Proteína multifuncional ADE2 como nexo entre vías de recuperación y síntesis de novo de nucleótidos
Liska Rayen Caviedes Cárdenas
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Proteína multifuncional ADE2 como nexo entre vías de recuperación y síntesis de novo de nucleótidos
Liska Rayen Caviedes Cárdenas Barcelona
2018
MEMÒRIA PER OPTAR AL GRAU DE DOCTOR PER LA UNIVERSITAT DE BARCELONA.
PROGRAMA DE DOCTORAT EN BIOMEDICINA.
DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOMEDICINA MOLECULAR.
FACULTAT DE BIOLOGIA.
“Proteína multifuncional ADE2 como nexo entre vías de recuperación y síntesis de novo de nucleótidos.”
Memòria presentada per:
Liska Rayen Caviedes Cárdenas
L’interessat,
Vistiplau dels directors,
Barcelona, 2018 Dr. MARÇAL PASTOR ANGLADA
Catedràtic de Bioquímica i Biologia Molecular
Departament de Bioquímica i Biomedicina Molecular
Facultat de Biologia Universitat de Barcelona
Dra. SANDRA PÉREZ TORRAS Investigadora CIBERehd
Professora Associada Departament de Bioquímica i
Biomedicina Molecular Facultat de Biologia Universitat de Barcelona
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics (MPET) en el departamento de Bioquímica y Biomedicina Molecular de la Facultad de Biología de la Universidad de Barcelona, IBUB y Institut de Recerca Sant Joan de Déu.
Barcelona, España. La investigación que ha conducido a esta tesis doctoral ha recibido financiamiento del por parte del Gobierno de Chile a través de su programa de becas de doctorado en el extranjero, Becas Chile, CONICYT, Ministerio de Educación. Fundación Ramón Areces (España) y a través del SAF2014-52067-R por el ministerio de economía y competitividad (MINECO, España)
“No te rindas, aún estas a tiempo De alcanzar y comenzar de nuevo, Aceptar tus sombras, enterrar tus miedos,
Liberar el lastre, retomar el vuelo.
No te rindas que la vida es eso, Continuar el viaje, Perseguir tus sueños,
Destrabar el tiempo,
Correr los escombros y destapar el cielo”.
Mario Benedetti
A mi Padre, A mi Madre, A mis Hermanos, Por su amor y apoyo incondicional.
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Índice
Introducción. ... 17
Biología de los nucleótidos y nucleósidos. ... 17
Síntesis de novo de nucleótidos de Pirimidinas. ... 18
Síntesis de novo de nucleótidos de Purinas. ... 21
“Metabolon” en el metabolismo de Purinas: El Purinosoma. ... 23
Vías metabólicas de recuperación. ... 25
Transportadores de nucleósidos. ... 27
Transportadores Equilibrativos de Nucleósidos. ... 27
Transportadores Concentrativos de Nucleósidos. ... 29
Distribución de los transportadores de nucleósidos. ... 31
Otras funciones de los Transportadores Concentrativos de Nucleósidos. ... 33
Cambios metabólicos asociados a la biología tumoral que afectan la biosíntesis de nucleótidos... 34
Hipótesis y Objetivos ... 39
Resultados y Discusión ... 43
Identificación de ADE2 como parte del interactoma de hCNT3. ... 43
Validación de la Interacción ADE2/ADK ... 44
Efecto de la biodisponibilidad de nucleósidos en la modulación de la expresión de ADE2. ... 58
Efecto del desbalance de nucleósidos de pirimidina sobre la expresión de PAICS. 58 Efecto de la disponibilidad extracelular de nucleósidos sobre la expresión de PAICS y los transportadores de nucleósidos, elementos clave de la vía de recuperación de nucleósidos. ... 62
Discusión general. ... 81
12
Conclusiones. ... 91
Metodología. ... 95
1. Cultivo Celular ... 95
1.1. MEC-1 ... 95
1.2. HEK-293 (ATCC CRL 1573) ... 95
1.3. HT-29 (ATCC HTB-38) ... 95
1.4. HeLa ... 96
1.5. HeLa PAICS KO ... 96
2. Tratamientos en cultivos celulares ... 96
2.1. Obtención de Suero libre de nucleósidos ... 96
3. Análisis de la expresión del mRNA ... 97
3.1. Extracción de ARN y retrotranscripción. ... 97
3.2. Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (qRT-PCR). ... 97
4. Análisis de la expresión proteica ... 98
4.1. Extracción de proteínas ... 98
4.2. Western blot... 98
4.3. Co-Inmunoprecipitación de Mutantes ... 99
4.4. Co-Inmunoprecipitación de Proteínas endógenas ... 99
5. Análisis de la Actividad de la DHODH ... 100
6. Métodos de expresión heteróloga transitoria. ... 100
6.1. Transfección por Fosfato de calcio... 100
6.2. Lipofectamina ... 101
7. Biología Molecular y técnicas relacionadas ... 101
7.1. Obtención del cDNA de PAICS ... 101
7.2. Subclonamiento de PAICS en el vector pCDNA3.1+ ... 101
7.3. Transformación de Bacterias competentes mediante Shock térmico ... 102
13
7.4. Mutación sitio dirigida ... 102
7.5. Secuenciación de vectores ... 103
7.6. Digestión enzimática del DNA ... 103
7.7. Extracción de DNA plasmidial ... 103
7.8. Purificación de DNA a partir de gel de agarosa ... 104
8. CRISPR ... 104
8.1. CRISPR CAS9 ... 104
8.2. Doble Nickasa ... 104
9. Análisis estadísticos ... 104
Bibliografía ... 107
Anexo ... 123
14
Introducción
17
Introducción.
Biología de los nucleótidos y nucleósidos.
Los nucleósidos y nucleótidos son componentes vitales en todas las células de un organismo y se encuentran involucrados en diversos procesos biológicos. Estas moléculas no sólo forman parte de dos de las biomoléculas más importantes de un ser vivo, el DNA y el RNA, sino que también participan activamente en la señalización celular, regulación enzimática, formación de enzimas y regulación del ciclo celular.
La estructura de un nucleósido está compuesta por una base nitrogenada y una pentosa. Una vez el nucleósido es internalizado mediante los transportadores de nucleósidos, es fosforilado dando origen a los nucleótidos, los cuales pueden ser mono, di o tri fosforilados. Dependiendo de la base nitrogenada que los componga, podemos separarlos en dos grupos: purínicos y pirimídicos (figura 1).
A nivel metabólico el ATP es uno de los nucleótidos más importantes en la célula, ya que aporta los grupos fosfatos necesarios para la síntesis de otros nucleótidos y es el principal dador de fosfatos para otras reacciones metabólicas. Por otro lado, GTP está
Figura 1. Estructura de nucleósidos y nucleótidos.
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involucrado en síntesis proteica y CTP en el metabolismo lipídico. También los nucleótidos pueden actuar como mediadores fisiológicos como es el caso de cAMP y cGMP que ejercen de segundo mensajero en variados procesos biológicos.
Por otro lado, los nucleósidos también median diversos procesos biológicos.
Adenosina, a través de su interacción con sus receptores (A1, A2A, A2B y A3) participa en la neurotransmisión, vasodilatación y lipolisis entre otros procesos biológicos.
En la actualidad se han identificado 17 patologías relacionadas con las deficiencias en el metabolismo de los nucleótidos/nucleósidos. Casi todas estas patologías están relacionadas con mutaciones en las enzimas encargadas de la síntesis de estos mismos (Jurecka 2009) .
