Preparación y evaluación de soportes de colágeno a partir de submucuosa intestinal porcina para tejido vascular

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(1)IM – 2005- I- 04 PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN DE SOPORTES DE COLÁGENO A PARTIR DE SUBMUCOSA INTESTINAL PORCINA PARA TEJIDO VASCULAR. RICARDO BELTRÁN. ASESOR JUAN CARLOS BRICEÑO, MSc. Ph.D. INGENIERÍA MECÁNICA COASESORA DIANA MARCELA TABIMA, MSc INGENIERÍA QUÍMICA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE MECÁNICA 2005.

(2) TABLA DE CONTENIDOS LISTA DE FIGURAS 1. INTRODUCCIÓN 1.1 OBJETIVO GENERAL 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2. MARCO TÉORICO 2.1 TEJIDO VASCULAR 2.2 INGENIERÍA DE TEJIDOS 2.3 INTERACCIÓN CON POLÍMEROS 2.4 SUBMUCOSA INTESTINAL PORCINA (SIS) 3. METODOLOGÍA 3.1 PREPARACIÓN DE CONDUCTOS 3.1.1 Conductos de Submucosa Intestinal (SIS) 3.1.1.1 Materiales y Reactivos 3.1.1.2 Procedimiento No. 1: Obtención de Submucosa Intestinal Porcina (SIS) 3.1.1.3 Procedimiento No. 2: Elaboración de Conductos 3.1.2 Conductos de Carótidas Porcinas Acelulares 3.1.2.1 Materiales y Reactivos 3.1.2.2 Procedimiento 3.2 EVALUACIÓN MECÁNICA 3.2.1 Pruebas Biaxiales 3.3 EVALUACIÓN IN VIVO 4. RESULTADOS 4.1 CONDUCTOS VASCULARES 4.1.1 Conductos de Submucosa Intestinal (SIS) 4.1.2 Conductos de Carótidas Porcinas Acelulares 4.2 EVALUACIÓN MECÁNICA 4.2.1 Pruebas Biaxiales 4.3 EVALUACIÓN IN VIVO 5. ANÁLISIS DE RESULTADOS 5.1 CONDUCTOS VASCULARES 5.1.1 Conductos de Submucosa Intestinal (SIS) 5.1.2 Conductos de Carótidas Porcinas Acelulares 5.2 EVALUACIÓN MECÁNICA 5.2.1 Pruebas Biaxiales 5.3 PROTOCOLO COMITÉ DE ÉTICA DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL (CEEA) 6. CONCLUSIONES GLOSARIO BIBLIOGRAFÍA ANEXO A (Protocolo de EVALUACIÓN PRECLÍNICA DE INJERTOS VASCULARES DE COLÁGENO).

(3) TABLA DE FIGURAS Figura 1. Montaje del sistema para ensayos biaxiales. Figura 2. Membrana de Submucosa Intestinal Porcina en su forma hidratada. Figura 3. Conductos de Submucosa Intestinal en su forma hidratada en los moldes. Figura 4. Conductos de Submucosa Intestinal en su forma deshidratada. Figura 5. Conductos de Submucosa Intestinal en su forma deshidratada. Figura 6. Conductos de carótidas acelulares. Figura 7. Conductos de carótidas acelulares. A) En su forma Hidratada. B) En su forma deshidratada. Figura 8. Conductos de carótidas acelulares. Figura 9. Curva Esfuerzo-Deformación, en conductos de SIS Figura 10. Curva Esfuerzo-Deformación, en conductos de SIS Figura 11. Curva Esfuerzo-Deformación, en conductos de SIS Figura 12. Arteria Carótida derecha reparada. Figura 13. Implantación del injerto vascular de SIS Figura 14. Injerto vascular de SIS implantado y permeable.

