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Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum Estudio in vitro

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Academic year: 2020

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(1)Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro. INVESTIGADORES PAOLA BERNATE CASTRO KATHERINE NIÑO SALINAS ERIKA PATRICIA PINEDA MATEUS JUAN CAMILO TORRES OLARTE. UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2019 1.

(2) Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro. INVESTIGADORES PAOLA BERNATE CASTRO KATHERINE NIÑO SALINAS ERIKA PATRICIA PINEDA MATEUS JUAN CAMILO TORRES OLARTE. Asesor ALVEIRO TUPAZ ERIRA DMD, MsC en Bioquímica, Universidad Nacional de Colombia. PhD (c) ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Javeriana.. UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2019 2.

(3) Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro. INVESTIGADORES PAOLA BERNATE CASTRO KATHERINE NIÑO SALINAS ERIKA PATRICIA PINEDA MATEUS JUAN CAMILO TORRES OLARTE. Trabajo de Grado presentado para optar el título de Odontólogo. Asesor ALVEIRO TUPAZ ERIRA DMD, MsC en Bioquímica, Universidad Nacional de Colombia. PhD (c) ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Javeriana.. UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA BOGOTÁ D.C. 2019 3.

(4) Bogotá, D.C, mayo 2019 4.

(5) DEDICATORIA A nuestros padres, quienes siempre nos han brindado su apoyo y cariño, por ser una guía constante para alcanzar nuestras metas, ya que con su enseñanza logramos ser seres humanos íntegros. Infinitas gracias por creer en lo que somos y en nuestro potencial.. 5.

(6) AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a: Yeisson Espinosa Villamizar., por su acompañamiento durante el proceso en este proyecto, por su tiempo, comprensión, apoyo y sobre todo paciencia. Alveiro Erira, por acogernos y guiarnos para finalizar de manera exitosa esta investigación.. 6.

(7) TABLA DE CONTENIDO GLOSARIO.............................................................................................................. 8 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 9 1 CONTEXTO DE LA INVESTIGACIÓN............................................................ 10 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN. .................. 10 1.2 MARCO TEÓRICO ................................................................................... 13 1.3 MARCO REFERENCIAL .......................................................................... 16 1.4 JUSTIFICACIÓN ...................................................................................... 18 1.5 OBJETIVOS ............................................................................................. 19 1.5.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................... 19 1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................. 19 2 MÉTODO ........................................................................................................ 21 2.1 TIPO DE ESTUDIO .................................................................................. 21 2.2 CRITERIOS DE INCLUSIÓN ................................................................... 21 2.3 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN .................................................................. 21 2.4 MUESTRA ................................................................................................ 21 2.5 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES .............................................. 21 2.6 HIPÓTESIS .............................................................................................. 22 2.7 PROCEDIMIENTO ................................................................................... 22 2.8 RECOLECCIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA INFORMACIÓN. ... 24 2.9 ASPECTOS ÉTICOS ............................................................................... 24 3 RESULTADOS ............................................................................................... 25 4 DISCUSIÓN .................................................................................................... 27 5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................. 29 REFERENCIAS ANEXOS Anexo 1. Protocolo cultivo bacteriano. 7.

(8) GLOSARIO . Alopático: sistema por el cual los profesionales de la atención de la salud, tratan los síntomas y las enfermedades por medio de medicamentos, radiación o cirugía. (1). . Antisépticos: sustancia o medicamento que se emplea para destruir los gérmenes que infectan un organismo vivo o para evitar su existencia.(2). . Biofilm: comunidad microbiana de células adheridas a una superficie en la que las células se mantienen unidas gracias a una matriz extracelular(3). . ENSAB: Estudio Nacional de Salud Bucal(4). . Homeopático: Método curativo que se fundamenta en la aplicación de sustancias naturales.(5). . OMS: Organización Mundial de la Salud(6). . UFC: Unidad Formadora de Colonias. 8.

(9) INTRODUCCIÓN La enfermedad periodontal es una patología que afecta los tejidos del periodonto, produciendo la perdida de inserción de estos, movilidad dental, sangrado gingival e inflamación. En Colombia se ha evidenciado gran prevalencia, por esto se ha hecho necesario estudiar diferentes alternativas de tratamiento novedosas que a su vez disminuyan los efectos secundarios que los métodos convencionales producen. El Objetivo de este proyecto fue Determinar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum. Se realizó un estudio experimental In Vitro, en donde se examinó a Fusobacterium nucleatum, determinando la actividad antimicrobiana que el aceite esencial de Cannabis sativa presentó sobre este, en diferentes concentraciones 20, 40, 60, 80,100%. Se realizó la activación de la cepa que se encontraba conservada a 20°C en suspensión de leche descremada, se procedió a descongelarla tomando un volumen de 100 µl, y fueron inoculadas en agar sangre suplementado utilizando la técnica de siembra masiva, luego se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis, posteriormente se tomó una UFC y se realizó un pase de siembra por técnica de rejilla, en agar Wilkins Chalgren suplementado con hemina y menadiona, se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis. Se depositó el inoculo y se incubó por 24 horas, pasadas estas se midió el halo de inhibición en cada una de las concentraciones, obteniendo como resultado que, Cannabis sativa sí presenta actividad antimicrobiana sobre Fusobacterium nucleatum y que su efecto fue similar al presentado con la clorhexidina.. 9.

