Actividad Antimicrobiana y Caracterización Química del Aceite Esencial de Ulex Europaeus L (Fabaceae)

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Texto completo

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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE)

CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ D.C.

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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE)

CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN.

Trabajo de Grado presentado como requisito para optar al título de Licenciado en Química.

Director:

WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA QUÍMICO, MAGISTER EN CIENCIAS AMBIENTALES

MAGISTER INVESTIGACIÓN EDUCATIVA

Codirector:

JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ

LICENCIADO EN QUÍMICA, ESPECIALISTA EN ANÁLISIS QUÍMICO INSTRUMENTAL, MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS CON ÉNFASIS EN

FITOQUÍMICA

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ D.C.

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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE)

CAMILO ALEXANDER PARRA GARZÓN Aprobado

_______________________________________ ANTONIO GUZMÁN AVENDAÑO M.Sc. (Jurado)

______________________________________________________ WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA M.Sc. (Director)

________________________________________________ JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ M.Sc.

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AGRADECIMIENTOS

El autor expresa sus más sinceros agradecimientos a:

Mis padres, Jairo Alberto Parra Herrera y Olga Cecilia Garzón Rodríguez por darme la vida, por sus continuos e incansables esfuerzos y sacrificios que durante muchos años han hecho para que pueda lograr y alcanzar mis metas, a ellos mi más eterno agradecimiento, lealtad y amor incondicional. A mi hermano Diego Alberto Parra Garzón, por enseñarme que aunque la vida nos golpea fuerte y nos pone obstáculos que creemos insuperables, siempre nos muestra la salida y nos permite avanzar con pasos firmes día a día y por último a mi hermana Solanyi Jorleth Zapata por todo su apoyo, colaboración y amor.

A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, y cada uno de los Docentes y compañeros de estudio que me brindaron sus conocimientos y enseñanzas durante estos largos años, por ser mí segundo hogar, al docente Oscar Rodríguez de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por su apoyo y colaboración con la actividad antimicrobiana, a todos y cada uno de los docentes que me apoyaron en mi proceso de formación, especialmente a la profesora Adis Ayala Fajardo.

Al Profesor Javier Andrés Matulevich Peláez de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, a quien considero mi segundo padre, mi amigo, mi mentor y ejemplo a seguir, a él expreso mi más profunda gratitud, admiración, lealtad y apoyo incondicional.

Al Profesor William Fernando Castrillón Cardona de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, quiero expresar toda mi gratitud por su confianza, por sus enseñanzas, por su apoyo, su amistad, a él mi gratitud y lealtad.

A mis apreciados compañeros de trabajo; Profesor Orlando Báez Parra y profesor Néstor Fabián Bravo Piñeros por su confianza, consejos, regaños, pero en especial por su amistad y apoyo.

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ... 1

INTRODUCCIÓN ... 3

JUSTIFICACIÓN ... 6

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ... 8

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ... 9

OBJETIVOS ... 9

OBJETIVO GENERAL. ... 9

OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ... 9

1 ESTADO ACTUAL DEL TEMA ... 10

1.1 Aceites esenciales ... 10

1.2 Familia Fabaceae ... 11

1.2.1 Características morfológicas de la familia Fabaceae. ... 11

1.2.2 Distribución y hábitat de la familia Fabaceae. ... 14

1.2.3 Usos etnobotánicos de la familia Fabaceae. ... 15

1.2.4 Estudios químicos y actividad biológica de la Familia Fabaceae. ... 16

1.3 Género Ulex. ... 20

1.3.1 Características morfológicas del género Ulex. ... 20

1.3.2 Distribución del género Ulex. ... 21

1.3.3 Etnobotánica del género Ulex. ... 23

1.3.4 Estudios químicos y actividad biológica del género Ulex. ... 23

1.4 Especie vegetal Ulex europaeus L. ... 25

1.4.1 Ulex europaeus L. ... 25

1.4.2 Distribución y hábitat de Ulex europaeus L. ... 26

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1.4.4 Etnobotánica de la especie Ulex europaeus L. ... 30

1.4.5 Estudios químicos y biológicos de la especie Ulex europaeus L. ... 30

1.5 Actividad antimicrobiana ... 33

1.5.1 Antimicrobianos ... 33

1.5.2 Métodos de evaluación antimicrobiana ... 34

2 METODOLOGÍA ... 37

2.1 Recolección y preparación del material vegetal ... 37

2.2 Extracción y caracterización del aceite ... 38

2.2.1 Extracción y caracterización química de los aceites esenciales por el método de arrastre con vapor ... 38

2.2.2 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas... 39

2.2.3 Análisis multivariado de los aceites esenciales extraídos de la especie vegetal Ulex europaeus L. ... 40

2.3 Extracción con etanol y fraccionamiento del extracto etanólico de las partes aéreas de Ulex europaeus L. ... 44

2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana ... 47

3 RESULTADOS Y ANÁLISIS. ... 49

3.1 Análisis Fitoquímico Preliminar (AFP) ... 49

3.2 Obtención del aceite esencial por el método de arrastre con vapor ... 50

3.3 Identificación de los componentes volátiles de los aceites esenciales ... 51

3.4 Análisis Multivariado ... 57

3.4.1 Análisis de Componentes Principales (ACP) ... 58

3.4.2 Análisis de Conglomerados Jerárquicos (ACJ) ... 64

3.5 Actividad Antimicrobiana ... 68

4 CONCLUSIONES ... 77

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6 BIBLIOGRAFÍA. ... 80

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Actividad biológica y química de algunas especies de la familia Fabaceae. ... 17

Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie vegetal Ulex europaeus L. ... 26

Tabla 3. Porcentaje de rendimiento calculado para cada extracción de aceite esencial

de la especie Ulex europaeus. ... 37

Tabla 4. Cepas de bacterias con las cuales se probó las fracciones del extracto

etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L. ... 48

Tabla 5. Resultados del Análisis Fitoquímico Preliminar de partes aéreas de la especie

vegetal Ulex europaeus L. ... 49

Tabla 6. Totalizado de los compuestos químicos reportados por CG-EM de los aceites

esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L. ... 51

Tabla 8. Totalizados de los porcentajes de área aportados por los compuestos

obtenidos por el análisis de CG-EM, de los aceites esenciales de la especie vegetal

Ulex europaeus L. ... 55

Tabla 9. Matriz de correlaciones ACP de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex

europaeus L. Análisis de los valores y vectores propios de la matriz de correlación. ... 59

Tabla 10. Determinación de la masa crítica de inhibición por cada fracción frente a las

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Clasificación de las hojas de las fabáceas ... 11

Figura 2. Caracterización morfológica de las Fabaceaes ... 13

Figura 3. Distribución de la familia Fabaceae a nivel mundial ... 14

Figura 4. Descripción morfológica de las especies pertenecientes al género Ulex ... 21

Figura 5. Distribución del género Ulex mundialmente. ... 22

Figura 6. Distribución de especies de Ulex por países en la flora mundial ... 22

Figura 7. Especie vegetal Ulex europaeus L. ... 25

Figura 8. Distribución mundial de la especie vegetal Ulex europaeus L ... 27

Figura 9. Mapa de la distribución de la especie vegetal Ulex europaeus L ... 28

Figura 10. Descripción morfológica de la especie vegetal Ulex europaeus L ... 29

Figura 11. Metodología MFP de las partes aéreas de Ulex europaeus L ... 45

Figura 12. Diagrama de Fraccionamiento Líquido-Líquido Discontinuo del extracto etanólico de Ulex europaeus L ... 46

