Estabilización de suelos con biocemento

Texto completo

(1)ESTABILIZACION DE SUELOS CON BIOCEMENTO. ING. JAIRO ALBERTO FLOREZ RAMIREZ. ING. ARCESIO LIZCANO PhD. - ASESOR. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES DEPARTAMENTO DE INGENIERIA CIVIL Santa fé de Bogotá D.C, 17 de enero de 2006.

(2) Índice general 1. Justificación. 6. 2. Objetivos. 8. 2.1. Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8. 2.2. Objetivos Especificos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8. 3. Antecedentes. 9. 3.1. Biotecnologı́a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 9. 3.2. Antecedentes en el mundo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 11. 3.3. Antecedentes en Colombia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 15. 4. Marco Conceptual. 18. 4.1. Estabilización de Suelos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 18. 4.2. Morfologı́a y Estructura de las Bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 19. 4.2.1. Tinción de Bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 19. 4.2.2. Tinción de Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20. 4.2.3. Morfologı́a de las bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 20. 4.2.4. Tamaño de las bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 21. 4.2.5. Forma de las bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 21. 4.3. Precipitación de Carbonato de Calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 22. 5. Aislamientos y Ensayos Microbiológicos 5.1. Aislamiento de la Bacteria Ureolı́tica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. Ensayos de suelos. 25 25 37. 6.1. Ensayos de compresión edométrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 39. 6.2. Ensayos triaxiales consolidados - no drenados ( CU ) . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 49. 6.2.1. Suelo natural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 50. 1.

(3) ÍNDICE GENERAL. MIC 2006-I-21. 6.2.2. Suelo con bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. Conclusiones y recomendaciones. 51 56. 2.

(4) Índice de tablas 3.1. Propiedades fı́sicas de las muestras de suelos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 11. 3.2. Granulometrı́a de la muestra RT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 12. 4.1. Ej. de mecanismos de precipitacion de carbonato. Especies y ambientes Asoc. (Hammes y Verstraete (2002)) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 24. 6.1. Cálculo de Gs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 37. 6.2. Granulometrı́a del suelo escogido para tratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 38. 6.3. Parámetros encontrados para el suelo escogido para tratamiento . . . . . . . . . . . .. 40. 6.4. Composición del medio nutritivo de precipitación utilizado en el tratamiento. 40. 6.5. Resultados de los ensayos de compresión edométrica. Titulo. 48x109. . . . .. UFC/ml y humedad. 20 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6. Resultados de los ensayos de compresión edométrica. Titulo. 80x108. 44. UFC/ml y humedad. 10 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 45. 6.7. Esfuerzos maximos desviadores (efectivos) - suelo natural . . . . . . . . . . . . . . .. 52. 6.8. Valores de φ y c p efectivos - suelo natural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 53. 6.9. Esfuerzos maximos desviadores (efectivos) - suelo bacteria . . . . . . . . . . . . . . .. 54. 6.10. Valores de φ y c p efectivos - suelo bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 54. 3.

(5) Índice de figuras 3.1. Dispositivo de inyección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 13. 3.2. Imágen captada por el DRX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 14. 3.3. Vista microscópica de granos de arena unidos por cristales de calcita . . . . . . . . .. 15. 3.4. Fotografı́as con microscopio electrónico a) control b) bacteria calcificada ”cbc” c) calcita formada ”cc” d) Biofilm (EPS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 16. 3.5. Mecanismo de precipitación de calcita bio-inducida (Piero Tiano) . . . . . . . . . . .. 17. 5.1. Cantera CIMACO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 26. 5.2. Trece(13) muestras en medio B.H.I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 27. 5.3. Incubación de las muestras en B.H.I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 28. 5.4. Toma de muestras con asa redonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29. 5.5. Pase en S.P.C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 30. 5.6. Imagen de las colonias de bacterias en uno de los S.P.C . . . . . . . . . . . . . . . .. 30. 5.7. Imagen de los S.P.C con los cuatro(4) morfotipos escogidos . . . . . . . . . . . . . .. 31. 5.8. Aislamiento de los cuatro(4) morfotipos en S.P.C distintos . . . . . . . . . . . . . . .. 31. 5.9. Equipo de filtrado para el medio-agar urea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 32. 5.10. Traslado del agar urea a los tubos de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 32. 5.11. Morfotipo tres(3) ureasa positivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 33. 5.12. Pase tubo urea en S.P.C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 33. 5.13. Tinción de Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 34. 5.14. Placa morfotipo tres(3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 34. 5.15. Imagen mostrando las dos estructuras encontradas . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 35. 5.16. S.P.C de Bacilos y Posibles Pseudomonas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 35. 5.17. Resultado positivo del ensayo a las cuarenta y ocho (48) horas de realizado . . . . .. 36. 5.18. Cocobacilos esporulados grampositivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 36. 6.1. Arena gravosa (SP) seleccionada para el tratamiento con bacterias . . . . . . . . . .. 38. 4.

(6) ÍNDICE DE FIGURAS. MIC 2006-I-21. 6.2. Curva granulométrica del suelo escogido para tratamiento . . . . . . . . . . . . . . .. 39. 6.3. Muestras de suelo tratado con bacterias y medio nutritivo . . . . . . . . . . . . . . .. 41. 6.4. Relación de vacios vs P(kPa) - muestra de suelo natural; 20 % humedad . . . . . . .. 41. 6.5. Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra de suelo natural; 20 % humedad . . . . .. 42. 6.6. Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 20 % humedad .. 42. 6.7. Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 20 % humedad 43 6.8. Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 20 % humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 43. 6.9. Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 20 % humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 44. 6.10. Relación de vacios vs P(kPa) - muestra de suelo natural; 10 % humedad . . . . . . .. 46. 6.11. Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra de suelo natural; 10 % humedad . . . . .. 46. 6.12. Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 10 % humedad .. 47. 6.13. Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 10 % humedad 47 6.14. Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 10 % humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 48. 6.15. Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 10 % humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 48. 6.16. Variación del pH para el suelo tratado con medio nutritivo y bacterias. . . . . . . . .. 49. 6.17. Preparaciòn de muestras para ensayos triaxiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 50. 6.18. Muestras para ensayos triaxiales a los 20 dias de tratamiento- Arriba: Suelo natural, Abajo: Suelo con bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 51. 6.19. Esfuerzo Desviador efectivo σ(kP a)vsDef ormaciònunitaria − suelonatural . . . . .. 52. 6.20. Circulos de Mohr esfuerzos efectivos - suelo natural . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 52. 6.21. Esfuerzo Desviador efectivo σ(kP a)vsDef ormaciònunitaria − suelobacteria . . . .. 54. 6.22. Circulos de Mohr esfuerzos efectivos - suelo bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 55. 7.1. En el futuro... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 57. 5.

