MODIFICACIONES HISTOLÓGICAS INDUCIDAS EN LA VID POR LA YESCA Lucia ANDREINI1*, Raffaella VITI2, Giancarlo SCALABRELLI2
1 Scuola Superiore Sant’Anna, P.zza Martiri della Libertà, 33 – 56127 Pisa 2
Dipartimento di Coltivazione e Difesa delle Specie Legnose “G. Scaramuzzi”, Università di Pisa, Via del Borghetto, 80 - 56124 Pisa
*landreini@sssup.it, fax 050 883204
Póster presentado en Enoforum, 21-23 abril 2009, Piacenza, Italia
Resumen
El objetivo de este trabajo de investigación era estudiar las características de muestras de hojas, pecíolos y entrenudos tomadas de plantas de Cabernet Sauvignon, Sangiovese y Trebbiano afectadas por la Yesca.
Durante tres años se tomaron muestras de: plantas sintomáticas (S); plantas que no habían mostrado nunca síntomas de Yesca (NoS) y de plantas que habían resultado ser sintomáticas durante el año precedente (PAS). En estas últimas plantas de la variedad Cabernet Sauvignon, desde la floración hasta el inicio del cuajado, y antes de la aparición de los síntomas, se seleccionaron brotes de los cuales se muestrearon pecíolos de hojas basales y apicales. Cuando se manifestaron los primeros síntomas, se tomaron muestras de pecíolos de hojas apicales y asintomáticas. Tras la aparición de los síntomas de la Yesca, desde el cuajado hasta el envero, se muestrearon pecíolos y entrenudos de plantas sintomáticas y asintomáticas de Cabernet Sauvignon, Sangiovese y Trebbiano.
Tras la fijación e inclusión los tejidos fueron seccionados y las secciones finas sometidas a tinción (Violeta cristal -Eritrosina B) para identificar la lignificación de las paredes celulares. La característica principal, de los tejidos de plantas sintomáticas, fue el menor engrosamiento de las paredes celulares, en particular de los elementos vasculares. Esta variación se observó en las tres variedades tanto a nivel de los tejidos de los entrenudos como en los pecíolos. La alteración de la coloración de las paredes de los vasos xilemáticos, observada en los pecíolos antes de la aparición de los síntomas foliares, sugiere la posibilidad de poder utilizar en el futuro el análisis histológico como un potencial método para la detección temprana de la yesca.
Introducción
La Yesca es una compleja patología que se conoce desde que se empezó a cultivar la vid y que en Europa, así como en otras partes del mundo, es considerada una de las patologías más dañinas que afectan a los tejidos leñosos de la vid. La yesca incluye una serie de síntomas que derivan de cambios estructurales y fisiológicos que no pueden reducirse a la simple relación causa-efecto. Como consecuencia de ello se obtiene que síntomas que parecen similares pueden ser originados por causas diferentes (Mugnai et al., 1999). Los síntomas pueden aparecer, desde junio hasta septiembre, de forma leve o severa, aunque existen casos en los que se pueden producir ambas tipologías en la misma planta (Surico et al., 2000; Dubos, 2002). Los síntomas de leve entidad se caracterizan por el deterioro del aparato foliar a partir de las porciones basales de los sarmientos; las hojas se ven afectadas por pequeñas zonas de tejido internerval que al principio muestran solamente un amarillamiento y a continuación los tejidos se necrotizan. Los racimos pueden presentar a su vez los síntomas sobre la epidermis de las bayas, en cualquier caso los racimos no llegan a madurar totalmente. La forma severa de la Yesca consiste en la rápida muerte de la planta, llamada apoplejía: consiste en un repentino marchitamiento que determina la muerte de toda la planta o de una parte de ella (Larignon and Dubos, 1997, Surico et al., 2000).
presencia de los síntomas es una de las características que hace que el estudio de esta enfermedad sea difícil (Mugnai et al., 1999).