La obtención de estas moléculas se puede llevar a cabo mediante dos vías denominadas síntesis de novo y vías de recuperación.
En condiciones en que la célula necesita incrementar sus niveles de nucleotidos para llevar a cabo procesos biológicos tales como división celular, proliferación y crecimiento, la síntesis de novo de nucleótidos es esencial para mantener constantes estos pools intracelulares. Es así como, bajo estas determinadas condiciones la célula promueve la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidinas y purinas. Este proceso, es de alto costo energético, altamente regulado y conservado, tanto para células eucariotas como procariotas.
Síntesis de novo de nucleótidos de Pirimidinas.
En el caso de la síntesis de novo de pirimidinas se necesitan tres moléculas precursoras: glutamina, ATP y bicarbonato (figura 2). Estas moléculas precursoras darán origen a los nucleótidos de pirimidinas por medio de 6 pasos los cuales están catalizados por tres proteínas diferentes. Las tres primeras reacciones las realiza la proteína citoplasmática CAD, la cual es un acrónimo de las tres actividades enzimáticas que realiza. Carbamoil fosfato sintetasa, Aspartato transcarbamilasa y Dihridroorotasa. CAD posee sus tres actividades enzimáticas en una única cadena proteica y su acción enzimática es realizada en el citoplasma, sin embargo, su producto (dihidroorotato)
19 difunde a la mitocondria donde es transformado a orotato por la dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH). La DHODH es la única enzima de las vías de síntesis de novo que se encuentra ubicada en la membrana mitocondrial. En paralelo a la oxidación de dihidroorotato a orotato, DHODH cataliza la reducción de la ubiquinona en la membrana mitocondrial. Estos dos procesos que ocurren de forma paralela son el nexo entre la síntesis de novo de pirimidinas y la cadena respiratoria. Los últimos dos pasos de la síntesis de novo de pirimidinas son citoplasmáticos y son catalizados por la enzima bifuncional de la vía, la orotato fosforibosiltransferasa/orotidilato descarboxilasa (también llamada uridina monofosfato sintetasa). Es también aquí cuando se une el anillo piriminídico a la ribosa. A partir del producto final uridina monofosfato (UMP) se pueden sintetizar los tres nucleótidos de pirimidinas, UMP, CMP y dTDP.
Figura 2. Síntesis de novo de pirimidinas.
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El hecho que la regulación del pool de pirimidinas dependa en parte de la síntesis de novo de éstas y que este proceso sea esencial para la proliferación y crecimiento celular ha propiciado que durante los últimos 40 años se hayan desarrollado diferentes inhibidores, que actúan principalmente sobre dos proteínas, CAD y DHODH. CAD es inhibida por PALA (N-(phosphonacetyl)-L-aspartate)(Collins and Stark 1971), la cual actúa sobre la actividad Aspartato transcarbamilasa (ATCase) de la proteína. Se ha demostrado que PALA detiene in vitro la proliferación de células tumorales (Tsuboi, Edmunds, and Kwong 1977) lo cual sugiere que podría ser utilizada como fármaco anti- tumoral (Grem et al. 1988). La otra enzima de la vía que ha sido diana para diversos inhibidores es DHODH y dentro de los más utilizados están: Brequinar (Chen et al. 1992), Leflunomida y Teriflunomida (A771726) (Greene et al. 1995).
Brequinar es un inhibidor específico y potente de la DHODH. Su efecto ha sido evaluado en varios ensayos clínicos (fase I y fase II) en pacientes con tumores sólidos avanzados (Arteaga et al., 1989; Burris et al., 1998; Noe et al., 1990; Schwartsmann et al., 1990). Sin embargo, en estos estudios no fue efectivo y las dosis y tratamientos utilizados son cuestionables. Recientemente se ha visto que en Leucemia mieloide aguda Brequinar reduce la proliferación e induce diferenciación celular (Sykes et al.
2016). Además, hasta la fecha Brequinar no ha sido aprobada por la FDA (“food drug and administration”) para su uso en pacientes.
Durante los últimos 20 años el efecto de Leflunomida y de su forma activa, Teriflunomida, ha sido ampliamente estudiado, ya que no sólo han demostrado ser buenos inhibidores in vitro, sino que también han sido probados en diferentes ensayos clínicos lo que les ha permitido ser un fármaco que se utiliza actualmente en clínica.
Ambos inhibidores han demostrado efectos antiinflamatorios, inmunosupresores y/o anti proliferativos, por lo que se utilizan no solo en desordenes proliferativos, sino también en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide. In vitro en células tumorales ambos fármacos promueven arresto celular en diferentes fases del ciclo (G y S). Estos procesos son reversibles al añadir dosis de uridina extracelulares (100µM) (L.
Liu et al. 2017). Sin embargo, leflunomida posee una serie de otras dianas lo que hace discutible su especificidad.
21 Hasta ahora no existen evidencias que en la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidinas exista algún tipo de regulación estructural asociada a la formación de complejos multiproteicos. Sin embargo, existen otros tipos de regulaciones. Se ha visto que CAD puede oligomerizar en respuesta a factores de crecimiento y aminoácidos (Robitaille et al. 2013), lo cual concuerda con la capacidad de esta proteína de formar oligómeros, debido a que en su forma activa ya es un hexámero. In vivo estas oligomeraciones son potenciadas por mTORC1, ya que la fosforilación de CAD por S6K contribuye a la regulación por el eje mTORC1 y representa una integración de señales nutricionales y endocrinas suceptibles de promover la síntesis de novo de pirimidinas y la progresión del ciclo celular (Ben-Sahra et al. 2013; Robitaille et al. 2013).
Síntesis de novo de nucleótidos de Purinas.
Para que la síntesis de novo de purinas se realice correctamente, es imprescindible la fosforibosil pirofosfato (PRPP) además de Glutamina, Glicina, CO2 y Formil-THF, estas últimas moléculas son donadoras de los átomos de carbono y grupos amino que construirán los anillos purínicos. En el caso de los eucariotas superiores la síntesis de novo de purinas se realiza mediante diez reacciones enzimáticas, las cuales son catalizadas por seis reacciones enzimáticas diferentes. De estas proteínas hay tres que son monofuncionales (PPAT, FGAMS, ASL), dos proteínas bifuncionales (PAICS y ATIC) y una proteína trifuncional (TGART) (Zhao et al. 2013) (Figura 3). El producto final de estas reacciones enzimáticas es la inosina mono fosfato (IMP) la cual puede ser metabolizada a Adenosina monofosfato (AMP) o a Guanosina monofosfato (GMP) dependiendo de los requerimientos celulares.
La primera reacción de esta vía es la conversión del fosforibosilpirofosfato (PRPP) a 5-fosforibosilamina (PRA) por la PRPP aminotransferasa (PPAT). Este paso es uno de los limitantes de la síntesis de novo. La transformación de PRA a ribonucleotido N- fomilglicinamida (FGAR) por la adicion de un grupo formil y glicil es catalizada por la fosforibosilglicinamida sintetasa (GARS) y el dominio de GART (TrifGART) fosforibosilglicinamida formiltransferasa (GAR Tfase). La tercera función de GART es no secuencial, por lo que en el cuarto paso de la vía el intermediario FGAR es convertido en
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el ribonucleótido N-formilglicinamida (FGAM) por la fosforibosil formilglicinamida sintetasa (FGAMS o PFAS). Posteriormente se forma el ribonucleótido aminoimidazol (AIR) por la acción de fosforibosilaminoimidasol sintetasa (AIRS), el cual se corresponde con el tercer dominio de GART. El paso seis y siete es catalizado por la proteína bifuncional fosforibosil aminoimidazole carboxilasa (CAIRS)/ fosforibosil aminoimidasol succinocaboxamida sintetasa (SAICARS) (PAICS) la cual utiliza AIR para generar el ribonucleótido N-succinocarboxiamida-5-aminoimidasol (SAICAR) en dos pasos secuenciales. SAICAR es procesado a ribonucleótido aminoimidasol-4-coboxiamida (AICAR) en una reacción reversible, catalizada por la adenosuccinato liasa (ADSL). Los dos últimos pasos de la vía convierten a AICAR en IMP por la acción de la proteína bifuncional 5-aminoimidasol-4-carboxiamida formiltransferasa (AICAR Tfase) / IMP ciclohidrolasa (IMPCH) (ATIC).
