Estudio de las propiedades de virulencia en cepas de Escherichia coli uropatógena

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(1)BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA. INSTITUTO DE CIENCIAS CENTRO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS MICROBIOLÓGICAS POSGRADO EN MICROBIOLOGÍA. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES DE VIRULENCIA EN CEPAS DE Escherichia coli UROPATÓGENA TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS (MICROBIOLOGÍA) CON OPCIÓN EN: MICROBIOLOGÍA MÉDICA. PRESENTA: IBt Abraham Pérez Ama ASESOR (ES) DE TESIS: DC Margarita María de la Paz Arenas Hernández. DC Claudia Fabiola Martínez de la Peña. PUEBLA, PUE.. ENERO 2018.

(2) AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES Al Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas de la Benemerita Universidad Autónoma de Puebla por las facilidades prestadas durante el desarrollo de esta Tesis. A la Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrado por el apoyo otorgado para la conclusión de esta tesis dentro del Programa II. Investigación y Posgrado. Aseguramiento de la calidad en el Posgrado. Indicador establecido en el Plan de Desarrollo Institucional 2013-2017 Al Laboratorio de Enfermedades Nosocomiales y de la Comunidad del CICM, ICUAP por la donación de la cepas usadas como control positivo para los ensayos de adherencia y la determinación del grupo filogenético. Al Doctor Gerardo Santos López del Centro de Investigación Médica de Oriente (Cibior) por la donación de la línea celular usada para los ensayos de adherencia. Al Doctor Juan Xicohtencatl Cortes del Laboratorio de Investigación en Bacteriología Intestinal del Hospital Infantil de México Federico Gómez (HIMFG) por la donación de la cepa UPEC J96 para la determinación de islas de patogenicidad. A la D C Margarita María de la Paz Arenas Hernández por darme la oportunidad de pertenecer a su equipo de trabajo y confiar en mí durante el avance del día a día. A la D C Claudia Fabiola Martínez de la Peña por los consejos y recomendaciones que me hizo durante los avances del proyecto..

(3) AGRADECIMIENTOS PERSONALES A mi Madre Flavia porque aunque no podía verla físicamente sé que estuvo todo el tiempo conmigo y nunca me dejo solo. A mi Tía Micaela por ser un apoyo incondicional durante el transcurso de la maestría. A Alma e Iván por ser los primeros amigos que hice en la maestría y los verdaderos en mucho tiempo. A Manuel por estar siempre como amigo y compañero en esas jornadas de trabajo tanto académico como de laboratorio. A mis compañeros de generación de Microbiología Médica: Pablo, Joaquín, Saira, Paty, Yesenia, Toño, Monse y Angy por tantos momentos divertidos durante las clases y convivencias que sin esos momentos me hubiera vuelto más loco de lo que ya estoy. A Belén por ser una luz al final de cada día de trabajo. A Roxana y Araceli, amigas que convirtieron las horas de comida en momentos agradables y divertidos. A Cecilia y David que además de ser mentores en el laboratorio hicieron gratas y divertidas todas las vivencias en el laboratorio. Al Maestro Joaquín por estar siempre al pendiente de cualquier duda que surgiera durante la marcha. A Edwin por todos los consejos y el apoyo que me brindo. A Gabriel, Julio y mi primo David por se una parte importante y ser muchas veces mi escape del mundo de la investigación..

(4) INDICE GENERAL ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................... 5 ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................ 6 LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... 7 RESUMEN ............................................................................................................... i 1.1 INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1 1.2 Escherichia coli UROPATÓGENA..................................................................... 2 2. PATOGENESIS Y FACTORES DE VIRULENCIA .............................................. 5 2.1 Fimbria Tipo 1 ................................................................................................... 7 2.2 Fimbria Tipo P ................................................................................................... 7 2.3 Hemolisina......................................................................................................... 7 2.4 Factor Necrotizante Citotoxico .......................................................................... 7 2.5 Toxinas Autotransportadoras ............................................................................ 8 2.6 Aerobactina ....................................................................................................... 8 2.7 Islas de Patogenicidad (PAI´s) .......................................................................... 9 2.8 Plásmidos .......................................................................................................... 9 3. ANTECEDENTES GENERALES ...................................................................... 10 3.1 Europa ............................................................................................................. 10 3.2 Asia ................................................................................................................. 11 3.3 México ............................................................................................................. 12 4. ANTECEDENTES ESPECIFICOS .................................................................... 15 5. JUSTIFICACION ............................................................................................... 16 6. OBJETIVO GENERAL....................................................................................... 16 7. OBJETIVO PARTICULAR ................................................................................. 16 8. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 17 9. ESQUEMA GENERAL DE TRABAJO ............................................................... 17 10. MATERIAL Y METODOS ................................................................................ 17 10.1 MATERIAL BIOLOGICO ............................................................................... 18 10.2 DETERMINACION DE GENES DE VIRULENCIA ........................................ 19 10.3 DETERMINACION DE ISLAS DE PATOGENICIDAD ................................... 19 10.4 DETERMINACION DE GRUPOS FILOGENETICOS .................................... 20 10.5 ENSAYOS DE ADHERENCIA ...................................................................... 21 10.6 BUSQUEDA DE PATOTIPOS HIBRIDOS..................................................... 21.

(5) 10.7 DETERMINACIÓN DE PERFILES DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS. .............................................................................................................................. 21 10.8 CLASIFICACIÓN DE LA MULTIRESISTENCIA ............................................ 22 10.9 PRESENCIA DE ENZIMAS BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO ......................................................................................................... 22 11. RESULTADOS ................................................................................................ 23 11.1 Población Estudiada ...................................................................................... 23 11.2 IDENTIFICACIÓN DE GENES DE VIRULENCIA EN CEPAS DE E. coli AISLADAS DE INFECCIONES DE TRACTO URINARIO. .................................... 24 11.3 PRESENCIA DE ISLAS DE PATOGENICIDAD (PAI´s). ............................... 31 11.4 GRUPO FILOGÉNETICO.............................................................................. 35 11.5 CARACTERISTICAS DE ADHERENCIA ...................................................... 43 11.5.1 Ensayos de adherencia. ............................................................................. 44 11.6 BUSQUEDA DE PATOTIPOS HIBRIDOS..................................................... 48 11.7 PERFILES DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIÓTICA Y PRODUCCIÓN DE BLEE ..................................................................................................................... 55 11.7.1 Determinación de los perfiles de susceptibilidad antibiótica ....................... 55 11.7.2 Determinación de la presencia de enzimas betalactamasas de espectro extendido (BLEE) .................................................................................................. 57 11.8 BANDAS PLASMIDICAS EN CEPAS DE E. coli AISLADAS DE INFECCIONES DE TRACTO URINARIO. ............................................................. 58 12. DISCUSION .................................................................................................... 61 13. CONCLUSIONES ............................................................................................ 72 14. PERSPECTIVAS ............................................................................................. 73 15. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................... 74.

(6) ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Genes asociados a virulencia para UPEC y función desempeñada. .. 4 Tabla 2. Cepas controles usadas en el presente trabajo ................................. 18 Tabla 3. Factores de virulencia buscados en las PCR´s múltiples. ................ 19 Tabla 4. Islas de Patogenicidad buscadas en PCR´s individuales. ................. 20 Tabla 5. Genes buscados en la PCR Quadruplex para la determinación de los grupos filogenéticos en E. coli .......................................................................... 20 Tabla 6. Genes y su respectivo producto para la identificación de patotipos de E. coli. ................................................................................................................... 21 Tabla 7. Perfiles electroforéticos de virulencia encontrados en cepas de E.coli aisladas de ITU. ................................................................................................... 30 Tabla 8. Relación entre las islas de patogenicidad encontrados y genes asociados a virulencia. ....................................................................................... 33 Tabla 9. Características generales del filogrupo A de cepas de E. coli aisladas de ITU separadas en tipificables y no tipificables. ........................................... 37 Tabla 10. Características generales del filogrupo B2 de cepas de E. coli aisladas de ITU separadas en tipificables y no tipificables. ............................ 39 Tabla 11. Comparación de las características de Virulencia y Resistencia a antibióticos entre los Grupos A y B2 ................................................................ 42 Tabla 12. Cepas seleccionadas para la realización de los ensayos de adherencia. .......................................................................................................... 43 Tabla 13. Porcentaje de adherencia de cepas de E. coli aisladas de ITU a la línea celular HeLa. ............................................................................................... 44 Tabla 14. Relacion entre las caracteristicas de virulencia, resistencia en cepas de E. coli, serotipo y su posible patotipo .......................................................... 49 Tabla 15. Relación entre las caracteristicas de virulencia, resistencia en cepas de E. coli no serológicamente tipificables ........................................................ 51 Tabla 16. Características de la cepa de E.coli que amplifico un gen de otro patotipo no perteneciente a UPEC. .................................................................... 54 Tabla 17. Resistotipos de cepas de E. coli aisladas de ITU. ............................ 56 Tabla 18. Perfiles de sustratos encontrados en cepas de E. coli productoras de BLEE´s ............................................................................................................ 58.