(10) 1 1.1. CONTEXTO DE LA INVESTIGACIÓN PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN.. Las enfermedades periodontales son alteraciones patológicas de etiología multifactorial en donde se encuentran implicados la bio película y algunas enfermedades sistémicas que alteran los tejidos del periodonto (encía, ligamento periodontal, cemento radicular y hueso inicialmente se presenta como gingivitis, con signos característicos como la inflamación y el sangrado gingival, el no realizar el tratamiento a tiempo genera periodontitis, donde aparte de las dos manifestaciones ya mencionadas, provoca pérdida de inserción de la encía y hueso(7) esto podría ocasionar pérdida dental. Entre los microorganismos patógenos. propios. de. actinomycetemcomitans,. la. enfermedad. Porphyromonas. se. encuentran:. gingivalis,. Bacteroides. Actinomices forsythus,. Veillonella paraula, Streptococcus sanguis, Prevotella intermedia, Fusubacterium nucleatum(8). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades periodontales afectan de un 15% a 20% adultos entre los 35 a 44 años a nivel mundial (6), los resultados del ENSAB IV en Colombia destacan que en la mayor parte de la población (61.8%) se evidenció periodontitis en sus diferentes grados de severidad, siendo más frecuente la periodontitis moderada (43.46%), seguida por la periodontitis avanzada (10.62%), y muy poca población se clasifico como sin periodontitis (38,20%), con lo cual se crea una urgente necesidad de intervenir en esta problemática (4).. 10.

(11) La periodontitis como ya se mencionó es de etiología multifactorial, en la cual interactúan los microorganismos y el huésped. Los microorganismos actúan como los iniciadores del proceso infeccioso, la susceptibilidad del huésped frente a esta enfermedad va estar determinada por factores de riesgo de tipo ambiental, sistémico y genético; la presencia de dos o más factores de riesgo en una persona aumentan la probabilidad de sufrir algún tipo de enfermedad periodontal (9). Siguiendo esto, el estilo de vida ha sido catalogado como un factor de riesgo que puede llegar a ser modificado, en este podemos encontrar el tabaquismo, alcoholismo, falta de ejercicio, mala alimentación, entre otros; El tabaquismo es el más significativo de estos, ya que se ha encontrado que dependiendo de su dosis se presenta la severidad de la enfermedad y que a su vez puede llegar a alterar la cicatrización de los tejidos bucales(10). Como factores sistémicos se puede encontrar la diabetes mellitus mal controlada, esta es una enfermedad caracterizada por la presencia de inflamación sistémica, en donde la periodontitis y candidiasis oral son sus manifestaciones bucales más prevalentes(9). Los microorganismos también hacen parte de los factores de riesgo para desarrollar la enfermedad periodontal y, han sido clasificados en complejos, Socransky. mediante. un. estudio. de. placa. sub-gingival,. agrupó. los. microorganismos por colores dependiendo su función y momento de aparición durante la enfermedad, en total salieron 6 complejos: el complejo amarillo está constituido por los colonizadores pioneros, en su gran mayoría Streptococos. El complejo azul está formado por microorganismos de co-agregación, haciendo parte de ellos las especies del género Actinomyces. El complejo purpura está compuesto por microorganismos colonizadores secundarios como Veionella 11.

