DETERMINACION DE LA CAPACIDAD INHIBITORIA DEL CRECIMIENTO DE Cryptococcus neoformans POR CELULAS NK HUMANAS Y FACTORES SOLUBLES

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DETERMINACION DE LA CAPACIDAD INHIBITORIA DEL CRECIMIENTO DE

Cryptococcus neoformans POR CELULAS NK HUMANAS Y FACTORES SOLUBLES

LINA MARIA SANTA GUZMAN

DIRECTOR

Dra. SUSANA FIORENTINO

CO-DIRECTOR

Dra. VIVIANA GRANADOS GONZALEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA BACTERIOLOGIA

SANTAFE DE BOGOTA D.C. SEPTIEMBRE DE 2000

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TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

para optar el título de BACTERIOLOGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA D. C.

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ARTICULO 23: De la resolución No. 13 de Julio de 1946: “ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”.

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DIRECTOR

_______________________ Dra. SUSANA FIORENTINO

CO-DIRECTOR

________________________________ Dra. VIVIANA GRANADOS GONZALEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULT AD DE CIENCIAS CARRERA BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA D. C.

SEPTIEMBRE DE 2000

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APROBADO

_____________________ ____________________ Dra. ADRIANA CUELLAR Dra. MERY SANTAELLA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA D. C.

SEPTIEMBRE DE 2000

_________________________ Dr. CARLOS CORREDOR Ph D

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____________________________ Dra. AURA ROSA MANAS CERO

DIRECTORA CARRERA DE BACTERIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA D. C.

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RESUMEN

Las células asesinas naturales (NK) han sido reconocidas como células efectoras del sistema inmune innato y están implicadas en la respuesta a microorganismos encapsulados como Cryptococcus neoformans. La presencia de receptores que unen carbohidratos sobre las NK, podría explicar la activación de éstas células como respuesta a la infección. Conocer el papel que juegan los polisacáridos capsulares, como GXM (Glucurunoxylomannan) de C. neoformans o el polisacárido de Pneumococo en la interacción NK- Cryptococo y poder establecer el tipo de mecanismo en la muerte de la levadura, nos permitirá analizar como dichas células pueden dirigir la respuesta inmune frente a éstos antígenos.

Poblaciones de células mononucleares enriquecidas en NK, mononucleares totales y mononucleares depletadas de monocitos, a diferentes concentraciones (2x105,1x1 05,5x104 y 30x104), se incubaron durante 24 y 48 horas con la levadura, tiempo en el cuál se sembró en agar Sabouraud para el recuento de unidades formadoras de colonias del microorganismo; de igual manera las células se incubaron con polisacárido GXM, polisacárido de Pneumococo y Cryptococo durante los mismos tiempos y se hizo posteriormente el recuento de las unidades formadoras de colonias. De dichos cultivos se recogieron sobrenadantes, los cuales fueron puestos en contacto con la levadura durante 24 y 48 horas y de igual manera se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias. Nuestros resultados mostraron, que luego de la incubación durante 48 horas, de 200.000 células mononucleares enriquecidas en un 20% de NK, la levadura mostró un 56% de inhibición, a dicha concentración de células se presentó la mayor inhibición; con mononucleares totales la inhibición fue del 74% y con células mononucleares depletadas de monocitos la inhibición fue del 18%. Al colocar la población de células enriquecidas en NK con 10 ug de polisacárido GXM de Cryptococo y de polisacárido de Pneumococo, observamos un 100% y un 10% de inhibición del crecimiento de la levadura respectivamente. Al analizar el efecto de los Sobrenadantes de 48 horas de células enriquecidas en NK y mononucleares depletadas de monocitos, se observó que la levadura muestra un 53% de inhibición.

En este estudio se demostró que la inhibición del crecimiento de C. neoformans es dependiente del tiempo y la concentración de células, igualmente se pudo observar que

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la inhibición en cultivos enriquecidos en NK previamente activados con GXM, es mayor que la observada en células depletadas de monocitos.

Estos resultados nos hacen pensar que probablemente la inhibición por células NK puede estar mediada por factores solubles inducidos por los polisacáridos capsulares, mientras que en la población celular total, ésta inducción de factores solubles es debida a la presentación de proteínas al sistema inmune.

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1. INTRODUCCION

Las células NK han sido reconocidas como células efectoras del sistema inmune innato. Estas células se caracterizan por lisar o inhibir una variedad de células incluyendo, células tumorales, células infectadas por virus, bacterias como Listeria monocytogenes, parásitos como Toxoplasma gondii y hongos oportunistas como C. neoformans (MURPHY, 1993)

Como ya se conoce, los polisacáridos son los componentes principales de la cápsula de microorganismos como C. neoformans. Dichos polisacáridos tienen la característica de comportarse como antígenos timo independientes, específicamente tipo 2, los cuales pueden activar directamente al linfocito B para que produzca anticuerpos en ausencia de linfocitos T, con la desventaja de que estos anticuerpos son no protectores; sin embargo los antígenos timo independientes tipo 2 en presencia de citocinas producidas por células accesorias como macrófagos, NK, etc., generan un cambio de isotipo de inmunoglobulinas (MURPHY, 1993; CHERNIACK,1992)

Por lo anterior, el papel de las células NK frente a la levadura tiene gran importancia, ya que estas células podrían activarse directamente con estos polisacáridos y producir citocinas que regulen la respuesta adaptativa positiva o negativamente (CHERNIACK, 1992)

Estudios realizados muestran una interacción de las células NK con C. neoformans, al evidenciar la inhibición del crecimiento de la levadura por dichas células. (MURPHY, 1993; STUART,1994; MURPHY,1991)

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Los mecanismos por los cuales se da ésta inhibición no son claros aún y tampoco se conoce el papel que puedan tener o no los polisacáridos capsulares como el GXM (Glucurunoxylomannan) de C. neoformans o el polisacárido de Pneumococo en esta interacción. En el presente trabajo se determinó la capacidad que tienen las células NK de inhibir el crecimiento de la levadura, así como el efecto de los polisacáridos capsulares solubles de Cryptococo y de Pneumococo en la interacción NK- Cryptococo y de los sobrenadantes obtenidos de cocultivos de éstas células con la levadur a. Los resultados obtenidos demuestran que la inhibición del crecimiento de C. neoformans es dependiente del tiempo y la concentración de células, igualmente se pudo observar que la inhibición en cultivos enriquecidos en NK previamente activadas con GXM es mayor que la observada en células depletadas de monocitos. Estos resultados nos hacen pensar que probablemente la inhibición por células NK puede estar mediada por factores solubles inducidos por los polisacáridos capsulares, mientras que en la población celular total, ésta inducción de factores solubles es debida a la presentación de proteínas al sistema inmune.

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2.1 Características generales de Cryptococcus neoformans.

C. neoformans es un hongo levaduriforme de tamaño variable, 4 a 8 micras, capsular, que se reproduce por gemación; crece tanto a 37ºC como a temperatura ambiente sin que ocurran cambios en el aspecto micro o macroscópico del hongo. Las colonias son de tipo levadura, blancas o cremas, de consistencia mucosa, dependiendo de la abundancia de material capsular. Es un saprófito en la naturaleza, con distribución universal. El hongo se puede encontrar con frecuencia en el suelo, en los excrementos de palomas así como en lugares de nidación como bordes de ventanas o graneros y causa en animales y en el hombre una enfermedad sistémica denominada Cryptococosis.

Antes de la aparición de la epidemia del SIDA, la incidencia anual de infecciones Criptococócicas en los Estados Unidos se estimaba en uno a dos casos nuevos por millón de habitantes. La frecuencia aumentó tanto que en este momento la cryptococosis constituye la cuarta infección oportunista más frecuente en pacientes con SIDA. (DIAMOND,1990; RESTREPO, 1992)

2.1.1 Clasificación Taxonómica

Sobre la base de la especificidad antigénica del polisacárido capsular se han encontrado cuatro serotipos diferentes de C. neoformans A, B, C y D. Los serotipos A y D se clasifican como C. neoformans var. neoformans, mientras que los serotipos B y C como C. neoformans var. gattii.