(7) ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Patogénesis de la Infección de Tracto Urinario mediada por E. coli uropatógena........................................................................................................... 6 Figura 2. Ubicacion de los sensidiscos para la prueba. ................................... 23 Figura 3. Determinación de genes de virulencia de UPEC por PCR múltiple 1. .............................................................................................................................. 25 Figura 4. Determinación de genes de virulencia de UPEC por PCR múltiple 2.. .............................................................................................................................. 26 Figura 5. Determinación de genes de virulencia de UPEC por PCR múltiple 3.. .............................................................................................................................. 27 Figura 6. Genes detectados por PCR múltiple e Individual. ............................. 28 Figura 7. Genes asociados a virulencia encontrados en cepas de E. coli aisladas de ITU. ................................................................................................... 29 Figura 8. Determinación de Isla de Patogenicidad I de CFT073 por PCR sencilla.. ............................................................................................................... 31 Figura 9. Determinación de Isla de Patogenicidad II de CFT073 por PCR sencilla. ................................................................................................................ 32 Figura 10. Islas de Patogenicidad presentes en cepas de E. coli aisladas de ITU. ....................................................................................................................... 33 Figura 11. Determinación de Grupos Filogeneticos PCR Cuadruplex. ........... 36 Figura 12. Grupos filogenéticos encontrados en cepas de E. coli aisladas de ITU. ....................................................................................................................... 37 Figura 13. Ensayos de Adherencia en cepas de E. coli aisladas de ITU. ........ 46 Figura 14. Porcentajes de adherencia de cepas de E. coli aisladas de ITU a la línea celular HeLa.. .............................................................................................. 47 Figura 15. Promedio de bacterias adheridas por célula de E. coli aisladas de ITU. ....................................................................................................................... 48 Figura 16. Determinación de patotipos E. coli por PCR sencilla. .................... 54 Figura 17 . Perfil de resistencia antimicrobiana de cepas de E. coli aisladas de ITU usando el método de Kirby-Bauer.. ............................................................ 56 Figura 18. Clasificación en base a las características de resistencia para cepas de E. coli aisladas de ITU, según Magiorakos, 2011 ........................................ 57 Figura 19. Método de difusión de doble disco para la búsqueda de betalactamasas de expectro extendido. ............................................................ 57 Figura 20. Bandas plásmidicas en cepas de E. coli aisladas de ITU. Resultado representativo de la electroforesis en gel de agarosa al 0.7% de la extracción de DNA plasmídico.. ............................................................................................ 59 Figura 21. Porcentaje de cepas de E. coli aisladas de ITU que presentan de 1 a 9 bandas plasmídicas. ........................................................................................ 60.

(8) LISTA DE ABREVIATURAS EXPEC. Escherichia coli patogénica extra intestinal. AMK. Amikacina. DEC. Escherichia coli diarreagénica. GM. Gentamicina. UPEC STEC. Escherichia coli uropatógena Escherichia coli productora de toxina shiga Escherichia coli Enterotoxigénica Escherichia coli Enteropatógena Escherichia coli Enterohemorrágica Escherichia coli Enteroagregativa Escherichia coli difuso adherente Escherichia coli Enteroinvasiva. NET AN. Netilmicina Ácido Nalidixico. CIP OFX NOR LVX TSX C. Ciprofloxacina Ofloxacina Norfloxacina Levofloxacina Trimetoprim con sulfametoxazol Cloranfenicol. AMP. Ampicilina. ITU CNF hlyA sat. Escherichia coli asociada a meningitis neonatal Infección de tracto urinario Factor de necrosis citotóxico Alfa hemolisina Toxina autotransportadora secretada. CF CFX CFZ CTX. Cefalotina Cefuroxima Ceftazidima Cefotaxima. vat. Toxina autotransportadora vacuolizante. CRO. Ceftriaxona. fliC. Adhesina flagelar. FEP. Cefepime. fimH. Adhesina del pili tipo 1. ATM. Aztreonam. Pap. Pili asociado a pielonefritis. AMC. Amoxicilina con ácido Clavulánico. PAI. Islas de patogenicidad. FOS. Fosfomicina. NMDR MDR XDR PDR. No multidrogo resistente Multidrogo resistente Extremadamente resistente Pandrogo resistente. CL TE ETP BLEE. Colistina Tetraciclina Ertapenem Betalactamasas extendido. mg g. Miligramos Gramos. ETEC EPEC EHEC EAEC DAEC EIEC NMEC. de. espectro.

(9) RESUMEN Las infecciones de tracto urinario son las infecciones bacterianas más comunes en el mundo y afectan principalmente a mujeres. El agente etiológico predominante es Escherichia coli uropatógena (UPEC), ésta ha sido generalmente clasificada filogenéticamente en 2 (B2 y D) de los 7 grupos filogenéticos. UPEC posee factores de virulencia que favorecen su éxito en la colonización del tracto urinario, algunos de estos factores están codificados en islas de patogenicidad (PAI) y/o plásmidos. Su elevada capacidad de adherencia al epitelio urinario hace difícil su eliminación incluso en presencia de antibióticos empleados en este tipo de infecciones, pues UPEC posee varios mecanismos que le permiten sobrevivir al efecto de estos fármacos. Uno de estos mecanismos es la producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). El objetivo de este trabajo fue determinar las propiedades asociadas a la virulencia. De 152 cepas de UPEC aisladas de mujeres de entre 22 y 55 años cursando con Infección de Tracto Urinario (ITU). Empleando reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se detectaron 9 genes de virulencia, 4 islas de patogenicidad (PAI) y se determinó el grupo filogenético de cada cepa. Usando células HeLa, se realizaron ensayos fenotípicos de adherencia a 6 cepas que fueron seleccionadas por su perfil de genes relacionados a adherencia, se evaluaron 24 antibióticos para conocer el perfil de susceptibilidad antibiótica y se clasificaron las cepas con base a su multiresistencia y la presencia de enzimas β-lactamasas. Adicionalmente se identificaron los perfiles de bandas plasmídicas. Los genes de virulencia predominantes fueron la adhesina de la fimbria tipo 1 (fimH 87%), aerobactina (iucD 85%), la adhesina homologa superficial receptora de hierro (iha 84%) y en menor medida el pilus tipo P (3%) y el factor de necrosis citotoxico (2%) Se encontraron 19 virotipos comunes. Las islas de patogenicidad IICFT073 y ICFT073 estuvieron presentes en un 61% y 35% respectivamente mientras que las islas IJ96 y IIJ96 estuvieron en muy bajo o nulo porcentaje. El 57% de las cepas pertenece al filogrupo B2, 41% al A. Tres de las seis cepas probadas mostraron un promedio de adherencia parecido a las cepas de UPEC usada como control positivo. Además, las seis cepas probadas y el control positivo, mostraron el mismo patrón de adherencia en “vagón de tren” donde las bacterias están dispuestas en la periferia de la célula HeLa. Un alto porcentaje (60%) del cepario son serológicamente no tipificables, y en su mayoría pertenecen al filogrupo A. Además, solo una cepa mostro características hibrido UPEC/ETEC. El cepario es Multidrogo resistente (MDR) en un 92%, extremadamente resistente (XDR, 5%); y no multidrogo resistente (NMDR, 3%). Se observó resistencia a fármacos de primera elección, siendo estos: Cefotaxima 59%, Nitrofurantoina 52%, Levofloxacina 46%, Trimetopim-Sulfametoxasol 45% Cloranfenicol 42%, mientras que las opciones terapéuticas fueron Cefepime con un 16% y Fosfomicina con un 14%. El 11% del cepario (16 cepas) es productor de BLEE´s, los principales sustratos de estas son Cefepime Aztreonam y Cefotaxima. El 80% del cepario posee bandas plasmídicas 20% del cepario no posee ninguna banda plasmídica. Estudios como el presente nos dan idea de la elevada complejidad que UPEC posee, así como un amplio panorama del efecto que tiene el tratamiento antibiótico utilizado, el cual debe ser personalizado y no empírico, esto debido a la elevada resistencia que se observa para antibióticos de primera elección. Por otra parte la elevada presencia de cepas serológicamente no tipifícables nos dice que nuevos serotipos de UPEC son los que están causando infección de tracto urinario en la población mexicana y estas cepas serológicamente no tipificables pertenecen además al grupo filogenético A indicando que dicho grupo ya no es solo un reservorio de resistencia antimicrobiana sino también de factores de virulencia.. i.

(10) 1.1 INTRODUCCIÓN Las infecciones del tracto urinario o ITU son las infecciones bacterianas más comunes afectando a 150 millones de personas en el mundo cada año, causantes de alrededor de 7 millones de visitas al médico y de un millón de ingresos a hospitales. Algunas complicaciones serias son: pielonefritis con sepsis y daño renal. Las ITU son categorizadas en complicadas y no complicadas (González, 2015). Las ITU no complicadas afectan típicamente a individuos clínicamente sanos sin alteraciones urológicas, estas se clasifican en ITU’s bajas (cistitis) y altas (pielonefritis). Algunos factores de riesgo son: sexo femenino (proximidad entre vejiga y ano), actividad sexual, infección vaginal, obesidad y susceptibilidad genética (Hooton, 2012; Guglietta, 2017). Por otro lado, las ITU’s complicadas son definidas como las asociadas con factores que comprometen el tracto urinario o la defensa del huésped incluyendo la obstrucción urinaria, retención de orina causada por problemas neurológicos, inmunosupresión, falla renal, trasplante de riñón, embarazo y la presencia de catéteres. Se sabe que del 20-30 % de las mujeres experimentaran una infección recurrente entre 4-6 meses después del primer episodio (Nielubowicz & Mobley, 2010; González, 2015; Spaulding & Hultgren, 2016). El tratamiento dependerá de qué tipo de infección se está cursando (alta o baja) y debe ser elegido en lo posible con base al resultado del urocultivo con antibiograma, los manejos van de 3 a 7 días hasta 14 días. El tratamiento de cistitis no complicada incluye Trimetropim Sulfametoxazol (160/800 mg 2 veces al día), Nitrofurantoina (100 mg 3-4 veces al día), Ciprofloxacino (250 mg 2 veces al día) durante 3 días o una dosis única de Fosfomicina (3 g). Para el caso de una Pielonefritis se utiliza Ciprofloxacino (500 mg 2 veces al día), Levofloxacino (500 mg 1 vez al día), Ceftibuten (400 mg 1 vez al día) o Cefixima (400 mg 1 vez al día) y si se trata de una Pielonefritis complicada el tratamiento consiste en Ciprofloxacino (400 mg vía intravenosa 2 veces al día), Levofloxacina (500 mg intravenosa 1 vez al día) Ceftriaxona (1 g intravenosa 2 veces al día), Cefotaxima (1 g intravenosa) Amikacina (15 mg intravenosa 1 vez al día) o Gentamicina (3.5 a 5 mg intravenosa 1 vez al día). Debido a que la mayoría de tratamiento es empírico las cepas causales 1.

