estrés salino es variable y depende del género, especie y cultivar.. 1.3.5.- Respuesta metabólica al estrés por salinidad, bajas temperaturas y sequía en tomate. En tomate, la respuesta metabólica frente al estrés abiótico involucra una serie de adaptaciones bioquímicas y fisiológicas, que ayudan a mitigar el efecto causado por el estrés. Diferentes compuestos (prolina, azúcares solubles, azúcares alcoholes y compuestos de amonio cuaternario) son acumulados en respuesta a sequía, salinidad y bajas temperaturas (Parvanova y col 2004; Gong y col., 2010). La mayoría de estos, están involucrados en el metabolismo secundario y presentan algunas diferencias y conexiones entre el los diferentes tipos de estrés abiótico (Gong y col., 2010).. Estudios realizados en plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan el gen ERD15 de S. pinennelli han mostrado un incremento en la tolerancia a bajas temperaturas y sequía. Estas plantas presentan un aumento en los contenidos de prolina y azúcares solubles. Además, muestran cambios en el contenido de malondialdehido (MDA) un biomarcador del estrés oxidativo indicando que la sobreexpresión del SpERD15 en tabaco confiere una acumulación de solutos compatibles y aumenta la estabilidad de membrana bajos diferentes tipos de estrés abiótico (Ziaf y col., 2011). Por otra parte, la sobre-expresión de un FT zinc finger de tomate ZF2 incrementa los niveles de expresión de un grupo de metabolitos secundarios involucrados en la biosíntesis de poliaminas, alcaloides y compuestos fenólicos son cruciales para la adaptación a condiciones medioambientales, ya que mantienen la actividad fotosintéticas y biosíntesis/señalización de hormonas (Hichri y col., 2014). Por último, Albacete y col., (2014), ha descrito que la interacción entre el metabolismo de la sacarosa y los factores hormonales. 19.