Se sabe que el microorganismo tiene un estado perfecto (sexuado) que lo cataloga como un basidiomiceto, género Filobasidiella , especies C.

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neoformans var. neoformans y bacillispora especies C. neoformans var. gattii. (DIAMOND; 1990, RESTREPO, 1992, MURPHY,1998)

2.1.2 Características bioquímicas.

En los medios de cultivo sólidos, las colonias de Cryptococcus neoformans son lisas, convexas, de color blanco o crema, mucoides. La mayoría de las cepas de los serotipos B y C asimilan los ácidos L-málico, fumárico y succínico produciendo un pigmento verde en medios selectivos y pueden utilizar glicina como única fuente de carbono, mientras que las cepas de los serotipos A y D generalmente no pueden hacerlo (DIAMOND, 1990; KONEMAN,1992).

Se han desarrollado mejores medios para distinguir los aislamientos de serotipos B y C de los A y D, que incluyen la formación de color azul alrededor de las colonias de cepas de tipo B y C pero no de A y D, usando un medio con agar que contiene L- canavanina, glicina y azul de bromotimol o la inhibición de la actividad ureasa de las cepas de los serotipos B y C pero no A y D mediante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Muchas cepas de C. neoformans utilizan la creatinina como fuente de nitrógeno, lo cual puede explic ar en parte el crecimiento del microorganismo en heces de aves, las cuales son ricas en creatinina (DIAMOND, 1990)

Otra característica de C. neoformans esta en la propiedad que tiene para producir melanina, un pigmento de color pardo. A diferencia de la síntesis de melanina humana, una enzima fúngica, la fenol oxidasa actúa sobre ciertos substratos como ácido caféico y dihidroxifenilalanina, en lugar de tirosina. Para la identificación de la producción de melanina se utiliza un

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medio que utiliza substratos definidos como el ácido caféico en agar harina de maíz o tiras de papel saturadas con una solución de L- β-3- dihidroxifenilalanina-citrato férrico, colocadas sobre cajas de petri con agar estándar, estos substratos son la base de la feniloxidasa para producir la melanina. (DIAMOND, 1990; KONEMAN,1992).

Una prueba de ureasa positiva también sugiere una especie de C. neoformans así como la incapacidad de C. neoformans de reducir nitratos a nitritos. En la siguiente tabla observamos los principales azúcares asimilados por C. neoformans (KONEMAN, 1992):

ASIMILACION DE: MALTOSA + SACAROSA + TREHALOSA + GALACTOSA + CELOBIOSA + XILOSA + RAFINOSA + LACTOSA - DULCITOL + MELIBIOSA - UREASA + NO3-NO2 -

Tabla No. 1 Tomado de Diagnóstico Microbiológico, Koneman,1992 2.1.3 Factores de Virulencia de Cryptococcus neoformans.

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Cryptococcus neoformans tiene una cápsula compuesta principalmente por polisacáridos, la cuál le confiere uno de sus principales factores de virulencia. Existen cepas sin cápsula y por ende avirulentas, sin embargo el tamaño de la cápsula es variable y tamaños pequeños de esta no necesariamente hacen del microorganismo un hongo patógeno. (CHERNIAK, 1994; CASADEVALL,1997).

La cápsula está compuesta principalemte de: Glucurunoxylomannan (GXM), Galactoxylomannan (GalXM) y manoproteina (MP). El Glucurunoxylomannan comprende el 80-90% del total de polisacáridos y está formado por manosa, xilosa, ácido glucorónico y o-acetyl (CHERNIAK, 1994; CASADEVALL,1997).

Se han descrito dos genes que codifican para la cápsula de C. neoformans: CAP54 y CAP64, la deleción de cualquiera de los dos termina en la obtención de una cepa sin cápsula y de igual forma, la complementación con el gen faltante resulta en la obtención de una cepa capsular. La pr esencia de ambos genes es esencial para la formación de la cápsula. (MURPHY, 1998)

Debido a que la cápsula de C. neoformans de los serotipos A y D fijan complemento por vía alterna se pueden producir péptidos quimiotácticos como C5a y C3a, cuyos efectos se ejercen sobre leucocitos y neutrófilos para que éstos se dirijan al sitio de infección. Estos péptidos sobre la superficie de la levadura facilitan la unión del microorganismo a receptores CR3 en los leucocitos y activan mecanismos de citotoxicidad. (MURPHY, 1998,1993)

C. neoformans también puede ser opsonizado por anticuerpos contra GXM, sin embargo la cápsula puede bloquear la porción Fc del anticuerpo

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y obstaculizar su unión a los receptores para la porción Fc sobre las células fagocíticas del huésped. (MURPHY, 1998,1993; KOZEL,1986).

La cápsula de C. neoformans tiene una fuerte carga negativa sobre su superficie, que es dependiente del tamaño y de la cantidad de polisacárido. Este hecho, causa una repulsión electrostática entre el microorganism o y las cargas negativas de las células efectoras del huésped, dando como resultado la inhibición de la fagocitosis. Al encontrarnos con una fagocitosis ineficiente, las citocinas proinflamatorias (TNFα, IL-1β e IL-6) requeridas para activar una respuesta protectora, no son producidas, ya que su activación es dependiente del proceso de la fagocitosis. (NOSANCHUK, 1997; MURPHY,1998).

Estudios realizados por Murphy y colaboradores, observaron la producción de IL-10 por monocitos y macrófagos, cuando son incubados con cepas de cápsula de gran tamaño; lo que puede indicar un efecto inmunosupresor de dicha cápsula debido a la producción de dicha citocina. (VECHIARELLI, 1994)

SINTESIS DE MELANINA

Otra característica que diferencia las cepas patógenas de las no patógenas es la producción de un pigmento café, denominado melanina. Este pigmento, es producido a partir de compuestos difenólicos como substratos y una enzima, la feniloxidasa. C. neoformans no posee enzimas tipo tirosinasas, indispensables para la producción endógena de dihidrofenoles, por esto la producción de melanina se hace a partir de compuestos difenólicos que C. neoformans toma del medio en el que crece. (WANG, 1995 ; MURPHY,1998).

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Jacobson y Tinell, Wang y Casadevall, encontraron que la melanina protege a C. neoformans del daño producido por los compuestos oxidativos derivados del nitrógeno y del oxígeno producidos por macrófagos. Además, el depósito de melanina en la pared celular puede inhibir la opsonización por anticuerpos específicos contra la cápsula y así inhibir la fagocitosis (WANG, 1995; MURPHY,1998).

Huffnagle y colaboradores, reportaron que cepas de C. neoformans productoras de melanina, disminuyen la producción de TNF

α

por los macrófagos alveolares y disminuye la proliferación de células T específicas contra antígenos del microorganismo. (WANG,1994).