(11) de este tipo de enfermedades han seleccionado la aparición de multiresistencia a la gran parte de los antibioticos utilizados (Lifshitz et al., 2010). Escherichia coli Uropatógena (UPEC) es el principal agente causal de las ITU´s que se adquieren en la comunidad con un 85% de todas las ITU no complicadas y 65% de las ITU complicadas y en un 50% cuando se consideran recurrentes las infecciones (González, 2015).. 1.2 Escherichia coli UROPATÓGENA Escherichia coli es una de las bacterias más diversas encontrada principalmente en el tracto intestinal de humanos y algunas otras especies, estableciendo relaciones benéficas mutuas. Mientras estén delimitadas por barreras intestinales estas no causan daño o enfermedad, sin embargo, algunas de estas bacterias han evolucionado adquiriendo un amplio rango de genes de virulencia que permiten su adaptación, colonización e invasión de distintos sitios anatómicos (Croxen & Finlay, 2012). Las cepas patogénicas y comensales de E. coli son clasificadas en 8 grandes grupos filogenéticos (A, B1, B2, C, D, E, F y E). Varios estudios han mostrado que las E. coli patogénicas son frecuentemente clasificadas en el grupo filogenético B2 o D mientras que las comensales son clasificadas en el grupo A o B1. Sin embargo, debido a que las cepas poseen mecanismos de transferencia genética horizontal permite el intercambio de genes de virulencia entre filogrupos promoviendo la emergencia de cepas altamente virulentas que pertenecen a los grupos filogenéticos A o B1 (Zhang et al., 2002; Bukh et al., 2009; Clermont et al., 2013; Guglietta, 2017). Las cepas de E. coli diarreagénicas (DEC) están agrupadas en 6 patotipos bien definidos: E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli Enterohemorrágica (EHEC), E. coli Enterotoxigénica (ETEC), E. coli Enteroinvasiva (EIEC), E. coli difusoadherente (DAEC) y E. coli Enteroagregativa (EAEC). El otro grupo es el de Escherichia coli patogénica extra intestinal o EXPEC en el que se encuentran Escherichia coli uropatógena (UPEC) y E. coli asociada a meningitis neonatal (NMEC) (Köhler & Dobrindt, 2011; Croxen & Finlay, 2012). 2.

(12) Como ya se mencionó con anterioridad E. coli uropatógena es la causa de infecciones de tracto urinario, generalmente poseen una cantidad heterogénea de genes de virulencia bien. La Tabla 1 resume los principales factores de virulencia asociados a UPEC. La posesión de estos factores (o una combinación de varios de estos) hacen de UPEC un patógeno exitoso para el desarrollo de una infección de tracto urinario (Pitout, 2012; Lüthje & Brauner, 2014).. 3.

(13) Tabla 1. Genes asociados a virulencia para UPEC y función desempeñada. ADHERENCIA Gen. Factor de Virulencia. Función. fim. Pili tipo 1. Adherencia al uroepitelio media la invasión. sfa. Fimbria S. Adherencia a uroepitelio. drb. Adhesina de la Familia Dr. Factor de adherencia que se une al factor de. focG. Fimbria F1C. Adherencia a uroepitelio. hra. Aglutinina resistente al calor. Factor de adherencia. usp. Proteína uropatógena especifica. Factor de adherencia. iha. Adhesina homologa IrgA. Factor de adherencia. papGII. Pili tipo P clase II. Adherencia a uroepitelio. papGIII. Pili tipo P clase III. Adherencia a uroepitelio. sfa. Familia fimbria S. Factores de adherencia. fliC. Subunidad de la flagelina. Adherencia/movilidad. iroN. Salmoquelina. Sideroforo hierro. iucD. Aerobactina. Sideroforo hierro. fyuA. Yersibactina. Sideroforo hierro. Ent. Enterobactina. Sideroforo hierro. ireA. Receptor Sideroforo. Receptor Sideroforo. Iro. Receptor Sideroforo. Receptor Salmoquelina. chu. Receptor hierro. Captación de Hemina. sit. Receptor. Transportador de Hierro y Manganeso. aceleración de decaimiento. CAPTACION DE HIERRO. TOXICIDAD hyl. Alfa hemolisina. Lisa eritrocitos. astA. Toxina de EAEC. Toxicidad. sat. Proteína Autotransportadora Secretada. Toxina. prc. Serin Proteasa. Toxina. cnf1. Factor de Necrosis Citotoxico. Causa multinuleación y redondeamiento de células humanas (Toxina). vat. Proteína Autotransportadora Vacuolizante. Toxina. tsh. Hemaglutinina sensible a Temperatura. Toxicidad. OTROS kpsMT. Capsula. Evasión del sistema inmune. K1, K2, K5. Variantes Capsula. Evasión al sistema inmune. traT. Resistencia asociada al suero. Evasión del sistema inmune. iss. Incremento de sobrevivencia al suero. Evasión del sistema inmune. picU. Autotransportador Serin proteasa. Involucrada en colonización intestinal. ompT. Proteasa de membrana externa. Proteasa de membrana externa. malX. Marcador de isla de Patogenicidad. Asociado a Virulencia. PAI II cft073. Múltiples Genes. Asociado a virulencia. (Nielubowicz & Mobley, 2010; Croxen & Finlay, 2012; Pitout, 2012; Flores-Mireles et al., 2015).. 4.

(14) 2. PATOGENESIS Y FACTORES DE VIRULENCIA Las infecciones de tracto urinario generalmente inician con la contaminación de la vejiga por bacterias procedentes del área perianal, dichas bacterias son capaces de migrar desde la uretra a la vejiga donde UPEC expresará fimbrias y adhesinas resultando en la colonización e invasión de la vejiga. La respuesta hospedera al contacto con las adhesinas bacterianas derivará en la infiltración de neutrófilos los cuales iniciaran la eliminación de estas bacterias. UPEC, como método de defensa, cambiara su morfología o formará nuevas estructuras para resistir y multiplicarse (biofilm). Se producirán toxinas que provocaran el daño a uroepitelio y aprovechar la liberación de nutrientes acrecentando su población. UPEC puede o no subir a riñón por medio de flagelo. En el riñón también ocurrirá una colonización mediada por otras adhesinas y fimbrias ocasionando nuevo daño uroepitelial por las toxinas producidas que dependiendo de la intensidad puede causar una bacteremia. La Figura 1 describe los pasos anteriormente descritos (Flores-Mireles et al., 2015).. 5.

(15) Figura 1. Patogénesis de la Infección de Tracto Urinario mediada por E. coli uropatógena.. 6.

(16) (Modificado de Flores-Mireles et al., 2015). 2.1 Fimbria Tipo 1 Las fimbrias tipo I son las fimbrias más expresadas por E. coli observándose en la mayor parte de cepas que producen cistitis recurrente y algunas son capaces de producir pielonefritis. FimH es la adhesina de este tipo de fimbria que se une a los residuos manosilados de la superficie de la vejiga así como a los receptores de las integrinas α3-β1 esta interacción induce una cascada de señalización que activa a las Rho GTPasas promoviendo rearreglos de actina provocando la internalización de UPEC por un mecanismo de zipper. (Bateman et al., 2013; Flores-Mireles et al., 2015). 2.2 Fimbria Tipo P Las fimbrias tipo P son hemaglutininas no sensibles a la manosa, el nombre P lo adquieren debido a su asociación con pielonefritis aguda, presentan escasa afinidad por el endotelio de la vejiga y alta por el epitelio renal. Los riñones en humanos expresan abundantemente globosidos que sirven como ligandos de PapGII y así se colonizan por bacterias que expresen el alelo PapGII, PapGIII y se une fuertemente al glicolípido Forssman el cual está presente en perros pero no en humanos (Lillington, Geibel, & Waksman, 2015; Spaulding & Hultgren, 2016). 2.3 Hemolisina La alfa Hemolisina (HylA) generalmente es liberada durante un periodo de cistitis, en alta concentración forma los poros permitiendo la lisis celular mientras que en bajas concentraciones interfiere con las vías de señalización celular y causa la muerte celular mediada por apoptosis lo que puede ser relacionado a la exfoliación que sufre el tracto urinario durante una infección urinaria, facilitando la entrada de UPEC al uroepitelio, También se le relaciona con la adquisición de nutrientes esenciales especialmente hierro, ayuda en la liberación de aminoácidos para el rápido crecimiento de UPEC (Justice & Hunstad, 2012; Bakás et al., 2013). 2.4 Factor Necrotizante Citotoxico El factor necrotizante citotoxico (CNF) es una proteína que cataliza la deamidación de residuos conservados de glutamina en las proteínas de unión GTP 7.