(4) 1. INTRODUCCIÓN El objetivo de esta sección es introducir el trabajo realizado para tener una visión global de lo que se hizo iniciando por el planteamiento del problema hasta su posible solución. Posteriormente se exponen los objetivos tanto generales como específicos del trabajo. Se ha creado la necesidad de tener disponibles injertos vasculares, debido al alto índice de enfermedades como lo son la aterosclerosis que hacen necesarios los procedimientos de bypass, que en EEUU hacienden a 515,000 casos por año [1]. Para enfrentar la limitación de donantes para llevar a cabo dicho procedimiento se ha investigado el uso de tejidos criopreservados, materiales sintéticos y naturales de tal forma que puedan ser utilizados en injertos vasculares. Los materiales sintéticos más utilizados son Dacron y politetrafluoroetileno ( PTFE), las prótesis de PTFE son químicamente inertes y no inducen respuestas alérgicas o inflamatorias, además que son hidrofóbicas pero aun as í la complicación mas frecuente es la trombosis precoz o tardía. En este tema existe un acuerdo en común, que estipula que si la sangre circula por debajo de una velocidad mínima deter minada irremediablemente aparecerá una trombosis. Hay factores que se derivan de este acuerdo como lo son la permeabilidad de la prótesis y el diámetro. En la gran mayoría de casos se espera poder utilizar tejido autólogo, pero es posible que este sufra las mismas complicaciones ateroscleróticas que se han manifestado con mayor incidencia en otros vasos. La ventaja de utilizar injertos autólogos es básicamente que la respuesta del hospedero es más amable, no existe oclusión en diámetros de 4 mm y puede per manecer abierto con flujos de solo 75mL/min el cual debe ser mayor para mantener estas características con materiales sintéticos. Con base a estas condiciones se pretende utilizar un material xenológico, el cual tiene condiciones inter medias entre el injerto autólogo y sintético. De esta forma se espera que se pueda utilizar en diámetros inferiores a 6mm, con gran aceptación por parte del hospedero al tratarse de matriz extracelular y por último que estimule la regeneración celular. Para esto se parte de una metodología propuesta para la obtención de submucosa intestinal porcina, y se desarrolla una metodología flexible para convertir estas membranas en conductos cilíndricos de diferentes diámetros y geometr ías. Se realizan pruebas mecánicas biaxiales en las cuales se pretende determinar las presiones que serán capaces de soportar los conductos, para asegurar su buen funcionamiento dentro de un medio hemodinámico. Por último se plantea una alternativa que consiste en utilizar tejido vascular porcino debido a su geometr ía cilíndrica, y para esto se emplea arteria carótida sin embargo no se realiza todo el procedimiento por problemas en la obtención del material. OBJETIVO GENERAL Crear conductos acelulares a partir de SIS y tejido vascular porcino que promuevan la regeneración de las células autólogas, asegurando mayor biodurabilidad del huésped y aumentando la biocompatibilidad por parte del organismo..

(5) OBJETIVOS ESPECÍFICOS Optimizar la elaboración de conductos para uso en injertos vasculares. Obtener conductos con características mecánicas reproducibles que aseguren su buen funcionamiento ante una presión fisiológica de 140mmHg. Acercamiento mediante un modelo in vitro de la resistencia de los conductos. Formular un protocolo para el comité de ética de experimentación animal con el fin de tener la aprobación para utilizar el dispositivo en un modelo animal..

(6) 2. MARCO TÉORICO El objetivo de esta sección es dar a conocer unos conceptos generales sobre el tejido vascular, la ingeniería de tejidos, la interacción de los polímeros con el hospedero y finalmente describir que es la submucosa intestinal. 2.1 TEJIDO VASCULAR El tejido vascular consta de 3 capas; íntima, media y adventicia, las cuales reaccionan de distinto modo ante los diferentes factores que inducen cambios patológicos. La capa íntima de las arterias esta constituida por un endotelio, esta descansa sobre una capa de tejido conjuntivo que la separa de la lámina elástica interna y de la media. Con el paso del tiempo esta capa se va engrosando progresivamente, debido a la proliferación de tejido conjuntivo. A través del endotelio pasan sustancias necesarias para el metabolis mo, esta se compone de células planas con un núcleo abultado y se encuentran situadas según un patrón escamoso. La capa subendotelial es una superficie delgada y completa de tejido conjuntivo que contiene fibras de colágeno y fibras elásticas delgadas. En la capa media se encuentra tejido elástico de forma difusa y una proporción de fibras musculares, a esto debe sus características. En la medida que dis minuye el diámetro de las arterias así mismo dis minuye progresivamente el contenido de la capa elástica, el caso de la aorta sería de una artería elástica y el de carótida se considera artería muscular. Las arterías musculares están constituidas fundamentalmente por un plano de células musculares y una escasa cantidad de fibras elásticas orientadas circular mente y en menor cantidad longitudinalmente. La capa adventicia tiene gran importancia ya que es la que provee fortaleza a la arteria y tiene características reconstructivas, está constituida en su mayoría por tejido muscular y en algunos casos llega a ser más gruesa que la media [2]. 2.2 INGENIERÍA DE TEJIDOS La meta de los primeros biomateriales, consistía en alcanzar una combinación de funcionalidad respecto al uso que se le da, sin deteriorar la respuesta ante el hospedero. En la primera generación los biomateriales se seleccionaban por sus características inertes, así tenían una respuesta mínima frente al tejido hospedero. Después se habló de biomateriales de segunda generación, estos incluían una respuesta controlada en los tejidos en los cuales serían incluidos y proporcionaban una ventaja en el uso terapéutico. Además se empezó a hablar de biomateriales reabsorbibles y su degradación dependía de la aplicación del dispositivo, por esta razón muchos grupos de trabajo desarrollaron polímeros biodegradables con diferentes características de resistencia, flexibilidad y composiciones químicas. Se desarrollaron nuevas superficies de ingeniería y arreglos arquitectónicos para diferentes aplicaciones y así se llego a la tercera generación de biomater iales, que consistía en estimular reacciones muy específicas con proteínas y células a nivel molecular buscando crear tejido funcional..