(12) párvula. En el complejo verde se encuentran anaerobios que hacen parte de la placa madura como Aggregatibacter actinomycetemcomitans. El complejo naranja se compone de Fusubacterium nucleatum este es un microorganismo gramnegativo catalogado como puente entre las comunidades pioneras y los microorganismos característicos de la enfermedad periodontal. Por último está el complejo rojo, al cual pertenecen los microorganismos propios de la enfermedad periodontal como Porphyromonas gingivalis (11). Como alternativas para el tratamiento de esta enfermedad existen diferentes terapias como la instrumentación mecánica o con ultrasonido (12) y la utilización de co-adyudantes tipo antisépticos y en algunos casos antibióticos (13) para la disminución de la placa bacteriana y la inflamación, lo que lleva en un corto plazo a lograr detener la pérdida de inserción del periodonto (12,13). El antiséptico de elección ha sido por mucho tiempo la Clorhexidina al 0.2% debido al amplio espectro que posee frente a estos microorganismos. Sin embargo, se deben tener en cuenta los efectos colaterales de esta: coloración parda de los dientes o de algunos materiales de restauración, erosión de la mucosa bucal y del dorso de la lengua (14), perturbación del gusto (15,16), tumefacción unilateral o bilateral de la parótida, aumento de la formación de cálculos supra-gingivales (este efecto puede deberse a la precipitación de proteínas de la saliva sobre la superficie dental), sabor amargo (16). Desde hace tiempo se ha evidenciado el uso indiscriminado de antimicrobianos, lo que ha creado una resistencia de los microorganismos. Debido a esto, los agentes antimicrobianos naturales han captado la atención y proponen una nueva alternativa como co-ayudante. 12.

(13) Uno de estos grupos de agentes antimicrobianos naturales que se ha utilizado durante siglos en naturopatía es el botánico derivado de aceites esenciales, debido a que han sido reconocidos por sus propiedades antiinflamatorias, antimicrobianas y antioxidantes (17). 1.2. MARCO TEÓRICO. Las enfermedades periodontales crónicas se. definen. como. enfermedad. inflamatoria del periodonto (tejido que rodea los dientes) (18),son alteraciones patológicas de etiología multifactorial en donde están implicada placa bacteriana, microorganismos patógenos y enfermedades sistémicas que alteran los tejidos del periodonto (18–20) .y. son un problema de salud pública a nivel mundial y. especialmente en los países en vía de desarrollo, ya que según la OMS afectan a un 15%-20% de los adultos de edad media 35-44 años(6). En 2009 se realizó un estudio en Estados unidos en el cual se evaluó la condición periodontal de 3.743 personas mayores de 30 años. Sus resultados arrojaron que el 47% de la población padecía periodontitis en algún grado de severidad con tendencia al aumento en periodontitis moderada acorde al incremento de edad(21). Un segundo estudio realizado en 1997 en Alemania en el que se evaluaron 4.310 personas mayores de 20 años, de las cuales 50.9% de los adultos presentó periodontitis entre moderada y severa. Igual presentando la edad como un factor predisponente al potenciamiento de su severidad(22). El último estudio realizado en Colombia a cerca de la salud buco dental de sus habitantes ENSAB IV tiene resultados preocupantes en materia de prevalencia de la periodontitis, puesto que, arroja un 61.8% de personas que padecen esta 13.

(14) enfermedad en sus diferentes grados de severidad, siendo más asidua la periodontitis moderada(4). Teniendo en cuenta los estudios anteriores si se realiza una comparación Colombia tiene el mayor porcentaje de población con periodontitis entre moderada y severa presentando un 54.8%, seguido de Alemania con un 50.9%, Estados Unidos con un 47% y por ultimo Australia con 22.9%. Dentro de los factores de riesgo de la enfermedad periodontal entendiéndose factor de riesgo como cualquier característica del individuo que incremente la posibilidad del individuo de padecer la enfermedad se encuentran: estilo de vida (cigarrillo), sistémicos (diabetes Mellitus, enfermedad cardiovascular, neumonía, embarazo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica e isquemia cerebrovascular),. microbianos(Porphyromonas. actinomycetemcomitans,. Bacteroides. gingivalis,. forsythus,. Aggregatibacter. Fusobacterium. nucleatum),. psicológicos (Depresión), genéticos, familiares y sociodemográficos. Asimismo, se detecta en estudios realizados en ratas a Actinomyces viscosus como posible agente causal de la periodontitis. Luego de 1980 se define que la etiología de la enfermedad periodontal como multifactorial. Es decir, en ellas intervienen los microorganismos y un hospedero susceptible, siendo los microorganismos factores etiológicos esenciales es decir son el factor etológico directo que causa esta enfermedad(9). Específicamente se debe a la proliferación de la placa dental formada por un número de especies bacterianas ubicadas en el surco gingival, estos microorganismos son anaerobios en un 90%, se distribuyen en:. Aggregatibacter. actinomycetemcomitans,. Bacteroides. forsythus,. Fusobacterium nucleatum vincentii ss, Peptomicros estreptococo, P. gingivalis, 14.