A pesar de las numerosas experimentaciones realizadas sobre la Yesca, las alteraciones histológicas en los tejidos afectados por la enfermedad sigue siendo un tema que debe ser todavía examinado y que podría contribuir a la comprensión del complejo mecanismo que origina la Yesca. El objetivo de este trabajo era estudiar desde el punto de vista histológico las características de pecíolos y entrenudos de brotes sintomáticos.
Materiales y métodos
El trabajo experimental se llevó a cabo durante el trienio 2005-2007 en un viñedo en su vigésimo cuarto año de producción situado en Colignola (Pisa), perteneciente a los campos experimentales del Departamento de Cultivo y Defensa de las Especies Leñosas (Altitud 6 m, 43.02 N, 10.36 E). El viñedo con marco de plantación 3 x 1 m, está constituido por 4 variedades (Sangiovese, Cabernet Sauvignon,
Trebbiano, Chardonnay) cuyas plantas, cultivadas en cordón libre, están distribuidas en sentido
transversal con respecto a la longitud del viñedo en cuatro bloques al azar de 15 plantas. El trabajo de investigación se llevó a cabo considerando tres de las cuatro variedades: Sangiovese, Cabernet
Sauvignon, Trebbiano. Cabernet Sauvignon es una variedad conocida por ser sensible a la Yesca, y Sangiovese y Trebbiano son dos variedades, una de uva tinta otra de uva blanca, muy extendidas en
el territorio nacional.
- Antes y al inicio de la aparición de los síntomas de la Yesca (desde la floración hasta las primeras fases del cuajado) se tomaron muestras de material de plantas de Cabernet Sauvignon, genotipo conocido por ser muy susceptible a la Yesca. De plantas que no habían sido nunca sintomáticas, consideradas sanas y por tanto testigo (NoS); y de plantas (5) que habían resultado ser sintomáticas el año anterior (PAS), antes de la aparición de los síntomas se seleccionaron tres brotes con un número parecido de nudos (comprendido entre 24 y 27) de los cuales se muestrearon pecíolos de hojas basales y apicales. Con el fin de muestrear material de la misma edad, dentro de cada porción los pecíolos se muestrearon de una misma sección de brote constituido por 3 nudos. Cuando se manifestaron los primeros síntomas foliares en la parte basal del brote las muestras se tomaron de las hojas apicales asintomáticas.
- Tras la aparición de los síntomas de la Yesca, (desde el cuajado hasta el envero) se tomaron muestras, en plantas sintomáticas (S) y asintomáticas (NoS) de Cabernet Sauvignon, Sangiovese y
Trebbiano, de pecíolos y entrenudos (n=10) en la porción mediana y apical de brotes constituidos por
un número parecido de nudos y comprendido entre 30 y 33. Con el fin de muestrear material vegetal lo más homogéneo posible desde el punto de vista de la edad y de las características de vigor de los brotes fructíferos, las muestras se tomaron siguiendo los mismos criterios arriba indicados. El material muestreado fue fijado en FAA (etanol, ácido acético, formaldehído en una proporción 8:1:1 v/v) y, tras la deshidratación en una serie alcohólica creciente, se incluyeron en Histoplast y se seccionaron con microtomo (Shandon) transversalmente (7 m). Con el fin de evidenciar la lignificación de los elementos vasculares, se efectuó la tinción de las secciones mediante Violeta cristal y Eritrosina B (Clark, 1981). La violeta genciana es un colorante catiónico que posee una elevada afinidad por la lignina (Drnovsek and Perdih, 2005), y que evidencia su presencia a través de una coloración azul-violácea. Las preparaciones histológicas fueron observadas al microscopio óptico (Nikon, Fluophot) de luz polarizada equipado con una cámara fotográfica digital para la adquisición de imágenes.
Resultados y discusión
El estudio al microscopio de las secciones finas realizadas de porciones de entrenudos e pecíolos, evidenció la presencia de características diferentes en función del estado sanitario del material.