Por último, otra ventaja que poseen las cepas productoras de melanina, es que son menos susceptibles a la anfotericina B, característica que hace poco efectivos los tratamientos en pacientes inmunocomprometidos (WANG, 1994)

OTROS FACTORES DE VIRULENCIA

PRODUCCION DE MANITOL

La producción de manitol (hexitol D-manitol) por C. neoformans puede incrementar la resistencia a condiciones de estrés como calor, osmolaridad y daño por compuestos intermediarios del oxígeno, como radicales hidroxilo (CHATURVEDI, 1996)

SUPEROXIDO DISMUTASA

Jacobson y colaboradores, reportaron que los niveles de producción de superóxido dismutasa por C. neoformans aumentan a 37ºC. Los autores

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sugieren que la superóxido dismutasa participa en la remoción de radicales libres a altas temperaturas in vivo. (JACOBSON, 1994)

PROTEASAS

Se ha reportado que C. neoformans produce una proteasa tal vez de tipo colagenasa que puede ayudar a iniciar la invasión en los tejidos del huésped (SALKOWASKI, 1991)

FOSFOLIPASAS

Recientemente se ha reportado la actividad de fosfolipasas en C. neoformans sobre agar yema de huevo. Los autores sugieren que la actividad extracelular de fosfolipasas producidas por C. neoformans pueden romper las membranas celulares y penetrar dentro de los tejidos celulares (CHEN, 1997)

2.1.4 Patogenia de Cryptococcus neoformans y manifestaciones clínicas.

La Cryptococosis es una infección sistémica con mayor incidencia en pacientes inmunosuprimidos con HIV, pacientes bajo tratamientos con dosis terapéuticas de corticosteroides, con procesos malignos linforreticulares (enfermedad de Hodking) y con sarcoidosis (DIAMOND, 1990)

La infección se adquiere por inhalación del hongo o basidiosporas has ta el pulmón. La infección pulmonar tiene tendencia a la resolución espontánea y con frecuencia es asintomática. Al diseminarse silenciosamente por la sangre en pacientes inmunocomprometidos, hasta el cerebro, provoca conglomerados de cryptococos en zonas

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perivasculares de la sustancia gris cortical, ganglios basales y en menor grado en otros sitios del sistema nervioso central (SNC) (WILSON, 1991; MURPHY, 1998)

C. neoformans no elabora ninguna toxina, de modo que el tejido está alterado sólo por la multiplicación del microorganismo, con escasa necrosis y disfunción orgánica hasta que el curso de la infección se encuentra avanzado o mas temprano en el caso de las infecciones masivas. Fuera del sistema nervioso central y en menor grado en las meninges, se observan macrófagos y células gigantes con cryptococos fagocitados o adyacentes junto con plasmocitos y linfocitos, pero en general no se encuentran granulomas bien formados. (WILSON, 1991; DIAMOND, 1990; KONEMAN,1990)

Manifestaciones Clínicas

Sistema Nervioso Central (SNC)

El comienzo de la cryptococosis en el Sistema Nervioso Central SNC usualmente es insidioso, aunque las manifestaciones pueden ser más agudas en particular en pacientes sometidos a una terapia con corticosteroides o tratados por un linfoma. Los síntomas pueden ser leves e inespecíficos, como cefaléa, náuseas, mareos, irritabilidad, somnolencia y torpeza. Si están afectados los pares craneales, el paciente puede notar una disminución de la agudeza visual, diplopía y disestesias o paresia facial (DIAMOND, 1990)

Las convulsiones se observan sólo en etapas tardías de la infección. En general, los pacientes están afebriles o presentan hipertermia leve que alcanza un máximo de 39º C. La mayoría de los pacientes presentan escasa rigidez de nuca, puede observarse papiledema, y parálisis de los pares craneales. En algunos pacientes es posible inducir hiperreflexia,

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clonus del tobillo o respuesta plantar extensora. (DIAMOND, 1990, 1974; MURPHY,1986)

Sistema Respiratorio

La cryptococosis pulmonar puede ser asintomática o producir solamente expectoración, que a veces presenta estrías sanguinolentas. El paciente puede presentar un dolor sordo precordial. La cryptococosis pulmonar puede progresar o regresar espontáneamente o permanecer estable durante períodos prolongados. En la mayoría de los casos de localización en el SNC no es evidente la invasión pulmonar, por el contrario, la infección del árbol respiratorio a menudo se presenta en forma aislada, aunque puede coexistir con una cryptococosis extrapulmonar en el SNC u otros órganos (DIAMOND, 1990, 1974; MURPHY,1986)

Otras localizaciones

Los pacientes pueden presentar lesiones cutáneas aisladas o múltiples, generalmente indoloras en la cara o cuero cabelludo, éstas lesiones son ignoradas, aunque constituyen los primeros signos de infección. Se presentan como pequeñas pápulas, pústulas o masas subcutáneas blandas o como úlceras más extensas con bordes enrollados, levemente socavados, que rodean una base de tejido de granulación. Estas lesiones pueden ser confundidas con neoplasias. En pacientes que han recibido transplantes se ha observado pielonefritis cryptococócica como causa de rechazo de un aloinjerto renal. Otras formas menos comunes de cryptococosis son coriorretinitis, afección adrenal, miocarditis, endocarditis, pericarditis, esofagitis, hepatitis, peritonitis, artritis, burisitis, miositis, abscesos renales y prostatitis (DIAMOND, 1990, 1974; MURPHY,1986).

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2.2 Respuesta inmune frente a Cryptococcus neoformans

El tracto respiratorio es la puerta de entrada para Cryptococcus neoformans y el desarrollo de una inmunidad protectora mediada por células es crucial para erradicar el microorganismo y controlar una diseminación del pulmón hacia el cerebro (HUFFNAGLE, 1998; DIAMOND, 1990, 1974; MURPHY, 1986)

Los eventos tempranos en el desarrollo de una inmunidad protectora incluyen el reconocimiento del microorganismo, la generación de señales y la expansión de linfocitos específicos contra C. neoformans, cada uno regulados por mediadores liberados durante cada fase. Estos eventos ocurren en los pulmones y en los nódulos linfáticos, determinando así el desarrollo de una inmunidad protectora (HUFFNAGLE, 1998)

* FAGOCITOSIS

La erradicación del microorganismo es dependiente de la habilidad de las células fagocíticas de unirse y de ingerir el microorganismo. Los macrófagos alveolares pueden unirse a C. neoformans pero requieren de opsoninas y la expresión de receptores apropiados sobre los macrófagos del pulmón. (LEVITZ, 1992)

La fagocitosis mediada por complemento ocurre a través de receptores para C3a o C5a y su expresión depende de la estimulación de citocinas en los macrófagos humanos. La fagocitosis es un proceso dependiente de energía y requiere de tres receptores para C3 que son: CR1, CR3 y CR4. (HUFFNAGLE, 1998)

Estudios con macrófagos murinos de peritoneo y pulmón, muestran una eficiente actividad fagocítica y fungicida después de la infección respiratoria. Los macrófagos peritoneales desarrollaron una máxima

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actividad fagocítica entre los días 21 y 28 de la infección, los macrófagos alveolares exhibieron un efecto fungistático al día 14 y los macrófagos peritoneales fueron fungicidas al día 28 (KARAOUI, 1977; BOLANOS, 1989) Seguidamente, la eficacia fagocítica y antifúngica, declina en macrófagos alveolares y del peritoneo, después del día 28, esto sugiere el desarrollo de un estado inmunosupresivo durante el progreso de la infección. En contraste con lo anterior, macrófagos alveolares de rata son fagocíticos y anifungicidas para C. neoformans en ausencia de opsoninas o citocinas exógenas, indicando así que la función que ejercen los macrófagos depende íntimamente de su grado de activación (CASADEVALL,1998)

Como ya se ha descrito anteriormente, los macrófagos son capaces de inhibir y matar a C. neoformans; no obstante, la levadura puede llegar a replicarse dentro de los macrófagos diseminándose fácilmente y las opsoninas que facilitan la fagocitosis no son lo suficientemente eficaces cuando se trata de cepas con grandes cápsulas, hecho desfavorable ya que, los altos niveles de CO2 en los pulmones contribuyen a la formación

de cápsula por parte de la levadura. ( BOLANOS, 1989; LEVITZ, 1992)

* PRODUCCION DE CITOCINAS

Los macrófagos son el primer tipo celular que entra en contacto con C. neoformans y sus funciones incluyen la producción de citocinas proinflamatorias para la activación de una respuesta por el huésped. (CASADEVALL, 1998)

TNFα, IL -1β, IL-18, IL -12 e IFNγ son citocinas producidas en los pulmones durante la primera semana de infección y contribuyen al desarrollo de una respuesta inmune protectora. Estudios realizados