(15) Prevotella. intermedia,. Streptococcus. intermedius,. Rectus. Campylobacter. espiroquetas(9,18). La Biopelícula (formada después de varios días de una deficiente higiene oral), da como resultado un desplazamiento de microorganismos anaerobios gram negativos a órganos móviles(23) como es el caso de los de. Fusobacterium. nucleatum Género Fusobacterium: bacilos largos, inmóviles, anaerobia, de las especies aisladas de este género se ha diferenciado a Fusobacterium nucleatum como la única potencialmente patógena y se asocia a la enfermedad periodontal ya que es el puente entre los microorganismos pioneros y los propios de la enfermedad(24). Dentro de los tratamientos instaurados para la enfermedad periodontal ha sido por excelencia la instrumentación mecánica, que se basa en realizar un raspaje y alisado radicular, ya sea utilizando instrumental manual, sónico, ultrasónico. Se ha evidenciado en diferentes estudios clínicos la respuesta que se tiene de estos tratamientos frente a la periodontitis crónica, lo que la hace sin duda el tratamiento a elección para cualquier enfermedad periodontal(25), junto con esta se utilizan coadyuvantes que ayudan a la disminución de microorganismos, se han escogido los antibióticos y antisépticos como la clorhexidina (2,26) Pero a través del tiempo los microorganismos se han adaptado y han creado una resistencia bacteriana a los antibióticos(27) estos han sido reconocidos desde que se introdujeron los primeros usos clínicos. El microorganismo en cuestión tiene la capacidad de destruir el antibiótico o de crecer en su presencia (27). Debido a esto se ha optado por utilizar diferentes extractos naturales como co-ayudantes dentro. 15.

(16) de. los. cuales. encontramos. diversas. plantas. y. frutos. con. actividad. antimicrobiana(28). Cannabis sativa es una planta que existe desde tiempos inmemoriales, y a la cual se le han retribuido numerosos beneficios para el tratamiento de diferentes enfermedades(17,28).Es. una. especie herbácea. de. la familia Cannabaceae, originaria de las cordilleras del Himalaya, Asia. Se ha utilizado durante miles de años como planta medicinal con registros escritos que datan de 2737 a. C.. Se ha utilizado en el tratamiento de pacientes con. enfermedades crónicas debilitantes tales como VIH / SIDA, dolor crónico no oncológico, epilepsia(29), múltiple la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis de la gestión de síntomas tales como dolor, náuseas, falta de sueño, ansiedad y estrés. Cannabis sativa es compleja en su composición química; contiene más de 525 productos químicos conocidos. La clase más conocida y más específica de cannabis constituyentes es los cannabinoides terpenophenolic C21, con delta-9tetrahidrocannabinol. (THC). es. el. más. constituyente. psicológicamente. activo(17,28,29). Por lo cual su utilización debe hacerse de manera propicia sin embargo se comprobó que tiene presente terpenoides normales con lo cual se informa que es usado como cualquier otro aceite esencial del mercado(17,28). 1.3. MARCO REFERENCIAL. Cannabis sativa es una planta conocida en todo el mundo bajo diferentes subtipos y derivados, es de origen oriental y el primer cultivo realizado data de hace 5000 años y desde entonces ha sido utilizada como materia prima para diferentes productos entre ellos fibras para material textil y aceites esenciales para uso medicinal(30). 16.

(17) Comúnmente los canabioides son relacionados con solo una partícula en especial THC que se encarga de activar el sistema nervioso central sin embargo para las personas del común son desconocidos los efectos. de los cannabinoides no. alucinógenos o cannabinoides no clásicos. Los cannabinoides clásicos son relacionados estructuralmente con el tetrahidrocannabinol, los cannabinoides no clásicos como Los aminoalquilindoles, los eicosanoides relacionados con los endo-cannabinoides,. 1,5-diarilpirazoles,. quinolinas. y. aril-Sulfonamidas. y. compuestos adicionales, son aquellos poco estudiados y los que poseen propiedades diferentes a alucinaciones. Los aceites esenciales, especialmente las de las variedades legales de Cannabis sativa, han recibido muy poca relevancia por parte de los investigadores en el mundo, a pesar de la importancia y potencial que pueda tener en la tecnología médica específicamente en el campo de la fito-medicina, la disciplina de estudio de los derivados farmacéuticos derivados de plantas. Por ejemplo, las propiedades antimicrobianas de los aceites de Cannabis sativa, pueden utilizarse contra patógenos nosocomiales, de deterioro y de origen alimentario en específico de origen bacteriano (31) Dentro del empirismo de la medicina alopática y la experticia de la fito-medicina en conjunto, desarrollaron aceites esenciales de sus semillas que tenían hasta un 95% de pureza en cuanto moléculas presentes (32). Estudios comprobaron que estos aceites esenciales de cannabis sativa tuvieron efecto mínimo inhibitorio en algunas bacterias gram (+) como Enterococcus hirae, Enterococcus faecium y S. salivarius, bacil- lus subtilis, Staphylococcus aureus y gram (-) como Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa en los cuales mostró una actividad inhibitoria 17.