Figura 13. Cromatogramas de los nueve perfiles de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L ... 56

Figura 14. Scree Plot de los nueve perfiles cromatográficos de los aceites esenciales de Ulex europaeus L. ... 58

Figura 15. Diagrama de dispersión de datos en los componentes principales (CP1 y CP2), para cada uno de los compuestos químicos encontrados en los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L ... 60

Figura 16. Gráfica de cargas para dispersión de la varianza aportada por los componentes principales de los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L. ... 63

Figura 17. Dendograma de Conglomerados Jerárquicos de los nueve perfiles de aceites esenciales teniendo en cuenta la similitud entre los perfiles ... 65

Figura 18. Dendograma de Conglomerados Jerárquicos de los perfiles de aceites esenciales asumiendo 5 conglomerados de similitud. ... 66

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Figura 20. Masa crítica de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico

frente Staphylococcus aureus.. ... 71

Figura 21. Relación entre halos de inhibición (mm) por concentración (µg/mL) de cada

fracción frente a las cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus. ... 72

Figura 22. Gráfica de varianzas iguales para las fracciones frente a cada una de las

cepas ensayadas. ... 73

Figura 23. Varianza de la media de halos de inhibición para cada una de las fracciones

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LISTA DE ABREVIATURAS ACJ Análisis de Conglomerados Jerárquicos AcOEt

Hex

Acetato de etilo Hexano

ACP Análisis de Componentes Principales AFP Análisis Fitoquímico Preliminar

ButOH CH2Cl2

CG - EM

Butanol

Diclorometano

Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas CP Componentes Principales

DMSO Dimetil Sulfóxido

EM Espectrometría de masas IE Ionización Electrónica IR Índice de retención

M Metros

m.s.n.m Metros sobre el nivel del mar MBC Concentración Mínima Bactericida MIC Concentración Mínima Inhibitoria ml Mililitros

mm Milímetros

TIC Corriente Iónica Total u.m.a Unidades de Masa Atómica Μg Microgramos

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1 RESUMEN

El presente trabajo de investigación describe los resultados del estudio fitoquímico y biológico realizado con los aceites esenciales y el extracto etanólico de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L. (Fabaceae) clasificada en el Herbario Nacional Colombiano bajo el número de colección COL 596977 con el propósito de contribuir a las investigaciones realizadas a la familia Fabaceae, al género Ulex y en particular a la especie vegetal, ya que esta especie cuenta con pocos estudios fitoquímicos.

Fueron obtenidos los componentes volátiles procedentes de la extracción de nueve aceites esenciales por la técnica de arrastre con vapor a partir de las partes aéreas frescas, bajo las mismas condiciones de extracción; la caracterización química de éstos se realizó por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM), comparación de los índices de retención, los espectros de masas y los datos reportados en la literatura, donde se pudo determinar eicosano; 8-hexilpentadecano; ácido decanoíco; β-Citronelol; D-Isomentol y tetracosano, como los componentes que presentaron el mayor porcentaje de composición relativa en los aceites extraídos.

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La actividad antimicrobiana fue ensayada a 4 fracciones (hexano, diclorometano, acetato de etilo y butanol) obtenidas a partir del extracto etanólico de las partes aéreas

de Ulex europaeus L., las cuales fueron evaluadas frente a dos cepas de bacterias,

siguiendo el método de difusión en gel por perforación en placa; frente a Escherichia

coli, la fracción de hexano inhibió el crecimiento de la bacteria con una masa crítica de

181.60; la fracción de acetato de etilo inhibió la bacteria con una masa crítica de 216.59; la fracción de diclorometano no presento actividad antimicrobiana; la fracción de butanol inhibió el crecimiento de la bacteria con una masa crítica de 246.14 y frente

a Staphylococcus aureus, todas las fracciones (hexano, acetato de etilo, diclorometano

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INTRODUCCIÓN

Desde tiempos remotos las plantas han sido catalogadas como recurso y fuente de muchas necesidades humanas, debido a sus propiedades, características físicas y químicas, como fuente de alimentos (algunos tallos, hojas, raíces y frutos), con fines terapéuticos y medicinales (todas las partes de la planta). Las plantas son uno de los mayores contribuyentes a nivel económico del país y del mundo, debido a que muchas de estas se emplean en la industria farmacéutica con miras al desarrollo científico en el avance de la medicina y la ciencia; para la producción de medicamentos, fragancias, entre otros usos.

Colombia cuenta con un sistema montañoso prodigioso, por estar ubicada dentro del sistema de montañas de los andes, gracias a esto posee todos los pisos térmicos y más de un 44% de los páramos de Suramérica. En relación a ello se pueden apreciar ecosistemas como bosques, sabanas, desiertos, selvas, pantanos, manglares, montañas y llanuras, que permiten la existencia de cientos de especies endémicas tanto animales como vegetales, siendo éstas últimas, unas 45.000 especies en Colombia, cuyos estudios prometen ser una fuente potencial de sustancias naturales de gran variedad química, que promueven el desarrollo tecnológico y científico con el fin de proporcionar tratamientos eficientes para la cura de enfermedades entre otros fines comerciales e industriales que se le pueden dar a las plantas (Shi et al., 2001; Proyecto páramo andino, s.f.).

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Estudios fitoquímicos bioguiados y de actividad biológica, han permitido la extracción, aislamiento, caracterización y síntesis de metabolitos secundarios que favorecen elaborar medicamentos con base en principios activos identificados en el material vegetal, salvando millones de vidas humanas (Shi et al., 2001) y combatir muchos de estos agentes patógenos microscópicos que han sido causales de incontables muertes.

Uno de los recursos naturales más valiosos del planeta, es sin duda, las plantas por su gran riqueza en metabolitos secundarios de donde derivan muchos de los compuestos que actualmente se usan para producir medicamentos, fármacos, productos de belleza, etc. De allí que sea importante el estudio de la flora del planeta y concretamente de Colombia, puesto que allí se encuentra cerca del 10% de especies vegetales del mundo.

La familia de las fabáceas (Fabaceae) a la cual pertenece la especie objeto de la presente investigación, es una de las familias más representativas a nivel de plantas, siendo ésta la segunda familia de plantas medicinales; tiene cerca de 730 géneros y alrededor de 19.400 especies, la mayoría de estas empleadas en la medicina tradicional y de las cuales, 31 especies pertenecen a los cerca de 20 géneros de la familia entre los que se encuentran las plantas empleadas como materia prima de medicinas y fármacos (Gao et al., 2010).

Sin embargo, muchas de estas plantas, no son estudiadas con el fin de determinar su utilidad a nivel farmacológico; por ejemplo la especie vegetal Ulex europaeus L.

perteneciente a la familia Fabácea, género Ulex, conocido como retamo espinoso, pica-pica, espino alemán, yáquil, aliaga, maticorena, corena, cachai, tejo, espinillo (Matthei, 1995), se conoce como gorse y furze en Gran Bretaña, Nueva Zelanda y Estados Unidos.

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además de ser empleado como delimitador de áreas (cercas vivas) dada su principal característica evolutiva (presenta espinas como remplazo de las hojas).