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muestran que, el RNA mensajero de TNFα y su producto protéico, incrementan en los pulmones entre los días 2 y 7 de la infección, mientras que el RNA m de la IL-18 es detectable en los días 3 a 7 de la infección (HUFFNAGLE, 1996; KAWAKAMI, 1997) Los investigadores demuestran que la neutralización de TNFα, IL -1β e IFNγ previa al día 7 bloquea el desarrollo de una respuesta inmune protectora mediada por células, en cambio la neutralización de IL-18 no ejerce un efecto considerable, lo cual indica que esta citocina podría activar en forma sinérgica otras citocinas como IL-12 para promover una respuesta inmune protectora mediada por células (KAWAKAMI, 1997; ZHANG, 1997)

Huffnagle y colaboradores, demostraron que una de las citocinas proinflamatorias, TNFα, es realmente necesaria para el reclutamiento de células inflamatorias dentro de los pulmones, para la activación de células CD4+ y para la inducción de una respuesta inmune mediada por células. ( HUFFNAGLE, 1996; AGUIRRE, 1995; MURPHY, 1997)

La producción temprana de IL-12 e IL-18 no está bien identificada, sin embargo, estudios realizados muestran que la administración intraperitoneal a ratones de TNF

α

,

IL-12 o IL-18 pueden incrementar la supervivencia y disminuir la diseminación de C. neoformans en el huésped. ( MURPHY,1997; HUFFNAGLE, 1998)

No obstante, la adición de polisacárido capsular de C. neoformans a cultivos con macrófagos disminuye la producción de TNF

α

e IL-1

β

por éstas células, ya que dicho polisacárido capsular induce la producción de IL-10 ( inhibidor de la respuesta Th1), dando como resultado el no desarrollo de una respuesta protectora mediada por células (HUFFNAGLE, 1994; ZHANG, 1997)

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La pr esencia de ciertas citocinas durante respuesta inmune mediada por células como IL-12, IL-18 o IFNγ, garantiza el desarrollo de células tipo Th1, mientras que la presencia de concentraciones significativas de IL-10 y /o IL-4 dirige la respuesta a Th2 (JANEWAY,1996; USHIO, 1996, MURPHY, 1998)

Otra citocina importante en la respuesta contra C. neoformans es el IFNγ, citocina proinflamatoria secretada por casi todas las células TCD8+, por algunas TCD4+ ( especialmente Th1, pero no Th2), y por células NK. (STITTES, 1995; MURPHY, 1998; HUFFNAGLE, 1996)

IFNγ es la citocina de mayor interés para los investigadores, pues se ha observado que dicha citocina es indispensable en la inducción de una respuesta inmune protectora mediada por células. Estudios en ratones muestran que ésta citocina juega un papel importante en la protección frente a C. neoformans, pues se ha observado que al administrar la citocina, se disminuye el número de las unidades formadoras de colonias del microorganismo en los tejidos, dando como resultado un incremento en la resistencia a la infección en varios modelos murinos. (MURPHY, 1998; HUFFNAGLE, 1996; CASADEVALL, 1998)

En conclusión, la producción de citocinas proinflamatorias como TNFα, IL-1β, e IL-6 por células mononucleares de sangre periférica, es de vital importancia, pues dichas citocinas ejercen un potente efecto en la inducción de una respuesta inmune mediada por células contra la levadura. Estas citocinas pueden disparar la migración de leucocitos dentro del sitio de infección, estimularlas, estimular las células que las producen o estimular otras células que produzcan citocinas adicionales (IFNγ) importantes en la inducción de una respuesta inmune protectora y aumentar la maduración o proliferación de linfocitos T ( LEVITZ,1994; JANEWAY, 1996; VECCHIARELLI, 1995, MURPHY, 1998

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PRESENTACION ANTIGENICA Y DESARROLLO DE INMUNIDAD

Para el desarrollo de una respuesta inmune protectora se requiere de una presentación antigénica efectiva. Las células presentadoras de antígeno (APC) en pulmón incluyen células dendríticas, células B y macrófagos, las cuales realizan la presentación a través de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC II). Las células dendríticas son particularmente numerosas en el epitelio de las vías aéreas, toman el antígeno y lo transportan hacia los nódulos linfáticos para iniciar una respuesta inmune primaria. Estas células son las APC más efectivas para la estimulación de células T especialmente para iniciar una respuesta tipo Th1 contra C. neoformans. Otras células como las células epiteliales o fibroblastos pueden ser activadas y expresar moléculas del MHC II y presentar antígenos cryptococales a células T durante la respuesta inflamatoria (HUFFNAGLE, 1998).

Las células T CD4+ y CD8+ son requeridas para la erradicación de la infección pulmonar. Las citocinas de los perfiles Th1(IL-2, INFγ) son producidas en pulmón y nódulos linfáticos durante la primera semana de infección y pueden inducir una respuesta inmune mediada por células. (HUFFNAGLE, 1998)

C. neoformans, puede sobrevivir en fagosomas de macrófagos y posiblemente liberar antígenos dentro del cytosol que entran a la vía endógena de procesamiento antigénico; razón por la cuál, la participación de células T CD 8+ en la respuesta protectora contra este organismo es importante. (HUFFNAGLE, 1995; HUFFNAGLE, 1998)

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Las células T CD4+ activadas, son mediadoras del reclutamiento y la activación de células fagocíticas en los pulmones. Pueden producir IFNγ, GM-CSF y TNFα, las cuales estimulan la muerte de la levadura por los fagocitos. El IFNγ, estimula la producción de NO (óxido nítrico), molécula que potencia la muerte de la levadura por macrófagos y así contribuir a la erradicación del microorganismo. (HUFFNAGLE, 1998).

* ANTICUERPOS

Los polisacáridos de la cápsula de C. neoformans son depositados y se acumulan en los tejidos durante la infección; allí estos pueden tener una variedad de efectos sobre los mecanismos del sistema inmune del huésped, como inhibir la fagocitosis. En este contexto, la disponibilidad de anticuerpos específicos para los polisacáridos de la cápsula puede ser un factor decisivo en una respuesta inmune satisfactoria por parte del huésped. En trabajos anteriores se ha observado que la administración de suero de conejo con altos títulos de anticuerpos contra los polisacáridos de la cápsula de C. neoformans prolonga la supervivencia en varios modelos murinos (CASADEVALL, 1995; DROMER, 1987)

Existe asociación entre la capacidad del huésped de producir anticuerpos y la susceptibilidad a la infección; dicha susceptibilidad en especies animales, sugiere que la respuesta de anticuerpos contra GXM determina el curso de la infección. Es así como BALB/c y C3H/Hej son considerados resistentes y DBA/2 y A/J como susceptibles a la infección por C. neoformans, indicando que la capacidad de producir anticuerpos influye en la característica de ser o no susceptible a la infección (DROMER; 1988)

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Existen muchos reportes que sugieren que anticuerpos contra el polisacárido capsular de C. neoformans aumentan la eficacia de las células efectoras contra la levadura (VECCHIARELLI, 1998; DROMER; 1988)

Los anticuerpos también pueden aumentar la actividad de células NK contra C. neoformans ya que pueden actuar como opsoninas y activar la citotoxicidad por dichas células. (VECCHIARELLI, 1998)

En resumen, la unión de anticuerpos a GXM está asociada con el aumento en la opsonización, la muerte de C. neoformans, la producción de agentes oxidantes, la linfoproliferación y la expresión de moléculas co-estimuladoras in vitro. Estos efectos, solos o en combinación, pueden tener profundas consecuencias en la habilidad de la respuesta celular del huésped para terminar con la infección por la levadura.

Estudios muestran que anticuerpos monoclonales isotipos IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgA son protectores contra C. neoformans, sin embargo IgG3 tiende a ser no protectora o a aumentar la infección dependiendo del modelo experimental. Esto muestra que el isotipo de inmunoglobulinas es importante para controlar la infección. La razón por la cual IgG3 no es una inmunoglobulina protectora no es clara aún, ya que ésta es protectora frente a otros microorganismos encapsulados como Streptococcus pneumoniae (VECCHIARELLI, 1998; CHEN, 1996; CHERNIACK, 1995)

2.3 Polisacárido capsular Glucurunoxylomannan de C. neoformans

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Los antígenos timo independientes son antígenos que no pueden ser procesados, ni presentados asociados al CMH. Este tipo de antígenos se componen de múltiples epítopos antigénicos idénticos. Estos antígenos pueden inducir el entrecruzamiento máximo de la inmunoglubulina de membrana del linfocito B específico, lo que conduce a su activación sin necesidad del contacto con la célula T.

