ESPAÑA
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Int. Cl.7:A61K 39/12
A61K 47/00
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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86
Número de solicitud europea:96943170 .9
86
Fecha de presentación :20.12.1996
87
Número de publicación de la solicitud:0869814
87
Fecha de publicación de la solicitud:14.10.1998
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Título:Estabilizadores para vacunas vivas.
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Prioridad:22.12.1995 FR 95 15778
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Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.11.2005
45
Fecha de la publicación del folleto de la patente:
01.11.2005
73
Titular/es:Sanofi Pasteur 2, avenue Pont Pasteur 69367 Lyon Cédex 07, FR
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Inventor/es:Fanget, Bernard y Francon, Alain
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Agente:Tavira Montes-Jovellar, Antonio
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 DESCRIPCIÓN Estabilizadores para vacunas vivas.
La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una vacuna que contiene un virus vivo atenuado de la varicela.
Las vacunas que comprenden virus vivos y más particularmente virus vivos atenuados muestran una fragilidad importante en sus condiciones de preparación y de almacenaje. Se constatan importantes pérdidas del título vírico durante las etapas de liofilización, durante el almacenaje y también durante las etapas de recolección del virus después de su cultivo. Dada la importancia del título vírico en la eficacia de la inmunización, es indispensable recurrir a agentes estabilizantes destinados a preservar mejor el título vírico. Los agentes estabilizantes son compuestos químicos y/o biológicos que pueden añadirse a las vacunas en diferentes etapas de su preparación con el fin de mantener un nivel de eficacia de la vacuna en el momento de su utilización que puede a veces ocurrir varios años después del inicio del almacenaje.
Se han probado numerosos compuestos en cuanto a sus propiedades como estabilizadores de distintas vacunas que contienen virus vivos atenuados. Los compuestos probados en la técnica anterior (véase por ejemplo los documentos de patente de Estados Unidos US 3.783.098 y US 3.915.794 y el documento de patente europea EP 028.563), de los que uno de los primeros fue el SPGA contienen esencialmente albúmina sérica bovina o humana, caseína más o menos hidrolizada o incluso gelatina, finalmente una sal de metal alcalino del ácido glutámico, un azúcar (glucosa, sacarosa, dextrano); y un fosfato monometálico o dimetálico de metal alcalino o sus mezclas.
El documento de patente europea EP 353.108 describe un procedimiento para preparar una vacuna liofilizada con un virus atenuado. Los virus que se benefician de este procedimiento son los que tienen dificultades de conservación en estado liofilizado. Se citan por nombre los virus del sarampión, de la rubeola y de la parotiditis. Los virus se cultivan, recolectan y mezclan con un agente estabilizante, preferentemente antes de la liofilización. En la práctica, los virus se recolectan y se congelan; después se descongelan y se mezclan de forma extemporánea con un agente estabilizante inmediatamente antes de la liofilización. La urea es un componente esencial del agente estabilizante. En los ejemplos, se citan otros componentes; y particularmente, la lactosa, sorbitol, manitol, dextrano y albúmina humana. La sacarosa no está incluida.
El documento de patente europea EP 065 905 describe un compuesto estabilizante de la vacuna de la fiebre amarilla que tiene uno o varios aminoácidos escogidos de un grupo de once aminoácidos, lactosa, sorbitol y una solución tampón de fosfato (PBS).
El documento de patente japonesa JP 57 007 423 describe composiciones a base de disacáridos y de polialcoholes en un tampón de fosfato. El disacárido puede ser de forma indiferenciada, sacarosa o lactosa. Estas composiciones se usan después de la recolección del virus del sarampión, para estabilizar este último antes de su congelación.
El documento de patente DD-A-299 213 menciona que puede usarse sacarosa en la composición del agente estabi-lizante que se usa para estabilizar el virus del sarampión únicamente durante su liofilización. La recolección no se hace en presencia de un agente estabilizante. De hecho, el virus del sarampión es un virus que abandona las células por sí mismo. Para su recolección, basta simplemente centrifugar el cultivo y recuperar el sobrenandante. No hay necesidad de lisar las celulas para recoger este virus. El agente estabilizante se añade al sobrenadante; por consiguiente, después de la recolección.