(7) La ingenier ía de tejidos utiliza un número de herramientas que interactúan entre la biomédica y la ingeniería con el fin de utilizar células o atraerlas para formar tejidos o regenerarlos. Generalmente se tiene una interacción entre las células, un soporte y un bioreactor. Las células pueden provenir de tejido alogénico, xenogénico o autólogo, un fenotipo y ciertas condiciones. El soporte debe tener unas propiedades mecánicas, una arquitectura característica, señales biológicas y cierta rata de reabsorción. Por último el bioreactor proporcionará las condiciones para la maduración in vitro, mediante factores de crecimiento, estímulo mecánico y nutrientes. En definitiva en el bioreactor se llevará a cabo la proliferación de las células, arreglo y proliferación, seguido de la producción de la matriz extracelular. Se pretende que in vivo se degrade el soporte y ocurra una remodelación del tejido [3]. Basados en esta tecnología se trabaja con un ángulo diferente en matrices naturales decelularizadas, con estos soportes se trabajó con el fin de remodelarlos in Vitro y se ha demostrado que se remodelan in vivo. 2.3 INTERACCIÓN CON POLÍMEROS El aspecto mas importante en cuanto a las respuestas patológicas de los implantes poliméricos químicamente puros, es que no se conocen respuestas inflamatorias o alérgicas. En principio se presenta una agregación de macrófagos por la respuesta a cuerpo extraño pero con el tiempo suele dis minuir, las células responden con la penetración de fibroblastos los cuales se incorporan al interior de la pared. Desde hace tres décadas se han venido utilizando materiales sintéticos para injertos vasculares, los comúnmente utilizados PTFE y Dacrón, pero estos materiales resultan exitosos en reemplazos para diámetros de 6 mm en adelante. La complicación mas frecuente en reconstrucción vascular es la trombosis, es dif ícil establecer su causa exacta, pero principalmente de adjudica a la circulación de la sangre a una velocidad mínima deter minada. Para los materiales sintéticos la velocidad mínima deter minada es mayor y por esta razón no se presentan porcentajes clínicamente aceptables por debajo de los 6mm [2]. 2.4 SUBMUCOSA INTESTINAL PORCINA (SIS) La matriz extracelular es un material biológico producido por las mis mas células la cual se encuentra entre estas y les da soporte. Las mantiene unidas por medio del soporte físico y les proporciona adherencia, además pueden enviar señales entre ellas e interactuar por medio de la matriz. Esta consiste en grandes moléculas sintetizadas por las células, que son llevadas a los espacios intercelulares y después son unidas para crear un soporte estructural compuesto por colágeno y elastina en su gran mayor ía y proteoglicanos, glucoproteínas los cuales proporcionan adhesión, algunos solutos y agua. Entre sus funciones principales se encuentra el soporte mecánico para que la célula se pueda anclar, determina la orientación de la célula, controla su crecimiento, mantiene la diferenciación, da una plataforma para remodelar el tejido de forma ordenada y establece un micro ambiente para el tejido [3]. La submucosa intestinal es un material natural obtenido del intestino delgado de porcinos, esta es una capa muy delgada constituida por tejido conectivo que contiene vasos sanguíneos, linfáticos y nervios. Este material es propiamente matr iz extracelular y en su estructura proteica.

(8) contiene específicamente 90% de colágeno tipo I y III y en menor proporción colágeno IV, V y VI. Entre las proteínas especializadas se encuentran Fibronectina, factor de crecimiento de fibroblastos FGF-2 y factor β de transformación (TGF- β) y por último entre los proteoglicanos hay heparina y heparán sulfato [4]. EL colágeno es la proteína más común en el reino animal, existen cerca de 20 tipos diferentes de colágeno pero el tipo I, II y III los cuales son intersticiales o fibrilares, son los más abundantes, estos son utilizados ampliamente en cultivos celulares y al existir pequeñas variaciones no es reconocido como extraño entre especies. Los Tipos IV, V y VI son no fibrilares y están presentes en las membranas basales [3]. La fibrinectina es una glicoproteína de multidominio que posee sitios de uniones para una gran variedad de componentes de la matriz extracelular como lo son el colágeno, Heparina A y B y fibrina. Esta se encuentra en el tejido conectivo, en el plas ma y alrededor de la superficie de las células y es muy importante por su carácter adhesivo en la matriz extracelular y en las células endoteliales que migran [3]. Entre las ventajas que ofrece este material, es su resistencia y la capacidad de ser remodelado por el hospedero después de ser implantado. Las células del hospedero para un tejido específico, pueden crecer sobre el soporte dependiendo de su ubicación en el transplante y por esta razón se puede utilizar exitosamente en injertos para conductos vasculares. 3. METODOLOGÍA El objetivo de esta sección es dar a conocer los distintos métodos empleados para la obtención de membranas de colágeno y su respectiva fabricación en conductos. También se mencionará la metodología para la descelularización de tejido vascular porcino y por último se explicará como se hicieron las pruebas biaxiales y el primer experimento en un modelo animal. 3.1 PREPARACIÓN DE CONDUCTOS 3.1.1 Conductos de Submucosa Intestinal (SIS) La obtención de las membranas de submucosa intestinal porcina se llevo a cabo utilizando la metodología propuesta por Tabima D. [5], la cual se deriva de una metodología propuesta por Badylak y col. [6] con ciertos cambios de tal forma que se pudiera adecuar al uso en la Universidad de Los Andes y a la planta piloto de hemosustitutos de la Fundación Cardioinfantil. 3.1.1.1 Materiales y reactivos El material primario utilizado es intestino delgado de porcino proveniente del Frigor ífico Guadalupe S.A. Para la adecuación de este, se utiliza una solución de hipoclorito de sodio y peroxido de hidrógeno. Además es necesario contar con equipo básico quirúrgico, una espátula y recipientes para hacer los lavados. Para la elaboración de los conductos una vez obtenidas las membranas, es necesario tener moldes de los diámetros y geometr ías deseadas. Estos deben ser preferiblemente en acero inoxidable 316L ya que este es el especif icado para uso clínico por su bajo contenido de carbono..