Los antígenos timo independientes se han clasificado en dos tipos: los polisacáridos son ejemplo del tipo 2 donde la respuesta primaria esta a cargo de células B y se ven involucrados linfocitos T, macrófagos, células NK, los cuales pueden secretar ciertas citocinas que actúan como una segunda señal en la activación del linfocito B. Los antígenos tipo 1 como el lipopolisacárido que estimula las células B por si mismo y que a bajas concentraciones, estimula la producción de anticuerpos específicos, mientras que a altas concentraciones es un activador policlonal del linfocito B. (ABBAS, 1997; SNAPPER, 1993)

2.3.2 Estructura de GXM

El GXM comprende el 90% de la composición de la cápsula y las diferencias en la estructura de éste polisacárido permiten serotipificar a C. neoformans dentro de los serotipos A, B, C y D (CHERNIACK, 1994) Varios grupos de investigadores se han centrado en la tarea de describir la estructura del polisacárido capsular Glucurunoxylomannan de C. neoformans.

Evans y Mehl, a través de cromatografía con papel de filtro, demostraron que el polisacárido tiene xylosa, galactosa, glucosa y ácido glucurónico. (EVANS, 1950). Drouhet y Segretain, observaron, que el polisacárido además de tener éstas características químicas, es biológicamente activo

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y puede inhibir la migración de leucocitos a los lugares de infección. Hence, no sólo observó las características mencionadas, si que además el polisacárido contenía varios determinantes antigénicos que permitían sertotipificar las cepas de C. neoformans. (CHERNIACK, 1994; CHERNIACK, 1991)

La estructura básica del polisacárido para todos los serotipos es la siguiente:

β-D-GLcpA 1 ↓

2

→ 3)- α-D-Manp- (1→3) - α-D-Manp- (1→3) - α-D-Manp- (1→3)

Tomado de CHERNIACK, 1994 Infection and Immunity.

El polisacárido consta de α-D-manopryranan con β-D- xylopyranosyl (Xy p), ácido β-D-glucurpyranosylurónico (Glc pA) y 6 subunidades o-acetyl.( BHATTACHARJEE, 1984) Esta estructura tiene variaciones de acuerdo al serotipo. (CHERNIACK, 1994)

2.4 Las Células NK

Las células asesinas naturales (NK), son linfocitos granulosos grandes (LGL) que comprenden el 10 o 15% de los linfocitos humanos de sangre periférica. También se encuentran en bazo, el intersticio pulmonar, la mucosa intestinal y el hígado, y son poco comunes en el timo y en los

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ganglios linfáticos. (ROBERTSON, 1990; CICCONE, 1992; YOKOYAMA, 1993)

Las principales funciones fisiológicas que desarrollan las células NK parecen estar en la defensa temprana del huésped contra agentes microbianos, por tanto, las células NK ayudan a proteger contra una diversidad de agentes infecciosos en el curso de las infecciones, antes de las respuestas de células T y B. (STITES, 1990; ROBERTSON, 1990; CICCONE, 1992; YOKOYAMA, 1993)

Al igual los LT citotóxicos, emplean gránulos citoplasmáticos que contienen perforinas y granzimas para matar a las células blanco. A diferencia de las células T, las células NK no expressan TCR ni un complejo de superficie celular TCR/CD3. La mayor parte de las células expresan CD16 (receptor Fc de esacasa afinidad que enlaza IgG en complejos inmunitarios) y CD56, que constituye una isoforma de las moléculas de adhesión N-CAM, es expresado en la mayoría de las células NK y representa un marcador importante para la diferenciación fenotípica de dichas células. No obstante existen poblaciones de células Nk que expresan receptores de linfocitos T como TCR. (ROBERTSON, 1990; CICCONE,1992;YOKOYAMA, 1993)

Además de su propiedad para mediar el asesinato natural, las cé lulas NK pueden matar células recubiertas por anticuerpo. Esta citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo, requiere el enlace de la porción Fc del anticuerpo al receptor Fc de superficie de la célula NK, CD16, que a su vez activa el aparato citolítico de la célula asesina natural. (STITES, 1990; ROBERTSON, 1990; CICCONE, 1992; YOKOYAMA, 1993; LANIER, 1997)

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La actividad asesina por éstas células se inhibe por las moléculas del MHC de clase I y aumenta por su ausencia. Estas observaciones han conducido a la hipótesis de que las células NK expresan dos tipos de receptores: un conjunto que desencadena avtividad citolítica y un segundo que enlaza moléculas del MHC de clase I e inhibe la acción lítica. (STITES, 1990; ROBERTSON, RITZ, 1990; CICCO NE, MORETTA, 1992; YOKOYAMA, 1993)

Dentro de éstas moléculas se encuentra la molécula inhibidora Ly-49 (NKG2A Y NKG2E) Son proteínas integrales de membrana tipo II (grupos amino intracelulares)y se expresan como dímeros ligados por puentes disulfuro. Se encuentran en ratones pero no en el hombre. (STITES, 1990, LANIER, 1997; RAULET,1996; BIRON, 1997).

Existen otras moléculas inhibidoras como KIR (killer cell inhibitory) y sus respectivas isoformas, como son KIRD2D que reconoce moléculas HLA-C, KIRD3D que reconocen moléculas HLA-B monomérico. (LANIER, 1997)

Dentro de esta gran diversidad de moléculas, algunas recientemente identificadas, son las proteínas NKRP-1. Estas, pueden jugar un papel importante en la activación de la célula NK a través del reconocimiento de polisacáridos y por lo tanto, podrían participar en la regulación de la respuesta inmune adaptativa a patógenos encapsulados (BEZOUSKA, 1994)

* El receptor NKRP1.

El receptor NKR-P1 humano presente en las células NK, ha sido parcialmente caracterizado. Los genes que codifican para este tipo de proteínas se localizan en el cromosoma 12 y su estructura corresponde a

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una glicoproteína de aproximadamente 40 Kd con 38 aminoácidos en la región citoplasmática, 29 en la región transmembranal y 158 en el dominio extracitoplasmático (LANIER, 1994)

Los receptores NKR-P 1 de ratón, se encuentran presentes en un complejo denominado NKC presente en el cromosoma 6. Este complejo codifica para glicoproteínas de membrana de tipo C de la familia de las lectinas (LEVITZ, 1994; YOKOYAMA, 1991), las cuales se expresan particularmente en células NK y se dividen en dos familias: la NKR -P1 que contiene tres genes homólogos (NKR-P1 A, B y C) y las Ly49 que son unigénicas. (LEVITZ, 1994; YOKOYAMA, 1995; BEZOUSKA, 1994)

Se ha observado que los receptores NKR-P1 unen principalmente carbohidratos y además podrían estar involucrados en la activación de las células NK (BEZOUSKA, 1994) Dicha activación de las células NK, se ve antagonizada por la función ejercida por los receptores Ly49, que reconocen las proteínas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de tipo C. Esta unión transmite una señal negativa que inhibe la actividad citotóxica ejercida por las células NK (RYAN, 1995; RYAN, 1992, LEVITZ, 1994)

El antígeno NKR-P1 no se presenta exclusivamente en las células NK. También está presente en linfocitos T denominados células NKT, y se puede encontrar principalmente en células doblemente negativas CD4-CD8-. (SHINOARA, 1999)

En las células linfoides el receptor NKR-P1 parece estar involucrado directamente en la función citotóxica, pero también podría estar implicado en la activación de las células T y en la producción de IFNγ, por un

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mecanismo diferente al mediado por la IL-12 (LANIER, 1994; ARASE, 1996)

Los LT NKR-P1+ son además productores de IL-4, lo que sugiere su participación en la activación de los linfocitos B. Es posible que la activación directa de esta población, por los polisacáridos, induzca un tipo de ayuda antígeno específica para la producción de anticuerpos específicos (LANIER, 1994; ARASE, 1996)