(7) Capı́tulo 1. Justificación Se define como estabilizar un suelo, cambiar o alterar sus propiedades con la finalidad principal de obtener un material de mejor calidad, que pueda soportar las solicitaciones de carga a las que va a ser sometido. Por lo general, los suelos colombianos en su estado natural no poseen una capacidad de soporte que sea aceptable para resistir estas solicitaciones en determinados proyectos, principalmente en el campo de infraestructura vial y pavimentos. Los principales factores que generan la inestabilidad de un suelo están ligados a las propiedades intrı́nsecas de estos, como son: 1) Resistencia mecánica, 2) Tamaño y forma de las partı́culas, 3) Estabilidad volumétrica, 4) Permeabilidad. Existen diferentes formas de estabilizar un suelo, ya sea con adición de cal o cemento, con materiales asfálticos o con otros aditivos como las escorias de alto horno, los cuales mejoran considerablemente las propiedades mencionadas anteriormente, pero desgraciadamente exigiendo de altas inversiones por parte de la empresas constructoras. Un campo hasta hace muy poco explorado en el mundo para la solución de éste problema, ha sido la interacción de cierto tipo de bacterias, llamadas calcificantes, con los suelos. Que bajo condiciones controladas pueden conseguir un mejoramiento de ciertos factores que influencian la resistencia de un suelo. Las bacterias causan en la matriz de suelo la precipitación o la formación de calcita; material cristalino que sirve de unión entre las partı́culas de suelo, es decir, cementa las partı́culas de suelo entre sı́ mejorando las propiedades intrı́nsecas de este.. 6.

(8) MIC 2006-I-21. El Ingeniero Cesar Pereira M.Sc de la Universidad de los Andes en su trabajo de Tesis de Magı́ster, logró aislar una bacteria ureasa positiva nativa de un suelo calizo colombiano, este proyecto será la continuación de su trabajo, en el cual se experimentara con la bacteria para evaluar sus propiedades calcificantes en ensayos de laboratorio y en suelos granulares, además de buscar nuevas alternativas para la obtención de bacterias de este tipo.. 7.

(9) Capı́tulo 2. Objetivos 2.1.. Objetivo General Experimentación en laboratorio con la(s) bacteria(s) aislada(s) de un suelo de origen calizo, en suelos granulares para determinar el mejoramiento o no de las propiedades intrı́nsecas de los mismos.. 2.2.. Objetivos Especificos Consecuciòn del suelo fuente para aislamiento de la bacteria calcificante. Reaislamiento de la bacteria. Preservaciòn en laboratorio de la bacteria aislada para futuros ensayos con esta. Realizar pruebas con al menos 2 concentraciones de bacterias en las muestras tratadas para observar su comportamiento.. 8.

(10) Capı́tulo 3. Antecedentes 3.1.. Biotecnologı́a. La biotecnologı́a no es, en sı́ misma, una ciencia; es un enfoque multidisciplinario que involucra ciencias como la biologı́a, la bioquı́mica, la genética, la virologı́a, la agronomı́a, la ingenierı́a, la medicina, la veterinaria, entre otras. Hay muchas definiciones para describir la biotecnologı́a. En términos generales la biotecnologı́a es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre. Como tal, la biotecnologı́a ha sido utilizada por este desde los comienzos de la historia en actividades tales como la preparación del pan y de bebidas alcohólicas o el mejoramiento de cultivos y de animales domésticos. Procesos como la producción de cerveza, vino, queso y yogurt implican el uso de bacterias con el fin de convertir un producto natural como leche o jugo de uvas, en un producto de fermentación mas apetecible como el yogurt o el vino. Un ejemplo sencillo es el compostaje, el cual aumenta la fertilidad del suelo permitiendo que microorganismos de suelo descompongan residuos orgánicos. Otras aplicaciones incluyen la producción y uso de vacunas para prevenir enfermedades humanas y animales. Los orı́genes de la biotecnologı́a se remontan a los inicios de la historia de la humanidad. Nuestros ancestros primitivos iniciaron hace alrededor de 10.000 años durante la edad de piedra, la práctica de utilizar organismos vivos y sus productos. Cuando comenzaron a domesticar animales y a cultivar plantas para su alimentación, en vez de depender únicamente de lo que pudiesen cazar o recolectar. La posibilidad que ofrece la ”biotecnologı́a moderna” es que presenta sistemas radicalmente novedosos para alterar o modificar las propiedades genéticas de los organismos en una forma. 9.