(9) Para la extracción de los conductos se necesita una fibra polimérica o natural dependiendo del diámetro de los conductos. 3.1.1.2 Procedimiento No. 1: Obtención de Submucosa Intestinal Porcina (SIS) Obtener Intestino delgado de los animales recién sacrificados. Almacenar a 4°C en solución salina. Retirar el mesenterio y lavar 5 veces hasta quede limpio. Abrir el Intestino Delgado en dirección longitudinal. Remover la capa muscular y serosa utilizando el raspador. Raspar una vez más la Submucosa Intestinal (SIS) para retirar cualquier tejido remanente indeseable. Sumergir en agua durante 2 horas hasta que desaparecen los residuos de sangre. Exponer a una mezcla de mezcla de 0.5% Hipoclorito de Sodio y 0.5% de Peróxido de hidrógeno por un periodo de 15 minutos con el objetivo de eliminar cualquier célula remanente. Lavar con PBS (Phosphate-Buffered Saline - pH=7), durante 15 minutos. Lavar con agua destilada. 3.1.1.3 Procedimiento No. 2: Elaboración de Conductos Recubrir el molde de acero inoxidable utilizando la fibra, la distancia entre cada vuelta depende del diámetro del molde a utilizar haciendo necesario que sea mas continua a medida que este disminuye. Recubrir el molde enrollando las membranas de Submucosa Intestinal en dirección longitudinal paralelo al molde, cuantas veces sea necesario para lograr el número de capas deseado. Deshidratar los conductos en flujo laminar durante un periodo de 12 horas. Una vez estén totalmente deshidratados, retirar la fibra en sentido axial al conducto. Retirar el conducto del molde. De ser necesario esterilizar utilizando óxido de Etileno (ETO). *Para la Elaboración de los conductos se mantuvieron las máximas condiciones de asepsia. 3.1.2 Conductos de Carótidas Porcinas Acelulares Con el fin de decelularizar el tejido vascular porcino, se empleo la metodología propuesta por Bader A [7], esta metodología a diferencia de la empleada para los conductos de SIS es enzimática y resulta ser más sencilla. 3.1.2.1 Materiales y Reactivos. El material primario utilizado es carótida de porcino proveniente del Frigor ífico Guadalupe S.A. para la adecuación de este se utiliza tripsina. Además es necesario contar con equipo básico quirúrgico, un agitador con control de temperatura y cajita de petri para mantener los conductos en la solución enzimática. 3.1.2.2 Procedimiento Obtener carótidas de animales recién sacrificados. Almacenar a 4°C en solución salina. Limpiar y remover tejido adiposo..

(10) Decelularizar por medio de una solución de 0.1% de tripsina en PBS (PhosphateBuffered Saline) en un agitador a una temperatura de 37°C por un periodo de 24 horas. Lavar con PBS. Deshidratar en flujo laminar durante 12 horas. 3.2 EVALUACIÓN MECÁNICA Para evaluar la viabilidad de los conductos, se decidió realizar pruebas biaxiales que permitieran observar las presiones a las cuales era posible que se presentara una falla del mater ial y tener un orden de magnitud de los esfuerzos principales. En estas pruebas se alimenta un sistema con un fluido incompresible y mediante imágenes y datos de presión se obtiene la curva del esfuerzo contra la deformación, la metodología es de Vásquez A. [8]. 3.2.1 Materiales Para la prueba se utilizaron los conductos de Submucosa Intestinal Porcina con diámetros de ¼”, 4 capas de grosor y una longitud de 5cm. Un medidor de presión, un inyector de volumen, un baño termostadado digital y una cámara digital. La adquisición de estos equipos y sus características fueron obtenidas del trabajo de Chalela I [9]. Medidor de presión. Unidades de medición: mmHg, bar, psi, Kg/cm², atm. T. Operación: 0 a 50ºC. Compatibilidad: medios y líquidos. Transductor de presión. (Resolución 0.02psi, rango de 0 a 29psi) Sistema de inyección. Rango de flujo: 0.001 µL/hr a 147mL/hr. Exactitud: ±0.5%. Jeringas aceptadas: 10µL a 60mL. Jeringa con conexiones. Capacidad 100µL. Jeringa con conexiones. Capacidad 25mL. Baño termostatado digital. Capacidad: 5.5L. Rango de temperatura: ambiente a 99ºC. Control digital. Cámara digital. 10x-Zoom (120 Digital) Photo 640x480Pix. 3.2.2 Procedimiento Instalar los equipos como se muestra en la figura 1. Marcar el conducto con 2 líneas perpendiculares a este. Hidratar el conducto..