Estudios de carácter científico han revelado algunas aplicaciones a nivel médico por ejemplo en el tratamiento y reconocimiento de grupos sanguíneos con el fin de contribuir a la prevención de algunas enfermedades de la sangre (Pestean et al., 1995) y en la determinación genética de la especie vegetal en particular, además de ello, ha sido catalogado como especie invasora, y se ha reglamentado su manejo por parte de la Corporación Autónoma Regional (CAR, 2010), sin embargo no se han realizado los estudios fitoquímicos pertinentes que permitan determinar la utilidad de la especie vegetal a nivel biológico u otro uso. Es por lo descrito anteriormente que el presente trabajo se orientó al estudio de metabolitos volátiles de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L., y la evaluación de la actividad antimicrobiana de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico frente a las cepas de bacterias

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JUSTIFICACIÓN

La especie Ulex europaeus L, es nativa de Europa y África pero se ha distribuido a nivel mundial, bien sea como planta introducida o por su proliferación. Es una planta que posee un alto grado de propagación, razón por la cual ha tenido un alto impacto en el continente americano, ya que la especie ha conseguido poblar la mayoría de ecosistemas, convirtiéndose en una plaga o especie invasora, para lo cual se implementan planes de gestión y erradicación de la especie vegetal en especial para Colombia y en concreto en los Cerros Orientales del país, la CAR emitió un decreto mediante el cual se prohíbe la plantación, comercialización, distribución, etc., de la especie, sin tenerse en cuenta los aportes a nivel químico o biológico que pueda tener ésta. (CAR, 2010).

La especie vegetal Ulex europaeus L., no cuenta con los adecuados estudios de carácter químico o biológico en Colombia, que permitan establecer un aprovechamiento de la planta, por el contrario, la mayoría de investigaciones en torno a la especie radican en el manejo, distribución y erradicación de la especie vegetal (Muñoz, 2009; Normabuena & Escobar, 2000; Pabón, 2013).

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En cuanto a la composición química volátil de la especie se han encontrado escasos reportes en literatura por ejemplo (Lopez-Hortas et al., 2016; (Cao et al., 1997), pero ningún estudio en particular de los componentes volátiles de la especie a nivel nacional. La importancia del estudio de las especies vegetales cuyas propiedades biológicas únicas confieren a los seres vivos y a la naturaleza innumerables beneficios, en particular por los aportes a nivel biológico sobre el ser humano en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo y como caso particular, la especie vegetal Ulex europaeus L. contribuye al tratamiento de reumatismos y afecciones hepáticas (Menendéz, 2007).

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PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

El presente proyecto fue desarrollado al interior del Grupo de Investigación de Productos Naturales Vegetales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas bajo el título: ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Ulex europaeus L. (FABACEAE), estudio con el cual se caracterizaron los compuestos químicos volátiles mayoritarios presentes en las partes aéreas de la especie vegetal y se evaluó la actividad antimicrobiana de las fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico de la misma, frente a las cepas de bacterias Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

Estudios realizados a la especie vegetal han reportado algunos carotenoides (Schon, 1936), chalconas y glicósidos flavonólicos (Harborne, 1962), estudios de biocontrol (Normabuena & Escobar, 2000), algunos alcaloides e isoflavonas (Russell et al., 1990), metabolitos a los cuales podría atribuirse la actividad antimicrobiana tal y como lo reportan Ruiz & Roque (2009) en su estudio, donde el análisis fitoquímico preliminar de las especies estudiadas allí, revela la presencia de flavonoides y alcaloides; algunos estudios bioquímicos como afimran (Pestean et al., 1995).

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FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

De acuerdo con lo expuesto anteriormente se plantea la siguiente pregunta de investigación:

¿Cuál es la composición química de los aceites esenciales extraídos de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L? ¿Presentan actividad antimicrobiana las fracciones del extracto etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L?

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL.

Contribuir al estudio fitoquímico de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex

europaeus L (Fabaceae) y evaluar la actividad antimicrobiana frente a las cepas de

bacterias: Escherichia coli (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

• Identificar de manera cualitativa a través de Marcha Fitoquímica Preliminar los posibles grupos de metabolitos secundarios presentes en las partes aéreas de la especie vegetal.

• Extraer los aceites esenciales de las partes aéreas de la especie vegetal Ulex

europaeus L, empleando el método de arrastre con vapor y caracterizar

químicamente los aceites esenciales extraídos mediante análisis por CG-EM.

• Realizar un análisis estadístico mediante Análisis de Componentes Principales y Análisis de Conglomerados Jerárquicos, los compuestos químicos obtenidos en los aceites esenciales.

• Evaluar la actividad antimicrobiana de cuatro fracciones de polaridad creciente del extracto etanólico frente a las cepas de bacterias: Staphylococcus aureus y

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1 ESTADO ACTUAL DEL TEMA

1.1 Aceites esenciales

Se le conoce por aceites esenciales, al destilado mediante vapor de agua de la planta que se ha seleccionado para efectuar el proceso de extracción de los metabolitos volátiles que hacen parte de ellas. Los aceites esenciales son una mezcla de componentes volátiles producto del metabolismo secundario de las plantas, donde intervienen hidrocarburos de tipo terpeno junto con otros compuestos casi siempre oxigenados y que son los que le confieren a los aceites esenciales de las plantas los aromas característicos (Stashenko et al., 2003). Generalmente el proceso se realiza con vapor de agua, ya que si se realiza con solventes orgánicos, los metabolitos pueden solubilizarse en el solvente y perderse en el proceso de evaporación natural del solvente, en la medida, que lo que se quiere extraer son aceites, es relevante que el solvente empleado para tal fin sea de polaridad contraria al producto que se desea obtener. Los aceites esenciales tienen diversos usos, con base a su actividad biológica, como por ejemplo, son empleados en la producción de fragancias para perfumes, aditivos para alimentos, antiinflamatorios, antimicrobianos, antioxidantes, antifúngicos, insecticidas, etc., como lo expresan (Gómez et al., 2013; Chaverri & Cicció, 2015; (Fuentes et al., 1998) quienes han reportado diferentes tipos de compuestos extraídos de los aceites esenciales de diferentes especies vegetales pertenecientes a la familia fabácea.

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11 1.2 Familia Fabaceae

1.2.1 Características morfológicas de la familia Fabaceae.

La familia de las fabáceas o leguminosas, son una familia del orden de las fabales. Se caracteriza por tener plantas herbáceas, trepadoras, arbóreas o arbustivas, anuales o perennes, con hojas muy variadas, simples o compuestas (figura 1), éstas últimas trifoliadas, pinnadas o digitadas. En ocasiones se encuentran reducidas a zarcillos, transformadas en espinas o ausentes. Con frecuencia presentan estípulas. Poseen flores hermafroditas, normalmente muy vistosas, adaptadas a la polinización por insectos.

Figura 1. Clasificación de las hojas de las fabáceas. (Herrera, 2008)

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La raíz de las fabáceas presenta un predominio del sistema primario, es decir, de aquel que proviene de la radícula de embrión. Su sistema radical es normalmente pivotante. Las raíces de las leguminosas son a menudo profundas y casi siempre presentan nódulos simbióticos poblados de bacterias del genero Rhizobium que asimilan el nitrógeno atmosférico.

Las flores pueden ser desde pequeñas o grandes, actinomorfas, como ocurre con las papilionóideas y en la mayor parte de las cesalpinióideas. Las irregularidades en la simetría floral en estos casos involucran al perianto y al androceo. El receptáculo de la flor desarrolla un ginóforo se encuentra fusionado al hipanto en las cesalpinióideas, con forma de cúpula. El hipanto puede estar presente o ausente, en este último caso está remplazado por el tubo del cáliz, como es el caso en la mayoría de las fabóideas.