(11) 3.1. BIOTECNOLOGÍA. MIC 2006-I-21. totalmente dirigida. Los avances en biotecnologı́a se están moviendo en circulos muy importantes y de gran impacto. La protección y restauración del medioambiente es una de ellas y puede convertirse en un logro prioritario de las ciencias y tecnologı́as. La biotecnologı́a ambiental no es un campo nuevo; la elaboración de compost (compostaje) y las tecnologı́as de aguas residuales son ejemplos conocidos de la ”antigua” biotecnologı́a ambiental. El uso de microorganismos en procesos ambientales viene desde el siglo XIX, aunque esas aplicaciones pueden ser consideradas mas como destreza que como ciencia. Hacia finales de 1950 y principios de 1960, cuando se descubrió la estructura y función de los ácidos nucleicos, se pudo distinguir entre biotecnologı́a tradicional y la de segunda generación, la cual, hace uso de la técnica del DNA recombinante. Actualmente la principal aplicación de la biotecnologı́a ambiental es limpiar o ”remediar” la polución; la limpieza de las aguas residuales fué una de las aplicaciones iniciales, seguida por la purificación del aire y los gases de desecho mediante el uso de biofiltros. La bioremediación se está enfocando hacia el suelo y los residuos sólidos, por lo cual están surgiendo complejas inquietudes e interrogantes tanto cientı́ficas como técnicas, relacionadas con el escaso conocimiento de las interacciones de los organismos entre sı́, y con el suelo. Logros destacados de la nueva biotecnologı́a ambiental incluyen la limpieza de aguas y de suelos contaminados con productos derivados del petroleo. En relación con la lixiviación bacteriana y biominerı́a, los microorganismos han venido usando y liberando minerales en la corteza terrestre desde tiempos geológicamente antiguos. Por largo tiempo las operaciones mineras se han beneficiado de las actividades de estos microorganismos, especialmente de la habilidad de algunas bacterias de solubilizar y lixiviar metales de menas insolubles (rocas mineralizadas). La lixiviación bacteriana está siendo utilizada exitosamente en muchos paı́ses del mundo para recuperar metales de gran variedad de menas. Los principales metales recuperados son cobre y uranio, pero tambiñ se ha obtenido cobalto, nı́quel, zinc, plomo y oro. La biolixiviación ha recibido cada vez mayor atención porque esta tecnologı́a tiene el potencial de aminorar algunos de los problemas que se presentan en la industria minera. Un problema grave es el agotamiento de depósitos minerales, cuya consecuencia es la necesidad de trabajar a mayores profundidades. En muchos casos, es posible utilizar bacterias para lixiviar el mineral deseado de profundidades mayores, sin necesidad de remover los depósitos, con lo cual se ahorran los costos de mover grandes tonelajes de menas y rocas de desecho a la superficie. Muchos procesos industriales han sido transformados en procesos ambientales más ”amigables” mediante el uso de enzimas. Las enzimas son catalizadores biológicos altamente eficientes con nu10.

(12) 3.2. ANTECEDENTES EN EL MUNDO. MIC 2006-I-21. merosas ventajas sobre los catalizadores no biológicos; No son tóxicas y son biodegradables, trabajan mejor a temperaturas moderadas y en condiciones no extremas. Los métodos de producción que utilizan enzimas son generalmente mas limpios y seguros comparados con otros métodos, asimismo son más económicos en energı́a y recursos.. 3.2.. Antecedentes en el mundo. Ismail, H. A. y Joer, M. A. han utilizado una técnica que se basa en introducir una solución quı́mica en la matriz de suelo, mediante mezcla o riego. El método se denomina Sistema de Precipitación In-situ, (CIPS) en ingles; es una nueva tecnologı́a desarrollada por CSIRO. La solución CIPS esta basada en agua no particulada, de baja viscosidad, pH neutro y no tóxica. Esta solución es inyectada permanentemente a través del material poroso, desplazando el fluido existente en los poros. Las reacciones quı́micas ocurren entre los componentes del CIPS y resulta en una precipitación de cristales de calcita en la superficie de los materiales constituyentes. Los cristales de calcita envuelven la superficie de los granos y forman puentes de unión entre ellos, por lo tanto cementan la matriz de suelo e incrementan la resistencia del material. Entre más riegos de la solución se le hagan al suelo, mayor será el grado de concentración. Las caracterı́sticas de los suelos que tomaron para el estudio se resumen en las Tablas 3.1 y 3.2:. Suelo. Tabla 3.1: Propiedades fı́sicas de las muestras de suelos. Gs D10: mm D50: mm %Finos emáx emı́n CaCO3 :. RT. 2.7. 0.170. 0.30. 0.80. 1.231. 0.824. 85. LP. 2.68. 0.130. 0.20. 0.54. 1.310. 0.942. 91. GW. 2.72. 0.014. 0.13. 25.40. 2.317. 1.30. 94. Si. 2.64. 0.320. 0.47. 0.30. 0.755. 0.520. 0. La técnica de preparación empieza con una pluviación de la muestra de arena seca para buscar determinada densidad, a una determinada altura, al interior de una membrana. Figura 3.1 Se inyecta agua desde la parte inferior hacia la parte superior del dispositivo, seguidamente se inyectan los dos componentes A y B de la mezcla CIPS. Rápidamente la mezcla se vuelve densa y. 11.

(13) 3.2. ANTECEDENTES EN EL MUNDO. MIC 2006-I-21. Tabla 3.2: Granulometrı́a de la muestra RT. Tamiz Porcentaje que pasa ( %) No.16. 100. No.20. 97. No.30. 91. No.40. 70. No.50. 50. No.60. 35. No.80. 19. No.100. 1. No.140. 0. el flujo a través de la masa de suelo disminuye. El proceso de riego de la muestra demora aproximadamente diez minutos. La muestra de suelo se deja curando por 24 horas. Lo importante de este método es el control tanto de la densidad como de la cementación de la muestra al momento de perturbar la muestra para sacarla o meterla en el dispositivo. Para la determinación de los parámetros de resistencia al cortante se hicieron Ensayos de Compresión Incofinada y Ensayos Triaxiales consolidados drenados (CD) y consolidados no-drenados (CU). Los ensayos de Compresión Inconfinada se hicieron en muestras totalmente saturadas, en una cámara triaxial con una presión de 500 kPa. Se realizó un estudio microscópico para poder entender el mecanismo de unión entre los granos de suelo, para tal efecto se utilizó un microscopio óptico petrográfico (OPM) y un microscopio de rastreo ambiental (ESEM). Difracción de rayos X (DRX), fué el método que se utilizó para verificar la presencia del agente cementante (carbonato de calcio). Para este fin los componentes A y B se mezclaron a una temperatura constante de 23 ◦ C y se dejaron durante 24 horas. La precipitación fue luego analizada usando DRX y se obtuvieron los siguientes resultados Figura 3.2. La interpretación de los resultados indica que la precipitación est¡a conformada principalmente por Calcita, y por algunas trazas de Vaterita. La Vaterita es una forma cristalina termodinámicamente inestable del carbonato de calcio, la cual tiende a transformarse en una forma más estable de calcita. El Instituto GeoDelft ha realizado ensayos de laboratorio con bacterias aisladas por la investigadora Australiana, Vicky Whiffin,las cuales producen precipitación de calcita. ”Bajo las condi-. 12.