(11) Recubrir el tapón utilizando cinta de teflón, se introduce uno de los extremos del conducto y se vuelve a recubrir con teflón posterior a esto se aprieta con abrazaderas de plástico. Realizar el mismo procedimiento del otro extremo del conducto que es conectado al sistema. Inyectar agua y purgar el sistema hasta que no quede aire en las mangueras ni en el conducto. Compensar el volumen de agua hasta que el medidor de presión marque 0 mmHg, pero debe haber agua en el conducto. Se enciende la cámara y se prosigue a inyectar agua a un caudal de 1 mm/min. Se toman datos hasta que ocurra una falla del conducto. Por medio de un programa realizado por Cadena C. [10], se obtiene la curva esfuerzo contra deformación.. Figura 1. Montaje del sistema para ensayos biaxiales. [8]. 3.3 Evaluación in vivo Se hizo un protocolo para el Comité de Ética de Experimentación Animal (CEEA) con la ayuda de un médico y un veterinario, el cual se fundamentó en el protocolo de experimentación propuesto por Huynh T [11]. Para el experimento se seleccionó un animal que se encontrara en el rango propuesto en el protocolo del experimento, un conejo Blanco de Nueva Zelanda con un peso de 2.1Kg. Para la cirugía se contó con un cirujano Cardiovascular, un veterinario y un médico general. Se le administraron los medicamentos para sedarlo y una vez dormido se afeitó en la zona del cuello para la intervención. Se hizo una incisión cervical y se pinzó la arteria carótida. Se le realizó una arteriotomía utilizando un injerto vascular de 2.6mm de diámetro. Se cerró la incisión sin haber aplicado anticoagulantes antes, durante o después el procedimiento. El animal se mantuvo en observación durante 3 días suministrándole los analgésicos indicados por el veterinario..

(12) 4. RESULTADOS A continuación se tienen los resultados obtenidos utilizando las metodologías descritas anteriormente. Así mis mo se tiene una evaluación mecánica mediante ensayos biaxiales en los conductos y por último se tiene un protocolo para el Comité de Ética de Experimentación Animal para la implementación de los dispositivos en un modelo animal. 4.1 CONDUCTOS VASCULARES 4.1.1 Conductos de Submucosa Intestinal (SIS) Se obtuvieron los conductos fabricados con Submucosa Intestinal, se hicieron de diferentes longitudes, diámetros y geometrías. Para eliminar el riesgo de contaminación se trabajó en un medio estéril y se dejaron en flujo laminar durante 12 horas, una vez deshidratadas se minimiza la posibilidad del crecimiento de bacterias. En la figura 2-3, se muestra la membrana de SIS y a continuación los conductos en sus moldes de forma hidratada.. Figura 2. Membrana de Submucosa Intestinal Porcina en su forma hidratada..

(13) Figura 3. Conductos de Submucosa Intestinal en su forma hidratada en los moldes.. En las figuras 4-5, se muestran los conductos de SIS finalizado el proceso en su forma deshidratada. Aquí están listos para su esterilización y su futura implantación.. 6 mm. Figura 4. Conductos de Submucosa Intestinal en su forma deshidratada..

(14) 4 mm. Figura 5. Conductos de Submucosa Intestinal en su forma deshidratada. 4.1.2 Conductos de Carótidas Porcinas Acelulares La elaboración de estos conductos es sin duda más sencilla y la tendencia apunta a tener el mater ial original en su forma deseada, es por esto que se intentó decelulalizar las carótidas de porcinos. En la figura 6, se muestra una arteria carótidas decelularizada, las pinzas están como escala.. Figura 6. Conductos de carótidas acelulares..

(15) 6 mm. Figura 7. Conductos de carótidas acelulares. A) En su forma Hidratada. B) En su forma deshidratada.. Figura 8. Conductos de carótidas acelulares.. 4.2 EVALUACIÓN MECÁNICA En la evaluación de los conductos solo se tomaron en cuenta los que fueron fabricados utilizando submucosa intestinal porcina, debido a problemas existentes en la longitud de las carótidas y la distribución de los diámetros. 4.2.1 Pruebas Biaxiales.