Características histológicas de los tejidos antes de la aparición de los síntomas de la Yesca.
Al inicio de la floración de las plantas de Cabernet Sauvignon (Figura 1 A, D), cuando los síntomas foliares de la Yesca no eran todavía visibles, los tejidos de los pecíolos de hojas basales y apicales muestreados en plantas que habían mostrado síntomas el año anterior (PAS), eran exactamente iguales a los tejidos de control (NoS). En los pecíolos basales las paredes celulares de los vasos y de las fibras del meta-xilema estaban lignificadas (Figura 1A) presentando una regular coloración violeta. En los pecíolos apicales los elementos vasculares mostraban una débil coloración que concuerda con el estadio juvenil de la hoja (Figura 1 D).
Figura 1. Secciones
trasversales que representan porciones de bandas vasculares de pecíolos muestreados de plantas Cabernet Sauvignon que el año anterior resultaron ser sintomáticas. Pecíolos muestreados de la parte basal (A, B, C) y apical (D, E, F) del brote durante la floración (A, D), cuajado (B, E) y envero (D, F). x: vasos xilemáticos del meta-xilema, fx: fibras xilemáticas. Barra: 50 µm
Durante las primeras fases del cuajado (Figura 1 B, E) las plantas PAS todavía no presentaban síntomas de Yesca, mientras que los pecíolos basales y apicales mostraban los tejidos xilemáticos poco lignificados con respecto al muestreo precedente. Este defecto se evidencia por la baja intensidad de la tinción de los elementos vasculares que denota una menor deposición de lignina sobre las paredes celulares. Esta misma característica se observó en los pecíolos de hojas sintomáticas que presentaban las paredes celulares de los vasos (x), las fibras xilemáticas (fx), y las esclerenquimáticas que protegen las bandas (fs) poco lignificadas (Fig. 5 e 6). Al principio del envero (Figura 1 C, F), cuando los síntomas foliares eran claramente visibles sólo en la parte basal del sarmiento, los pecíolos de hojas apicales todavía asintomáticas mostraban los tejidos vasculares poco lignificados y parcialmente dañados.
Figura 2. Porción de secciones trasversales de entrenudos medianos muestreados en el envero de plantas de Sangiovese: sanas (A), con síntomas de la Yesca (C) y respectivos detalles (B y D). fs: fibras esclerenquimáticas; f: floema; c: felógeno; x: xilema; r: radio parenquimático. Barra: 100 µm.
Figura 3. Porciones de secciones trasversales de entrenudos apicales muestreados en el envero de plantas de Sangiovese: sanas (A), con síntomas de la Yesca (C) y respectivos detalles (B y D). fs: fibras esclerenquimáticas; f: floema; c: felógeno; x: vaso xilemático. Barra: 50 µm.
La menor lignificación de los tejidos de los entrenudos era claramente visible en las secciones finas de
Sangiovese muestreadas en el envero (Figura 2 e 3), cuando en los sarmientos se reconocían ya las
típicas venas foliares. La figura 2 (A) muestra el detalle de una sección transversal representativa de un entrenudo mediano muestreado en una planta sana. Se puede ver el engrosamiento regular de los tejidos vasculares y parenquimáticos con respecto a los tejidos de brotes dañados por la Yesca (Figura 2 C) y caracterizados por un tinte muy ligero. Una situación similar se observó en la parte apical del brote (Figura 3 A, C). En particular, en las muestras afectadas por la enfermedad se observaba una menor lignificación de las fibras esclerenquimáticas, muy marcada en la porción apical del brote (Figura 3 D), con respecto a la mediana (Figura 2 D).
Características similares se observaron también en muestras de entrenudos medianos muestreados en el cuajado de plantas sintomáticas de Trebbiano (Figura 4): los elementos xilemáticos y las fibras esclerenquimáticas presentaban un menor engrosamiento de las paredes celulares, detectado a través de su débil o ausente coloración.