(14) 3.2. ANTECEDENTES EN EL MUNDO. MIC 2006-I-21. Figura 3.1: Dispositivo de inyección ciones correctas, los microbios producen la precipitación del carbonato de calcio CaCO3 logrando el enlace entre los granos de arena pegándolos como lo harı́a el cemento. Esto lleva a la formación de una piedra arenisca, que es similar a la piedra arenisca natural. Figura 3.3. La resistencia del cuerpo de arena depende del número de ”baños”que se le den con las bacterias y nutrientes (en este caso principalmente sales). Durante el primer baño, la formación de calcita alcanzará sólo para unir la superficie de contacto entre los granos. Esto significa que el cuerpo de arena es de muy poca resistencia, ’dice Molendijk. Con el segundo baño la capa de calcita se vuelve más espesa, logrando ası́ un aumento de la resistencia. Después del tercer baño, se han obtenido resultados de resistencia que son similares a los de piedra arenisca natural.” Rodrı́guez y Navarro et al. (2003) , han propuesto el uso de mixobacterias, especificamente Myx13.

(15) 3.2. ANTECEDENTES EN EL MUNDO. MIC 2006-I-21. Figura 3.2: Imágen captada por el DRX ococcus xanthus, capaz de depositar calcita, para el recubrimiento de la piedra porosa ornamental. La actividad metabólica de esta mixobacteria induce la producción de N H3 que incrementa el ph de la solución. El CO2 producido por la bacteria es disuelto y transformado en HCO−3 o CO3−2 . Los carbonatos formados se adhieren a los granos de calcita original formando un cemento. Figura 3.4. La ventaja de la M. xanthus es que no completa su ciclo vital en el cultivo; aunque la bacteria esta viva en el cultivo, en la piedra acaba muriendo. La ganancia de peso induce a pensar que la mayor parte de la precipitación ocurre de 5-10 dı́as. Bachmeier. et al. (2002) , mediante el uso de Bacillus pasteurii,ha relacionado la producción de calcita con la enzima ureasa, responsable de la alcalinización del medio por la producción de amoniaco. Piero Tiano (1999) , ha intentado inducir la precipitación de carbonato cálcico a partir de matrices organicas de macromoléculas (Organic Matrix Macromolecules) , extraı́das del Mytilus hyspanicus.(Molusco). Figura 3.5. Brunella Perito et al. - Giorgio Mastromei del Departamento de Biologı́a animal y genética. 14.

(16) 3.3. ANTECEDENTES EN COLOMBIA. MIC 2006-I-21. Figura 3.3: Vista microscópica de granos de arena unidos por cristales de calcita ’Leo Pardi’de la Universidad de Florencia, Italia; Han estudiado la formación de cristales de calcita con la bacteria Bacillus subtilis para identificar los genes y estructuras celulares que influyen en la biomineralización. Un equipo de la Universidad Pierre y Marie Curie de Parı́s consiguió, gracias a un producto activador, que las bacterias fabricasen carbonato de calcio en laboratorio. Sólo faltaba dejar las probetas y dedicarse a las obras de arte, cosa que hicieron en el Laboratorio de Investigación de los Monumentos Históricos (LRMH) y en la Universidad de Nantes en colaboración con la sociedad Calcite Bioconcept, dueña de la patente francesa depositada en 1989 por la Universidad Curie, después de seleccionar, con la ayuda del Instituto Pasteur, la especie idónea Bacillus Céreus.. 3.3.. Antecedentes en Colombia. En Colombia el tema de la Biotecnologı́a es bastante nuevo y por el cual se esta empezando a mostrar a interés ya que nuestros suelos presentan propiedades bastante pobres en cuanto a resistencia se refiere.. 15.

(17) 3.3. ANTECEDENTES EN COLOMBIA. MIC 2006-I-21. Figura 3.4: Fotografı́as con microscopio electrónico a) control b) bacteria calcificada ”cbc” c) calcita formada ”cc” d) Biofilm (EPS) A. Gómez, A. L. Ramı́rez, O. Echeverri R., N. Santander de la Universidad Nacional de Colombia con sede en Medellı́n, Antioquia se han interesado en este tema y han realizado ensayos de laboratorio preparando medios nutritivos para facilitar el crecimiento de las bacterias calcificantes nativas en el suelo, además de tratamientos con bacterias como Bacillus subtilis y Serratia marcensces en muestras de suelo tomadas en diferentes municipios del departamento de Antioquia. Como resultado de los ensayos de CBR (California Bearing Ratio) aplicados a las muestras concluyeron que este valor aumento para las que fueron tratadas con el medio nutritivo MN y también en las tratadas con las bacterias anteriormente mencionadas.. 16.

(18) 3.3. ANTECEDENTES EN COLOMBIA. MIC 2006-I-21. Figura 3.5: Mecanismo de precipitación de calcita bio-inducida (Piero Tiano). 17.