(16) Se realizaron varias pruebas ajustando el montaje de tal forma que no se presentaran fugas en el sistema. Una vez se hicieron las correcciones necesarias, se dispuso de 6 conductos todos con diámetros de ¼” y longitudes de 4cm para llevar a cabo la prueba. A continuación se observan las curvas esfuerzo contra deformación, más representativas de los conductos fabricados a partir de SIS.. Figura 9. Curva Esfuerzo-Deformación, en conductos de SIS. Figura 10. Curva Esfuerzo-Deformación, en conductos de SIS.

(17) Figura 11. Curva Esfuerzo-Deformación, en conductos de SIS 4.3 Evaluación in vivo Los resultados del experimento en el modelo animal fueron muy satisfactorios, ya que se logró llevar a cabo el procedimiento que consistía como se dijo anteriormente en la implantación del injerto en la arteria carótida de un conejo. El procedimiento no tuvo mayores complicaciones y se pudo observar una vez liberado el flujo el paso de sangre por el conducto. El animal fue suturado y se mantuvo en observación, aparentemente se encuentra muy bien pero se le hará una ecografía para determinar si el conducto se encuentra ocluido y evaluar la permeabilidad de este. En las figuras se muestran momentos de la intervención y el injerto implantado.. Fig 12. Arteria Carótida derecha reparada.

(18) Fig 13. Implantación del injerto vascular de SIS. Fig 14. Injerto vascular de SIS implantado y permeable..

(19) 5. ANÁLISIS DE RESULTADOS En el análisis de resultados se pretende tener un orden coherente con el trabajo realizado, de tal forma se analizarán los conductos resultantes donde se destacaron pros y contras de cada uno de estos, seguido por los resultados obtenidos en las pruebas mecánicas y finalmente algunos aspectos prácticos del protocolo para el CEEA. 5.1 CONDUCTOS VASCULARES 5.1.1 Conductos de Submucosa Intestinal (SIS) Cuando se hicieron los primeros acercamientos para la obtención de conductos de SIS, se pensó en sobreponer el número de capas que se quer ía tener y dejar un porcentaje de la longitud total para su traslape, pero al tratarse de un material en su estado hidratado sumamente viscoso, se dificultaba esta tarea y no se obtenían muy buenos resultados. Por esta razón se prefirió que todo el conducto quedara traslapado, cortando la cantidad necesaria de membranas para un número dado de capas dependiendo del radio del molde. Se descartó el uso de parafina antes de revestir el molde con la fibra sintética, de esta forma elimina un paso en el proceso y no se corría el riesgo que esta se fuera acumulando, hasta obstruir el espacio entre el molde y el conducto dificultando la separación de los dos. La metodología es adecuada pero necesita mucho trabajo humano al tratarse de un proceso de remoción mecánico seguido de un proceso químico, además de la preparación de los conductos que es totalmente artesanal. Los conductos resultantes utilizando SIS fueron muy satisfactorios, la metodología empleada es precisa ya que se obtenían los conductos de los diámetros deseados y una muy pequeña variación entre el molde y el conducto. El proceso es flexible ya que permite la variación de las características de los conductos como lo son el grosor de la pared, la longitud y la geometría. Se pueden hacer conductos con el número de capas deseado dependiendo de la aplicación por tratarse de un método artesanal. Se realizaron conductos de 2 hasta 6 capas y en ambos casos se pudo retirar el molde sin problemas, al igual que en los soportes que se hicieron de 2.5mm de diámetro que además tenían longitudes de hasta 18cm. Por último se probaron diferentes geometr ías de tal forma que no existe la limitación de solo poder fabricar conductos rectos para probar esto se hicieron conductos curvos los cuales se pudieron extraer sin ningún problema, esto nos indica que de tratarse de una aplicación especifica donde exista una geometr ía curva y diferentes radios en los extremos, se puede fabricar sin ningún problema. La longitud de los soporte depende particular mente de como se tome el intestino delgado, si las fibras son orientadas de forma longitudinal al molde, se pueden obtener moldes tan largos como sea posible limpiar el intestino sin romperlo, pero de lo contrario su longitud esta limitada al perímetro circular del intestino. Aquí entra una discusión que favorece la orientación de las fibras de forma circular o la producción en el número de conductos. Como se ve en los resultados de los esfuerzos biaxiales, no es necesario que el conducto tenga una mayor resistencia, por lo tanto se podría pensar que es preferible sacar de un solo molde un conducto mas largo para después cortarlo en varias partes cuando esté deshidratado..