Para la acción enzimática de estas seis proteínas son necesarias una serie de moléculas y cofactores. Por cada molécula de IMP generada se necesitan cinco moléculas de ATP, dos de glutamina, dos moléculas de formato y una molécula de glicina, aspartato y dióxido de carbono. Glutamina y glutamato pueden venir de la dieta o pueden ser generados por intermedios del ciclo de ácidos tricarboxílicos y son necesarios para la acción enzimática de PPAT, FGAMS y PAICS. Glicina es un producto secundario del metabolismo 1-C de la serina en mitocondria y es necesaria como sustrato para la acción de GART. Formato es un metabolito que es exportado desde la
Figura 3. Síntesis de novo de purinas. French et al. 2013.
23 mitocondria y es necesario para la síntesis de 10-formiltetrahidrofolato el cual es necesario para la acción de GART y ATIC (Fan et al. 2014). Se ha visto que las estructuras cuaternarias de estas enzimas podrían estar regulando su actividad catalítica. Sin embargo, este dato aún no se ha confirmado para PPAT y FGAMS, las cuales se encuentran como tetrámero y monómero, respectivamente. GART es un dímero, PAICS un octómero y ADSL un tetrámero. ATIC se encuentra en un equilibrio mono-dímero, donde el dímero predomina cuando AICAR y 10-formiltetrahidrofolato están presentes.
“Metabolon” en el metabolismo de Purinas: El Purinosoma.
El término “Metabolon” fue definido por primera vez por Paul A. Srere en 1985 como un complejo supramolecular de enzimas metabólicas secuenciales y elementos estructurales celulares. El metabolon se ha observado en diferentes vías metabólicas como en la glicolisis y el ciclo de ácidos tricarboxílicos, en donde las enzimas de estas vías trabajan secuencial y conjuntamente para optimizar los procesos metabólicos (Srere 1985). Si pensamos que para el correcto funcionamiento metabólico y su regulación es necesaria la interacción eficaz de diferentes proteínas, distribuidas por el citoplasma y que estas funcionen como una red eficaz, tiene lógica pensar que algún tipo de estructura reguladora las esté rigiendo. Por supuesto, no estamos hablando de una estructura rígida, sino de algún tipo de regulación transitoria que permita optimizar el proceso.
En el caso de la síntesis de novo de purinas hace un par de décadas se hipotetizó que podría estarse rigiendo por algún tipo de estructura. Esta hipótesis nace a partir de ciertos parámetros cinéticos, específicamente si miramos la vida media del primer producto de la vía PRA. PRA posee una vida media tan corta que pasa rápidamente a ser metabolizada por GART, lo que siguiere la proximidad de ambas enzimas (Rudolph and Stubbe 1995; Schendel et al. 1988; Antle et al. 1999). De forma similar, GART cataliza pasos no secuenciales dentro de la misma vía y requiere la actividad de FGAMS para catalizar el cuarto paso de la vía. Este hecho hace que aumente la posibilidad de que GART y FGAMS estén interactuando. La primera evidencia que estas dos proteínas podrían estar interaccionando se realizó en células HeLa mediante microscopía confocal,
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donde mediante la expresión heteróloga transitoria de ambas enzimas y en condiciones en las cuales se producía un aumento de la síntesis de novo de purinas se observó un agrupamiento de ambas proteínas (Songon An et al. 2008). Al observar lo que sucedía con las otras cuatro proteínas de la vía, estas mostraban un agrupamiento conjunto con FGAM. Esta estructura transitoria que se forma en condiciones en las cuales se favorece la síntesis de novo de purinas se conoce como “Purinosoma” (Songon An et al. 2008).
Además, se vío que no existen cambios en la expresión de las proteínas de la vía cuando se utilizaron medio depletado de nucleósidos y medio rico en nucleósidos (Chan et al.
2015; Zhao et al. 2015) y que la formación del purinosoma es independiente de la expresión de G3BP, la cual se utilizó como marcador de estrés y se demostró que el purinosoma no colocaliza con ella (French et al. 2013). Estas observaciones definen el purinosoma como un cuerpo subcelular único (figura 4). Esta estructura puede desensamblarse cuando al medio de cultivo se le añaden purinas exógenas, lo cual sugiere que este complejo es reversible y que se forma con el único propósito de suplir las necesidades celulares de purinas y para optimizar el proceso de síntesis de novo de estas.
La formación del purinosoma no es una asociación de proteínas al azar, sino que se forma alrededor de tres de las proteínas de la vía PPAT, GART y FGAMS, las cuales están formando el corazón del purinosoma. Mientras que las otras tres proteínas PAICS, ADSL y ATIC se ubican en la parte periférica de la estructura (Deng et al. 2012;
Havugimana et al. 2012; Kristensen, Gsponer, and Foster 2012; Wan et al. 2015).
En muestras de fibroblastos de pacientes con AICAR-ribosiduria y deficiencia de ADSL se ha visto que las mutaciones en ADSL y ATIC disminuyen la formación del purinosoma, sugiriendo que estas proteínas contribuyen a la estabilidad del complejo (Baresova et al. 2012). Además, este mismo grupo demostró que en células HeLa KO de las proteínas GART, ADSL y ATIC, la formación del purinosoma desaparecía completamente (Baresova et al. 2016). Sin embargo, la pérdida de expresión de las proteínas FGAMS o PAICS sólo muestra una disminución significativa de su formación comparado con células HeLa control (Baresova et al. 2012). Además, se ha visto que Adenilatosuccinato sintetasa (ADSS) e IMP dehidrogenasa (IMPDH) también estarían formando parte del purinosoma (Zhao et al. 2015).
25 La formación de la estructura del purinosoma sugiere que podría haber proteínas accesorias que contribuirían a su estabilidad y actividad como las proteínas Hsp70/Hsp90. Ambas proteínas fueron identificadas por medio de co- inmunoprecipitaciones de FGAMS bajo condiciones en las que se favorecía la formación del purinosoma. La inhibición de Hsp90 por medio de los inhibidores NVP-AUY922 o 17- AAG deriva en el desensamblaje de la estructura del purinosoma de la misma forma que cuando añadimos purinas de forma exógena (French et al. 2013).
Vías metabólicas de recuperación.
Las vías de recuperación son una alternativa a la síntesis de novo de nucleotidos de purinas y pirimidinas. En este proceso se reciclan los nucleósidos y nucleobases de purinas y pirimidinas que se encuentran disponibles en la célula producto del recambio y/o degradación del material celular. También en este proceso se incluyen los nucleósidos, nucleótidos y nucleobases provenientes de la dieta. A diferencia de la síntesis de novo que es un proceso altamente conservado, las vías de recuperación muestran una amplia diversidad entre las diferentes especies.