2.4.1 Mediadores producidos por células NK .

Las células NK producen factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), IFNγ, TNFα e IL-12, quemocinas como MIP1α y MIP1β entre otras (BUCHANAN,1998)

Igualmente estudios recientes han demostrado que las células NK pueden producir IL-10 e IFNγ luego de una estimulación con IL-2 y esta producción puede estar enlazada sinergicamente luego de la estimulación con IL-12 (RAYMOND, 1998; SHIBATA, 1998)

Igualmente la IL-12 puede ser producida por macrófagos y estimula tanto a células NK como LT para que se produzca IFNγ, juega un papel muy importante en el desarrollo de respuesta de tipo Th1 lo que estimula la producción de TNFα e IFNγ citocinas importantes en las infecciones causadas por muchos patógenos microbianos, en particular el IFNγ se ha considerado muy importante en la activación de macrófagos por la inducción de NO (oxido nítrico), componente importante en la actividad fagocítica del macrófago (BUCHANAN, 1998)

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Es posible que las células NK funcionen como un puente entre los sistemas innato y adaptativo al actuar como una línea de defensa temprana mientras producen citocinas para promover el desarrollo de una respuesta inmunitaria específica.

2.5 Las células NK en respuesta a C. neoformans

Varios estudios indican evidencias de que las células NK están involucradas en la protección contra C. neoformans.

Murphy y sus colaboradores, han caracterizado la interección NK-Cryptococo extensivamente. En 1982 este grupo demostró la actividad anticryptococal de preparaciones de linfocitos y NK esplénicos murinos in vitro, y sugirieron que ésta actividad está mediada por las NK. (MURPHY, 1982)

La citotoxicidad mediada por las NK frente a la levadura es similar a la citotoxicidad frente a células tumorales y requiere de la unión de las NK a la levadura. Luego de éste contacto entre las células, las NK liberan componenetes citolíticos para matar la levadura. (HIDORE, 1991; MURPHY, 1982)

Sin embargo, existen diferencias entre la acción de las NK frente a células tumorales y la acción frente a la levadura; pues se ha observado que células NK murinas se unen a C. neoformans por medio de prolongaciones que penetran la cápsula, mientras que, a las células tumorales, las NK se unen por interacciones de la membrana celular. (HIDORE, 1991) Además, las células NK lisan células tumorales después de 5 o 10 minutos después de la unión y en cambio, para matar la levadura se requieren más de 4 horas. (MURPHY, 1991)

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Estudios con ratones, muestran que al eliminar las células NK, aumenta considerablemente el número de unidades formadoras de colonias del microorganismo en pulmón, en los primeros días de la infección, indicando que la presencia de NK en una fase temprana de la infección es vital para inhibir el crecimiento de la levadura y su diseminación. (LIPSCOMB, 1987; HIDORE, 1991; MURPHY, 1982)

Zhang y colaboradores, demostraron actividad antifúngica de células de exudados de peritoneo de ratón, y que dicha actividad es tá mediada por la producción de INFγ secretado por células NK, cuando los cocultivos eran activados con IL-12 e IL-18 (ZHANG, 1997)

Estos hallazgos sugieren que el mecanismo de acción contra C. neoformans de células NK murinas y humanas puede estar involucrado, directamente con la toxicidad ejercida por estas células sobre la levadura, posiblemente a través de factores solubles citotóxicos. La secreción de citocinas como INFγ, GM-CSF y TNFα, por las NK, pueden activar células efectoras y promover una efectiva respuesta inflamatoria que termine con el microorganismo. (HIDORE, 1991; MURPHY, 1982)

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3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Las células NK han sido implicadas en la respuesta a microorganismos encapsulados. La presencia de receptores que unen carbohidratos, podría ser el mecanismo por el cual se activan éstas células dando como resultado la inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans. Conocer el papel que juegan los polisacáridos capsulares como el GXM (glucurunoxyl omanan) de Cryptococcus neoformans o de Pneumococo en la interacción NK- cryptococo y poder establecer el tipo de mecanismo involucrado en la muerte de la levadura, nos permitirá analizar como dichas células pueden dirigir la respuesta inmune frente a dic hos antígenos.

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4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Determinar la capacidad inhibitoria del crecimiento del Cryptococcus neoformans por una población enriquecida en células NK humanas y el papel del polisacárido capsular GXM (glucurunoxylomanan) de Cryptococcus neoformans en ésta actividad inhibitoria.

4.2 Objetivos Específicos

Establecer la capacidad inhibitoria del crecimiento de Cryptococcus neoformans por una población enriquecida en células NK a través del recuento de unidades formadoras de colonias.

Determinar el efecto del polisacárido capsular GXM de Cryptococcus neoformans y de Pneumococo en cocultivos de Cryptococcus neoformans con las células NK a través del recuento de unidades formadoras de colonias.

Determinar el efecto en la capacidad inhibitoria de sobrenadantes obtenidos del cocultivo de células NK y Cryptococcus neoformans sobre el crecimiento de la levadura a través del recuento de unidades formadoras de colonias.

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5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Tipo de Estudio

El presente estudio es de tipo descriptivo y analítico.

5.2 Población y muestras

En este estudio se trabajó con células de sangre periférica obtenidas de 6 donantes sanos previa aceptación de participar en el proyecto, los cuales llenaron un formato de autorización para los experimentos a realizar y una encuesta para identificar las condiciones de salud de los donantes.

5.3 Metodología

5.3.1 Cepa de Cryptococcus neoformans

Se utilizó la cepa de Cryptococcus neoformans serotipo A ATCC 90113, donada por el Instituto Nacional de Salud. La cepa fué cultivada y mantenida en agar Sabouraud modificado con biotina y tiamina durante el tiempo de la investigación. (Anexo No.1) Simultáneamente se realizaron periódicamente prueba de ureasa y ácido caféico.

La recuperación de la cápsula se realizó a partir de la agitación de la levadura en caldo Sabouraud a 150 r. p.m. a 37º C durante 48 horas (CHERNIACK, 1996) (Anexo No. 2)

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El polisacárido utilizado, se purificó en el laboratorio por la técnica descrita por Cherniack. Brevemente, el cultivo se inactivó en autoclave por 25 min. a 121ºC, se centrifugó y se tomó el sobrenadante en el cuál se encuentraba el polisacárido capsular soluble. El polisacárido se obtuvo, precipitando con acetato de calcio, etanol y etanol acetona. El precipitado se separó por centrifugación a 16.000 g durante 4 horas, se desecó y finalmente se almacenó a 4° C. A partir de éste polisacárdo capsular se procedió a la purificación del GXM con CTAB (CHERNIACK, 1996)

5.3.2 Polisacárido Capsular de Pneumococo

El polisacárido utilizado fue el serotipo 14 ATCC 197-X, representativo en Colombia, el cual se almacenó a -70ºC durante la investigación.

5.3.4 Obtención de una población enriquecida en células NK humanas

Las células se obtuvieron de 6 pacientes sanos previa aceptación de participar en el proyecto.

Se recolectaron por venoclisis, 450 ml de sangre por paciente en bolsas triples con citrato de sodio (BAXTER).

Las bolsas con la sangre recolectada se centrifugaron a 2500 r.p.m. durante 15 minutos para separar el plasma, que se colectó en una de las bolsas piloto y la capa de glóbulos blancos, que se colectó en la otra bolsa piloto.