(20) Es posible que la orientación de la matriz extracelular logre orientar de alguna forma la regeneración de las células pero Sacks MS. [12] trabajó en la arquitectura de las fibras de SIS y logró establecer un patrón de orientación y recomienda que se utilicen en forma longitudinal ya que en la remodelación se dará un cambio en el sentido. Por esta razón la discusión sobre la orientación de las fibras en los conductos de SIS resulta irrelevante para la orientación del tejido nativo, ya que en el momento de presentarse una endotelización del conducto, probablemente se respete la orientación de las fibras del tejido vascular nativo. 5.1.2 Conductos de Carótidas Porcinas Acelulares Estos conductos presentan grandes ventajas pero tienen grandes limitaciones por el proceso en el sacrif icio de los animales. La metodología resulta muy satisfactoria ya que es menos esclavizante, pero en general toma el mis mo tiempo e inclusive más que la metodología para hacer conductos de SIS. Como se trata de un proceso totalmente enzimático, se eliminan las células sin necesidad de que exista una persona encargada de este proceso. Como se dijo anteriormente existe una tendencia a buscar que el material tenga su geometría circular desde el comienzo, por esto resulta tan atractivo utilizar tejido vascular. Como se mencionó las limitaciones que se presentaron corresponden al método de sacrificio y además que se trata de porcinos adultos, es por esta razón que utilizamos carótidas y no aortas pero las carótidas eran muy cortas ya que están ubicadas en el cuello donde el animal es destazado. Lamentablemente existen otros factores que son difíciles de controlar y que son muy importantes para la futura implantación del dispositivo, estos son; la geometr ía la cual es única y la variación en los diámetros y longitud. 5.2 EVALUACIÓN MECÁNICA 5.1 Pruebas Biaxiales Existieron varias dificultades al realizar las pruebas, la pr incipal fue el medio de contraste que no per mitía apreciar bien las marcas y no había una buena diferenciación entre el conducto y el fondo del recipiente. Al tratarse de un método por imágenes, esta parte juega un papel crucial en el cálculo de los esfuerzos, así que lastimosamente tuvimos que remitirnos a las lecturas de presión por ser una medición directa. El intestino delgado tiene unas fibras que favorece la orientación de forma longitudinal a este, por esta razón el modulo de elasticidad para esta dirección es mayor que en la dirección transversal. Teniendo en cuenta los resultados vistos, donde la deformación de los conductos no fue apreciable, se recomienda que se siga trabajando con la orientación de las fibras de la misma forma que actúan en el intestino delgado. Utilizando las membranas de esta forma se pueden fabricar conductos de mayor longitud y como se tiene un modulo de elasticidad menor en la dirección circunferencial la impedancia vascular será menor. Es deseable seguir haciendo pruebas biaxiales pero en conductos hechos con menos capas, así el conducto puede deformarse apreciablemente con menores presiones..

(21) En las curvas esfuerzo contra deformación se obtuvieron valores de esfuerzo tangencial de hasta 1.9MPa, con la teoría para cilindros de pared delgada y se registraron presiones mayores a los 1000 mmHg, además todos los conductos lograron sobrepasar los 500 mmHg, sobrepasando las expectativas. 5.3 Evaluación in vivo Al protocolo se le hicieron algunos cambios menores por petición del cirujano cardiovascular, pero al momento del primer experimento se notó que la arteria carótida del conejo de 2.1Kg es muy pequeña. Afortunadamente se contaba con un conducto de 2.6mm de diámetro con el que se pudo realizar el procedimiento satisfactoriamente. Sin embargo como se ha mencionado anteriormente existe una alta probabilidad de trombogénesis cuando se trabaja con diámetros tan pequeños y por esta razón se utilizarán conejos más grandes y se plantea una opción para reemplazar la aorta ya que se espera que tenga un mayor diámetro. Es importante que la resistencia del material sobrepase la necesaria ya que en principio existe una degradación, pero posteriormente cuando se de una endotelización del tejido injerto su resistencia aumentará. Se puede apreciar en un estudio realizado por Badylak et al. [13], el deterioro de las propiedades mecánicas por un periodo de tiempo inicial hasta su recuperación donde se sobre pasan las propiedades iniciales..