(17) de la familia Rho (RhoA, Cdc42 y Rac). La activación de estos permite un rearreglo en el citoesqueleto, la disrupción del ciclo celular y la interrupción de las vías de señalización. Hasta el momento el papel de CNF durante una ITU no está totalmente claro. La presencia de CNF está relacionada con la presencia de hemolisina, causante también de exfoliación del tejido durante una ITU, causa disfunción de neutrófilos y se ha observado que solo el 4% de las cepas produce este tipo de toxina y se asocia frecuentemente con cepas de UPEC responsables de ITU´s severas. (Hoffmann et al., 2004; Lemonnier et al., 2007; Welch, 2016). 2.5 Toxinas Autotransportadoras La toxina autotransportadora secretada (Sat por sus siglas en inglés) es producida por UPEC durante una infección de tracto urinario; se encuentra generalmente en 68% de cepas de E. coli aisladas de pielonefritis. Causa vacuolizacion de las células de vejiga y riñón aunque no exhibe actividad hemaglutinante. Generalmente promueve lesiones en las uniones estrechas de los epitelios posiblemente relacionada con la exfoliación del tejido. Se sabe que es capaz de degradar caseína, espectrina, fodrina y el factor de coagulación V pero no mucina o pepsina (Dautin, 2010; Liévin-Le Moal et al., 2011). La toxina autotransportadora vacuolizante (Vat por sus siglas en inglés) posee actividad vacuolizante (induce la formación de vacuolas intracelulares). No se conocen reportes que indiquen su papel especifico en una infección de tracto urinario aunque se ha encontrado que puede estar presente en aislados de E. coli procedentes de cistitis o pielonefritis (Nichols et al., 2016). 2.6 Aerobactina UPEC produce 4 tipos de sideroforos: Enterobactina, Salmoquelina, Aerobactina y Yersiniabactina. Los genes involucrados en la biosíntesis de sideroforos son encontrados en UPEC y cepas comensales; sin embargo, salmoquelina, aerobactina y yersiniabactina son localizados en islas de patogenicidad asociados a UPEC pero no en cepas comensales sugiriendo que los sistemas de captación de hierro fueron adquiridos por transferencia horizontal de genes. La aerobactina es un sideroforo presente en la mayoría de las cepas de. 8.

(18) UPEC, teniendo una gran estabilidad en la unión al Fe3+ y es uno de encargados en el secuestro de hierro durante una ITU (Watts et al., 2012; Su, Guan, & Lv, 2016; Subashchandrabose & Mobley, 2015). 2.7 Islas de Patogenicidad (PAI´s) Son encontradas siempre en cepas virulentas y muy rara vez en las que no lo son. Algunas islas son descritas en la cepa UPEC 536 y posteriormente en otras 3 cepas UPEC aisladas de pielonefritis (J96 y CFT073) y cistitis (UTI89) (Schmidt & Hensel, 2004; Andreu, 2005; Lloyd, Rasko, & Mobley, 2007; Lloyd et al., 2009). CFT073 posee en su genoma 13 islas de las cuales la PAI I codifica para: operón de alfa hemolisina, un operón del Pilus tipo P y genes relacionados a sistemas de transporte de hierro y sistemas putativos de transporte de carbohidratos, mide 58 kb de largo y un contenido de G+C del 42.9%, la PAI II contiene operón pap, genes de regulación de hierro, elementos genéticos móviles y genes desconocidos. J96 contiene igualmente dos islas relacionadas a ITU, la PAI I posee un tamaño de 170 kb y contiene el operón hly y el operón pap que codifica el pilus tipo P, la PAI II posee un tamaño de 110 kb. Contiene los genes codificantes de CNF-1 y un operón de hly. (Rasko et al., 2001; Schmidt & Hensel, 2004). 2.8 Plásmidos Otra forma de diseminación de resistencia y/o virulencia entre este tipo de bacterias es a través de plásmidos; elementos genéticos movilizables autorreplicables formados por DNA de doble cadena que no son esenciales para la bacteria. Se ha observado que UPEC poseé plásmidos de distintos tamaños y en ellos, se encuentran los elementos para su transferencia; así como resistencia a varios antibioticos como por ejemplo genes codificantes para enzimas beta-lactamasas (Baral et al., 2012; Farshad et al., 2012).. 9.

(19) 3. ANTECEDENTES GENERALES 3.1 Europa Calhau et al 2015 (Portugal) analizaron 65 cepas de E. coli procedente de ITU encontrando que la isla de patogenicidad IV536 (68%), el gen iutA (57%) y la resistencia a ampicilina fue el rasgo más característico entre las cepas. Tambien encontro que la PAI IICFT073 estaba presente en un 42% igual que PAI ICFT073, la PAI IIJ96 estuvo en un 9% mientras que la PAI IJ96 no fue encontrada. Las islas PAI I536, PAI II536, PAI III536 y PAI Ij96 fueron exclusivamente asociadas con la susceptibilidad a Amoxicilina/ Ácido Clavulánico, Cefotaxima, Ceftazidima, Ciprofloxacina, Gentamicina y Trimetropim-Sulfametoxazol y resistentes a Ampicilina y Cefalotina. PAI IV536, PAI IICFT073 y PAI ICFT073 fueron más prevalentes en aislados que mostraron resistencia a Amoxicilina-Ácido Clavulánico, Cefalotina, Cefotaxima, Ceftazidima y Gentamicina (Calhau, et al., 2015). Sabaté et al en 2006 (España) usó 50 cepas comensales y 100 cepas UPEC se reporta la distribución de varias islas de patogenicidad en ambos grupos de cepas, la mayor prevalencia es PAI IV536 (38% comensal vs. 89% UPEC), seguido por PAI ICFT073 (26% vs. 73%), PAI IICFT073 (14% vs. 46%), PAI IIJ96 (8% vs. 34%), PAI I536 (8% vs. 33%) and PAI II536 (4% vs. 20%). PAI III536 fue solo detectada en UPEC (2%), mientras que PAI IJ96 no fue detectada en ningún aislado. Aunque el número medio de PAIs identificadas fue mayor entre UPEC (2.97) que en cepas comensales (0.98), no hay diferencias estadísticas entre el grupo B2 de las dos cepas de E. coli; sin embargo, los aislados comensales de los grupos D y B1 parecen ser menos virulentos que los aislados patógenos. (Sabate, et al., 2006). Rodriguez-Avial et al 2013 (España) trabajo con aislados de urocultivos de tres años diferentes (2005-2009-2011) encontrando presencia de enzimas betalactamasas en porcentajes de 3.9%-7.3%-8.7% en los periodos de tiempo antes mencionados. Entre los antibioticos probados que no eran betalactamicos se encuentra Colistina que resultó ser el más activo seguido de Nitrofurantoina. Ciprofloxacino y Trimetropim - Sulfametoxazol tuvieron un 80% de resistencia, durante el análisis de resistencia hacia la Fosfomicina se observó que entre los años. 10.

(20) evaluados la resistencia a Fosfomicina aumento de un 0%, pasando por un 9.3% hasta un 14.4% (Rodriguez-Avial et al., 2013). 3.2 Asia Tabasi et al 2015 (Irán) estudiaron 156 cepas de UPEC aisladas de pacientes con síntomas clínicos de ITU. La formación de biofilm y la producción de hemolisina se observa en 133 cepas (85.3%) y 53 (34%) respectivamente. 98 (62.8%) mostraron la presencia de la fimbria tipo 1 (manosa sensible) y 58 (37.2%) mostraron la presencia de la fimbria P (manosa resistente). Las cepas presentaron resistencia a Ampicilina, Tetraciclina, Amoxicilina y Cotrimoxazol, el 26.9% de los aislados resultaron en producción de BLEE (Tabasi et al., 2015). Zhao et al en 2015 (China) realizaron estudios en 120 cepas recolectadas de pacientes hospitalizados. Todos los aislados mostraron resistencia a Ampicilina, Cefazolina, Cefuroxima, Cefotaxima, Cefoperazona y Ceftriaxona, la mayoría fue resistente. a. Sulfametoxazol. Piperacilina (72.5%). (82.5%), y. fueron. Ciprofloxacina sensibles. (81.2%), a. Trimetropim-. Imipenen. (98.4%),. Piperacilina/tazobactam (96.7%), Cefoperazona/sulbactam (91.7%), Amikacina (90.8%) y Cefepime (75.8%). Se encontraron 9 diferentes patrones genotípicos de BLEE y el gen ctx-m fue el más prevalente (42.5%) El grupo B2 (36.7%) y D (35%) fueron el principal reservorio de estas cepas. La prevalencia de traT, ompT, iss, PAI, afa, fimH y papC fueron de 75.8%, 63.3%, 63.3%, 60.8%, 40.8%, 19.2% y 6.7% respectivamente (Zhao, 2015) Munkhdelger et al 2017 (Mongolia) trabajaron con 148 cepas aisladas de pacientes con infección de tracto urinario, encontrando al grupo B2 como el más predominante (33.8%) seguido por el D (28.4%) la presencia de genes como fimH (89.9%), fyuA (70.3%), iutA (62.2%) kpsMTII (58.8%) y aer (56.1)% mientras que papC (20.3%), papGII (17.6%), papGIII (1.4%), la resistencia antimicrobiana más elevada fue en Cefalotina (85.1%), Ampicilina (78.4%) y en menor porcentaje aparece Nitrofurantoina e Imipenen (5.4% y 2%). El 93.9% de los aislados fue multidrogo resistente (MDR), encontro que el grupo B2 poseia mas virulencia (fimH 96%, iutA 78%, aer 70%, papGII 28%) que el grupo A y B1 (fimH 85-93%, iutA 4065%, aer 44-48%, papGII 7-20%). encontro también una elevada a aminoglucosidos 11.