Figura 4. Detalles de secciones transversales de entrenudos medianos muestreados en el envero de plantas de Trebbiano: sintomáticas (A, B, C) y sanas (D, E, F). pco: parenquima cortical; fs: fibras esclerenquimáticas; f: floema; c: felógeno; x: vaso xilematico; r: radio parenquimático; fx: fibras xilemáticas;. pce: parenquima central. B, E: barra 30 µm; A, C, D, F: barra 50 µm).
El examen histológico de los pecíolos confirmó todo lo observado a nivel de los entrenudos (Figuras 5 y 6). A nivel de la zona cortical del pecíolo de hojas sintomáticas se observó además una mayor disgregación de las células parenquimáticas (Figuras 7C); mientras, a nivel del parénquima central, las células se presentaban sin turgencia y parcialmente colapsadas (Figura 7D). Por el contrario, en los pecíolos de hojas sanas los tejidos se presentaban íntegros y lignificados normalmente (Figure 5, 6, 7).
Figura 5. Porciones de bandas vasculares en sección transversal de pecíolos muestreados en el envero en plantas sanas de Sangiovese: sanas (A), sintomáticas (C) y respectivos detalles (B y D). pco: parénquima cortical; x: xilema; pce: parénquima central. Barra: 50 µm.
Figura 6. Detalles de bandas vasculares en sección transversal de pecíolos muestreados en el envero en plantas de Cabernet Sauvignon: sanas (A, B) y sintomáticas (C, D). pco: parénquima cortical; x: xilema; pce: parénquima central. A, C: barra 70 µm; B, D:
Figura 7. Detalles de células del parénquima cortical y central en secciones transversales de pecíolos muestreados en el envero en
plantas de Cabernet
Sauvignon: sanas (A, B) y sintomáticas (C, D). pco: parénquima cortical; pce: parénquima central. Barra: 50
µm.
Conclusiones
La principal peculiaridad de los tejidos vegetales afectados por la Yesca, está representada por una menor lignificación, en particular de los tejidos vasculares. Además los tejidos parenquimáticos mostraron zonas afectadas por degradación celular. Estas alteraciones de los tejidos afectados por la enfermedad fueron observadas de forma similar en las tres variedades examinadas y se repitieron en los tres años de experimentación. El estudio histológico de los tejidos de pecíolos y entrenudos de vides afectadas por la Yesca puso de manifiesto estas características histológicas en los dos órganos estudiados.
La menor coloración de las paredes celulares y de los elementos vasculares fue confirmada en parte mediante otro método de tinción, con Safranina y Fast Green (datos no mostrados), sin embargo es necesario validar estos resultados con otras tinciones específicas para evidenciar la diversa lignificación de las paredes celulares. Si se confirmase todo lo observado quedaría por verificar si la menor lignificación de las paredes de los elementos vasculares, detectada antes de la aparición de los síntomas foliares en plantas de Cabernet Sauvignon, es común con otras variedades. En caso positivo el examen histológico podría representar un método útil para la determinación de un factor “espía” de la aparición de la enfermedad.
Agradecimientos
La investigación ha sido llevada a cabo en el marco del proyecto interregional “Investigación y experimentación en vivero y en campo para la contención de la Yesca de la vid” (MESVIT) comisionado por ARSIA y financiado por el Ministerio de Agricultura y Silvicultura italiano.
LARIGNON P., DUBOS B., 1997. Fungi associated with esca disease in grapevine. European Journal of Plant Pathology, 103:147-157.
MUGNAI L., GRANITI A., G. SURICO, 1999. Esca (Black Measles) and Brown Wood-Streaking: Two Old and Elusive Diseases of Grapevines. Plant Disease, 83(5): 404-418.
SURICO G., MARCHI G., FERRANDINO F. J., BRACCINI P., MUGNAI L., 2000. Analysis of the spatial spread of esca in some Tuscan vineyards (Italy). Phytopathol. Mediterr. 39: 211-224.