(18) mayor (32). En otro estudio se señaló que en plantas sembradas en los países nórdicos la molécula de THC desciende y otras elevan su crecimiento dando una mejor actividad antimicrobiana (33) esto afirmando la teoría de que las moléculas no alucinógenas poseen propiedades medicinales no solo analgésicas si no también antibacterianas. Otro estudio demostró que la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa va más allá de bacterias gram y tiene presencia inhibitoria también en hongos (34) teniendo en cuenta la resistencia que han creado muchas de las bacterias debido a la utilización y el abuso de medicamentos antibióticos(35) hacen del efecto del aceite esencial del cannabis sativa. una. alternativa. para. tratar. enfermedades. causadas. por. estos. microorganismos. 1.4. JUSTIFICACIÓN. El aceite esencial de Cannabis Sativa ha presentado actividad antimicrobiana en la mayoría de cepas gram-positivas y algunas gram-negativas, como se presenta en los estudios de Hossein Sarmadyan (33). Otros investigadores han encontrado que los compuestos bioactivos le dan la capacidad de inhibir irreversiblemente y causar la muerte celular bacteriana, sin llegar a producir efectos secundarios como los antisépticos comunes (18,19). Los. estudios. demuestran. que. utilizando. co-ayudantes. de. tipo. natural. específicamente aceites esenciales, se logra una reducción de la carga bacteriana, ya que presentan actividad antimicrobiana(2). Annona muricata ha mostrado. actividad. contra. Streptococcus. mutans,. Streptococcus. mitis,. Porphyromonas gingivalis y Candida albicans, por otro lado, Robinia pseudoacacia presentó actividad frente a Porphyromonas gingivalis (36).El aceite de timol 18.

(19) (extraído de la planta de tomillo), ha sido conocido por su amplio espectro antimicrobiano, posee múltiples propiedades biológicas tales como la actividad antiinflamatoria, antioxidante, hepato protectora y antitumoral (20). El mecanismo detrás de esta actividad antibacteriana incluye permeabilización y despolarización de la membrana citoplasmática, reduciendo el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática. Esta reducción en el gradiente de pH también afecta negativamente a la fuerza motriz del protón que conduce al agotamiento del ATP intracelular causando la muerte celular. La enfermedad Periodontal es una alteración de los tejidos de soporte de origen inflamatorio causada por la formación y persistencia de una biopelícula bacteriana (11,12) donde se da una pérdida de inserción de los tejidos del periodonto, debido a que la enfermedad periodontal es la sexta enfermedad con más prevalencia a nivel mundial(18), surge la necesidad de seguir indagando acerca de la actividad antimicrobiana de productos naturales como el aceite esencial de cannabis sativa y la respuesta de microorganismos patógenos como Fusobacterium nucleatum, ya que es el puente entre los microorganismos pioneros de la enfermedad periodontal y así poder dar una nueva alternativa en el tratamiento de estas enfermedades. 1.5. OBJETIVOS. 1.5.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum. 1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Establecer la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Cannabis Sativa sobre Fusobacterium nucleatum. 19.

(20) Comparar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis Sativa versus la clorhexidina al 0.2 % sobre Fusobacterium nucleatum.. 20.

(21) 2. MÉTODO. 2.1 TIPO DE ESTUDIO Estudio Experimental In Vitro 2.2. CRITERIOS DE INCLUSIÓN. Cepas viables. 2.3. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN. Crecimiento atípico. 2.4. MUESTRA. Fusobacterium nucleatum. 2.5. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES. VARIABLE. DEFINICIÓN. OPERACIONALI. ESCALA. RECOLECCIÓN. ZACIÓN. DE. Y REGISTRO. MEDICIÓN Actividad. Eliminación. de 1.Presente. antimicrobiana. microorganismos. 2.Ausente. Cuantitativa. Halo de. discreta. Inhibición(mm). o inhibición de su. Excel resultados. crecimiento mediante. Cannabis Sativa. una. sustancia Concentración. Concentración. mínima. más baja de un. 1.20% 2.40%. antimicrobiano. 21. Cuantitativa. Halo de. ordinal. Inhibición(mm).