(21) (58%), Betalactamicos (45%),Trimetoprim (68%), Quinolonas (42%) aunque en este ensayo el grupo A resulto ser mas resistente a Carbapenemicos (3.4%) y Nitrofurantoina (13.8%) uno de los antibioticos de primera eleccion para el tratamiento de las ITU. (Munkhdelger et al., 2017) Iranpour et al en 2015 (Iran) trabajando con 140 cepas aisladas de pacientes con ITU encontró que el grupo B2 estaba en un 39.3, el grupo Desconocido en un 27.1%, el E en un 9.3%, C y el clado I 6.4%, B1 en 5%, F y D en 2.9% y el grupo A en un 0.7%, La resistencia principal fue para Amoxicilina (82.1%) Ampicilina (80%), Trimetropim Sulfametoxasol (57.9%), Cefalotina y Acido Nalidixico (45%), Ceftriaxona (42.9%), Cefotaxima (41.4%), Levofloxacina (35.7%), Norfloxacina (34.3%), Ofloxacina, Ciprofloxacina (34.3%) Ceftazidima (31.4%) y Nitrofurantoina, el grupo B2 presentaba mas resistencia (Aminoglucosidos 7% vs 0%; Betalactamicos 22% vs 0.7%; Sulfamidas 23% vs 0.7%; Quinolonas 19% vs 0.7%; Carbapenems 16.4% vs 0.7%; Nitrofuranos 0.7% vs 0%), las MDR fueron de 82% y el 50% fue ubicado en el grupo B2 (Iranpour et al., 2015). Lee et al 2016 (Corea del Sur) trabajando con 58 aislados encontraron que el 79.31% pertenecian al grupo B2, el 15.51% al grupo D, 3.44 al grupo A y 1.72% al grupo B1, la prevalencia de genes se encontro a fimH (100%), sfa (100%), feoB (98.2%), irp2 (94.8%), iucC (81%), cnf1 (65.5%), hylA (62%), iha (51.7%), stb (43.1%), papA (39.6%), iroN (39.6%), eae (10.3%), afaC (8.6%). En cuanto a resistencia se encontro un 84.4% a Ampicilina, 37.9% a Trimetropim, 36.2% a Tetraciclina, 31% a Ciprofloxacina 18.9% a Gentamicina, 15.55% a Tobramicina, 15.5% a Cefotaxima, 8.6% a Aztreonam, 6.8% a Ceftazidima y Cefepime, 5.1% a Cefoxitina, 3.4% a Cloranfenicol, encontraron que el grupo B2 tenia resistencia elevada (Aminoglucosidos 19.5% vs 0%; Betalactamicos 28.2% vs 25%; Trimetropim 32%; Cloranfenicol 4.3% vs 0%) (Lee et al., 2016). 3.3 México Paniagua-Contreras et al 2017 trabajaron con 194 cepas de UPEC. Las cepas fueron aisladas de la Unidad Médica Familiar de Salud Pública localizada en el Estado de México. Los genotipos más usuales son usp 68%, iha 64.9%, kpsMT 61.3%, fim 58.2%, irp2 48.4%, papC 33.5%, set 31.4%, y astA 30.9%; mientras que 12.

(22) los genes de resistencia más frecuentemente detectados son tet(A) 34%, sul1 31.4%, y blaTEMIyII 26.3%. El patrón más abundante de la expresión genética fue irp2/fim/iha/kpsMT/usp asociado con 8 combinaciones diferentes de genotipos de resistencia antibiótica, exhibido por 28 cepas (14.4%) (Paniagua-Contreras et al., 2017). López-Banda et al 2014 trabajo con 108 aislados de E. coli aisladas de mujeres mexicanas diagnosticadas clínicamente con ITU. La distribución filogenética encontrada es B1 9.3%, A 30.6%, B2 55.6% y D 4.6%. Los genes de virulencia con mayor prevalencia son ecp 98.1%, fimH 86.1, traT, 77.8%, sfa/focDE 74.1%, papC 62%, iutA 48.1%, fyuA 44.4%, focG 2.8%, sfaS 1.9%, hylA 7.4%, cnf1 16.5%, cdt-B 0.9%, cvaC 2.8%, ibeA 2.8% y rfc 0.9%. La resistencia antimicrobiana está por arriba del 50% para Ampicilina/Sulbactam, Ampicilina, Piperacilina, Trimetropim-Sulfametoxazol, Ciprofloxacina y Levofloxacina. UPEC está principalmente en el grupo B2, predominando los genes asociados a sideroforos y adhesión y en menor medida los relacionados a toxinas (López-Banda et al., 2014) Miranda-Estrada et al 2015 analizaron 107 aislados de E. coli en 2 localidades de México. Los grupos filogenéticos predominantes son el B2 (60%) y F (12%), la mayoría de genes predominantes son fimH (96%), iutA (66%), y sat (36%) en la localidad del centro mientras que en la localidad del suroeste lo predominante son el grupo A (35%) y B1 (21%) pero presentan menor cantidad de factores de virulencia. El 21.5% de los aislados pertenecieron al grupo O25-ST131. La producción de hemolisina y biofilm se tiene en mayor porcentaje en la localidad del sureste encontró una elevada resistencia a Ampicilina (86-100%), Cefotaxima (2594%), Acido Nalidixico (52-76%), Cefuroxima (56-70%), Ceftazidima (24-94%) encontrando igualmente una elevada resistencia a los antibioticos de primera y segunda. elección. (Ciprofloxacino. 42-50%,. Trimetoprim. 64-75%),. aunque. Nitrofurantoina tiene bajos valores de resistencia (4-21%) como para seguirse considerando como tratamiento (Miranda-Estrada et al., 2015). Ochoa et al 2016 partió de una colección de 500 cepas UPEC 103 fueron seleccionadas con características MDR y XDR, mientras que las cepas MDR son 13.

(23) agrupadas en el grupo D (54.87%) y B2 (39.02%) con un porcentaje mayor al 70% para genes fimbriales (fimH, papGII), captadores de hierro y toxinas mientras que las cepas XDR se agrupan en el grupo B2 (47.61%) y el grupo D (42.85%), este grupo tiene un porcentaje de más del 80% de presencia de genes de virulencia, encontraron un porcentaje de 76.19% en cepas que determinaron como XDR productoras de BLEE y 18.29% productoras de BLEE en cepas determinadas como MDR, de igual manera encontro un porcentaje elevado de genes asociados a virulencia concentrado en el grupo B2(papGII 90%, papGIII 15.62%, iutD 65%) en comparacion al grupo A (papGII 40%, papGIII 0%, iutD 60%) aunque el gen hlyA esta en mayor porcentaje en el grupo A (100%) que en grupo B2 (75%) (Ochoa et al., 2016). La mayoría de los trabajos aquí descritos nos muestran la alta resistencia que exhiben las cepas de UPEC específicamente a la gran mayoría de los antibioticos de primera elección para el tratamiento de ITU, así como la presencia de genes relacionados directamente a la adhesión, captación de hierro y daño al hospedero tanto en ITU altas como bajas.. 14.

(24) 4. ANTECEDENTES ESPECIFICOS Estudios. realizados. en. el. laboratorio. de. Biología. Molecular. de. Enteropatógenos del Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas del Instituto de Ciencias de la Universidad Autónoma de Puebla (ICUAP), se ha buscado la presencia de algunas características de virulencia de E. coli uropatógena. Molina Villa en 2011, trabajó con 116 cepas de E. coli aisladas de ITU´s de un hospital privado de la ciudad de Puebla, observándose una mayor frecuencia de aislamiento en mujeres adultas y de edad avanzada, 114 de esas cepas presentaron resistencia a Ampicilina 63.16%, Cefalotina 52.63% y Trimetropim/Sulfametoxazol. 46.49%,. resultando. 72%. de. estas. cepas. multirresistentes. Los genes de virulencia como papGII estuvieron presentes en el 37.7% de los aislamientos, seguido de papGII 21.9% y hlyA 29.8%. Los serotipos más frecuentes fueron O25, O1 y O102, 27 cepas presentaron O25:H4 y O6:H1 (Molina Villa, 2010). Aroche Camarillo en 2011, trabajó con 133 cepas aisladas de un hospital privado de la ciudad de Puebla; en mayor proporción aisladas en mujeres que en hombres. El rango de edad de las mujeres fue 22 a 55 años y son más susceptibles a estas enfermedades, las cepas tuvieron un alto porcentaje de resistencia antibiótica a nitrofurantoina 35.3% seguido de ampicilina 30.1% y en menor medida para cefalotina 4.5%. Un 70% del total de cepas presentaron multiresistencia. El gen de virulencia fimH apareció en un 93.96% y el gen flagelar fliC en un 30.38%. Solo un 15% presento serotipo O25:H4 asociado a UPEC (Aroche Camarillo, 2011). Es importante destacar que aún falta realizar estudios de estas cepas por lo que en el presente trabajo se desarrolló utilizando las mismas cepas de los trabajos anteriormente citados.. 15.