(19) Capı́tulo 4. Marco Conceptual 4.1.. Estabilización de Suelos. Una de las caracterı́sticas más determinantes de los suelos es su heterogeneidad, pues en unos pocos metros no solo puede haber cambios en las propiedades, sino ademàs en el tipo de suelo también. Muchas veces los suelos en su estado natural no son adecuados para los proyectos de construcción debido a su baja capacidad portante. En estos casos el suelo se denomina inestable. Las causas que generan la inestabilidad de un suelo están ligadas a las propiedades intrı́nsecas de estos, como: Resistencia mecánica de los granos de suelo. Tamaño y forma de las partı́culas. Permeabilidad. Compresibilidad. Estabilidad Volumétrica. Cambiar o alterar las propiedades de un suelo con el fin de obtener un mejor material que pueda soportar los esfuerzos a que va a estar sometido, se conoce como estabilización de suelos. Existen muchos métodos de estabilización cuyo fin principal es el de aumentar esta resistencia; dependiendo del tipo de suelos, encontramos diferentes métodos: compactación mecánica, vibroflotación, precarga, drenajes y adiciones de agentes estabilizantes como el cemento Pórtland,la cal y los cementos asfálticos entre otros, los cuales pueden alcanzar porcentajes importantes en el presupuesto de cualquier obra de ingenierı́a. 18.

(20) 4.2. MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS. 4.2.. MIC 2006-I-21. Morfologı́a y Estructura de las Bacterias. Durante varios siglos, mucho antes de el comienzo de la biologı́a como ciencia, se reconoció que las formas vivas se agrupaban en dos grandes divisiones: animales y plantas. Aún después del descubrimiento de los organismos microscópicos no era fácil distinguir con las técnicas de microscopı́a las bacterias de ciertas células animales o vegetales. El desarrollo de la microscopı́a electrónica, con mayor resolución y amplificación, permitió visualizar los componentes y la estructura fina de todo tipo de células. A partir de estos estudios se reconoció que existe una diferencia fundamental en cuanto al nivel de organización celular y que hay dos tipos celulares básicos. De un lado se encuentran las células eucarióticas, unidades estructurales de los animales y plantas superiores, hongos, protozoos y la mayor parte de las algas; las células eucarióticas se caracterizan por tener un verdadero núcleo, que está rodeado por una membrana celular, y cromosomas que experimentan división mitótica (Por mitosis). Estas células poseen también diversos orgánulos celulares, como retı́culo endoplásmico y aparato Golgi. Menos abundantes en la naturaleza, y bastante mas simples en cuanto a su organización, son las células procarióticas, el tipo celular de bacterias y algas verde-azuladas. En las células procarióticas, las estructuras nucleares no tienen membranas limitantes y no se dividen por mitosis. La célula está rodeada normalmente por una pared celular rı́gida que tiene como único constituyente ácido murámico. Todas las células, eucariotas o procariotas, tienen ciertas similitudes que indican un origen evolutivo común. Todas las células utilizan el mismo código genético, con sus correspondientes mecanismos de replicación, transcripción y traducción del mensaje genético, y muestran homologı́as en la biosı́ntesis de los principales constituyentes celulares. Aunque todavı́a no es posible establecer las relaciones evolutivas precisas entre los dos tipos de células, parece aceptarse que ambos surgieron a partir de una forma ancestral común.. 4.2.1.. Tinción de Bacterias. Las células bacterianas, para poder ser vistas con un microscopio de luz, normalmente se fijan y se tiñen. La célula bacteriana intacta se tiñe fácilmente con colorantes básicos como cristal violeta, azul de metileno y fucsina básica, pero tiñen pobremente con colorantes ácidos como la eosina. En las células viejas se observa a menudo una tinción irregular, con diferenciación de gránulos o áreas teñidas mas intensamente, esto es caracterı́stica de pocas clases de bacterias; pero la mayorı́a de las bacterias se tiñen uniformemente sin diferenciación de la estructura interna, la cual puede demostrarse a menudo en células procedentes de tejidos de mamı́feros. 19.

(21) 4.2. MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS. MIC 2006-I-21. La marcada afinidad por colorantes básicos indica que el protoplasma es ácido y contiene cantidades inusualmente grandes de ácidos nucleicos distribuidos mas o menos uniformemente; los ácidos ribonucleico y desoxirribonucleico constituyen entre 5 % y 30 % del peso seco de las células microbianas. Las reacciones de las células microbianas intactas con estos colorantes simples son extraordinariamente uniformes. Para la diferenciación resultan más útil la reacción a la tinción de Gram y la elevada resistencia a la penetración del colorante y a la decoloración que caracteriza a los bacilos ácido-alcohol resistentes.. 4.2.2.. Tinción de Gram. Este procedimiento de tinción diferencial fue inventado en 1884 por el histólogo Christian Gram como un método para la tinción de bacterias en tejidos. Es un procedimiento que consta de cuatro pasos: 1) Tinción primaria con un colorante trifenilmetano (cristal violeta), el cual contiene normalmente un mordiente que puede ser oxalato amónico; 2) Aplicación yodada diluida(lugol); 3) Decoloración, lo mas utilizado es etanol al 95 %(alcohol acetona); 4) Tinción de contraste, normalmente con safranina o fucsina. Cuando se tiñen bacterias con este método se dividen en dos grupos: Grampositivas y gramnegativas. Las bacterias grampositivas son las que retienen la tinción primaria y aparecen de un color violeta oscuro; las bacterias gramnegativas son las que quedan decoloradas y se tiñen ligeramente por el contraste, rosa en el caso de la sacarina. La reacción grampositiva es relativamente rara en biologı́a; aparece solo en bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Muy pocas estructuras biológicas son grampositivas; en este grupo se incluyen los cromosomas de ciertas especies, mitocondrias, centrosomas y centrómeros. Existen muchas diferencias entre bacterias grampositivas y gramnegativas y la reacción de Gram es de gran importancia para reflejar las diferencias fundamentales entre los dos tipos de bacterias.. 4.2.3.. Morfologı́a de las bacterias. La morfologı́a bacteriana debe considerarse desde dos puntos de vista: 1) Células individuales y grupos de células, según se observen en el microscopio, y 2) Colonias de bacterias que se desarrollan. 20.