El volumen recolectado de glóbulos blancos se diluyó en PBS pH 7.2 a 37º C, para separar las células mononucleares por gradientes de densidad con Ficoll-hypaque; el ficoll se montó en una relación 3:1, en

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tubos falcon de 50 ml; se centrifugó en una centrífuga refrigerada, a 1800 r.p.m., 30 minutos a temperatura ambiente, aceleració n lenta desaceleración lenta. (MURPHY, 1993;ZHANG, 1997; LEVITZ, 1994; HIDORE, 1991)

Seguidamente se recolectó la interfase que aparece en el tubo, que es la que contiene las células blancas, éstas se lavaron una primera vez con PBS pH 7.2 a 37ºC a 1800 r.p.m., temperatura ambiente durante 10 minutos y una segunda vez con medio RPMI 1640 con L-glutamina 100 M, penicilina/ estreptomicina 1000 ul/lt (completo) al 2% de suero fetal bovino (SFB) bajo las mismas condiciones del primer lavado.(Anexo No.3)

Posteriormente las células fueron resuspendieron en 5 ml de RPMI 1640 (completo) al 2% SFB, se contaron en cámara cuenta células con azul tripano y se colocaron aproximadamente 150 millones de células en 15 ml de medio en cajas de cultivo de 75 ml, para por adherencia eliminar monocitos; las cajas de cultivo con las células resuspendidas en RPMI 1640 (completo) al 2% de (SFB), se llevaron a incubar durante 30 minutos a 37°C, 5% de CO2..

Luego de esta incubación, se recolecto el sobrenadante de las cajas de cultivo que contiene las células no adherentes, las cajas se lavaron 2 veces con RPMI 1640 (completo) al 2% de SFB, para recuperar todas las células no adherentes. Las células recolectadas, se centrifugaron a 1800 r.p.m, durante 5 minutos a temperatura ambiente, se resuspendieron en 5 ml de RPMI 1640 (completo) al 2% de SFB para así pasar las células no adherentes por columnas de nylon, previamente activadas con HCL al 1% y reactivadas con RPMI 1640 (completo) al 10% de SFB. Después de pasar las células por las columnas, estas columnas se lavaron 2 veces con RPMI 1640 (completo) al 2% de SFB y asi poder eliminar LB presentes.

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Para eliminar LT, a las células recuperadas, se les adicionó anti CD3 a concentración de saturación (2 ug/ 106 células) y se incubó a 4°C durante una hora, agitando suave y ocasionalmente. Después de esta incubación, a las células se les adicionó 1ml complemento de cobayo sin diluir, y se incubó a 37°C durante una hora. Finalmente, las células fueron lavadas 3 veces con RPMI 1640 (completo) al 10% de SFB a 1200 r.p.m. durante 10 minutos. (MURPHY, 1993;ZHANG, 1997; LEVITZ, 1994; HIDORE, 1991)

Las células obtenidas fueron contadas con azul tripan y congeladas a –70°C para el desarrollo de la investigación.

El porcentaje de pureza de la población celular se obtuvo marcando las células con antiCD56 y leídas por citometría de flujo. (MURPHY, 1993;ZHANG, 1997; LEVITZ, 1994; HIDORE, 1991)

5.3.5 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células NK

Para determinar la inhibición del crecimiento del Cryptococcus neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK, células mononucleares sin monocitos y células mononucleares totales; en ensayos independientes, se colocaron dichas células en placas de 96 pozos en diferentes concentraciones, 30.000, 50.000, 100.000 y 200.000cel/pozo, en un volumen final de 200 ul en RPMI 1640 (completo) al 10% de SFB y una misma concentración de la levadura 1000 cryptococos por pozo, previamente activada, cada concentración se realizó por triplicado con sus respectivos controles, uno de replicación de la levadura y el otro de viabilidad celular. Cada placa se incubó a 37°C,

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5% de CO2 24 y 48 horas, tiempo en los cuales se sembraron 100ul del

co-cultivo en agar Sabouraud modificado y se incubaron a 37° C durante 3 días. Finalmente se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias para determinar la inhibición del crecimiento con su correspondiente porcentaje de inhibición. (HIDORE, 1991)

5.3.6 Efecto del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans GXM y de Pneumococo en la actividad inhibitoria

El efecto de los polisacáridos capsulares se realizó con células mononucleares depletadas de monocitos y con células mononucleares enriquecidas en NK. En ensayos independientes, se colocaron en placas de 96 pozos de fondo en U, células a una concentración de 200.000 células/pozo, con diferentes concentraciones de los polisacáridos solubles 2, 5 y 10 ug en un volumen final de 200 ul en medio RPMI 1640 (completo) al 10% de SFB, por triplicado con sus respectivos controles; replicación de la levadura, viabilidad celular e inhibición del crecimiento de la levadura. Las células con cada polisacárido se incubaron durante 5 horas, posterior a esta incubación con cada polisacárido se colocó Cryptococo en una concentración de 1000 cryptococos/pozo y se incubó nuevamente 24 y 48 horas, tiempo en los cuales, se sembraron 100 ul del co-cultivo en agar Sabouraud modificado; se incubó a 37°C durante 3 días y finalmente se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias. (HIDORE, 1991)

5.3.7 Efecto de sobrenadantes obtenidos del cocultivo de células NK y Cryptococcus neoformans en el crecimiento de la levadura

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Las células utilizadas para el desarrollo de este objetivo fueron células mononucleares enriquecidas en NK y células mononucleares depletadas de monocitos.

En ensayos independientes, se colocaron, en placas de 96 pozos de fondo en U, células a una concentración de 200.000 células/pozo, con la levadura a una concentración de 1000 cryptococos por pozo en un volumen final de 200 ul en RPMI 1640 (completo) al 10% de SFB. Como sobrenadantes control de la prueba se colocaron células sin la levadura. Se incubó durante 24 y 48 horas tiempo en los cuales se recolectaron los sobrenadantes en el que se encontraban las células con la levadura. Los sobrenadantes recolectados se colocaron en placas de 96 pozos de fondo en U con la levadura, 1000 cryptococos, por pozo y por triplicado, con sus respectivos controles, replicación de la levadura, sobrenadante sin cultivar con la levadura y viabilidad celular, en un volumen final de 200 ul. Se incubó 24 y 48 horas tiempo en los cuales se sembraron 100 ul del co-cultivo en agar Sabouraud, y finalmente se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias. (HIDORE, 1991)

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6. RESULTADOS

6.1 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK

Tres ensayos cualitativos con poblaciones de células mononucleares enriquecidas en NK, mostraron que la inhibición del crecimiento del microorganismo es dependiente de la concentración de células y del tiempo de incubación con la levadura; se observa claramente que a una concentración de 200.000 células/pozo y un tiempo de incubación de 48 horas con la levadura, los porcentajes de inhibición del microorganismo son de 96%,87% y 100%, mientras que, a una concentración de 30.000 células/ pozo y 48 horas de incubación con la levadura, los porcentajes de inhibición son 10%, 35% y 53%. (Figuras 1,2 y 3; Tablas 2,3 y 4)

Para hallar los porcentajes de inhibición se utilizó la siguiente fórmula: (HIDORE, 1991)

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0 20 40 60 80 100 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

Figura No. 1 Porcentaje de Inhibición del crecimiento de Cryptococcus

neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK. En el eje de las X se

encuentra el tiempo de incubación con la levadura y las concentraciones de células utilizadas, en el eje de las Y el porcentaje de inhibición del crecimiento del

microorganismo.