(25) 5. JUSTIFICACION Las infecciones del tracto urinario se presentan en una alta frecuencia derivando en un serio problema en salud y gastos económicos elevados. El tratamiento para las ITU´s continua siendo empírico, sin la espera de los resultados del urocultivo y mucho menos de un antibiograma, esto ha generado la selección de cepas multirresistentes que también resultan ser altamente virulentas debido a la adquisición de elementos genéticos móviles conteniendo genes de virulencia o inclusive resistencia a antibioticos. UPEC es el agente etiológico principal en una ITU, su incidencia como agente causal en México continua siendo muy debatida e incluso desconocida, las características de virulencia y resistencia, entre otras, han convertido a UPEC en un patógeno exitoso al colonizar e iniciar una ITU. El conocer tanto las características de virulencia como las de resistencia antimicrobiana y relacionar estas con características de adherencia y filogenéticas ayudara a tener un mayor entendimiento de UPEC como el patógeno principal en una ITU y contrarrestar las consecuencias de esta enfermedad y disminuir los gastos económicos que estas conllevan.. 6. OBJETIVO GENERAL Analizar. filogenéticamente,. serológicamente,. genéticamente. y. fenotípicamente cepas de Escherichia coli uropatógena aisladas de población mexicana cursando con infección de tracto urinario.. 7. OBJETIVO PARTICULAR Determinar las propiedades asociadas a la virulencia y resistencia de cepas de Escherichia coli uropatógena aisladas de población mexicana cursando con infección de tracto urinario.. 16.

(26) 8. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1.. Identificar la presencia de genes que codifican para factores de virulencia de UPEC.. 2.. Determinar la presencia de PAIs.. 3.. Identificar el grupo filogenético.. 4.. Determinar las características de adherencia.. 5.. Buscar patotipos híbridos.. 6.. Determinar los perfiles de susceptibilidad antibiótica y producción de BLEE’s.. 7.. Determinar la presencia de bandas plasmídicas en cepas de UPEC.. 9. ESQUEMA GENERAL DE TRABAJO. 10. MATERIAL Y METODOS 17.

(27) Se usaron 152 cepas de E. coli aisladas de pacientes con ITU obtenidas de un laboratorio particular de análisis clínicos de la Cd. de Puebla que se encuentran en crioalmacén del laboratorio de Biología Molecular de Enteropatógenos del Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, del Instituto de Ciencias BUAP; dichas cepas fueron caracterizadas bioquímica y serológicamente en el año 2011. Se resembraron en medio líquido LB incubándolas a 37°C toda la noche de 18 a 24 hrs. Se obtuvieron paquetes celulares que fueron usados para la extracción genómica y plasmídica. 10.1 MATERIAL BIOLOGICO La Tabla 2 enlista las cepas usadas como controles durante los ensayos que se realizaron en el presente trabajo. Tabla 2. Cepas controles usadas en el presente trabajo Cepa UPEC CFT073 059I GAG1 EHEC EDL UPEC J96 E. coli K12 MC4100 Cepa 7223. ETEC LD102b ETEC CD79a EPEC E2348/69. Características Positivo a iucD, vat, sat, hylA, papGII, fliC, fimH y las Islas I y II de dicha cepa Control positiva UPEC para ensayo de adherencia Positivo a sat, vat, papGIII Positivo a iucD, sat, hlyA, papA, fliC, fimH, cnf, Cepa Tipo EHEC Plásmido de 92 kb conocido Control Positivo para Hemolisina Positivo a las Islas I y II de dicha cepa Control Negativo para ensayo de Adherencia Control Positivo para Grupo A Cepa hiperadherente serotipo O25 multirresistente aislada de heces de portadores donada por el Laboratorio de Infecciones Hospitalarias y de la Comunidad. Control Positivo para el ensayo de adherencia. Cepa Tipo ETEC Control positivo para Toxina termolábil Cepa Tipo ETEC Control positivo para Toxina Termoestable Cepa Tipo EPEC Control positivo para Gen perteneciente al a isla de patogenicidad LEE. Para llevar a cabo las determinaciones de genes de virulencia, PAI´s, grupo filogenético, la búsqueda de patotipos híbridos y el bandeo plasmídico se usaron técnicas convencionales de extracción de DNA genómico mediante lisis alcalina, extracción de DNA plasmídico por Quick Prep previamente estandarizados en el laboratorio de Biología Molecular de Enteropatógenos (Sambrook et al., 2001). 18.

(28) 10.2 DETERMINACION DE GENES DE VIRULENCIA La Tabla 3 muestra los Genes buscados en 3 PCR’s múltiples y una PCR simple, los protocolos fueron previamente estandarizados en el Laboratorio de Biología Molecular de Enteropatógenos. Los productos expresados fueron revelados en geles de agarosa al 1%. Tabla 3. Factores de virulencia buscados en las PCR´s múltiples. GEN. TAMAÑO. TM. (pb) PCRm1. PCRm2. PCRm3. PCR individual. iucD. 512. satA. 384. fliC. 304. fimH. 210. papGII. 562. papGIII. 421. vatA. 330. vatP. 226. iha. 150. hylA. 1280. satP. 880. papA. 641. cnf. 3100. 57.7°C. 61.4°C. 61.4°C. 61.4°C. fimH: adhesina fimbrial pilus tipo 1, iucD: aerobactina, iha: adhesina homologa/captadora de hierro, sat: toxina autotransportadora secretada, vat: toxina autotransportadora vacuolizante, papG+papA: base y adhesinas del pilus tipo P, fliC: flagelina, hlyA: hemolisina, cnf: factor necrotizante citotoxico.. 10.3 DETERMINACION DE ISLAS DE PATOGENICIDAD. 19.

(29) Se utilizó el protocolo propuesto por Sabate et al., 2006 donde se buscaron 4 islas que codifican factores de virulencia clásicos de UPEC, las cuales se muestran en la Tabla 4. Tabla 4. Islas de Patogenicidad buscadas en PCR´s individuales.. Isla. Tamaño (pb). PAI. I 925pb. CFT073 PAI. Secuencia Oligonucleótida. Referencia. F: gga cat cct gtt aca gcg cgc a. Sabate et al., 2006. R: tcg cca cca at caca gcg aac II 420 pb. Sabate et al., 2006. F: atg gat gtt gta tcg cgc. CFT073. R: acg agc atg tgg atc tgc. PAI I J96. 400 pb. Sabate et al., 2006. F: tcg tgc tca ggt ccg gaa ttt R: tgg cat ccc aca tta tcg. PAI II J96 2300 pb. F: gga tcc atg aaa aca tgg tta atg gg. Sabate et al., 2006. R: gat att ttt gtt gcc att ggt tac c 10.4 DETERMINACION DE GRUPOS FILOGENETICOS Se utilizó el método propuesto por Clermont et al., 2013 para la identificación del grupo filogenético mediante un PCR Quadruplex La Tabla 5 muestra los genes buscados en el método y su correspondiente interpretación. Tabla 5. Genes buscados en la PCR Quadruplex para la determinación de los grupos filogenéticos en E. coli. Quadruplex arpA (400pb) + + + + + +. chuA (288pb) + + + + + + +. yjaA (211pb) + + + +. Filogrupo TspE.C4 (152pb) + + + + -. A B1 F B2 B2 B2 AoC DoE DoE E o clado I. Desconocido arpA: control interno de la pureza del DNA; chuA: captador tipo heme; yjaA: proteína inducida por estrés (resistencia a peróxido y acido); TspE4.C2: lipasa esterasa putativa. Desnaturalización 4 min a 94°C, 30 ciclos de 5 seg a 94°C y 5 seg a 59°C con un paso final de extensión de 5 min a 72°C. Clermont et al 2013. 20.

(30) 10.5 ENSAYOS DE ADHERENCIA Células HeLa fueron sembradas en medio MEM adicionado con suero fetal bovino (FBS) al 5% hasta que se obtuvieron cultivos con un porcentaje de confluencia del 70 al 80%, dichas células se tripsinizaron para obtener un conteo de células con azul de tripan en cámara de Neubauer y así obtener una dilución de 5x104 células/ml. Se sembraron 425 μl de dicha dilución por pozo en una placa de 8 pozos, estas placas se incubaron toda la noche a 37°C con 5% de CO2. Posterior a la incubación las monocapas de células HeLa en las placas de 8 pozos fueron lavadas con PBS estéril (aprox 785 μl por pozo). Por otro lado las cepas problema fueron sembradas en caldo LB durante toda la noche y 40 μl de cada cepa fueron diluidas en 4 ml de MEM con 1 ml de Manosa al 1%. Las monocapas de células HeLa se inocularon con 250 µl de la dilución bacteriana incubándose por dos horas a 37°C con 5% de CO2. Posterior a la incubación las placas de 8 pozos conteniendo tanto las células HeLa como las cepas problema se lavaron con PBS, se fijaron con metanol por 10 min y se tiñeron con 500 μl de Giemsa durante 10 min, se lavaron con Agua tridestilada para su posterior observación al microscopio y se determinó la adherencia localizada (Cieza et al., 2015). 10.6 BUSQUEDA DE PATOTIPOS HIBRIDOS Se llevaron a cabo 4 PCR´s individuales con los genes enlistados en la Tabla 6 para determinar cepas con genotipo híbrido, es decir que posea genes característicos de UPEC pero además genes de otros patotipos DAEC o ExPEC presentes en el cepario estudiado. Tabla 6. Genes y su respectivo producto para la identificación de patotipos de E. coli.. Gen hyl escD lt st. Tamaño 826 pb 759 pb 322 pb 147 pb. Patotipo Producto EHEC Hemolisina EPEC Gen perteneciente al a isla de patogenicidad LEE ETEC Toxina Termolábil ETEC Toxina Termoestable. 10.7 DETERMINACIÓN DE PERFILES DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS.. 21.