(22) inhibitoria. que se necesita 3.60%. Excel resultados. para. Cannabis Sativa.. inhibir el. 4.80%. crecimiento de un microorganismo 2.6. 5.100%. HIPÓTESIS. NULA: El aceite esencial de cannabis sativa NO tiene actividad antimicrobiana sobre Fusobacterium nucleatum. ALTERNA: El aceite esencial de Cannabis sativa Sí tiene actividad antimicrobiana sobre Fusobacterium nucleatum. 2.7. PROCEDIMIENTO. Fase 1: selección bacteriana y del aceite esencial. -Selección de la cepa bacteriana: Fusobacterium nucleatum -Selección del aceite. Aceite Esencial de Cannabis sativa Fase 2: Preparación de la solución de trabajo y dilución en diferentes concentraciones Se realizó una solución de trabajo con el extracto puro de Cannabis sativa, ya que por sus características viscosas y resinosas fue imposible tomar las cantidades necesarias con la pipeta para realizar las diferentes diluciones con exactitud. Para esto se realizó una dilución del extracto en agua destilada y tween 1:1:1, obteniendo un volumen final de 300 µl; posteriormente, se procedió a realizar las diluciones de trabajo al 20,40, 60, 80 y 100% en agua destilada.. 22.

(23) Concentración. Solución de trabajo. Agua destilada. Volumen final. 20%. 20 µl. 80 µl. 100 µl. 40%. 40 µl. 60 µl. 100 µl. 60%. 60 µl. 40 µl. 100 µl. 80%. 80 µl. 20 µl. 100 µl. 100%. 100 µl. 0 µl. 100 µl. Fase 3: Activación bacteriana. La cepa se encontraba conservada a -20°C en suspensión de leche descremada, se procedió a descongelarla tomando un volumen de 100 µl, y fueron inoculadas en agar sangre suplementado con hemina y menadiona, utilizando la técnica de siembra masiva. Luego se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis, posteriormente se tomó una UFC y se realizó un pase de siembra por técnica de rejilla, en agar Wilkins Chalgren suplementado con hemina y menadiona, se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis. Se tomaron 3-5 UFC de una caja previamente sembrada, con asa bacteriológica para ser solubilizadas en caldo tioglicolato, y así alcanzar una concentración MacFarland 1 (3x108 células/mililitro). Se depositó el inoculo y se sembró sobre las superficies de agar Wilkins Chalgren suplementado con hemina y menadiona, seguido a esto se realizaron pozos sobre la superficie del agar con un sacabocados estéril de 6mm de diámetro y en cada uno de ellos se depositaron 20 µl de las diluciones del extracto puro de Cannabis sativa al 20,40,60,80,100% respectivamente, Clorhexidina al 0,2% (control positivo) y agua con Tween 20 (control negativo), cada uno de estos ensayos se. 23.

(24) realizaron por triplicado, y se procedió a incubar por 24 horas a 37°C, posteriormente se midieron los halos de inhibición. 2.8. RECOLECCIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA INFORMACIÓN.. Los datos obtenidos fueron registrados en la base de datos realizada en Excel llamada resultados Cannabis Sativa. Los análisis fueron realizados por medidas de tendencia central, medidas de dispersión y T-Student. 2.9. ASPECTOS ÉTICOS. Según la resolución número 8430 de 1993 (octubre 4), artículo 63 aquellas instituciones. investigadoras. en. las. que. se. realice. investigación. con. microorganismos patógenos o material biológico que puedan contenerlos deberán contar con instalaciones y equipo de laboratorio adecuado a las normas estipuladas,. donde. se. garantice. la. correcta. manipulación. de. estos. microorganismos. Para la evaluación de riesgo el artículo 67 evalúa las normas técnicas y correspondientes que clasifican a los microorganismos. Grupo de riesgo l, microorganismos que representan escaso riego para el individuo y la comunidad. Los residuos generados por la manipulación de los materiales utilizados en el laboratorio de microbiología durante el manejo de las cepas bacterianas serán desechados de acuerdo a los protocolos de manejo de residuos de la universidad descritos en el Decreto 2676 de 2000 “Por el cual se reglamenta la gestión integral de los residuos hospitalarios y similares”.. 24.

(25) 3. RESULTADOS. Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum Al realizar las pruebas antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria, se evidenció que al diluir el aceite esencial de Cannabis sativa en Tween 20 y agua, las propiedades antimicrobianas disminuían, por lo cual no fue posible determinar la concentración mínima, sin embargo, se pudo determinar una actividad inhibitoria al 100% del aceite esencial sobre Fusobacterium nucleatum con un halo inhibitorio de 4,2mm ± 0,85 SD. Grafico 1. Actividad antimicrobiana del Aceite esencial de Cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum 6 0.65 0.85. Halo de inhibición (mm). 5 4 3 2 1 0. 0. 0. 0. 0. 20%. 40%. 60%. 80% Concentración. 25. 0 100%. clorhexidina agua+tween.