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Figura 2. Caracterización morfológica de las Fabaceaes. Fuente: http://www.elmundoforestal.com/terminologia/leguminosas.html

Como se ha mencionado, las fabáceas realizan el proceso de fijación de nitrógeno atmosférico mediante bacterias simbiontes tales como Allorhizobium, Rhizobium, etc,

elemento que está presente en nódulos radicales lo cual es una característica que

presentan muchas leguminosas (Aizpuru et al., 1993). Se clasifican acorde al sistema de clasificación de Cronquist; encontrándose distribuida en tres subfamilias diferentes, la familia Mimosaceae, Caesalpinaceae y Fabaceae, en ésta última se encuentran las papiledoneas donde se distribuye el género Ulex.

Estípula Inflorescencias

solitarias

Inflorescencias

terminales

Fruto leguminoso

Inflorescencias

Ápice

oblongado

Tallo

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1.2.2 Distribución y hábitat de la familia Fabaceae.

La familia se distribuye de manera cosmopolita, es decir, a nivel mundial se encuentran plantas pertenecientes a la familia. Los árboles son más frecuentes en las regiones tropicales, mientras que las hierbas y los arbustos dominan en las extratropicales. En particular la familia Fabaceae se encuentra ampliamente extendida en zonas boreales, templadas y tropicales. Por esta afinidad en sus características morfológicas, se encuentran en aproximadamente todos los hábitats, y frecuentemente son dominantes en las comunidades forestales en los que ocurren, presentando así un número de géneros en aproximadamente 730 y cerca de 19.400 especies a nivel mundial, por lo que se distribuye en casi todo el globo terráqueo como se indica en la figura 3.

Entre los múltiples géneros que tiene la familia, los más representativos son el

Astragalus con 2000 especies, el género Indigofera con cerca de 700, el Crotalaria con

alrededor de 90, el Desmodium con 400 y por último el Trifolium con cerca de 300 especies (Bonifacino, 2013).

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1.2.3 Usos etnobotánicos de la familia Fabaceae.

La familia Fabaceae presenta gran importancia a nivel económico, debido a que se emplean casi todas las especies bien sea con fines medicinales u ornamentales, como en el caso de Cytisus (retama), Erythrina (ceibo), Laburnum (lluvia de oro), Lathyrus

(guisante de olor), Lupinus, Robinia y Wisteria cuyos usos están enfocados a la ornamentación. Algunas especies del género Indigofera (índigo), se emplean industrialmente con el fin de extraer colorantes, azul generalmente. Otros géneros, por ejemplo, Dalbergia, Pterocarpus, son importantes fuentes de maderas de lujo. (Bonifacino, 2013).

Se han reportado algunos estudios que indican que algunas especies de Facaeaes se emplean como analgésicos, contra reumatismos y como diurético (Castañeda et al., 2017), algunos estudios indican que se emplean para tratar mordeduras de serpiente, dolores de cabeza, estomacales y prevenir la diabetes. (Zambrano-Intriago et al., 2015). Las hojas y frutos de Ceratonia siliqua L., se han empleado como antidiarreico y antitusivo (Carrió & Vallès, 2012); así como las semillas de Lens culinaris medic, para el tratamiento por deficiencia de hierro como lo reportan en el mismo estudio Carrió & Vallès, 2012).

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1.2.4 Estudios químicos y actividad biológica de la Familia Fabaceae.

La familia Fabaceae se caracteriza por la presencia de numerosas sustancias bioactivas de diversa naturaleza química en corteza, hojas y raíz. De esta familia se han caracterizado y reportado alcaloides, flavonoides y polifenoles. La bioactividad de este tipo de metabolitos de plantas está asociada a su efecto antidiabético, antiinflamatorio y antimicrobiano. (Martínez et al., 2011). Así mismo en la familia de las fabáceas se encuentran especies las cuales reportan diversos estudios a nivel fitoquímico como se indica en la tabla 1, las actividades mencionadas anteriormente, se pueden atribuir a algunas especies vegetales en concreto y a mencionar: Inga vera, Crotaina retusa,

Caesalpinia coriaria, Cassia fistula, Bauhinia variegata, otras especies pertenecientes a

la familia; la Erythrina falcata, reporta compuestos de tipo alcaloides, taninos, glicósidos antraquinónicos y flavonólicos, algunos de estos empleados por la población como sedantes (Almeida, 2008). Se han reportado sesquiterpenos, monoterpenos como componentes principales de los aceites esenciales de algunas especies vegetales pertenecientes a la familia (Chaverri & Cicció, 2015; Gómez et al., 2013).

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Tabla 1. Actividad biológica y química de algunas especies de la familia Fabaceae.

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Entre algunos de los compuestos encontrados para la familia fabácea se han reportado con respecto al grupo de metabolitos alcaloides en las semillas de la especie vegetal

Lupinus mexicanus tales como: lupanina (1), α-isolupanina (2), 3-β-hidroxilupanina (3),

multiflorina (4), afilina (5) y epiafilina (6) entre otros muchos que se han reportado para la familia de las fabáceas (Zamora et al., 2008). Así como se han encontrado alcaloides, también se han reportado algunos compuestos flavonoides, tales como: trihidroxisoflavona (7), tetrahidroxiflavona (8), catequina (9), quercetina (10) como posible antiinflamatorio (Matulevich & Gil-Archila, 2014), dihidroquercetina (11), miricetina (12), y dehidromiricetina (13) (Moreno et al., 2007). Así mismo, para el estudio de aceites esenciales se han reportado compuestos tales como: alcanfor (14), α-eudesmol (15), hexanal (16), 2-hexenal (17), pentadecanal (18), caprolactama (19), linalool (20), β-cariofileno (21), β-farneseno (22), β-Ionona (23) y α-pineno (24).

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(31)

20

(22) (23) O

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1.3 Género Ulex.

1.3.1 Características morfológicas del género Ulex.

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Figura 4. Descripción morfológica de las especies pertenecientes al género Ulex.Fuente: César Fernández González, 24/11/2014, Asturias, Parres, Alrededores de lla mina de Curiellu, Llerandi.

Dado que la mayoría de especies del género, presentan las mismas caracteristicas morfológicas, la descripción de los ejes y ramas principales, así como de las espinas, aplican para la mayoría de las especies.

1.3.2 Distribución del género Ulex.

El género Ulex, es uno de los géneros más recientemente estudiados, sin embargo, a nivel mundial son pocos los estudios que se ha realizado entorno a las especies pertenecientes a éste, a nivel mundial, se encuentra distribuido en América (norte, centro y sur), Europa (España y Francia), en África de Sur y en India como se indica en la figura 5, sin embargo en la figura 6 se presenta con mayor claridad que la mayor fuente de especies de éste género, se encuentran distribuidas en Colombia, hallándose alrededor de nueve especies.

Tallo

Inflorescencia

Hoja secundaria Hoja primaria (Alternada)

Vaina Fruto

Cáliz

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22

Figura 5. Distribución del género Ulex mundialmente. Los puntos amarillos indican los países en los cuales se encuentran especies pertenecientes al género Ulex. (Tropicos.org, 2015)

Como se ha mencionado, la variedad de pisos térmicos que ofrece Colombia, permite la proliferación de muchas especies vegetales de un alto valor económico, cultural y científico, en Colombia, se encuentran alrededor de nueve especies de Ulex, entre las que se encuentra una especie vegetal en particular Ulex europaeus L.