(22) 4.2. MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS. MIC 2006-I-21. en medios sólidos apreciables a simple vista y formadas por un número muy grande de células. En primer lugar las diferencias en el tamaño, la forma y ciertos detalles estructurales son caracterı́sticas de los principales grupos de bacterias y proporcionan las bases fundamentales para su estudio sistemático. De igual forma, las colonias bacterianas, compuestas por masas de células individuales, tienen caracterı́sticas de tamaño, consistencia, textura y color, que posee un valor sistemático, pero no tienen la importancia fundamental de la morfologı́a celular.. 4.2.4.. Tamaño de las bacterias. Uno de los aspectos más llamativos de la morfologı́a de los microorganismos es su tamaño extremadamente pequeño. Su orden de tamaño es tal que se miden mas convenientemente en micras o micrómetros y en nanómetros. Aquellas bacterias capaces de tener una existencia metabólicamente independiente y que pueden crecer en medios nutritivos inertes, exhiben una notable variación de tamaño. Existe variación de tamaño de las células bacterianas dentro de algunas especies; esta diferencia no es constante, siendo mayor en las formas bacilares y menor en las esféricas. En el caso de las formas filamentosas e hinchadas, la diferencia del tamaño entre células individuales maduras es mayor. Los lı́mites de tamaño entre las células bacterianas y los virus pueden ilustrarse comparándolos con linfocitos normales, que se encuentran entre las células de mamı́feros más pequeños. Son muchas veces más grandes que las bacterias, como se puede observar por el tamaño de la mayor de las bacterias con gran importancia médica, B. anthracis, y la menor, F. tularensis. Esta última parece representar el tamaño mı́nimo que permite el grado de organización necesario para tener metabolismo y crecimiento independientes, ya que las rikettsias y los virus, más pequeños, son parásitos intracelulares estrictos.. 4.2.5.. Forma de las bacterias. La diferencia mas obvia entre las bacterias es su forma, y hay tres tipos morfológicos generales claramente evidentes. Estos tres tipos son formas esféricas o cocos; formas alargadas o bacilos, y formas espirales, con subtipos de vibrio, espirilo y espiroqueta. Las bacterias esféricas (cocos) son las más homogéneas con respecto a su tamaño y en general, tienen un diámetro de 0.6 a 1.0 µm, a pesar de que se han descrito variedades mayores y mas. 21.

(23) 4.3. PRECIPITACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO. MIC 2006-I-21. pequeñas. La forma no es exactamente esférica siempre; en ciertas especies se han observado formas lanceoladas, como de grano de café, o cocobacilos. Las formas alargadas (bacilos) agrupan una gran variedad de subtipos morfológicos, ya que la mayorı́a de las bacterias alargadas individuales difiere considerablemente entre géneros e incluso entre especies. Las variables morfológicas, incluidas ancho, longitud y forma de los extremos de la célula, proporcionan una considerable heterogeneidad a la forma bacilar. Sin embargo, dentro de cada especie hay una forma determinada relativamente constante, a pesar de que la razón ancholongitud puede variar, debido, en gran parte, a la elongación de las células individuales y, en menor grado, a la división celular. El tercer tipo morfológico principal es la forma espiral, que puede considerarse como un bacilo que se ha torcido y ha adoptado forma de hélice. Los bastones curvados serı́an un intermedio en una escala morfológica, pero no filogenético. Aunque la curvatura de los bastones se observa ocasionalmente en muchas formas bacilares, en el género Vibrio es suficientemente constante como para tener importancia diferencial. Los vibrios pueden parecerse superficialmente a la forma espiral cuando las células permanecen unidas por sus extremos.. 4.3.. Precipitación de Carbonato de Calcio. La precipitación de calcita es un proceso quı́mico mediante el cual los cationes de calcio se unen a iones carbonato para formar carbonato cálcico. En la actualidad se está investigando la influencia que tienen ciertos microorganismos en este proceso, hablándose incluso de precipitación biológica de carbonatos. Esta reacción se produce en medio básico. Es el proceso contrario a la degradación de carbonatos, que está arruinando numerosos monumentos en nuestras ciudades debido a la contaminación atmosférica, y el descenso de ph que provoca. El calcio en el agua puede encontrarse en forma de bicarbonato HCO3− soluble, o de carbonato CO32− más insoluble. El equilibrio entre ambos está influenciado por el CO2 , que al disolverse en el agua forma ácido carbónico H2 CO3 . El pH y los factores que lo modifican, tienen gran influencia, por ejemplo las bacterias. Efectivamente, existen bacterias capaces de aumentar localmente el pH a su alrededor, favoreciendo la precipitación de carbonato cálcico. La fotosı́ntesis en medios acuáticos debe ser el principal proceso que contribuye a la precipitación del carbonato. El Ca se encuentra disuelto en forma de bicarbonato, que se equilibra con el CO2 disuelto: 22.