Las bases de purina libres se pueden convertir en sus nucleótidos correspondientes por la acción de dos enzimas, la Hipoxantina-Guanosil fosforibosiltransferasa (HGPRT) que en presencia de fosforibosilpirofosfatasa (PRPP)
Figura 4. Formación del purinosoma. modificado de Pedley and Benkovic 2017.
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permite obtener inosina monofostato (IMP) y guanosina monofosfato (GMP) y por la acción de Adenina fosforibosiltransferasa (APRT) obtenemos del mismo modo adenosina. Como consecuencia de este proceso la síntesis de novo de purinas se ve disminuida cuando purinas exógenas como hipoxantina se encuentran disponibles (Becker and Kim 1987; Yamaoka et al. 2001).
Por otro lado, el proceso de recuperación de las pirimidinas es más eficiente que el de purinas. Los nucleósidos pueden ser metabolizados por kinasas. En humanos dentro de las desoxirribonucleosidos kinasas se encuentra la deoxicitidina kinasa (dCK), dos timidilato kinasas (TK1 y TK2) y la desoxiguanosina kinasa (dGK). Estas kinasas se encuentran distribuidas por el citosol (dCK y TK1) y en la mitocondria (TK2 y gCK).
Por otro lado, citidina y deoxicitidina pueden ser recuperadas por acción de la citidina deaminasa (CDA) produciendo uridina y deoxiuridina (Navaratnam and Sarwar 2006). Citidina también puede ser recuperada directamente por la acción de la Uridina- Citidina kinasa produciendo CMP (Suzuki et al. 2004).
Figura 5. Vías de recuperación de nucleótidos y desoxinucleotidos. Modificado de Schmidt, Nagar, and Martinez 2017.
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Transportadores de nucleósidos.
El proceso de recuperación depende de la incorporación de (desoxi) nucleósidos y nucleobases para su posterior metabolización. Debido a su composición química estas moléculas no pueden difundir a través de la membrana plasmática, sino que necesitan ser recaptadas por medio de proteínas transportadoras. Estas proteínas no solo juegan un rol fundamental en la incorporación de estas moléculas, sino que contribuirán al correcto desarrollo celular y tisular. Dentro de nuestro genoma existen dos familias génicas que codifican los transportadores de nucleósidos; estas son SLC28 y SLC29. La familia codificada por SLC28 corresponde a los transportadores concentrativos de nucleósidos (hCNTs) la cual está compuesta por hCNT1, hCNT2 y hCNT3. Mientras que la SLC29 corresponde a los transportadores equilibrativos de nucleósidos (hENTs) la cual está compuesta por hENT1, hENT2, hENT3 y hENT4.
Transportadores Equilibrativos de Nucleósidos.
La familia de transportadores equilibrativos humanos (hENTs) está compuesta por cuatro transportadores hENT1, hENT2, hENT3 y hENT4 susceptibles de mediar el influjo o eflujo de nucleósidos dependiendo de los requerimientos de la célula. Estos sistemas son independientes de sodio y presentan una amplia especificidad, ya que pueden incorporar tanto nucleósidos de purinas como de pirimidinas y nucleobases.
Tanto hENT1 como hENT2 pueden transportar nucleósidos y sus derivados con menor afinidad que los transportadores concentrativos de nucleósidos. hENT2 es considerado un transportador de nucleobases mientras que hENT1 ha sido descrito recientemente que transloca algunos fármacos derivados de las nucleobases (Yao et al. 2011). Además, estos transportadores difieren en su sensibilidad a S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBTI) siendo hENT1 inhibido en concentraciones entre 1-10nM mientras que hENT2 es inhibido a concentraciones sobre 10µM (Pastor-Anglada and Pérez-Torras 2018). A su vez, ambos transportadores pueden ser inhibidos por fármacos con efecto protector cardiovascular como dipiridamol, dilazep y draflazina (Kong et al. 2004).
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Tabla 1. Características de los transportadores equilibrativos de nucleósidos (Pastor‐Anglada, Urtasun, and Pérez‐Torras 2018).
Transportador Gen Sustrato (Km) Inhibidor (Ki)
hENT1 SCL29A1
Adenosina (40 M) Guanosina (140 M)
Inosina (170M) Uridina (240 M) Timidina (300 M)
Citidina (580 M)
NBTI (1M) Dipiridamol (10M)
hENT2 SCL29A2
Guanosina (2.7 mM) Inosina (50 M) Adenosina (140 M)
Uridina (200 M) Timidina (710 M)
Citidina (5.6 mM)
NBTI (>10M) Dipiridamol (10M)
hENT3 fue descrito como un transportador intracelular dependiente de pH ya que se ubica en la membrana del lisosoma y también se ha encontrado en mitocondria, donde tendría un rol fundamental en la citotoxicidad mitocondrial mediada por fármacos derivados de nucleósidos (Govindarajan et al. 2009). El último miembro de la familia de los hENTs, hENT4 no se le considera un transportador de nucleósidos como tal, ya que también puede transportar neurotransmisores. Sin embargo, a pH bajo es capaz de transportar adenosina (Barnes et al. 2006).
Estructuralmente hENT1 y hENT2 poseen 456 aminoácidos con un 46% de homología. Su estructura ha sido predicha como 11 dominios transmembrana con un dominio N-terminal intracelular y un C-terminal extracelular. Además, posee dos loops uno intracelular y otro extracelular. hENT1 posee sólo un sitio de glicosilación mientras que hENT2 posee dos. Sin embargo, estas glicosilaciones no son necesarias para que el transportador esté activo. Recientemente se identificaron 2 nuevas variantes de hENT2 que se encuentran en la membrana nuclear, estas isoformas tendrían un rol importante durante la replicación, secuestrando a hENT2 de membrana hacia la membrana nuclear para la incorporación de nucleósidos en el núcleo (Natalia Grañé-Boladeras et al. 2016).
29 Transportadores Concentrativos de Nucleósidos.
La familia de transportadores concentrativos de nucleósidos humana (hCNTs) está compuesta por tres transportadores hCNT1, hCNT2 y hCNT3. Estos transportadores median el flujo unidireccional de nucleósidos, son de tipo activo secundario y poseen alta afinidad por sus sustratos dado que sus Km son del orden de µmolar bajo. Estos transportadores se caracterizan por tener diferente afinidad de sustrato y diferente dependencia de sodio. hCNT1 transloca una molécula de sodio por cada nucleósido transportado y posee afinidad por nucleósidos pirimídicos y sus derivados farmacológicos como la gemcitabina y citarabina. Curiosamente adenosina es capaz de unirse a hCNT1, pero no es translocada (Larráyoz et al. 2004). Al igual de hCNT1, hCNT2 transloca una molécula de sodio por cada nucleósido translocado. Este transportador es específico para nucleósidos de purinas, sin embargo, también puede translocar uridina.
Desde el punto de vista farmacológico también puede transportar antivirales y fármacos quimioterapéuticos. El tercer miembro de la familia hCNT es hCNT3 el cual es un transportador con amplia selectividad de sustrato, ya que puede translocar tanto nucleósidos púricos como pirimidínicos. A su vez transporta dos moléculas de sodio por cada nucleósido, aunque también se ha descrito que puede transportar un protón por cada nucleósido transportado.
TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 TM8 TM9
TM1 TM10 TM11
C-terminal
N-terminal
Figura 6. Estructura de los transportadores equilibrativos de nucleósidos. modificado de dos Santos- Rodrigues et al. 2014.
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Tabla 2 Características de los transportadores concentrativos de nucleósidos. modificado de Pastor‐
Anglada, Urtasun, and Pérez‐Torras 2018.