Figura 6. Distribución de especies de Ulex por países en la flora mundial. Los puntos amarillos indican los países donde se encuentran las especies pertenecientes al género Ulex. La tabla a la derecha indica la cantidad de

géneros que se encuentran por país, Colombia, como el país que mayor cantidad de especies de Ulex

(34)

23 1.3.3 Etnobotánica del género Ulex.

La mayoría de las especies pertenecientes al género Ulex, debido a sus características morfológicas (presentan espinas) son empleadas como delimitadores de zonas, es decir, se emplean como cercas que restringen el acceso a ciertas áreas, zonas o viviendas de las comunidades rurales.

Si bien el género es nativo de Europa y África, se ha logrado distribuir por algunas partes del mundo, debido a su alta capacidad de adaptación a cualquier clima y hábitat, presentando condiciones de invasión, debido a que en distintos países se ha introducido algunas especies con fines ornamentales, sin embargo, su alta capacidad de proliferación ha dado las condiciones para su alta distribución (Muñoz, 2009).

Hasta el momento, se han reportado alrededor de veinte especies pertenecientes al género, entre las cuales se encuentran Ulex airensis, Ulex argenteus, Ulex australis, Ulex boivinii, Ulex borgiae, Ulex canescens, Ulex cantabricus, Ulex densus, Ulex

eriocladus C. Vicioso, (endemismo ibérico), Ulex europaeus, Ulex jussiaei, Ulex gallii,

Ulex genistoides, Ulex micranthus, Ulex portuguese, Ulex minor y Ulex parviflorus,

muchas de estas especies, solo han sido clasificadas a nivel taxonómico y por lo tanto muchos de los aspectos químicos, biológicos del género se desconocen. (Máximo et al., 2006)

1.3.4 Estudios químicos y actividad biológica del género Ulex.

(35)

24

(36)

25 1.4 Especie vegetal Ulex europaeus L. 1.4.1 Ulex europaeus L.

La especie Ulex europaeus L, (figura 7) pertenece al género Ulex de la familia Fabaceae. Se le conoce con diferentes nombres en el mundo, entre los más representativos se encuentra el Gorse del inglés, en Portugal se le conoce como Tojo, en España como Toxo cachás, en Asturias se conoce como Coyota, árgoma, toxu, en el País Vasco se le conoce como otaka, otalera y en muchos países de Latinoamérica se le conoce como retamo espinoso o espinillo.

Figura 7. Especie vegetal Ulex europaeus L. (arbusto maduro con inflorescencias). Fuente: Castroviejo & al. (eds.), Flora ibérica (Real Jardín Botánico).

http://www.rjb.csic.es/floraiberica/ http://www.anthos.es

(37)

26

Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie vegetal Ulex europaeus L. Clasificación taxonómica Ulex europaeus L.

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Subclase Rosidae

Orden Fabales

Familia Fabaceae

Subfamilia Faboideae

Tribu Genisteae

Género Ulex L.

1.4.2 Distribución y hábitat de Ulex europaeus L.

(38)

27

Figura 8. Distribución mundial de la especie vegetal Ulex europaeus L. Los puntos rojos indican los países en los cuales se encuentra distribuida la especie vegetal. (Acuña, 2011)

En Colombia (ver figura 9) la especie se encuentra reportada en los departamentos de Boyacá, Santander, Cundinamarca, Cauca, Huila, Nariño, Tolima, Caldas y Risaralda (Acuña, 2011). Aunque la especie está distribuida por todo el país teniendo en cuenta que se adapta fácilmente a cualquier ecosistema.

(39)

28

Figura 9. Mapa de la distribución de la especie vegetal Ulex europaeus L., en Colombia.

Los puntos rojos, indican los departamentos donde se ha reportado la existencia de la especie. (Acuña, 2011)

1.4.3 Características morfológicas de la especie Ulex europaeus L.

(40)

29

aplanado lateralmente, es amarillento y tiene unos pelos gruesos y patentes; el labio superior de hasta 6 mm de anchura tiene 2 dientes y el inferior 3. La corola, amarilla, típica papilionácea de la familia, está formado por un estandarte y unas alas más largas que el cáliz, además de la quilla; el estandarte mide de 14 a 21 x 8 a 17 mm, las alas de 12 a 21 x 3 a 6.5 mm y la quilla de 11 a 16 x 4 a 7 mm. El androceo está formado por 10 estambres soldados para formar un tubo por el cual pasa el estilo y el gineceo por un ovario sentado y peloso del que sale un estilo curvado en la parte superior. El fruto es una legumbre pelosa de 10 a 20 x 5 a 7 mm cuyo contenido varía entre 2 y 8 semillas, como lo indica la figura 6-10.

Figura 10. Descripción morfológica de la especie vegetal Ulex europaeus L. Prof. Dr. Otto Wilhelm Thomé ''Flora von Deutschland, Österreich und der Schweiz'' 1885, Gera, Germany.

Bracteola Labio

superior

Inflorescencia

Semilla Fruto

Estambres soldado

Vista interna del fruto

Cáliz

Vista interna de la semilla

(41)

30

1.4.4 Etnobotánica de la especie Ulex europaeus L.

Son hasta el momento, muy pocos los estudios que se han realizado alrededor de la especie vegetal, reportan que las ramas y las flores contienen carotenoides y pigmentos flavónicos. Las vainas y las semillas contienen alcaloides hepatotóxicos. Las flores son diuréticas, siendo empleadas en reumatismos y afecciones hepáticas (Menendéz, 2007).

En la mayoría de poblados donde se encuentra la especie vegetal, se le emplea como cerca viva, dado que se desconoce sus características etnobotánicas.

1.4.5 Estudios químicos y biológicos de la especie Ulex europaeus L.

(42)

31

(43)
(44)

33 1.5 Actividad antimicrobiana

1.5.1 Antimicrobianos

Aproximadamente desde el siglo XVIII, el hombre ha empleado sustancias químicas con el fin de tratar y combatir enfermedades infecciosas. El reconocido Paul Ehrlich, fue quien formuló los principios de toxicidad selectiva, reconoció las reacciones químicas específicas entre microorganismos y medicamente, así como la aparición de la resistencia de estos y el papel de la terapéutica combinada para combatirlos. Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se acrecentó el interés en sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas antibióticos, de ahí surgen entonces las conocidas penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol y demás.

El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de diferentes maneras: puede llevarse a cabo por inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones de la membrana celular, además puede darse de la traducción de material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos (Manrique & Mosquera, 1977).

El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades y que afectan en sobremanera la salud, inclusive con riesgo de muerte. Los antibióticos pueden actuar de dos maneras:

(45)

34

• Como microbiostático, es decir, inhibe el crecimiento de microorganismos y se denomina entonces, bacteriostático o fungistático, refiriéndose a bacterias y hongos, respectivamente. (Barreto, 1997)

1.5.2 Métodos de evaluación antimicrobiana

Para lograr un correcto tratamiento de las infecciones provocadas por los microorganismos, fue necesario desarrollar técnicas apropiadas debido a que los microorganismos eran capaces de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado contra él durante un periodo largo de tiempo, esta resistencia puede ser producto de diversos mecanismos como:

• Producción de una sustancia que destruye el antibiótico.