(24) 4.3. PRECIPITACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO. MIC 2006-I-21. Ca(HCO3 )2 > CaCO3 + H2 O + CO2. (4.1). La fotosı́ntesis, al asimilar el CO2 , hace que el equilibrio se desplace hacia la formación de carbonato1 . Castanier et el al. 1999; Erlich 1998. La precipitación del carbonato de calcio CaCO3 es un fenómeno encontrado comunmente en ambientes como las aguas marinas, aguas dulces, y los suelos. Es un proceso quı́mico algo directo gobernado por cuatro factores dominantes: La concentración de iones calcio Ca2+ La concentración de carbón inorgánico disuelto El pH La disponibilidad de sitios de nucleación (Kile et el al. 2000; Castanier et al. 1999) Diversas especies bacterianas se han detectado y se ha asumido previamente su asociacı́on a las precipitaciones naturales del carbonato en ambientes diversos. El papel primario de las bacterias en el proceso de precipitación se ha atribuido a su capacidad de crear un ambiente alcalino (altos pH y aumento [ DIC ]) con varias actividades fisiológicas (Castanier et el al. 1999; Douglas Y Beveridge 1998). Tabla ??.Aunque la precipitación microbiológica del carbonato, (MCP) en ingles, se ha investigado extensivamente en ambientes naturales y bajo condiciones definidas del laboratorio, los mecanismos exactos de la precipitación y función de este proceso dentro de la ecologı́a microbiana de los organismos precipitadores permanece sin resolver. (Yates y Robbins 1999; Rivadeneyra et al. 1994; Ferrer et al. 1988).. 23.

(25) 4.3. PRECIPITACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO. MIC 2006-I-21. Tabla 4.1: Ej. de mecanismos de precipitacion de carbonato. Especies y ambientes Asoc. (Hammes y Verstraete (2002)) Esp. y mec.. Ambiente. Tipo de Cristal. Ref.. Synechococcus GL24. Lago meromitico. Calcita. Douglas y Beveridge(1998). Nannochloris atomus. Medio BG11. Calcita. Yates y Robbins(1999). Lago hipersalino. Dolomita. Warthmann et al.(2000). Bacillus pasteurii. Deg. de urea en M. sintetico. Calcita. Stocks-Fischer et al.(1999). Bacillus cereus. Reducción de nitratos. Calcita. Castainer et al.(1999). Variovorax spp y Pseudomonas spp. Deg. de urea en M. sintetico. Calcita. Fujita et al.(2000). Vibrio spp. Sintético + mezcla de sal mar. Calcita. Rivadeneyra et al.(1994). Flavobacterium spp. Sint. + mezcla de sal mar. Mg-Calcita. Ferrer et al.(1998). Acinetobacter spp. Sint. + mezcla de sal mar. Mg-Calcita Aragonita. Ferrer et al.(1998). Fotosı́ntesis. Reducción de sulfatos Aislamiento SRB Ciclo del Nitrógeno. Mecanismos no especificados. 24.

(26) Capı́tulo 5. Aislamientos y Ensayos Microbiológicos 5.1.. Aislamiento de la Bacteria Ureolı́tica. En esta fase se procedió a realizar de nuevo el aislamiento de una bacteria relacionada con la precipitación de calcita, ya que la cepa ureasa positiva aislada por el Ing. Cesar Pereira M.Sc desafortunadamente no fué conservada de la manera apropiada y fué desechada. Para ello fué necesario la recolección de nuevas muestras provenientes de la Cantera CIMACO a las afueras de la ciudad de Cartagena de Indias D.T ,de la cuales se habı́a aisladado anteriormente la cepa ureasa positiva del tipo coco bacilo gram-negativo, con la que se pretendia realizar ensayos en suelos Bogotanos. Como se mencionó anteriormente se consiguió traer nuevamente muestras de CIMACO. Figura 5.1.; esta vez el número de muestras ascendió a trece(13); acatando los mismos parametros que habı́a establecido Pereira para la recolección de las muestras. Estos fueron: Tamaño Incrustaciones calizas visibles Muestras de doscientos(200) gr tomadas quince(15) cm de profundidad. Transporte en camara refrigerada y por vı́a aerea. Este último con el fin trasladar las muestras al Laboratorio de Microbiologı́a con la menor cantidad de alteraciones posible.. 25.

(27) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. MIC 2006-I-21. Figura 5.1: Cantera CIMACO Ya en el laboratorio, fueron tomadas porciones de cada una de las muestras y puestas en earlen mayers separados con medio enriquecido B.H.I (Brain Heart Infusion - Infusión Cerebro Corazón), con el fin de lograr que las bacterias alojadas en estas crecieran y se desarrollaran con mayor rapidez. Figura 5.2. Las muestras se dejaron en la incubadora a treinta(30) grados centı́grados durante cinco(5) dı́as al cabo de los cuales todas presentaban turbidez y olor nauseabundo, corroborando ası́ la presencia de bacterias. Figura 5.3. El siguiente paso consistió en realizar pases en medio nutritivo S.P.C (Standard Plate Count) de cada una de las muestras incubadas con medio B.H.I. Figuras 5.4 y 5.5. Estos aislamientos en S.P.C se dejaron en la incubadora durante veinticautro(24) horas al cabo de las cuales, se empezaron a ver colonias de bacterias en todos los S.P.C. Figura 5.6. En los 13 S.P.C se identificaron macroscopicamente cuatro(4) morfotipos distintos, los cuales se pueden observar mejor en la imagen de la Figura 5.7, tomada dieciseis(16) dı́as después de la siembra. Para su escogencia se tuvo en cuenta cuales habian presentado mayor turbidez en el medio 26.

(28) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. MIC 2006-I-21. Figura 5.2: Trece(13) muestras en medio B.H.I B.H.I y además las colonias que se desarrollaron más rapido en los S.P.C en veinticuatro(24) horas. Se realizó el aislamiento de cada uno de los morfotipos en nuevos S.P.C y se dejaron en la incubadora por veinticuatro(24) horas para acelerar su creciemiento. En la Figura 5.8 se observan las siembras de los cuatro (4) morfotipos al 21 de abril de 2005. El siguente paso consistió en realizar las pruebas de degradación de urea a los cuatro(4) morfotipos encontrados. Para ello se tuvo que esterilizar el equipo de filtrado (Figura 5.9) para el agar urea y cuatro(4) tubos de ensayo para garantizar la pureza del agar al momento de realizar la prueba. El medio utilizado para las pruebas fué el agar urea con las especificaciones Difco. Despues de tener listo el agar, con ayuda de una micropipeta se depositaron tres(3) ml del mismo en cada uno de los cuatro(4) tubos de ensayo (Figura 5.10) y se procedió a llevar inóculo de los S.P.C a estos. Las cuatro(4) pruebas se llevaron a la incubadora y a las veiticuatro(24) horas de haber relizado el ensayo, el tubo con el morfotipo tres(3) se tornó color fucsia demostrando ası́ su habilidad de degradar urea. Figura 5.11.. 27.