(31) La susceptibilidad a antibioticos se determinó hacia 24 antibióticos de 8 familias distintas mediante el método de difusión en disco (Kirby- Bauer) siguiendo los lineamientos del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2017). Como cepas de referencia se usaron Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Los antibióticos usados son los siguientes: Amikacina, Gentamicina, Netilmicina,. Ampicilina,. Cefotaxima, Ciprofloxacina,. Ofloxacina,. Cefalotina,. Ceftazidima,. Levofloxacina,. Trimetropim/Sulfametoxazol,. Cefuroxima,. Norfloxacina,. Ceftriaxona,. Ácido. Nitrofurantoina,. Nalidíxico,. Cloranfenicol,. Amoxicilina con Ácido Clavulánico, Aztreonam, Cefepime, Fosfomicina, Ertapemen, Colistina y Tetraciclina. Se inocularon 5 µl de crioconservado de la cepa a analizar en un tubo con 5 ml de caldo tripticaseina se dejó crecer hasta alcanzar una concentración de 0.5 en la escala de McFarland (1.5 x10 8 ufc/ml) y se sembró masivamente sobre una placa de Agar Mueller Hinton, antes de transcurridos 5 mins. Se colocaran los sensidicos sobre la superficie del agar y se dejó incubar a 37 °C durante 16-18 hrs. Posteriormente se midió el díametro del halo de inhibición de cada sensidisco y los resultados se compararon con los criterios del CLSI 2017. 10.8 CLASIFICACIÓN DE LA MULTIRESISTENCIA Se implementó el nuevo esquema de clasificación para la multiresistencia usado por Magiorakos et al., 2011 en el cual se clasifica a las Enterobacterias mediante la evaluación de la multiresistencia en 13 grupos principales. Se clasificó mediante el uso de la siguiente nomenclatura: NMDR: No multidrogo resistente (Resistencia en 2 o menos grupos); MDR: Multidrogoresistente (Resistencia en 3 grupos o más); XDR: Extremadamente resistente (Susceptibilidad en 1 o 2 grupos evaluados); PDR: Pandrogo resistente (Resistencia a todos los grupos evaluados). 10.9 PRESENCIA EXTENDIDO. DE. ENZIMAS. BETALACTAMASAS. DE. ESPECTRO. Se utilizó el método de difusión de doble disco en una placa de agar MuellerHinton inoculada con una suspensión bacteriana. Se colocaron los discos de 22.

(32) antibioticos betalactamicos (Ceftriaxona, Ceftazidima, Cefepime, Aztreonam, Cefotaxima) y el disco con el inhibidor de betalactamasa (Amoxicilina/Ac. Clavulánico) en la placa de Mueller-Hinton y se dejó incubar a 37°C durante 16-18 hrs para su posterior interpretación con base en la observación de sinergia entre los antibióticos (CLSI 2017), La Figura 2 indica la colocación de dichos sensidiscos.. Figura 2. Ubicación de los sensidiscos para la prueba.. 11. RESULTADOS 11.1 Población Estudiada El cepario fue obtenido a partir de 152 muestras de orina de pacientes ambulatorios cursando con infección de tracto urinario que acudieron a un 23.

(33) laboratorio clínico particular en la Cd. De Puebla durante el año 2010. Las muestras provenían principalmente de mujeres (83%) en un rango de edad de 22 a 55 años. Las E. coli que fueron aisladas se caracterizaron bioquímica y serológicamente. También se les evaluó la resistencia antimicrobiana a 12 antibioticos donde mostraron una multiresistencia del 70-72% (Molina Villa, 2010; Aroche Camarillo, 2011). 11.2 IDENTIFICACIÓN DE GENES DE VIRULENCIA EN CEPAS DE E. coli AISLADAS DE INFECCIONES DE TRACTO URINARIO. Las Figuras 3, 4 y 5 muestran geles representativos con sus respectivos patrones de bandeo de acuerdo a la longitud en pb de cada uno de los genes de virulencia amplificados.. 24.

(34) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. iucD (512 pb) satA (384 pb) fliC (304 pb) fimH (210pb) Figura 3. Determinación de genes de virulencia de UPEC por PCR múltiple 1. Resultado representativo de electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación. Carril 1: Control positivo cepa tipo CFT073, Carril 2 Cepa CR05, Carril 3 Cepa CR06, Carril 4 Cepa CR08, Carril 5 Cepa CR09, Carril 6 Cepa CR10, Carril 7 Cepa CR20, Carril 8 Cepa CR23, Carril 9 Control Negativo, Carril 10 Marcador de Peso Molecular GeneRulerTM 100 pb Plus DNA Ladder. iucD: aerobactina; satA: región autotransportadora de la toxina secretada; fliC: flagelina; fimH: adhesina fimbrial pilus tipo 1. 25.

(35) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. papGII (562 pb) papGIII (421 pb) vatA (330 pb) vatP (226 pb) iha (152 pb) Figura 4. Determinación de genes de virulencia de UPEC por PCR múltiple 2. Resultado representativo de electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación. Carril 1: Control positivo cepa tipo CFT073 + y cepa tipo O59I, Carril 2 Cepa CR41, Carril 3 Cepa CR42, Carril 4 Cepa CR43, Carril 5 Cepa CR44, Carril 6 Cepa CR45, Carril 7 Cepa CR46, Carril 8 Cepa CR54, Carril 9 Control Negativo, Carril 10 Marcador de Peso Molecular GeneRulerTM 100 pb Plus DNA Ladder. papGII: adhesina fimbrial pilus P; papGIII: adhesina fimbrial pilus P; vatA: región autotransportadora toxina vacuolizante; vatP: región peptidasa toxina vacuolizante; iha: adhesina homologa IrgA/sideroforo.. 26.

(36) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. hylA (1280 pb) satP (880 pb) papA (641 pb). Figura 5. Determinación de genes de virulencia de UPEC por PCR múltiple 3. Resultado representativo de electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación. Carril 1: Control positivo cepa tipo GAG1, Carril 2 Cepa CR119, Carril 3 Cepa CR120, Carril 4 Cepa CR121, Carril 5 Cepa CR123, Carril 6 Marcador de Peso Molecular GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder., Carril 7 Cepa CR124, Carril 8 Control Negativo. hylA: hemolisina; satP: región peptidasa toxina autotransportadora; papA: base pilus P.. La Figura 6 muestra los porcentajes de amplificación de cada gen de virulencia individual considerando la amplificación por separado de los componentes del pilus tipo P (papA y papG) así como los motivos transportador y proteolítico de las toxinas secretada y vacuolizante (satA, satP, vatA y vatP).. 27.

(37) Porcentaje (%). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0. 87. 85. 84. 64 55. 68. 54 47 26. 26 14 7. fimH papGII papGIII papA. Adherencia. 2 iha. iucD. fliC. satA. satP. Sistemas de Captación de Hierro y movilidad. vatA. vatP. hlyA. cnf. Citotoxicidad. Figura 6. Genes detectados por PCR múltiple e Individual. (n=152). La Figura 7 muestra la interpretación de los resultados considerando solo aquellos productos genéticos que son parte de un mismo factor de virulencia, tal es el caso de la parte estructural del pilus tipo p (papA) y los diferentes alelos de las adhesinas (papGII o papGIII) así como el motivo proteolítico (satP y vatP) y las partes autotransportadoras (satA y vatA) de las toxinas Sat y Vat. Los porcentajes más altos fueron para genes relacionados a adhesina del pilus tipo 1, fimH con un 87% (n=132), el sistema de capción de hierro aerobactina, iucD con un 85% (n=129) y al receptor de hierro que funciona también como adhesina de superficie, iha con un 84%(n=128) mientras que los genes relacionados al pilus Pap 3% y cnf 2% fueron detectados en bajo porcentaje.. 28.

(38) 100 90. 87. 84. 85. Porcentaje (%). 80 70 60. 49. 50 40. 32 26. 30. 14. 20 10. 3. 2. 0 fimH. papA+papG. Adherencia. iha. iucD. fliC. Sistemas de Captacion de hierro y movilidad. sat. vat. hylA. cnf. Citotoxicidad. Figura 7. Genes asociados a virulencia encontrados en cepas de E. coli aisladas de ITU. (n=152). El 100% del cepario amplificó al menos uno de los 13 fragmentos genéticos asociados a los 9 genes de virulencia de UPEC. El 31% (n=47) del cepario posee 3 genes amplificados seguido por las que amplificaron 4 y 5 genes; 26% (n=39) y 16% (n=24) respectivamente. Así mismo, se encontraron un total de 19 virotipos comunes y 133 virotipos únicos (Tabla 7).. 29.

(39) Tabla 7. Perfiles electroforéticos de virulencia encontrados en cepas de E.coli aisladas de ITU. Cepa. Perfiles Comunes. No. Cepas. CR24,CR57. fimH,iha, fliC. 2. CR188, CR190. fimH,iucD,fliC, vat. 2. CR41, CR224. iucD,iha,sat,vat. 2. CR75, CR164. fimH,iucD, iha,vat,hylA. 2. CR16, CR132. fimH,iucD,iha,fliC,sat. 2. CR178, CR183, CR186. fimH,iucD,vat. 3. CR56, CR128, CR134. fimH,iucD, iha,sat,hylA. 3. CR89, CR200, CR201, CR244. fimH. 4. CR39, CR43, CR54, CR229. iucD,iha,vat. 4. CR45, CR120, CR157, CR231. fimH,iucD, iha,fliC,vat. 4. CR165, CR191, CR198, CR199, CR205. fimH,iucD,fliC. 5. CR135, CR176, CR180, CR139, CR177. fimH,iucD, iha,sat,vat,hlyA. 5. CR18, CR20, CR27, CR44, CR217, CR234. iucD,fimH,iha,sat. 6. CR05, CR124, CR144, CR172, CR189, CR221. iucD,fliC,fimH,iha,sat,vat. 6. CR13, CR62, CR64, CR68, CR79, CR82, CR130. fimH,iha. 7. CR06, CR100, CR126, CR202, CR207, CR09, CR136, CR138, CR142 CR10, CR129, CR227, CR12, CR116, CR123, CR125, CR145, CR169, CR184, CR197, CR208, CR235 CR11, CR106, CR223, CR40, CR46, CR121, CR160, CR166, CR168, CR206, CR209, CR215, CR220, CR225, CR226 CR31, CR39, CR71, CR96, CR105, CR108, CR111, CR112, CR171, CR216, CR230, CR08, CR32, CR42, CR76, CR97, CR102, CR143, CR151, CR154, CR163, CR241, CR243, CR55, CR77. fimH,iucD, iha,fliC,. 9. fimH,iucD,iha,sat,vat. 13. fimH,iucD,iha,vat. 15. fimH,iucD,iha. 25. (n=119) fimH: adhesina fimbrial pilus tipo 1, iucD: aerobactina, iha: adhesina homologa/captadora de hierro, sat: toxina autotransportadora secretada, vat: toxina autotransportadora vacuolizante, papG+papA: base y adhesinas del pilus tipo P, fliC: flagelina, hlyA: hemolisina, cnf: factor necrotizante citotoxico.. 30.