• Adaptación del metabolismo bacteriano para inhibir el antibiótico.

• La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al antibiótico.

• Un fago comunica la resistencia por transducción.

• Desaparición de cepas sensibles y supervivencia de cepas resistentes por un fenómeno de selección natural.

• Producción de cepas mutantes, ya que para ello existen varias técnicas que permiten evaluar la actividad antimicrobiana, como lo son los métodos de dilución, de difusión en gel y el método de bioautografía. (Arévalo & Enciso, 1996).

1.5.2.1 Método de dilución

(46)

35

periodo de incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la existencia o no de turbidez. (Manrique & Mosquera, 1977).

1.5.2.2 Método de difusión en gel por perforación en placa

Este método consiste básicamente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico o el microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio, se adicione la contraparte y de esta manera observar la inhibición de crecimiento o halos de inhibición según la técnica utilizada. Esta técnica, también es conocida como discos de papel, en la cual el compuesto se incorpora a discos de papel absorbente en concentración conocida, los cuales se colocan sobre la superficie de una caja de agar sembrado masivamente con el microorganismo en estudio, luego de incubar a la temperatura y tiempo adecuados se observan halos de inhibición de crecimiento. (Arévalo & Enciso, 1996).

(47)

36 1.5.2.3 Método de bioautografía

Este método consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por cromatografías en capa fina en un medio de cultivo. Para ello se utilizan placas cromatográficas de sílica gel 60F 254 de MERCK o de celulosa las cuales se colocan en las cajas petri correspondientes. Es necesario que previamente sea eliminado el disolvente, con el fin de evitar falsas bandas de inhibición. (Manrique & Mosquera, 1977).

La bioautografía ha sido considerada como el ensayo más eficiente para la detección de componentes bactericidas, porque esta permite la localización de la actividad en un complejo matriz y por lo tanto permite un directo aislamiento de los constituyentes activos. Así pues, este ensayo se puede dividir en tres grupos:

1. Bioautografía directa: Donde los microorganismos crecen directamente sobre la capa fina cromatográfica.

2. Bioautografía de contacto: Donde los componentes bactericidas son transferidos e la fina capa cromatográfica y son inoculados en una caja de agar a través de contacto directo.

(48)

37

2 METODOLOGÍA

2.1 Recolección y preparación del material vegetal

Nueve especímenes del material vegetal fueron recolectados en el bosque de Monserrate (que hace parte del páramo del Sumapaz), ubicado en el barrio la perseverancia de Bogotá, (Coordenadas Geográficas latitud: 4°36’24.74”N y longitud: 74°3’52.27”O); en las fechas que se especifican en la tabla 3; los porcentajes de rendimiento obtenidos fueron entre 0.0208% y 0.0258%. Los individuos recolectados para cada extracción de aceites esenciales fueron seleccionados teniendo en cuenta que la planta se encontrará en proceso de floración, que presentara frutos y que todas las partes aéreas estuvieran frescas (flores, hojas, frutos). El material vegetal fue reducido de tamaño sin discriminar los órganos de la planta para la extracción de aceites esenciales. Por otro lado una muestra de 790g de material vegetal fue secada a temperatura ambiente y posteriormente molida para su extracción por maceración en frío con etanol (EtOH), y otra muestra testigo fue enviada al Herbario Nacional de Colombia para su identificación taxonómica la cual fue clasificada como Ulex europaeus L., bajo el número de colección COL 596977, identificada por el biólogo Carlos Alberto Parra.

Tabla 3. Porcentaje de rendimiento calculado para cada extracción de aceite esencial de la especie Ulex europaeus. Muestra Fecha de recolección Rendimiento (%)

(49)

38

El porcentaje de rendimiento de cada extracción fue determinado utilizando la

ecuación 1.

Ecuación 1. Porcentaje de rendimiento de aceite esencial de U. europaeus L.

% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒

𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙𝑥 100

El porcentaje se calculó teniendo en cuenta los mililitros (mL) de aceite esencial obtenido en cada extracción con respecto a la masa de material vegetal fresco recolectado en gramos (g).

2.2 Extracción y caracterización del aceite

2.2.1 Extracción y caracterización química de los aceites esenciales por el método de arrastre con vapor

Los aceites esenciales fueron obtenidos a partir de plantas frescas (450g en promedio) por arrastre con vapor, obteniéndose 0,1mL de aceite esencial con porcentajes de rendimiento entre 0.0208% y 0.0258%. La composición química de los aceites se determinó por CG-EM y la identificación se realizó a través del cálculo de los índices de retención (IR) y comparación con los espectros de masas almacenados en la librería NIST 08.

Los índices IR se calcularon teniendo en cuenta los tiempos de retención de una serie homologa de patrones de hidrocarburos desde C9 hasta C20, analizados por CG-EM bajo las mismas condiciones que los aceites esenciales.

Los valores fueron calculados aplicando la Ecuación 2:

𝑅 = 100𝑛+ 100 [𝑡𝑅𝑋 − 𝑡𝑅𝑛 𝑡𝑅𝑁 − 𝑡𝑅𝑛]

Ecuación 2. Fórmula matemática para la determinación de los índices de retención (IR) (Babushok et

(50)

39 Dónde,

IR: Índice de retención de compuesto de interés X.

n: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés X.

N: Número de átomos de carbono del n-alcano que eluye después del compuesto de interés X.

tRX: Tiempo de retención del compuesto de interés X.

tRN: Tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés X.

tRn: Tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés X.

2.2.2 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

Para la determinación de la composición química del aceite esencial de las partes aéreas se utilizó un cromatógrafo de gases con detector selectivo de masas SHIMADZU QP2010 plus, ubicado en el laboratorio de Química de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.

(51)

40

2.2.3 Análisis multivariado de los aceites esenciales extraídos de la especie vegetal Ulex europaeus L.

Se realizó el Análisis de Componentes Principales (ACP) de los nueve perfiles de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L., empleando los software estadísticos Minitab 17 y OriginPro 8, con el fin de optimizar los parámetros de identificación de los compuestos más representativos en las extracciones de aceites esenciales de la especie vegetal y organizar la composición de compuestos representativos o relevantes al estudio de la especie Ulex europaeus L.

Se emplearon dos métodos estadísticos: Análisis Multivariado de Componentes Principales (ACP) y Análisis de Conglomerados Jerárquicos o Clusters (ACJ), con el fin de estandarizar un modelo interpretativo del comportamiento de los compuestos químicos reportados por CG-EM, en cuanto a la composición de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L.

2.2.3.1 Análisis de Componentes Principales (ACP)

El ACP, es una técnica estadística de síntesis de la información, donde se reduce la dimensión del número de variables, es decir, ante un banco o matriz de datos con muchas variables con el objetivo de reducir a un menor número de variables o componentes principales (CP) perdiendo la menor cantidad de información posible. En este contexto, los nuevos componentes principales o factores serán una combinación lineal de las variables originales, y además serán independientes entre sí.

(52)

41 2.2.3.1.1 Análisis de la matriz de correlaciones

Un análisis de componentes principales tiene sentido en la medida que deben existir altas correlaciones entre las variables seleccionadas, ya que esto es indicativo de que existe información redundante y, por tanto, pocos factores explicarán gran parte de la variabilidad total.