Las composiciones de la técnica anterior presentan generalmente inconvenientes mayores. En primer lugar, con-tienen proteínas o hidrolizados de proteínas de origen animal o humano (albúminas...), que representan un riesgo biológico potencial y que no constituyen compuestos químicamente definidos. Por otro lado, las composiciones del estado de la técnica no dan suficiente estabilidad a las vacunas vivas atenuadas, lo que hace que las posibilidades de almacenaje de dichas vacunas sean limitadas y su exposición eventual o durante su almacenaje o durante su expedición a altas temperaturas arriesgada. En efecto, su pérdida de actividad entraña la ineficacia de la vacunación y por tanto la falta de protección en caso de infección real. Además, las composiciones conocidas son de eficacia todavía más li-mitada cuando se trata de estabilizar las especies distintas de una vacuna multivalente que contiene virus distintos. La vacuna tetravalente MMRV (sarampión-parotiditis-rubeola-varicela) constituye así un ejemplo de vacuna multivalente para la que no hay actualmente un estabilizante adecuado para las cuatro especies.
La presente invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de una vacuna que contiene un virus vivo de la varicela atenuado, según la cual (i) se cultiva el virus vivo de la varicela atenuado; (ii) se añade a la preparación obtenida en (i), un agente estabilizante tal como se define a continuación, (iii) se recolecta el virus; y (iv) se liofiliza la preparación obtenida en (iii).
Los agentes estabilizantes útiles en el marco de la presente invención no presentan los inconvenientes expuestos anteriormente. Estos agentes estabilizantes para composiciones y particularmente vacunas que contienen uno o más virus vivos atenuados, comprenden uno o más compuestos escogidos de cada uno de los grupos que son la urea y sus derivados, los aminoácidos, disacáridos, polialcoholes y las soluciones tamponadas, entendiéndose que un compuesto escogido del grupo de disacáridos es la sacarosa. En cuanto al agente estabilizante útil en el marco de la presente
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invención, el o los elementos escogido(s) en el grupo de disacáridos puede(n) estar presente(s) en una proporción que va del 2 al 6%. Ventajosamente, el o los elementos escogido(s) en el grupo de disacáridos puede(n) estar presente(s) en proporción del 2,5%.
El grupo de polialcoholes que es un componente del agente estabilizante según la invención puede particularmente comprender el sorbitol y el manitol. El agente estabilizante según la invención puede comprender el sorbitol y el manitol. En el caso de que el agente estabilizante según la invención comprenda el sorbitol, éste está preferentemente presente en una proporción que va del 2 al 6%. En el caso en que el agente estabilizante según la invención comprenda el sorbitol, éste estará ventajosamente presente en una proporción que va del 3 al 5%. De forma particularmente ventajosa, el sorbitol podrá estar presente en una proporción del 5%. En el caso de que el agente estabilizante según la invención comprenda el manitol, éste estará preferentemente presente en una proporción que va del 1 al 2,5%. En el caso de que el agente estabilizante según la invención comprenda el manitol, éste estará ventajosamente presente en una proporción del 1,5%.
El grupo de soluciones tamponadas que es un componente del agente estabilizante según la invención puede par-ticularmente comprender los tampones de fosfato y el ácido tetracético de la etilendiamina (EDTA). De manera ven-tajosa, el agente estabilizante según la invención comprenderá un tampón de fosfato. El agente estabilizante según la invención podrá comprender otro de dextrano. En el caso de que el agente estabilizante según la invención comprenda dextrano, éste estará preferentemente presente en una proporción que va del 1 al 4%. En el caso de que el agente estabilizante según la invención comprenda dextrano, éste estará ventajosamente presente en una proporción del 3%.
El agente estabilizante útil en el marco de la presente invención comprende la urea, un derivado de la urea o una mezcla de éstos. Ejemplos de derivados de la urea utilizables son la alilurea, acetamida, metilcarbamato o butilcarba-mato. La urea, uno de sus derivados o una mezcla de éstos, estarán preferentemente presentes en una proporción que va del 0,125 al 2%; ventajosamente presente(s) en proporción del 0,5%.
El pH de las composiciones según la invención se ajustará preferentemente en función del o de los virus a estabi-lizar. El ajuste del pH a 7 es particularmente ventajoso.