Transportador Gen Sustrato (Km) Estequiometria (Na+: Nucleótido)
hCNT1 SCL28A1
Uridina (38 M) Timidina (27 M) Citidina (3.1 M) Adenosina (8M)
1:1
hCNT2 SCL28A2
Inosina (13.7M) Adenosina (8M) Guanosina (8.5M)
Uridina (116M)
1:1
hCNT3 SCL28A3
Citidina (3.5M) Adenosina (2.4M)
Timidina (10.6M) Uridina (5.3M) Guanosina (8.5M)
Inosina (4.3M)
2:1
Estructuralmente hCNT1, hCNT2 y hCNT3 poseen 649, 658 y 691 aminoácidos.
Tradicionalmente se creía que los CNTs en humanos poseían 13 dominios transmembrana (TMD) con un C-terminal extracelular y un N-terminal intracelular. Sin embargo, Jonhson et al en el año 2012 lograron cristalizar el transportador concentrativo (CNT) de Vibrio cholerae (Johnson et al. 2012). Los CNTs de procariotas mostraron 8 dominios transmembrana los cuales poseen un alto porcentaje de homología con los hCNTs. Sin embargo, los eucariotas hemos adquirido tres dominios transmembrana y una cola N-terminal, por lo que en la actualidad el modelo en eucariotas es de 11 TMD. Debido a que estos dominios no son indispensables para la actividad del transportador se sugiere que puede contener zonas reguladoras que aún no están del todo descritas.
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Distribución de los transportadores de nucleósidos.
Las proteínas hCNTs se expresan en bastantes tejidos, pero no son ubicuas.
hCNT1 se expresa mayoritariamente en hígado, corazón, riñón, intestino y cerebro (Pennycooke et al. 2001). hCNT2 está más ampliamente expresado si lo comparamos con hCNT1 ya que se expresa en riñón, corazón, hígado, musculo esquelético, páncreas, placenta, cerebro, cérvix, próstata, intestino delgado, recto, colon y pulmón (Pennycooke et al. 2001; Gray, Owen, and Giacomini 2004). Generalmente hCNT3 se expresa en glándula mamaría, páncreas, médula ósea, intestino, hígado, pulmón, placenta, próstata, cerebro y tejido cardiaco (Gray, Owen, and Giacomini 2004). Los hCNTs se han encontrado en la mayoría de los epitelios polarizados y están localizados en la membrana apical, lo cual facilita el flujo de los nucleósidos entre barreras (Mangravite et al. 2001; Errasti-Murugarren, Casado, and Pastor-Anglada 2010).
Por otro lado, los hENTs se encuentran ampliamente distribuidos en diferentes tejidos y con diferente expresión (Baldwin et al. 2004). Estos transportadores están generalmente ubicados en la membrana basolateral de las células de epitelios absortivos (Mangravite et al. 2001; Lai, Bakken, and Unadkat 2002).
Figura 7. Estructura predicha de los transportadores concentrativos de nucleósidos.
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La distribución de los hCNTs y hENTs en algunos epitelios es asimétrica en las regiones apicales y basolaterales, lo cual favorece el flujo vectorial de nucleósidos para la correcta homeostasis celular (Errasti-Murugarren, Pastor-Anglada, and Casado 2007).
Sin embargo, la distribución de los transportadores no es igual en todos los epitelios (figura 8). En intestino en la membrana apical se encuentran los transportadores concentrativos (hCNT1, hCNT2 y hCNT3) mientras que, en la membrana basal se encontrarían los hENT1 y hENT2 (M Pastor-Anglada et al. 2007; Young et al. 2013) . En riñón en la membrana apical se encuentran los hCNTs. hENT1 se expresa tanto en la membrana apical como basolateral mientras que, hENT2 se expresa solo en la basolateral. En hígado existe una distribución diferente mientras que hENT2 sólo se expresa en la membrana sinusoidal (basal), hCNT1, hCNT2, hENT1 se expresan tanto en la membrana sinusoisal como en la membrana canicular (apical)(Govindarajan et al.
2008; Duflot et al. 2002).
ENT1
ENT2
CNT2 CNT1
CNT3
CNT1
CNT2
ENT1
Enterocito (Intestino)
Célula tubular epitelial de la nefrona (Riñón)
Hepatocito (Hígado)
MB MA MB MA
MS MS
CNT2 MC
CNT1 ENT1
ENT2
ENT1
ENT2
CNT2 CNT1
CNT3 ENT1
Figura 8. Distribución de los transportadores de nucleósidos en células de epitelios polarizados.
Modificado de Molina-Arcas and Pastor-Anglada 2013.
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Otras funciones de los Transportadores Concentrativos de Nucleósidos.
Como se comentó anteriormente los CNTs de eucariotas poseen un dominio N- terminal intracelular y tres dominios que no influyen en la selectividad de los sustratos ni en el transporte de nucleósidos. Los extremos citoplasmáticos de los transportadores de eucariotas están compuestos por 83 aminoácidos en el caso de hCNT1, 80 aminoácidos para hCNT2 y 103 aminoácidos para hCNT3. Debido a que esta adquisición evolutiva es innecesaria para el transporte nos permite sugerir que la región N-terminal podría contener zonas reguladoras (Pinilla-Macua et al. 2012; Errasti-Murugarren et al.
2010).
En el año 2013 nuestro grupo demostró que al restaurar la expresión de hCNT1 en un modelo de adenocarcinoma pancreático se observaba un aumento en la muerte celular, una disminución de la proliferación y migración celular. Estos efectos también se observaron al restituir un hCNT1 carente de su capacidad transportadora. Además, in vivo se observó una disminución del crecimiento tumoral (Pérez-Torras et al. 2013). Este trabajo es la primera evidencia que hCNT1 además de su función transportadora presenta una actividad “señalizadora” independiente por lo que puede ser clasificado como un transceptor. Hasta ahora, según nuestros resultados sólo hCNT1 puede atribuirse esta capacidad. Aunque, hemos identificado proteínas “partners” del interactoma de hCNT2 como Aldolasa B y GRP58 (Huber-Ruano et al. 2010) estas no anticipan una doble función del transportador, sino que participan como proteínas reguladoras. Por otro lado, hemos intentado identificar proteínas que interaccionen con las porciones N-t de hCNT3 ya que tanto por su papel en el transporte de un amplio abanico de fármacos antitumorales como por su posible rol en redes implicadas en mecanismos de reparación de ADN y de apoptosis (Natàlia Grañé-Boladeras et al. 2016), hCNT3 parece ser una proteína de alto interés en la biología tumoral. Por ello, la identificación de proteínas de interacción con su gran dominio N-t intracelular (103 aminoácidos) se plantea como un objetivo de alto interés.
Mediante una aproximación proteómica utilizando la totalidad del dominio intracelular de hCNT3 como cebo y en extractos proteicos de colon humano sano como
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fuente de probables proteínas de interacción hemos identificado la primera proteína de interacción de hCNT3, la Galectina 4 (Gal-4). La interacción hCNT3/ Gal-4 es neceria para que el transportador llegue a membrana y pueda ejercer su función, aunque no anticipa funciones accesorias para hCNT3 (Fernández-Calotti et al. 2016).
Cambios metabólicos asociados a la biología tumoral que afectan la biosíntesis de nucleótidos.