(26) Efecto del Aceite esencial de Cannabis sativa vs clorhexidina al 0,2% sobre Fusobacterium nucleatum Teniendo en cuenta que el aceite esencial de cannabis sativa no mostró efecto inhibitorio en concentraciones del 20%, 40%, 60%, y 80% no fue posible realizar una comparación con la clorhexidina; sin embargo, como la concentración del 100% del aceite esencial de cannabis fue la única que mostró un efecto inhibitorio sobre fusobacterium nucleatum se realizó la comparación con clorhexidina al 0,2 % y se observó que el aceite esencial generó un halo de inhibición de 4,2mm ± 0,85 SD, mientras que la clorhexidina generó un halo de inhibición de 4,6mm ± 0,65 SD. Las diferencias no fueron estadísticamente significativas con un valor p=0.50. 26.

(27) 4. DISCUSIÓN. Según los resultados obtenidos, se puede evidenciar que cannabis sativa tiene efecto antimicrobiano sobre Fusobacterium nucleatum, y que este efecto es similar al de la clorhexidina al 0.2%; aunque no se encontraron estudios similares donde se determine el efecto antimicrobiano de cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum, sí se encontraron estudios del efecto antimicrobiano sobre cepas gram positivas y gram negativas por lo cual se realizaron algunas comparaciones entre los estudios. Ali Esra et al en el 2012 (37) evaluaron la actividad antimicrobiana de Cannabis sativa como aceite esencial y en dilución en éter de petróleo y metanol, cada uno de estos sobre cepas gram positivas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) y hongos(Aspergillus niger y Candida albicans.). Sus resultados se pueden comprar con los de este estudio ya que el aceite esencial presentó actividad moderada sobre las cepas gram negativas (15mm en halo de inhibición). Hossein Sarmadyan et al en el 2014(31) determinaron el efecto del extracto hidroalcoholico de Cannabis sativa en infecciones nosocomiales, lograron determinar que el extracto de cannabis sativa tuvo efecto sobre las cepas gram positivas como Staphylococcus aureus, mientras que sobre cepas gram negativas (Pseudomonas) no mostraron efecto antimicrobiano por lo cual se evidenció cierta resistencia. Otro estudio realizado por Lorenzo Nissen et al en el 2010(30) caracterizaron y evaluaron la actividad antimicrobiana de aceites esenciales de variedades industriales de cáñamo. (Cannabis sativa), 27. sobre microorganismos gram.

(28) positivos(streptococcus. salivarius. subsp.. ,. Thermophilus,. Enterococcus. y. Clostridium spp ), gram negativas(Pseudomonas savastonoi, Pectobacterium carotovorum. subsp.. Carotovorum). y. levaduras. (Torulospora. delbrueckii,. Saccharomyces cerevisiae) tomando tres variedades de cáñamo: carmagnola, fibranova y futura, aunque todas obtuvieron efecto sobre cepas gram positivas, solo futura mostró tener efecto antimicrobiano sobre cepas gram negativas.. 28.

(29) 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. El aceite esencial de Cannabis Sativa si presenta actividad antimicrobiana sobre Fusobacterium nucleatum al 100% La actividad antimicrobiana de Cannabis sativa al 100% es similar al de la clorhexidina al 0,2%. La mezcla de tween 20 y agua como diluyente inhibe las propiedades antimicrobianas de cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum.. 29.

(30) BIBLIOGRAFÍA 1.. Petrelli B, Martínez B. Avances en periodoncia/ Tratamiento quirúrgico vs terapia periodontal básica: estudios longitudinales en periodoncia clínica. Av Periodon Implant. 2007;19(2):161-75. 2.. Bascones A, Mudarra S, Perea E. Antisépticos en el tratamiento de la enfermedad periodontal. Av Periodon Implant [Internet]. 2002;14(3):101-14. Disponible. en:. http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S1699-. 65852002000300002&script=sci_arttext&tlng=pt 3.. Reyes L,.“ Efecto de dos tecnicas de ligado sobre el biofilm en pacientes con aparatología ortodóntica fija ”. [dissertation] Perú: Universidad privada Antenor Orrego Facultad de Medicina Humana Escuela de Estomatología. 2018;43. 4.. Ministerio de Salud y Protección Social. IV Estudio Nacional de Salud Bucal. Ensav IV. Situación en Salud Bucal. Iv Estud Nac Salud Bucal. 2014;55, 108-109, 116-118, 128-131, 177-178, 190-192,19.. 5.. Vallejo D, Mauricio D. Efecto antibacteriano del aceite esencial de (caléndula officinalis) vs clorhexidina al 0,12% sobre cepas de Porphyromona gingivalis: estudio. in. vitro.. 2019;. Disponible. en:. http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/17330 6.. Nota informativa N°318. OMS | Salud bucodental. Who. 2012. p. 1.. 7.. Carranza F, Newman M, Takei H, Klokkedvold P. Periodontología clínica de 30.