Numerosas composiciones y particularmente vacunas monovalentes que contienen esencialmente una especie o cepa vírica, o las multivalentes que contienen varias especies o cepas víricas pueden estabilizarse con los agentes estabilizantes según la invención. El objeto de la invención reside también en las composiciones y particularmente las vacunas, estabilizadas con ayuda de los agentes estabilizantes anteriormente mencionados.
Dichas vacunas estabilizadas según la invención pueden por ejemplo comprender al menos un virus de la familia Herpesviridae. La familia Herpesviridae comprende particularmente el virus de la varicela, el citomegalovirus y el virus del herpes simplex. El virus de la varicela es particularmente frágil y termolábil cuando se le compara con otros virus. Los agentes estabilizantes según la invención son particularmente interesantes cuando se trata de estabilizar un virus tan inestable como el de la varicela.
Los agentes estabilizantes según la invención son aplicables a otros virus, que pueden particularmente escogerse entre los Paramyxoviridae (morbillivirus del sarampión, el virus de la parotiditis, el virus parinfluenza de tipo 1, 2, 3, 4, los pneumovirus), los Togaviridae (rubeola), y los virus influenza (A, B, C).
Las mezclas obtenidas a partir de virus citados anteriormente o de otros virus y constituyentes de vacunas poliva-lentes pueden ventajosamente estabilizarse con la ayuda de agentes estabilizantes según la invención. Pueden citarse entre las vacunas multivalentes a considerar la vacuna sarampión-parotiditis-rubeola. En el contexto de las asociacio-nes de especies, los agentes estabilizantes según la invención presentan además de las ventajas citadas anteriormente propiedades interesantes ya que su aptitud para estabilizar cada una de las especies permite su asociación. En efecto, la combinación de agentes infecciosos de varias enfermedades representa un progreso económico y práctico en la medida en que una profilaxis permite proteger contra varias enfermedades al contrario que con las vacunas monovalentes. Sin embargo, la coexistencia de agentes infecciosos diferentes presenta problemas importantes de compatibilidad entre estos agentes lo que hace difícil una polivacunación simultánea eficaz. Los agentes estabilizantes según la invención proporcionan una solución a estos problemas. La fabricación de la vacuna tetravalente sarampión-parotiditis-rubeola-varicela es un ejemplo de estos problemas de asociación de vacunas puesto que tres de las especies de la asociación presentan termoinestabilidad. Cuando se utiliza un agente estabilizante según la invención, se consigue estabilizar y conservar una capacidad infecciosa suficiente para cada una de las cuatro especies.
Se prefiere que estas vacunas estén liofilizadas cuando ésto sea posible para mejorar aun más la estabilidad de la vacuna final. En la preparación de vacunas vivas liofilizadas dichas vacunas preferentemente se pondrán en contacto con una cantidad apropiada de un agente estabilizante según la invención. El contacto de los virus con el agente estabilizante se efectuará antes de la recolección de dichos virus.
Se describirá la invención de manera más detallada en la descripción a continuación. Como ejemplos, hemos elegido exponer en cuanto a los ejemplos de realización de la invención la preparación de una vacuna monovalente estabilizada de la varicela así como la de una vacuna multivalente estabilizada sarampión-parotiditis-rubeola-varicela ya que los problemas de estabilidad y asociación están aquí particularmente acentuados.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Ejemplos Ejemplo 1
Preparación de una vacuna de varicela estabilizada según la invención
La cepa de varicela atenuada utilizada para la preparación de una vacuna estabilizada según la invención es la cepa OKA.
Se prepara un estabilizante utilizando los componentes siguientes que son mezclas en agua p.p.i (preparaciones para inyección) de los relacionados a continuación:
- Sorbitol 5% - Manitol 2,5% - Sacarosa 5% - Dextrano 3% - mezcla de aminoácidos, - urea 0,5% - EDTA 0,05%, - Glutamato sódico 0,05%
La recolección o liberación de los virus de las células infectadas se realiza o por desintegración celular (sonica-ción, rotura, altas presiones...) en el estabilizante, o espontáneamente en el estabilizante. Se obtiene así después de la clarificación una suspensión vírica estable.
Los ensayos se realizan después de ajustar el título por dilución en pequeños matraces que se liofilizan siguiendo un ciclo adaptado.
Pruebas de estabilización de la vacuna obtenida.