2.2.3.1.2 Selección de los factores

La elección de los factores se realiza de tal forma que el primero recoja la mayor proporción posible de la variabilidad original; el segundo factor debe recoger la máxima variabilidad posible que no logró ser recogida en el primer factor, y así sucesivamente. Del total de los factores proporcionados por el ACP se elegirán aquellos que recojan el mayor porcentaje de variabilidad que se considere suficiente, éstos serán los denominados componentes principales.

2.2.3.1.3 Análisis de la matriz factorial

Una vez seleccionados los componentes principales, se representan en forma de matriz. Cada elemento de ésta, representa los coeficientes factoriales de las variables (correlaciones entre cada una de las variables y los componentes principales). La matriz tendrá tantas columnas como componentes principales y tantas filas como variables.

2.2.3.1.4 Interpretación de los factores

(53)

42

2.2.3.1.5 Cálculo de las puntuaciones factoriales

Para calcular las puntuaciones que tienen los componentes principales para cada caso, se emplea la ecuación 3.

Ecuación 3. Ecuación de cálculo para determinar las puntuaciones de los componentes principales. Fuente: (Terrádez, 2017)

Donde los a son los coeficientes y los Z son los valores estandarizados que tienen las variables en cada uno de los sujetos de la muestra.

(54)

43

2.2.3.2 Análisis de Conglomerados Jerárquicos o Cluster (ACJ)

El Análisis Cluster, conocido comúnmente como Análisis de Conglomerados, es una técnica estadística multivariante cuyo fin es agrupar elementos (variables) tratando de lograr la máxima homogeneidad en cada grupo y la mayor diferencia entre los grupos.

El ACJ es una herramienta ampliamente utilizada en muchas áreas de investigación, pero se debe hacer claro énfasis en que la técnica ACJ es una técnica netamente descriptiva, ateórica y no inferencial, por ende no tiene bases estadísticas profundizadas sobre las que deducir inferencias estadísticas para una población a partir de una muestra, ya que es un método basado en criterios geométricos y se utiliza principalmente como exploratoria, descriptiva pero no explicativa.

En este sentido no son únicas, en la medida en que la pertenencia al conglomerado para cualquier número de soluciones depende de muchos elementos del procedimiento elegido. Así, la solución Cluster depende totalmente de las variables utilizadas, por adición o destrucción de variables relevantes se puede generar un impacto substancial sobre la solución resultante, que se verá reflejada en datos atípicos muy sobresalientes que no aportan ninguna relación al ACJ y se mostrarán como datos independientes. (de la Fuente, 2011)

Los algoritmos de formación de conglomerados se agrupan en dos categorías:

2.2.3.2.1 Algoritmos de partición

(55)

44 2.2.3.2.2 Algoritmos jerárquicos

Es el método que entrega una jerarquía de divisiones del conjunto de elementos en conglomerados o agrupaciones. Se parte de una situación en la que cada observación forma un conglomerado y sucesivamente se va uniendo paso a paso, hasta que finalmente todas las situaciones están en un único conglomerado.

2.3 Extracción con etanol y fraccionamiento del extracto etanólico de las partes aéreas de Ulex europaeus L.

El material vegetal seco y reducido de tamaño fue sometido a una extracción con etanol por el método de maceración en frío, obteniéndose 25.07g (3.173% de rendimiento) de extracto total etanólico de Ulex europaeus L., (E.EtOH.Ue) el cual fue floculado con agua, posteriormente filtrado y concentrado a presión reducida a 40°C.

(56)

45

(57)

46

Para el fraccionamiento del extracto etanólico, se empleó el método de extracción líquido – líquido discontinuo (LLD) como se indica en la figura 12, con solventes de polaridad creciente obteniéndose las fracciones de hexano (F.Hex.Ue), diclorometano (F.CH2Cl2.Ue), acetato de etilo (F.AcOEt.Ue) y butanol (F.ButOH.Ue) y el residuo hidroalcoholico.

Figura 12. Diagrama de Fraccionamiento Líquido-Líquido Discontinuo del extracto etanólico de Ulex europaeus L. Resaltados en color amarillo se encuentran los porcentajes de rendimiento.

(58)

47 2.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana se realizó siguiendo el método de difusión en gel perforación en placa (Arévalo & Enciso, 1996; Rodriguez et al., 2007), los microorganismos se seleccionaron teniendo en cuenta su facilidad de desarrollo y crecimiento en medios de cultivo convencionales para ensayos de susceptibilidad a antibióticos. Cada una de las cepas se fueron conservadas bajo refrigeración a 4°C, y fueron sembradas por estrías en placa con Agar Mueller Hinton (AMH) y posterior incubación a 37°C por 24 horas, al cabo de las cuales se tomó una colonia y se sembró en 5mL de caldo Mueller Hinton; incubándose a 37°C por 18 horas, se realizaron resiembras sucesivas en el mismo caldo para asegurar que los microorganismos se encontraban en la fase de crecimiento exponencial 107 y 108 UFC.

(59)

48

la susceptibilidad de un microorganismo de prueba (Koneman, 1999). En cuanto a la masa crítica (ecuación 3), se determinó entonces que en cada pozo se encuentra una masa relativa de extracto de 2, 4, 6 y 8 mg para cada fracción. Cada una de las fracciones del extracto etanólico fue probada contra las cepas de bacterias:

Staphylococcus aureus y Escherichia coli, cuyas patologías asociadas se describen en

la tabla 4.

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑎 = ln 𝐶 𝑋^2

Ecuación 4. Determinación de la masa crítica de las fracciones de Ulex europaeus frente a las cepas de bacterias.

Donde,

Ln C, es el logaritmo natural de la concentración X^2, es el cuadrado del halo de inhibición

Tabla 4. Cepas de bacterias con las cuales se probó las fracciones del extracto etanólico de la especie vegetal Ulex europaeus L.

Nombre de la especie Patología asociada Clasificación

(GRAM + / GRAM -) Referencia

ATCC 25923 Enfermedades cutáneas

GRAM positiva

(coco) (Kobayashi et al., 2015)

(60)

49

3 RESULTADOS Y ANÁLISIS.

3.1 Análisis Fitoquímico Preliminar (AFP)

Los resultados obtenidos de los ensayos químicos preliminares realizados al extracto etanólico de las partes aéreas (E.EtOH.Ue) de la especie vegetal Ulex europaeus L., se encuentran consignados en la tabla 5, todos los ensayos químicos fueron comparados frente a estándares como controles positivos para cada grupo de metabolitos secundarios en particular.

Tabla 5. Resultados del Análisis Fitoquímico Preliminar de partes aéreas de la especie vegetal Ulex europaeus L. Grupo de

metabolitos

secundarios

Prueba Química Control positivo Resultados (E.EtOH.Ue)

Flavonoides Shinoda E.EtOH Allium fistulosum L. + Leucoantocianidinas Rosenheim E.EtOH Allium fistulosum L. -

Taninos

Cardiotónicos Baljet E.EtOH.H Digitalis purpurea -

Quinonas Borntrager Alizarina -

Alcaloides

Cumarinas Hidroxamato Férrico E.EtOH.Fl Calendula officinalis L. -

(+): Resultado positivo. (-): Resultado negativo. (E.EtOH): Extracto etanólico. (E.EtOH.Ue): Extracto etanólico Ulex europaeus L. (E.EtOH.H): Extracto etanólico hojas. (E.EtOH.F): Extracto etanólico frutos. (E.EtOH.Fl): Extracto

(61)

50

Los resultados del Análisis Fitoquímico Preliminar, en comparación con estudios realizados anteriormente a la especie, confirman la presencia de metabolitos secundarios como flavonoides, los cuales son reportados por Spínola et al, (2016), también fueron encontrados alcaloides confirmando los reportes de (Hornoy et al., 2012), se logró evidenciar la presencia de carotenoides en la planta como indican Martínez et al., en (2011) y Harborne (1962); y también se reporta que la planta puede contener taninos, para especies vegetales pertenecientes a la familia Fabaceae y en particular a la especie vegetal como indican Ruíz y Roque (2009).