(22) 6. CONCLUSIONES Se alcanzó exitosamente el propósito principal de este proyecto el cual era obtener conductos para uso vascular con características específicas para poder ser utilizados en las condiciones hemodinámicas del cuerpo y que además promovieran la regeneración celular. Se desarrolló una metodología que per mite fabricar conductos de SIS de diferentes diámetros, los cuales se encuentran en un rango entre 2.5 y 6mm. Esta metodología también per mite diversas geometr ías y diámetros variables entre los extremos del conducto. La resistencia se puede cambiar dependiendo del número de capas que se traslapen en el conducto, por lo tanto resulta ser una metodología viable y funcional donde se tiene un proceso estandarizado para la fabricación de los conductos. La metodología para decelularizar carótidas porcinas es muy eficiente ya que no requiere de mucho esfuerzo humano, pero se encuentran limitaciones al momento de encontrar los diámetros y las longitudes deseadas. Las pruebas fueron satisfactorias en los conductos ya que todos sobrepasaron con un factor de 3.5 la presión arterial promedio de una persona sana, la cual equivale a 140mmHg. Inclusive, en algunos casos las pruebas se realizaron por encima de los 1000mmHg, y los esfuerzos tangenciales soportados por el conducto utilizando la teor ía de cilindros para pared delgada, fue de 1.9MPa corroborando la resistencia del material y su viabilidad para ser utilizado en aplicaciones de reemplazo vascular. En ningún caso se pudo hacer pruebas biaxiales a los materiales por encima de estas presiones ya que se incurría en fallas en el sistema, sin embargo creo que se puede obtener curvas esfuerzo-deformación muy similares entre el tejido nativo y los conductos de SIS ya que ambos tienen un comportamiento exponencial. El modelo in vivo demostró que es totalmente viable el uso de este mater ial para el reemplazo de tractos vasculares, debido a su alta resistencia, su método de fabricación y básicamente porque cumple dos condiciones necesarias para poder utilizarse en cirugía, su facilidad para ser suturado y su resistencia al desgarre frente al hilo. El cirujano cardiovascular hizo muy buenos comentarios sobre el material quedando muy complacido al momento de la implantación por el comportamiento amigable de este. Es importante recalcar que quedó implementado el procedimiento y se puede proseguir a realizar mas pruebas en una población para deter minar como es el proceso de endotelización y cuanto tiempo toma obtener aorta nativa. De forma general se puede concluir que se lograron los objetivos, se le dio un alcance más amplio al proyecto por medio de la búsqueda de otra metodología pero aun as í se logró hacer el injerto vascular con el material originalmente propuesto y utilizando una metodología estandarizada. El paso a seguir en este proyecto es buscar que se trabaje con las dos metodologías propuestas y que se tenga gran éxito en el modelo animal deter minando los tipos de colágeno presentes y determinando las propiedades mecánicas durante la endotelización para hacer una comparación posterior con el tejido nativo. La aplicación inicial de estos conductos es en reemplazos de 4mm, desde luego es importante determinar las causas que llevan a que se presente la oclusión del injerto para lograr la viabilidad del uso de conductos de un diámetro menor. Es necesario buscar la inclusión en el colágeno de agentes anticoagulantes y tratamientos superficiales que inhiban la adhesión de plaquetas..

(23) GLOSARIO CEEA: Comité de Ética de Experimentación Animal ECM: Matriz Extracelular SIS: Submucosa Intestinal Porcina mm: milímetro Hg: Mercurio KPa: Kilo Pascal PBS: Buffer Fosfato de Sulfato. PTFE: Politetrafluoroetileno.

(24) BIBLIOGRAFÍA 1. Heart deseases and stroke statistics – 2005 Update. American Heart Association, American Stroke Association. 2. Cirugía Vascular – Principios y Técnicas. Henry Haimovici. Salvat Editores 1986. 3. BIOMATERIALS SCIENCE 2ed. Buddy D. Ratner, Allan S. Hoffman, Frederick J. Schoen, Jack E. Lemons. Academic Press 2004. 4. He Y. APPLICATIONS OF SMALL INTESTINE SUBMUCOSA IN TUMOR MODEL AND VASCULAR TISSUE ENGINEERING. Master of Science, The Florida State University 2004. 5. Tabima D. Desarrollo de una metodología para la preparación y evaluación de matrices biodegradables usadas para el crecimiento de fibroblastos. Proyecto de postgrado (Magíster en Ingeniería Mecánica) Universidad de Los Andes. Bogotá 6. Lindberg K, Badylak S. Porcine small intestine submucosa (SIS): a bioscaffold supporting in vitro primary human epidermal cell differentiation and synthesis of basement membrane proteins, burns 2001; 27: 254-266. 7. Bader A, Steinhoff G, Strobl K, Schilling T, Brandes G, Mertsching H, Tsikas D, Froelich J, Haverich A. Engineering of human vascular aortic tissue based on a xenogeneic starter matrix. Transplantation: Volume 70(1) 15 July 2000 pp 7-14. 8. Vásquez A. Determinación de las propiedades mecánicas de la pared arterial mediante una prueba presión-volumen. Tesis de Ingeniería Mecánica Universidad de los Andes 2005. 9. Chalela, I. Optimización de una máquina de ensayos Biaxiales para tejido vascular. Tesis de ingeniería mecánica, Universidad de los Andes, 2005. 10. Cadena, C. Caracterización de las propiedades mecánicas de las arterias. Tesis de Ingeniería Mecánica, Universidad de los Andes, 2004. 11. Huynh T, Abraham G, Murray J, Brockbank K, Heigen PO, and Sullivan S. Remodeling of an acellular collagen graft into a physiological responsive neovessel. Nat. Biotechnol., 1999; 17: 1083-1086 12. Sacks MS, Gloeckner C. Quantification of the fiber architecture and biaxial mechanical behavior of porcine intestinal submucosa. J Biomed Matter Res, 46, 1-10, 1999. 13. Badylak S, Kokini K, Tullius B, Whitson B. Strength over time of a resorbable bioscaffold for body w all repair in a dog model. Journal of surgical Res 99, 282-287..

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