Las preparaciones liofilizadas para ensayar se rehidratan y valoran. La actividad se determina según el número de unidades que forman las placas (pfu) con la ayuda de la numeración de los efectos citopatógenos obtenidos en la cuadrícula de 25 cm2por las distintas diluciones de los ensayos.
El estabilizante de control utilizado es un estabilizante tradicional de tipo conocido y corresponde por ejemplo al descrito en el documento de patente de los Estados Unidos US 4.147.772.
Estabilidad comparada de las distintas fases de la preparación de la vacuna
Condiciones y fases de la prueba Título (pfu/ml)
Control (ej.: SPGA) Estabilizante según la invención
Durante la recogida X X + 1 log
Después de la liofilización X X + 0,2 log
Almacenado 7 días a 37º X X + 1,1 log
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Estabilidad obtenida con el estabilizante según la invención en las diferentes condiciones de almacenaje
Duración del Pérdida de título a Duración del Pérdida de título a Duración del Pérdida de título a almacenaje 22,5oC (∆pfu/dosis) almacenaje 5o(∆pfu/dosis) almacenaje -70oC (∆pfu/dosis)
1 mes 0,3 6 meses 0 9 meses 0,1
1,5 meses 0,3 12 meses 0,1 18 meses 0,3
2 meses 0,46 18 meses 0,15 30 meses 0,1
3 meses 0,54 24 meses 0,28 36 meses 0,06
30 meses 0,35 36 meses 0,4
Los valores indicados en la tabla anterior han sido obtenidos de la media de tres ensayos realizados.
El estabilizante según la invención permite mantener la titulación vírica durante las diferentes fases de la prepara-ción de la vacuna también durante su almacenaje, que se comprueba aquí a cuatro temperaturas diferentes.
Ejemplo 2
Preparación de una vacuna multivalente Sarampión-Parotiditis-Rubeola-Varicela estabilizada según la invención Los productos víricos concentrados rubeola, parotiditis, sarampión y varicela, conservados congelados a bajas temperaturas se descongelan y después se mezclan extemporáneamente. Esta mezcla se reparte enseguida ente los ensayos diferentes que contienen el producto estabilizante según la invención ejemplarizada en el ejemplo 1 anterior. Se procede de esta forma para obtener las proporciones de las soluciones finales siguientes: sarampión: 1,5 volúmenes ; parotiditis: 0,01 volúmen ; rubeola : 1,0 volúmen y varicela : 2,5 volúmenes. Estas proporciones diferentes indicadas en relación con los ejemplos, pueden variar, según el título de los productos víricos concentrados y no son limitativas. Los ensayos se reparten en pequeños matraces ya que seguidamente se liofilizan según un ciclo estándar. Las pruebas de estabilidad se realizan colocando los matraces durante 7 días a 37ºC o 21 días a 22ºC o 30 meses a + 4ºC. Estabilidad obtenida con el estabilizante según la invención en las diferentes condiciones de almacenaje
No se constatan pérdidas significativamente diferente de las obtenidas por las vacunas monovalentes correspon-dientes.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 REIVINDICACIONES
1. El procedimiento de preparación de una vacuna que contiene un virus vivo de la varicela atenuado, según el cual:
(i) se cultiva el virus vivo de la varicela atenuado
(ii) se añade a la preparación obtenida en (i), un agente estabilizante para estabilizar el virus, que comprende: - uno o varios aminoácidos
- sacarosa
- uno o varios polialcoholes - una solución tampón, y - urea o un derivado de la urea: (iii) se recolecta el virus; y
(iv) se liofiliza la preparación obtenida en (iii).
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente estabilizante comprende de 2 a 6% de sacarosa. 3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el agente estabilizante comprende el 5% de sacarosa 4. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente estabilizante comprende un polialcohol que es el sorbitol.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el agente estabilizante comprende de 2 a 6% de sorbitol. 6. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente estabilizante comprende un polialcohol que es el manitol.
7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el agente estabilizante comprende de 1 a 2,5% de manitol. 8. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el agente estabilizante comprende una solución que es un tampón de fosfatos.
9. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el agente estabilizante comprende de 0,125 a 2% de urea o de un derivado de la urea.
10. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el agente estabilizante comprende 0,5% de urea o de un derivado de urea.
11. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el agente estabilizante comprende dextrano. 12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el agente estabilizante comprende de 1 a 4% de dextrano. 13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que el agente estabilizante comprende el 3% de dextrano.