El crecimiento y proliferación descontrolada es fundamental en un proceso neoplásico y para que ocurra es necesario que la célula realice ciertos cambios metabólicos. La reprogramación metabólica que se produce durante un proceso oncológico forma parte de los denominados “hallmark” del cáncer. Otto Warburg fue el primero en observar que la célula tumoral en presencia de oxigeno reprogramaba su metabolismo de glucosa. Las células tumorales a diferencia de las células normales realizan glicólisis aeróbica, lo que se traduce en aumento en el consumo de glucosa y el aumento del ácido láctico. El aumento de la glicólisis conlleva a un aumento de diversos intermediarios que son metabolitos necesarios para otros procesos, tales como la generación de nucleótidos. Estos metabolitos permiten que la célula pueda seguir proliferando ya que sus nutrientes fundamentales tienen garantizada su síntesis (Hanahan and Weinberg 2011; Pavlova and Thompson 2016).
Otro aspecto para tener en consideración es el aumento de la demanda de nitrógeno por parte de la célula tumoral. Las células en proliferación necesitan sintetizar de novo nucleótidos, aminoácidos no esenciales y poliaminas. Glutamina es imprescindible para que se lleven a cabo estos procesos ya que su grupo amida es el principal donante de nitrógeno para la síntesis de novo de purina y pirimidinas. Así, una sola molécula de glutamina es necesaria para la síntesis de uracil y timina, dos moléculas para la síntesis de citosina y adenina y tres para la síntesis de guanina. Además, para que tanto bases de purinas y pirimidinas se ensamblen es necesaria una molécula de aspartato, el cual es un catabolito de la glutamina. Por lo tanto, glutamina como donante
35 de grupo aminos es una de las moléculas pilares en la biosíntesis de nucleótidos (figura 9).
El oncogén c-myc también está regulando la biosíntesis de nucleótidos ya que está promoviendo la expresión de varias enzimas de la vía. Dentro de las enzimas reguladas por c-myc están la fosforibosil pirofosfato sintetasa (PRPS) la cual cataliza el primer paso de la síntesis de novo de nucleótidos purinas, también regula la expresión de CAD una proteina disfuncional fundamental en la síntesis de novo de pirimidinas (Cunningham et al. 2014; Eberhardy and Farnham 2001; Mannava et al. 2008). Otras proteínas diana de c-myc involucradas en la biosíntesis de nucleótidos son: timidilato sintetasa (TS), inosina monofosfato deshidrogenasa 1 (IMPDH1), inosina monofosfato deshidrogenasa 2 (IMPDH2) (Y.-C. Liu et al. 2008; Mannava et al. 2008). Además, las proteínas de síntesis de novo purinas PPAT, GART, PFAS, PAICS ADSL también son reguladas por c-myc (Y.-C. Liu et al. 2008; Mannava et al. 2008).
Figura 9. Biosíntesis de nucleótidos regulada por oncogenes. modificado de Pavlova and Thompson 2016.
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Las mutaciones de p53 han demostrado tener efectos sobre los genes que regulan la biosíntesis de nucleótidos como IMPDH1, IMPDH2, GMP sintetasa (GMPS) y enzimas relacionadas con las vías de recuperación deoxicitidina kinasa (DCK) y timidina kinasa (TK1) (Kollareddy et al. 2015). Por otro lado, como se mencionó previamente CAD es regulada por MAPK y por mTORC1. (Ben-Sahra et al. 2013; Graves et al. 2000;
Robitaille et al. 2013). La regulación mediada por mTORC1 permite a la célula activar CAD en respuesta a los niveles de glutamina intracelular contribuyendo a la activación de mTORC1 (Durán et al. 2012; Jewell et al. 2015). Además, la inhibición farmacológica de GART está inhibiendo la activación de mTORC1 vía disminución de los niveles RheB.
Lo que se traduce en una disminución de la concentración de nucleótidos de guanina y no de adenina. Sugiriendo que mTORC1 estaría regulando los niveles de purinas intracelulares (Emmanuel et al. 2017).
Hipótesis y Objetivos
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Hipótesis y Objetivos
Los mecanismos que determinan si la célula optará por realizar síntesis de novo de nucleótidos o potenciará las vías de recuperación cuando la asequibilidad extracelular de nucleósidos y nucleobases sea alta no son bien conocidos. A priori, el alto coste energético de la síntesis de novo nos induciría a pensar que las vías de recuperación son la mejor alternativa para facilitar el aporte de nucleótidos para la síntesis de ácidos nucleicos y la proliferación celular.
Tampoco está claro cuál es el sensor celular que permitiría detectar cambios en los niveles extracelulares de nucleósidos y nucleobases. No obstante, podríamos hipotetizar que uno de los posibles mecanismos sensores de estos cambios podría guardar relación con el transporte de nucleósidos a través de la membrana plasmática.
En este sentido, hasta cinco transportadores de nucleósidos naturales distintos han sido descritos hasta la fecha en membrana plasmática, lo cual podría sugerir cierta redundancia en su expresión y, eventualmente, un posible papel accesorio para alguno de estos subtipos de transportador más allá de su mera función como translocadores de nucleósidos.
Entre ellos, el transportado de alta afinidad hCNT3 es el único capaz de translocar de forma unidireccional y altamente concentrativa un amplio abanico de nucleósidos extracelulares, tanto purínicos como pirimídinicos. Al iniciarse este proyecto, en nuestro grupo de investigación se llevó a cabo una aproximación proteómica destinada a identificar posibles proteínas de interacción para hCNT3.
Fruto de esta primera aproximación proteómica se identificaron distintas proteínas candidatas a formar parte del interactoma de hCNT3, entre ellas, la proteína multifuncional ADE2 implicada en la síntesis de novo de purinas. ADE2 se conoce que se ensambla con toda la maquinaría enzimática responsable de la síntesis de novo de nucleótidos de purina mediante interacciones proteína-proteína, constituyendo una estructura supramolecular conocida como purinosoma.
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Debido a todo lo expuesto anteriormente la hipótesis de nuestro trabajo es:
“ADE2 puede contribuir a regular las vías de recuperación y de síntesis de novo de nucleótidos mediante interacciones proteína-proteína”.
El objetivo general de este trabajo es:
Determinar el rol de la proteína multifuncional ADE2 en la regulación de las vías de síntesis y de recuperación de los precursores de los ácidos nucleicos.
Los objetivos específicos de este proyecto son:
Establecer si la proteína ADE2 interacciona con el transportador concentrativo de alta afinidad hCNT3.
Estudiar el efecto de la modulación de los niveles de nucleósidos y nucleótidos sobre la expresión de ADE2 y los transportadores de nucleósidos.
Resultados y Discusión
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Resultados y Discusión
Identificación de ADE2 como parte del interactoma de hCNT3.
Mediante una aproximación proteomica utilizando el dominio N-terminal de hCNT3 como cebo, se identificaron una serie de posibles proteínas que podrían interaccionar con hCNT3. Entre ellas se encontraron proteínas que sugerían un sentido fisiológico al estar involucradas en el metabolismo de nucleótidos y nucleósidos. Estas proteínas fueron: Adenosina kinasa (ADK), la proteína multifuncional ADE2 (también llamada PAICS) y SAMHD1. ADK es la principal enzima que cataliza la transferencia de fosfato para la formación de AMP, por lo que es una enzima que está involucrada en la regulación del tono de adenosina y en la formación de los nucleótidos de adenina.
SAMHD1 es una trifosfohidrolasa que regula los niveles de dNTPs en las células. Además, su expresión ha sido asociada con efectos anti proliferativos y funciones supresoras en tumores (Kohnken, Kodigepalli, and Wu 2012). Estas posibles proteínas “partner” se han ido validando en el marco de otras tesis doctorales por diferentes miembros del grupo.