(40) 11.3 PRESENCIA DE ISLAS DE PATOGENICIDAD (PAI´s). Las Figuras 8 y 9 muestran los amplificados de dos de las cuatro islas de patogenicidad buscadas en el presente trabajo. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. PAI ICFT073 (925 pb). Figura 8. Determinación de Isla de Patogenicidad I de CFT073 por PCR sencilla. Resultado representativo de electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación. Carril 1: Control positivo usando como templado DNA genómico de la cepa tipo de UPEC CFT073, Carril 2 Cepa problema CR80, Carril 3 Cepa CR82, Carril 4 Cepa CR83, Carril 5 Cepa CR84, Carril 6 Cepa CR85, Carril 7 Cepa CR86, Carril 8 Cepa CR87 Carril 9 Control Negativo, Carril 10 Marcador de Peso Molecular GeneRulerTM 100 pb Plus DNA Ladder.. 31.

(41) 1. 2. 3 4. 5 6. 7 8. 9 10 11 12. PAI IICFT073 (420 pb). Figura 9. Determinación de Isla de Patogenicidad II de CFT073 por PCR sencilla. Resultado representativo de electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación. Carril 1: Control positivo usando como templado DNA genómico de la cepa tipo de UPEC CFT073, Carril 2 Cepa CR126, Carril 3 Cepa CR128, Carril 4 Cepa CR129, Carril 5 Cepa CR130, Carril 6 Cepa CR132, Carril 7 Cepa CR134, Carril 8 Cepa CR135 Carril 9 Cepa CR136, Carril 10 Marcador de Peso Molecular GeneRulerTM 100 pb Plus DNA Ladder, Carril 11 Cepa CR138, Carril 12 Control Negativo.. Con los resultados obtenidos de las diferentes reacciones de PCR, se graficó el porcentaje de PAIs en la población analizada Figura 10. Se observa que la isla de patogenicidad IICFT073 está en un 61% (n= 92) seguida de la isla ICFT073 en un 35% (n=53). Ninguna cepa amplifico cualquiera de las islas típicas de J96. La Tabla 8 muestra las cepas que poseen las islas de patogenicidad en relación a los genes de virulencia que se han reportado para cada una de estas islas.. 32.

(42) 100 90. Porcentaje (%). 80 70. 61. 60 50 40. 35. 30 20 10. 0. 4. 0 PAI I CFT073. PAI II CFT073. PAI I J96. PAI II J96. PAI´s. Figura 10. Islas de Patogenicidad presentes en cepas de E. coli aisladas de ITU. (n=152). Tabla 8. Relación entre las islas de patogenicidad encontrados y genes asociados a virulencia. Cepas donde se encontraron presentes los genes codificantes para las islas. CR128 CR207 CR223 CR12 CR13 CR32 CR39 CR43 CR123 CR125 CR144 CR168 CR172 CR176 CR215 CR218 CR241. PAI. PAI ICFT073. Productos reportados presentes en dichas islas Genes de hlyA y iucD. Genes de virulencia. fimH,iucD,iha,sat,hylA fimH,iucD,fliC,iha fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD,iha,sat,vat fimH,iha fimH,iucD,iha iucD,iha,vat iucD,iha,vat fimH,iucD,iha,sat,vat fimH,iucD,iha,sat,vat fimH,iucD,iha,fliC,sat,vat fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD, iha,fliC,sat,vat fimH,iucD, iha,sat,vat,hlyA fimH,iucD, iha,vat fimH,papG+papA,iucD,iha,sat,vat fimH,iucD,iha. 33.

(43) CR06 CR11 CR31 CR38 CR54 CR57 CR58 CR61 CR62 CR65 CR71 CR86 CR89 CR90 CR92 CR94 CR95 CR100 CR105 CR106 CR112 CR130 CR165 CR167 CR170 CR171 CR173 CR179 CR183 CR187 CR188 CR194 CR198 CR201 CR202 CR216 CR230 CR231 CR244 CR40 CR44 CR60 CR97 CR102 CR136 CR142 CR154 CR157 CR160 CR163 CR180. PAI IICFT073. fimH,iucD,fliC,iha fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD,iha fimH,iucD,iha iucD,iha,vat fimH,iha,fliC iucD,iha fimH,iha,vat fimH,iha fimH,iha fimH,iucD,iha sat fimH iucD iha fliC,vat iucD,iha,sat iha,fliC fimH,iucD, iha,fliC fimH,iucD,iha fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD,iha fimH,iha fimH,iucD,fliC fimH,iucD fimH,iucD,sat fimH,iucD,iha fimH, papG+papA,iucD,iha, fimH,iucD,sat,vat fimH,iucD,vat fimH,vat fimH,iucD,fliC,vat fimH,iucD,iha, fliC,sat,vat,hylA fimH,iucD,fliC, fimH fimH,iucD,iha,fliC fimH,iucD,iha fimH,iucD, iha,sat,vat fimH,iucD,iha fimH,iucD, iha,fliC,vat fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD,iha,sat iucD,iha,sat,vat,hylA fimH,iucD,iha fimH,iucD,iha fimH,iucD,iha,fliC fimH,iucD, iha,fliC fimH,iucD,iha fimH,iucD,iha,fliC,vat fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD,iha fimH,iucD,iha,sat,vat,hlyA. 34.

(44) CR189 CR190 CR206 CR209 CR229. NINGUNA CR118 CR119 CR23 CR138 CR148 CR164. fimH,iucD,iha,fliC,sat,vat fimH,iucD,fliC,vat fimH,iucD,iha,vat fimH,iucD,iha,vat iucD,iha,vat. PAI IJ96 PAI IIJ96. Ninguno fimH,papG+papA,iucD,iha,sat,hyl A fimH,iucD, iha,fliC,sat,vat,hylA,cnf fimH,iucD, iha,fliC,sat,vat,hylA fimH,iucD, iha,fliC, iucD,iha,vat,hylA fimH,iucD,iha,vat,hylA. (n=81) fimH: adhesina fimbrial pilus tipo 1, iucD: aerobactina, iha: adhesina homologa/captadora de hierro, sat: toxina autotransportadora secretada, vat: toxina autotransportadora vacuolizante, papG+papA: base y adhesinas del pilus tipo P, fliC: flagelina, hlyA: hemolisina, cnf: factor necrotizante citotoxico.. 11.4 GRUPO FILOGÉNETICO El grupo filogenético se determinó mediante una PCR Cuádruplex propuesta por Clermont et al., 2013, los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% para observar el perfil de bandeo. La Figura 11 muestra un ejemplo de la determinación por este método.. 35.

(45) 1. 2. 3 4. 5. 6. 7 8. 9 10 11 12 13. arpA (400 pb) chuA (288 pb) yjaA (211 pb) TspE4.C2 (400 pb) Figura 11. Determinación de Grupos Filogenéticos PCR Cuádruplex. Resultado representativo de electroforesis en geles de agarosa al 1% de los productos de amplificación. Carril 1: Control Positivo Cepa Tipo CFT073 y MC4100; Carril 2 Cepa CR05, Carril 3 Cepa CR06, Carril 4 Cepa CR08; Carril 5 Cepa CR09; Carril 6 Cepa CR10; Carril 7 Cepa CR11; Carril 8 Cepa CR12; Carril 9 Cepa CR13, Carril 10 Cepa CR16, Carril 11 Cepa CR18, Carril 12 Cepa CR16; Carril 13 Marcador de Peso Molecular GeneRulerTM 100 pb Plus DNA Ladder. arpA: control interno de la pureza del DNA; chuA: captador tipo heme; yjaA: proteína inducida por estrés (resistencia a peróxido y acido); TspE4.C2: lipasa esterasa putativa. La Figura 12 muestra al grupo B2 se encontró en el 57% (n=86 cepas) seguido del grupo A 41% (n= 63 cepas). El grupo D y el desconocido (cepa que no pudo ser clasificada por esquema Clermont et al 2013) fueron encontrados en un bajo porcentaje representados por 1 y 2 cepas respectivamente. Posterior a esto las cepas de cada grupo fueron ordenadas junto a su serotipo, su perfil de virulencia y de resistencia, separándolas de las no tipificables (Tablas 9 y 10). Se encontró que el Grupo A (tipificables y no tipificables) poseían una elevada variedad de genes de virulencia, algunos de ellos de gran importancia debido al daño que pueden causar en un hospedero. Mientras que el Grupo B2 (tipificables y no tipificables) tienen una virulencia más elevada que en el grupo filogenético A.. 36.