Los grupos de metabolitos secundarios identificados, indican que la especie vegetal es promisoria de alcaloides (todas las pruebas de alcaloides resultaron positivas), para flavonoides y posiblemente carotenoides como se indicó en la tabla 5, metabolitos secundarios que están relacionados con la actividad antimicrobiana y antifúngica como menciona Harborne (1962). En los resultados de la AFP se logró determinar que la especie vegetal no posee leucoantocianidinas y taninos (salvo para la prueba con cloruro férrico que resultó positiva generando incertidumbre respecto a que este grupo de metabolitos se encuentre en la planta), tampoco se encuentran triterpenos, esteroides, compuestos cardiotónicos, quinonas ni cumarinas lo cual está de acuerdo con lo reportado previamente en otros estudios.

3.2 Obtención del aceite esencial por el método de arrastre con vapor

(62)

51

3.3 Identificación de los componentes volátiles de los aceites esenciales

Los constituyentes de cada uno de los aceites esenciales extraídos de las partes aéreas de la especie Ulex europaeus, se analizaron mediante la técnica CG-EM, siguiendo la metodología descrita en el numeral 2.2, y se encuentran reportados en la tabla 6 teniendo en cuenta: fórmula molecular, clasificación, porcentaje de coincidencia, índices de retención tanto teóricos como calculado en promedio y los porcentajes de área reportados en cada perfil.

(63)
(64)

53

(FM): Fórmula Molecular, (C): Clasificación, (%): Porcentaje de coincidencia, (IRt): Índice de Retención

teórico (Adams, 2007), (IRc prom.): Índice de Retención calculado promedio en columna DB5, (P1 a P9):

% de área de cada compuesto en los perfiles 1 a 9

(65)

54

eicosano (16.92%) y heptadecano (5.45%) para un perfil que reporta el 88.72% del porcentaje total.

Para el perfil 2 se encontraron los compuestos mayoritarios: ácido decanoíco (33.19%), tiglato de geranilo (7.60%) y geraniol (7.26%) para un perfil que reporta el 96.51% del porcentaje total.

En el perfil 3 se encontraron como compuestos mayoritarios: tetracosano (21.85%), β-citronelol (12.33%), y heneicosano (11.96%); perfil que reportó el 85.01% del porcentaje total.

En el perfil 4 se encontraron los compuestos mayoritarios: 8-hexilpentadecano (34.83%), heneicosano (15.3%) y hexahidrofarnesil acetona (6.41%); el porcentaje aportado por dicho perfil es 86.32% del porcentaje total.

Para el perfil 5 se reportan como compuestos mayoritarios: tetratetracontano (21.95%), eicosano (20.96%) y D-isomentol (11.98%); este perfil aportó el 84.49% del porcentaje total.

En el perfil 6 se reportaron los compuestos mayoritarios: eicosano (34.1%), β-citronelol (16.8%) y heptadecano (15.3%), perfil que aportó el 81.45% del perfil total.

El perfil 7 reportó el menor porcentaje de área total: 47.25% y en este se encontraron los compuestos: D-isomentol (11.13%), triacontano (8.14%) y hexahidrofarnesil acetona (6.43%) como mayoritarios.

(66)

55

Por último en el perfil 9 se encontraron los compuestos mayoritarios: D-isomentol (29.33%), triacontano (14.95%) y 3-isopropenil-2-metilciclohexanol (7.46%); perfil que aportó un 74.79% del porcentaje total.

En los nueve perfiles de aceites esenciales se encontraron 90 compuestos de interés los cuales se encuentran distribuidos de la siguiente manera: 2 corresponden a compuestos de tipo Diterpeno Oxigenado (DO), 36 corresponden a Hidrocarburos Alifáticos (HA), 5 compuestos de tipo Monoterpeno (M), 11 Monoterpenos Oxigenados (MO), 18 Sesquiterpenos (S), 17 Sesquiterpenos Oxigenados (SO) y 1 Triterpeno (TT). En la tabla 7 se muestra el porcentaje en términos de composición de cada uno de estos grupos de metabolitos para cada perfil.

Tabla 7. Totalizados de los porcentajes de área aportados por los compuestos obtenidos por el análisis de CG-EM, de los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L.

Compuestos y

(67)

56

canfeno y sabineno (Cao et al., 1997); de los cuales sólo los cuatro primeros compuestos fueron hallados en algunos de los perfiles de aceites del presente estudio.

Figura 13. Cromatogramas de los nueve perfiles de aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L, obtenido por CG-EM

(68)

57

compuestos mencionados anteriormente. Entre los compuestos reportados por literatura para esos meses, ninguno de los obtenidos en el perfil 3 (recolectado y extraído en el mes de mayo) coincide con lo mencionado en la literatura; teniendo en cuenta que el órgano de la planta seleccionado para la extracción realizada por los autores corresponde en su gran mayoría a flores; y para el estudio actual se realiza la extracción empleando las partes áreas de la planta sin discriminación de los órganos de la misma.

Si bien no se han realizado estudios de aceites esenciales de la especie cuyas extracciones se realicen en diferentes meses del año, se podría presumir que las extracciones de aceites de Ulex europaeus L., se ven afectadas por el mes del año en que se realiza la recolección y extracción de los componentes volátiles de partes aéreas, esto en relación a los compuestos químicos mayoritarios encontrados en los perfiles del presente estudio y concretamente se podría esperar obtener β-citronelol durante los meses de enero a julio y D-isomentol durante los meses de agosto a diciembre. Los compuestos mencionados anteriormente se presentaron en altos porcentajes en la composición química relativa de los aceites esenciales de la especie vegetal Ulex europaeus L., y como demuestran estudios realizados con base en actividades biologicas de tipo antimicrobiano (A.L. Umagiliyage et al., 2017; Fuentes et al., 1998) y en los compuestos reportados, es altamente probable que tanto metabolitos fijos como volátiles de la especie vegetal presenten actividad antimicrobiana.

3.4 Análisis Multivariado

(69)

58

representativos de acuerdo al porcentaje de varianza de la siguiente manera: los compuestos de tipo terpeno e hidrocarburo con valores altos en cuanto a porcentaje de varianza y el tercer grupo de compuestos químicos (terpenos, hidrocarburos, etc.,) con porcentajes de varianza bajos y poco representativos para el estudio.

3.4.1 Análisis de Componentes Principales (ACP)

El Scree Plot o diagrama de sedimentación (figura 14) indica la relación del número de componentes frente a la varianza de los datos de los nueve perfiles; de este se establece que se requieren cinco componentes principales (CP), debido a que con estos el valor propio de la varianza converge y se estabiliza cerca de 1.05 y es allí donde la varianza de correlaciones se reduce al máximo para explicar el modelo de ACP que se encuentra reportado en la matriz de correlaciones (tabla 9).

Figure

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Referencias

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