Para llevar a cabo esta tesis doctoral hemos decidido trabajar con la proteína multifuncional ADE2 ya que nos pareció de interés no sólo por su papel biológico, al ser imprescindible para la síntesis de novo de nucleótidos de purina sino también por catalizar la síntesis de SAICAR, el cual recientemente ha sido descrito como regulador de PKM2 activando vías de proliferación celular mediadas por ERK 1/2 (K. Keller et al. 2014).
Con el objetivo de validar la interacción, el primer ensayo que realizamos fue un
“GST- pull down” dirigido utilizando el dominio N-terminal de hCNT3 como cebo, y células de pacientes de leucemia linfoblástica crónica (LLC) como fuente de proteínas.
Este ensayo lo realizamos en las mismas condiciones que se había realizado el experimento con el cual encontramos las posibles proteínas de interacción de hCNT3.
Así comprobamos que al inmunoprecipitar con el N-terminal-hCNT3 se co- inmunoprecipitaba tanto ADE2 como ADK (figura 10A). Sin embargo, el resultado para ADE2 no fue del todo concluyente ya que en el control también se puede observar que se arrastró ADE2.
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Posteriormente, para continuar el estudio de interacción se eligió en primer lugar una línea celular derivada de LLC, MEC-1, y se comprobó si expresaba las proteínas de interés. Como se puede observar en la figura 10B, MEC-1 expresa hCNT3 y ADE2 al igual que las muestras de pacientes de LLC usadas en el ensayo GST-pull down.
Para la validación bioquímica de la interacción hCNT3 y ADE2 utilizamos ensayos de Co-IP en extractos proteicos de células MEC-1, en los cuales esperábamos que al inmunoprecipitar ADE2 arrastraríamos a hCNT3. Sin embargo, existe una baja inmunodetección de hCNT3 cuando se inmunoprecipita ADE2 (figura 11). Estos resultados sugieren que estas proteínas no estarían interaccionando entre sí o que la posible interacción sería muy débil como para detectarla mediante Co-IPs
Validación de la Interacción ADE2/ADK
El hecho de no haber logrado Co-inmunoprecipitar hCNT3 cuando arrastrábamos a ADE2, nos llevó a revisar el listado de posibles proteínas de interacción obtenidas
Figura 10. Identificación de ADE2 y ADK como proteína parter de hCNT3. A, “GST-pull down” dirigido contra muestras de pacientes con LLC. B, Expresión proteica de hCNT3 y ADE2 en extractos de células de un “pool” de pacientes con LLC y en células MEC-1.
Figura 11. Análisis de la interacción ADE2 hCNT3. Co-inmunoprecipitación de hCNT3 y ADE2 en células MEC-1. (n=5).
45 mediante la aproximación proteómica. Esta vez teniendo en cuenta que podría ser que la interacción con hCNT3 no fuese directa, sino que hubiese alguna proteína intermedia, y aprovechando que la interacción ADK-hCNT3 fue validada en el marco de la tesis doctoral de Olga Casulleras, nos planteamos la hipótesis que ADE2 podría estar interaccionando con ADK. Para validar esta hipótesis realizamos una Co-IP en células MEC-1, ya que sabíamos que expresaban endógenamente las tres proteínas.
Primeramente, inmunoprecipitamos ADK y luego detectamos ADE2. Como se observa en la Figura 12A no hubo Co-IP. Sin embargo, al realizar la IP contra ADE2 y luego inmunodetectar ADK, pudimos observar que si había detección (Figura 12B) sugiriendo que ambas proteínas están interaccionando.
Con el fin de determinar si hCNT3 podría tener algún efecto en la regulación de la expresión proteica de ADE2 y ADK, realizamos un silenciamiento transitorio de la proteina mediante un siRNA en células con expresión heteróloga estable del transportador (HEK293-CNT3), en las cuales previamente habíamos comprobado la expresión de ADK y ADE2. A 48h de silenciamiento transitorio de hCNT3 no se observan cambios en la expresión proteica de ADE2 ni de ADK tanto cuando utilizamos una concentración de siRNA de 200nM como cuando la incrementamos al doble (figura 13), lo cual sugiere que hCNT3 no regula la expresión de estas dos proteínas.
Figura 12. Interacción entre ADE2 y ADK. Las Co-IPs se realizaron en extractos celulares de MEC-1, las cuales fueron incubadas con 5ug del anticuerpo y posterior análisis de ambas proteínas. A, muestra el resultado de co-inmunoprecipitar ADK. B, Co-IP para ADE2 en la cual se detectó ADK.
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Posteriormente quisimos saber si existía algún tipo de regulación a nivel proteico entre ADE2 y las proteínas ADK y hCNT3. Para esto nuevamente utilizamos las células HEK293 CNT3. Las células fueron sembradas y luego de 24h se procedió mediante un siRNA a silenciar transitoriamente ADE2. Después de 48h y 72h del silenciamiento de ADE2 no se observó ningún tipo de regulación sobre ADK y hCNT3 a nivel de proteína (figura 14). Estos resultados nos permiten inferir que cuando rompemos la interacción ADE2/ADK por medio del silenciamiento transitorio de ADE2, no se observó efecto sobre la expresión proteica de ADK y hCNT3. Esto nos permite sugerir que las expresiones de estas proteínas no se regulan entre ellas.
Figura 14. Efecto del silenciamiento de ADE2 en la expresión de ADK y hCNT3. Las células HEK293 CNT3 fueron tratadas con 200nM de sIRNA de ADE2 por 48 y 72h. Posteriormente se analizó su expresión mediante westernblot. La figura muestra una imagen representativa de n=3.
Figura 13. Efecto del silenciamiento de hCNT3 en la expresión de ADE2. Las células HEK293 CNT3 fueron sembradas y 24h después fueron tratadas con dos concentraciones diferentes de siRNA de CNT3 (n=3).
47 La importancia de la función biológica de ADE2 y ADK nos permite anticipar que la implicación de su posible interacción debería ir más allá de la LLC. Con el objetivo de determinar si la interacción de ADE2 y ADK es específica de esta enfermedad o puede darse en otros contextos, quisimos analizar la expresión de mRNA de ambas proteínas en tejido sano y para eso utilizamos la base de datos Reactome (figura 15). La expresión de ambas proteínas en tejido sano es diferente, siendo ADE2 mucho más ubicua que ADK. Otro aspecto interesante es que ADE2 se expresa menos en tejidos absortivos como duodeno, intestino delgado y riñón. Cabe destacar que en estos tejidos existe una alta recaptación de nucleósidos mediada por los transportadores de nucleósidos (Pastor‐Anglada, Urtasun, and Pérez‐Torras 2018). Sin embargo, en hígado podemos ver que existe una alta expresión tanto de ADE2 como de ADK, lo cual concuerda con el papel del hígado en el metabolismo de nucleótidos. Ya que el hígado es el órgano donde se produce una síntesis de novo activa y controla los niveles de nucleobases libres y nucleósidos para que otros tejidos las recuperen (Fustin et al. 2012).
Por otro lado, analizamos la expresión de ADE2 y ADK en distintas líneas celulares con las que contamos en el laboratorio, la mayoría de las cuales provienen de cáncer humano. Concretamente se utilizaron líneas derivadas de colangiocarcinoma (BCLC12, EGI1, TKF1), adenocarcinoma pancreático (NP9 Y CP15T) cáncer colorectal (HT-29 y CaCo2), cáncer de mama (T47 y MDA468), leucemia linfática crónica tipo B (MEC-1), HEK293 CNT3 y su respectivo control HEK293 pcDNA5. En todas ellas se detectó
PAICS ADK
Tejidoadiposo Glándulaadrenal Médulaósea Cortezacerebral Colon Duodeno Endometrio Esófago Trompasdefalopio Vesícula biliar Corazón Riñón Hígado Pulmón Ganglios Ovarios Páncreas Placenta Próstata Recto Glándulasalival Músculoesquelético Intestinodelgado Músculoliso Bazo Estómago Testículos Tiroides Tonsila Vejiga Apéndice Piel
Figura 15. Expresión del mRNA de PAICS y ADK en diferentes tejidos sanos. Datos obtenidos desde la base de datos Reactome, correspondiente a 70 pacientes.