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(36) ANEXO 1. PROTOCOLO DE CULTIVO BACTERIANO Medidas generales de seguridad en el laboratorio. -. Locativas:. -. Desinfección de paredes y equipos. (antisépticos).. -. Canecas de basura con bolsa roja y verde.. -. Guardianes.. -. Personales.. -. Guates de látex.. -. Gorro.. -. Tapabocas.. -. Bata desechable.. -. Gafas de protección.. Materiales de cultivo: -. Cepa bacteriana (fusobacterium nucleatum).. -. Aceite de Cannabis Sativa.. -. Jarra de anaerobiosis.. -. Sobres de anaerobiosis. -. Cajas petry. -. Asa de jenly. -. Agar sangre. -. Agar Wilkins Chalgren. -. Hemina y menadiona. -. Incubadora.. -. Alcohol 36.

(37) -. Mecheros. 1. Preparación del agar: En una balanza analítica se procedió a pesar 60gr de agar base, se depositó el contenido en un Erlenmeyer y se disolvió en 500ml de agua destilada, se agitó hasta obtener una solución homogénea sin grumos, posteriormente se tapó y se llevó al autoclave y esterilizarlo a 120ºC por 1 hora y se dejaron enfriar los materiales. 2. Adición de la sangre: con una jeringa desechable se agregó directamente a la mezcla por uno de sus costados, se tuvo en cuenta que no tuviera coágulos ni estuviera hemolisada, se agitó suavemente y se agregó 5%. 3. Dispensar el medio: Se procedió a rotular las cajas en la tapa y se sirvieron aproximadamente 20ml en cada una de las cajas petri y se esperó a que se solidificaran. 4. Preparación de cultivo: a) En la mesa de trabajo se procedió a poner varios mecheros encendidos, luego se descongeló la cepa la cual se encontraba a -20ºc en suspensión de leche descremada, con una micropipeta, se tomó 100 µl y se dispensó en el agar con un asa por todo el medio de cultivo, en técnica de siembra masiva. b) En una jarra de anaerobiosis, se procedió a depositar las cajas petri, introduciendo un sobre de anaerobiosis, se selló la jarra rápidamente para llevarla a la incubadora a 37ºc por cinco días. c) Se tomaron 1 UFC y se realizó un pase de siembra por técnica de rejilla en agar sangre con hemina y menadiona, se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis. 37.

(38) d) Se tomaron 3-5 UFC de una caja petri previamente sembrada, tomando un asa bacteriológica para ser solubilizadas en caldo tioglicolato y así alcanzar una concentración MacFarland 1 (3x108 células/mililitro). 5. Dispersión del aceite en el medio: Se depositó el inoculo y se sembró sobre las superficies de agar Wilkins chalgren suplementado con hemina y menadiona, seguido a esto, se realizaron pozos sobre la superficie del agar con un sacabocados estéril de 6mm de diámetro y en cada uno de ellos se depositaron. 20µl. de. las. diluciones. de. Cannabis. sativa. al. 20,40,60,80,100%respectivamente, Clorhexidina al 0,2% (control positivo) y agua con Tween 20 (control negativo), cada uno de estos ensayos se realizaron por triplicado. y se procedió a incubar por 24 horas a 37°C, posteriormente se midieron los halos de inhibición. PROTOCOLO DE COLORACIÓN GRAM MATERIALES a. Cristal violeta. b. Lugol de Gram. c. Alcohol-acetona. d. Safranina o Fucsina de Gram e. Cultivos bacterianos. PROCEDIMIENTO 1. Se preparó un extendido fino de una colonia bacteriana y se dejó secar al aire.. 38.

(39) 2. Se fijó el material al portaobjeto de modo que no fuera arrastrado durante el proceso de tinción, pasando el portaobjeto. 4 veces sobre la llama del. mechero. 3. Se colocó el preparado sobre un soporte de tinción y se cubrió la superficie con solución cristal-violeta durante 1 minuto. 4. Se lavó bien con agua destilada. 5. Se cubrió el preparado con solución de yodo (Lugol de Gram) durante un minuto. 6. Se lavó nuevamente con agua destilada. 7. Se sostuvo el portaobjeto y se bañó la superficie con el decolorante (alcohol cetona),. hasta. no. arrastrar. más. colorante. violeta. (esto. requiere. habitualmente unos 10 segundos más o menos). 8. Se lavó nuevamente con agua corriente y colocar el portaobjeto sobre el soporte, cubrir con safranina o el contra-colorante a utilizar durante un minuto. 9. Se lavó nuevamente con agua destilada y se procedió a examinar el preparado al microscopio, las bacterias Gram positivas se observaron de color violeta y las Gram negativas de color rojo o rosadas.. 39.

(40)

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