Tabla No.2 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK –Unidades Formadoras de Colonias-

Células x 103 24 horas X DS % Inhibi 48 horas X DS % Inhibi. 200 640 640 652 644 7 43.5 45 35 40 40 5 96.4 100 1006 1015 1000 1007 8 11.7 450 470 400 440 36 60.9 50 1100 1200 1100 1133 58 0.6 900 850 950 900 50 20.0 30 1100 1140 1120 1120 20 1.8 1010 989 1015 1004 14 10.6 Control crecimiento* 1145 1125 1150 1140 13 0.0 1130 1115 1128 1124 8 0.0 % Células CD56+ no determinado *Crecimiento de la levadura

% Inhibición: Obtenido de acuerdo a la fórmula mencionada

DS : Desviación estándar

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0 20 40 60 80 100 % INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

Figura No.2 Porcentaje de Inhibición del crecimiento de Cryptococcus

neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK

Tabla No. 3 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK -Unidades Formadoras de Colonias-

Células x 103 _{24 horas} _X _DS _% Inhibi 48 horas X DS % Inhibi. 200 710 650 680 680 30 43.3 160 135 156 150 13 87.5 100 910 830 780 840 66 30.0 600 505 545 550 48 54.2 50 970 950 960 960 10 20.0 750 690 665 702 44 41.5 30 980 960 1000 980 20 18.3 800 760 780 780 20 35.0 Control crecimiento 1200 1150 1250 1200 50 0.0 1150 1250 1200 1200 50 0.0 % Células CD56+ no determinado *Crecimiento de la levadura

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0 20 40 60 80 100 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

Figura No.3 Porcentaje de inhibición del crecimiento de Cryptococcus

neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK

Tabla No. 4 inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares enriquecidas en NK - Unidades Formadoras de Colonias-

Células x 103 _{24 horas} _X _DS _% Inhibi. 48 horas X DS % Inhibi 200 310 310 350 323 23 70.6 0 0 0 0 0 100 100 550 490 525 522 30 52.6 190 265 145 200 61 81.8 50 495 562 530 529 34 51.9 525 485 490 500 22 54.5 30 510 565 575 550 35 50.0 495 560 530 528 33 52.0 Control crecimiento* 1250 1200 1150 1200 50 0 1150 1150 1300 1200 87 0 % células CD 56+ no determinado *Crecimiento de la levadura

DS: Desviación estándar Viabilidad población celular: 90%

(47)

Al utilizar células mononucleares enriquecidas en un de 20% y 15% de células NK, evidenciamos, que la inhibición del crecimiento de C. neoformans es igualmente dependiente de la concentración de células (200.000) y del tiempo de incubación con la levadura (48 horas); además que el porcentaje de inhibición tiende a aumentar cuando el enriquecimiento en células CD56+ es mayor. (Figuras 4, 5 y 6; Tablas 5, 6 y 7)

Figura No. 4 Porcentaje de inhibición del crecimiento de Cryptococcus

neoformans por células mononucleares con 20% de NK. En el eje de las X se

microorganismo. 0 10 20 30 40 50 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

(48)

Tabla No.5 Inhibición del crecimiento Cryptococcus neoformans por células mononucleares con 20% de NK -Unidades Formadoras de colonias-

Células x 103 _{24 horas} _X _SD % Inhibi 48 horas X SD % Inhibi. 200 730 720 800 750 44 25 755 655 690 700 51 34.4 100 780 835 785 800 30 20 775 750 780 768.3 16 28 50 1000 900 890 930 61 70 900 850 950 900 50 15.6 30 1100 980 920 1000 92 0 1000 970 960 976.6 21 8.4 Control crecimiento* 1090 980 930 1000 82 0 1100 1000 1100 1066 58 0 % Células CD56+ 20 0 10 20 30 40 50 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

Figura No.5 Porcentaje de Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares con 15% de NK

*Crecimiento de la levadura

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Tabla No.6 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares con 15% de NK – Unidades formadoras de colonias-

Células x 103 24 horas X DS % Inhibi 48 horas X DS % Inhibi 200 870 810 825 835 31 16.5 780 830 790 800 26 20 100 950 840 880 890 56 11 795 785 885 821.6 55 17.8 50 1000 850 910 920 75 8.0 890 870 850 870 20 13 30 960 950 1015 975 35 2.5 920 860 1000 926.6 70 7.3 Control crecimiento 1090 930 980 1000 82 0 1000 1100 900 1000 100 0 % Células CD56+ 15 0 20 40 60 80 100 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

Figura No. 6 porcentaje de Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares con 20% de NK

DS: Desviación estándar

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Tabla No. 7 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares con 20% de NK – Unidades Formadoras de colonias-

Células x 103 24 horas X DS % Inhibi. 48 horas X DS % Inhibi 200 680 750 730 720 36 34.5 500 470 480 483.3 15 56.1 100 890 870 875 878 10 20.2 630 650 585 621.6 33 43.5 50 950 960 1000 970 26 11.8 750 708 770 743 32 32.5 30 1000 900 1100 1000 100 9.1 740 840 730 770 61 30.0 Control crecimiento 1110 1075 1115 1100 22 0.0 1095 1085 1120 1100 18 0.0 20% Células CD56+

Los resultados que se muestran a continuación, corresponden a los porcentajes de inhibición del crecimiento de la levadura, con células mononucleares sin monocitos; estos porcentajes bajo las mismas condiciones que en los ensayos anteriores solamente muestran un 18% de inhibición del crecimiento de la levadura. (Figura No. 7, Tabla No.8)

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Figura No. 7 Porcentaje de Inhibición del crecimiento de Cryptococcus

neoformans por células mononucleares sin monocitos. . En el eje de las X se

microorganismo.

Tabla No. 8 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares sin monocitos –Unidades Formadoras de Colonias-

Células x 103 24 horas X DS % Inhibi 48 horas X DS % Inhibi 200 1080 1200 1144 1141 60 4.9 984 1008 936 976 37 18.7 100 1200 1200 1058 1153 82 3.9 998 1132 985 1038 81 13.5 50 1104 1200 1200 1168 55 2.7 1000 1118 1120 1079 69 10.1 30 1176 1176 1176 1176 0 2.0 1145 1168 1120 1144 24 4.6 Control crecimiento* 1200 1200 1200 1200 0 0.0 1200 1200 1200 1200 0 0.0

Paralelamente, al utilizar células mononucleares totales, se pudo observar que la inhibició n del crecimiento es dependiente de la concentración de células y del tiempo de incubación de los cocultivos. Las diferencias en los porcentajes de inhibición obtenidos entre las 24 y

0 10 20 30 40 50 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento *Crecimiento de la levadura

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48 horas de incubación, aunque son leves, se pueden apreciar de un tiempo al otro, como sucedió cuando la inhibición era mediada por células enriquecidas en células CD56+; con las que, a las 48 horas de incubación se duplicaron éstos porcentajes. Sin embargo, los porcentajes de inhibición del crecimiento de la levadura observados con esta población celular son mayores comparados con las poblaciones de mononucleares libres de monocitos o enriquecidas en NK, suponemos que con esta población celular los porcentajes de inhibición encontrados son dependientes de monocitos o linfocitos B que están presentando probablemente proteínas a LTCD4+ o CD8+ presentes.(Figura No 8, Tabla No. 9) 0 20 40 60 80 100 %INHIBICION 24 horas 48 horas TIEMPO 200000 100000 50000 30000 Control crecimiento

Figura No.8 Porcentaje de Inhibición del crecimiento de Cryptococcus

neoformans por células mononucleares totales. En el eje de las X se encuentra el

tiempo de incubación con la levadura y las concentraciones de células utilizadas, en el eje de las Y el porcentaje de inhibición del crecimiento del microorganismo .

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Tabla No. 9 Inhibición del crecimiento de Cryptococcus neoformans por células mononucleares totales – Unidades Formadoras de Colonias-

Células x 103 24 horas X DS % Inhibi. 48 horas X DS % Inhibi 200 408 360 336 368 37 68.9 240 360 320 307 61 74.8 100 624 480 576 560 73 52.7 700 685 578 654 67 46.2 50 744 1104 624 824 250 30.4 720 720 768 736 28 39.5 30 912 888 900 900 12 24.0 840 720 744 768 63 36.8 Control crecimiento 1080 1272 1200 1184 97 0 1320 1128 1200 1216 97 0

6.2 Efecto del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans GXM y de Pneumococo serotipo14 en la actividad inhibitoria UFC.

Al cultivar previamente células mononucleares enriquecidas en 30% de células CD 56+ con 10 ug del polisacárido capsular GXM y colocarlas en contacto con la levadura, se observó que el porcentaje de inhibición fue del 100% después de 48 horas de incubación, es decir que dicha inhibición es dependiente de la concentración de polisacárido capsular y el tiempo de incubación, ya que a bajas concentraciones de polisacárido los porcentajes de inhibición fueron muy bajos. (Figura No. 9,Tabla No 10)