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claramente la expresión de ADE2 y ADK (figura 16). Además, en hepatocitos primarios, los cuales utilizamos como control no tumoral, también se expresa ADE2.
Si comparamos los resultados obtenidos a partir de Interactome con los resultados obtenidos de expresión de proteínas, podemos observar que en las células tumorales existiría un cambio en la expresión de ambas proteínas. Ya que curiosamente en páncreas se observa una baja expresión de ambas proteínas en los resultados obtenidos de Interactome pero, al analizar las líneas celulares tumorales de origen pancreático podemos ver que ambas proteínas se expresan, lo cual concuerda con los cambios metabólicos que tiene una célula tumoral.
Al analizar las células que disponemos en nuestro grupo decidimos comenzar a trabajar con una línea celular de cáncer de colon, concretamente con HT-29 porque esta línea celular expresa las dos isoformas de ADK, una citoplasmática de menor peso molecular (también llamada corta) y otra nuclear de mayor peso (también llamada larga). Además a diferencia de MEC-1 esta linea presenta la ventaja que al crecer en monocapa es más fácil de manipular y de transfectar.
Figura 16. ADE2 y ADK se expresan en diferentes líneas tumorales. Para en análisis de la expresión proteica se utilizó 5µg los cuales fueron analizados por medio de westernblot.
49 Aprovechando que ambas proteínas han sido cristalizadas (Li et al. 2007;
Mathews et al. 1998) y por tanto son de estructura conocida, en colaboración con el Dr. Juan Fernández-Recio (Barcelona Supercomputing Center & CSIC) se generó un modelo de interacción de proteína-proteína. Mediante modelamiento bioinformático se comprobó que las diez posiciones de interacción de mayor energía convergían en un solo dominio de ADE2, que presumiblemente sería el que estaría interaccionando con ADK. El modelo generado fue suficiente para poder identificar los residuos que podrían participar directamente en esta interacción (figura 17). Como se observa en la tabla 1 sólo se identificaron dos posibles residuos para ADK, mientras que para ADE2 se identificaron 34 residuos. De los residuos identificados para ADE2, 30 de ellos poseen un índice NIP mayor a 0.2 y cuatro residuos poseen índice NIP mayor a 0.5.
Tabla 3. Posibles residuos involucrados en la Interacción ADE2/ADK.
Residuos de
ADK NIP Residuos de ADE2 NIP
R321, D343 0.2 K125, S166, F121, G373, V359, K414 0.2 - - D417, Y119, D163, E174, L378, W399, C374 0.3 - - R403, W363, V362, V377, Q389, Q170, L413,
S375, T376, H167, I406, Y122 0.4
- - F386, L366, P123, W410 0.5
Figura 17. Modelo de interacción ADE2-ADK en el que se muestran los residuos más propensos a participar de la interacción. 2H31 corresponde al cristal de ADE2 mientras que, 1BX4 corresponde al de ADK.
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El índice NIP representa la frecuencia de un determinado residuo que se encuentra en la interfase de las dos proteínas entre las soluciones de menor energía.
Mientras mayor sea el valor del NIP mayor es la probabilidad que el residuo se encuentre involucrado en interacciones con la proteína de interacción, que en este caso corresponde a ADK. De los cuatro residuos con índice NIP de 0.5 decidimos trabajar con los residuos F386 y W410. F386 se encontraría en el sitio de unión en todos los modelos bioinformáticos que se realizaron y estaría interaccionando con residuos aromáticos de ADK. Al igual que el residuo F386, W410 está interaccionando con otros aminoácidos aromáticos. El hecho de no haber escogido los otros residuos con NIP 0.5 obedece a que a nivel estructural la P123 podría ocasionar un cambio muy drástico en la conformación de la proteína lo cual podría inducir una pérdida de su función. Además, el residuo P123 se encuentra involucrado en la región en donde esta enzima realiza su primera función (SAICAR sintetasa) mientras que los otros residuos se encuentran en la región donde se realiza la segunda función (AIR carboxilasa). El hecho de no escoger la L366 es debido a que la mutación por alanina no produciría una ruptura de gran energía lo que no nos permitiría teóricamente romper la interacción. Por otro lado, debido al bajo índice NIP que poseían los posibles residuos involucrados en la interacción en ADK decidimos no trabajar con ellos.
La identificación de estos residuos también nos permitió explicar por qué al inmunoprecipitar ADK no estábamos detectando ADE2. Esto se debe a que la región que reconoce el anticuerpo es la que estaría hipotéticamente interaccionando con ADE2.
El hecho de que tanto ADE2 como ADK se expresan simultáneamente en todos los modelos analizados ya sean tumorales como no tumorales, nos planteó una limitación experimental importante para poder determinar la implicación de los residuos identificados en la interacción de ambas proteínas. A raíz de esto, nos vimos en la necesidad de disponer de un modelo celular libre de ADE2, por lo que decidimos generar una línea celular KO. Para esto utilizamos el sistema de ADE2 CRISPR CAS9 KO (Santa Cruz Technologies).
51 Para la obtención del KO primeramente trabajamos con células HT-29. Las células fueron co-transfectadas con el sistema de la compañía Santa Cruz el cual posee una mezcla que contiene vectores con tres diferentes gRNAs y con otro vector que le otorga resistencia a puromicina, expresión de RFP (red fluorescent protein) y que promueve la HDR (Homology Directed Repair). Una vez transfectadas, las células fueron mantenidas en DMEM (10% FBSI + glutamina) y puromicina 2µg/mL. Luego de cinco días de tratamiento se procedió a aislar colonias, las cuales fueron amplificadas hasta obtener las cantidades de células necesarias para analizar la expresión de ADE2 a nivel proteico y a nivel de mensajero. Lamentablemente, en las HT-29 no se logró obtener una disminución de la expresión a nivel de proteína ni a nivel de mRNA (figura 18). Este resultado nos llevó a pensar que seguramente al ser HT-29 una línea de origen tumoral e hipertripliode podría estar dificultando la correcta incorporación de la CAS9 en el genoma y que por este motivo no se logró obtener el KO.
Posteriormente, decidimos buscar una línea no tumoral en la que se hubiese logrado realizar correctamente un CRISPR KO. De todas las líneas celulares que tenemos en el laboratorio las que han sido más comúnmente utilizadas por otros autores para realizar KO son HEK293 y HeLa. Nosotros optamos por trabajar con las HEK293 por ser un modelo ampliamente utilizado y caracterizado en nuestro grupo. Sin embargo, esta vez intentamos realizar una estrategia diferente ya que a las 72h post-transfección medimos en el pool de células transfectadas los niveles del mRNA y de proteína de ADE2.
Tanto a nivel de mensajero como de proteína estas células expresaban menos ADE2 comparadas con las células HEK293 controles (figura 19).
Figura 18 Expresión de ADE2 en células HT-29 con CRISPR KO ADE2. A, Westernblot representativo de las colonias analizada. B, qRT-PCR de dos colonias aisladas comparadas con la expresión de las células sin el KO.