(29) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. MIC 2006-I-21. Figura 5.3: Incubación de las muestras en B.H.I Para poder observar el morfotipo tres(3) al microscopio fué necesario realizar otro pase en S.P.C y dejarlo incubando otras veinticuatro(24) horas ya que al hacer la placa tomando inóculo directamente del tubo de ensayo no se pudo observar nada debido a la escases de bacterias en el mismo. Pasado el tiempo de incubaciòn del nuevo S.P.C se observaron gran cantidad de bacterias. Figura 5.12. Se procediò a realizar la placa y la tinciòn respectivas para despues llevarla al microscopio. Figuras 5.13 y 5.14. Al ver la placa en el microscopio se pudieron identificar dos estructuras distintas; la primera bacilos cortos y la segunda, una estructura en forma de raqueta , posiblemente pseudomonas, los bacilos se identificaron como grampositivos y las posibles pseudomonas como gramvariables. Figura 5.15. Debido a que se identificaron dos estructuras diferentes, se decidio dejar incubando por veinticuatro(24) horas más el último aislamiento en S.P.C que se habia hecho; esto con el fin de dejar crecer las colonias para poder indentificar macroscopicamente los bacilos y las posibles pseudomonas y realizar nuevos aislamientos de estas en cajas separadas(Figura 5.16). Adicionalmente se hicieron nuevas pruebas de úrea con las colonias de los nuevos S.P.C para las cuales los dos tipos de bacterias dieron positivo. Las bacterias del tubo marcado Ps (Posi-. 28.

(30) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. MIC 2006-I-21. Figura 5.4: Toma de muestras con asa redonda ble Pseudomona) se comportaron de forma lenta (color rojizo), mientras que las Bacterias del tubo B (Bacilos) tuvieron un comportamiento rapido, tornandose totalmente de color fucsia. Figura 5.17. Por ultimo se realizaron las placas y las tinciones de los bacilos y las posibles pseudomonas para observarlas al microscopio. La figura 5.18 muestra los bacilos grampositivos esporulados degradadores de urea aislados.. 29.

(31) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. Figura 5.5: Pase en S.P.C. Figura 5.6: Imagen de las colonias de bacterias en uno de los S.P.C. 30. MIC 2006-I-21.

(32) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. MIC 2006-I-21. Figura 5.7: Imagen de los S.P.C con los cuatro(4) morfotipos escogidos. Figura 5.8: Aislamiento de los cuatro(4) morfotipos en S.P.C distintos. 31.

(33) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. Figura 5.9: Equipo de filtrado para el medio-agar urea. Figura 5.10: Traslado del agar urea a los tubos de ensayo. 32. MIC 2006-I-21.

(34) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. Figura 5.11: Morfotipo tres(3) ureasa positivo. Figura 5.12: Pase tubo urea en S.P.C. 33. MIC 2006-I-21.

(35) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. Figura 5.13: Tinción de Gram. Figura 5.14: Placa morfotipo tres(3). 34. MIC 2006-I-21.

(36) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. Figura 5.15: Imagen mostrando las dos estructuras encontradas. Figura 5.16: S.P.C de Bacilos y Posibles Pseudomonas. 35. MIC 2006-I-21.

(37) 5.1. AISLAMIENTO DE LA BACTERIA UREOLÍTICA. MIC 2006-I-21. Figura 5.17: Resultado positivo del ensayo a las cuarenta y ocho (48) horas de realizado. Figura 5.18: Cocobacilos esporulados grampositivos. 36.

(38) Capı́tulo 6. Ensayos de suelos De acuerdo con las investigaciones realizadas por diferentes autores se ha demostrado que los suelos granulares no cohesivos presentan una mejor respuesta al tratamiento con bacterias que los suelos cohesivos, principalmente por la alta permeabilidad de estos suelos y el tamaño de particula del suelo con relación al tamaño de las bacterias. Debido a que los suelos cohesivos constan de particulas de tamaños del orden de las dos (2) micras y poseen además bajas permeabilidades , para las bacterias que son de tamaño mucho mas grande es casi imposible movilizarse a través del suelo, quedando de esta forma encapsuladas en la matriz de suelo sin posibilidad de producir las reacciones quı́micas que generan la precipitación del carbonato de calcio. En relaciòn con los objetivos y el alcance de la investigación se decidió utilizar para los ensayos de tratamiento con bacterias, un material granular no cohesivo (arena fina). Figura 6.1. Este tipo de arena es muy usado para la preparación de morteros para pañete gracias a su finura. En primer lugar se realizó un ensayo para determinar la gravedad especı́fica de los sólidos Gs de la arena escogida , para el cual se obtuvo un valor de 2.61. Tabla 6.1.. Tabla 6.1: Cálculo de Gs Medida Peso del Picnómetro. 48.9. Peso del Picnómetro + Suelo seco Peso del picnómetro + agua a. 20o C. Peso del picnómetro suelo + agua a Gs. Valor (gr). 20o C. 80.4 168.4 148.9 2.61. 37.

(39) MIC 2006-I-21. Figura 6.1: Arena gravosa (SP) seleccionada para el tratamiento con bacterias A continuación se realizó el ensayo de granulometrı́a(tabla 6.2) por tamizado sin lavado el cual arrojo la curva granulometrica que se muestra en la figura 6.2.. Tabla 6.2: Granulometrı́a del suelo escogido para tratamiento Tamiz % que pasa 4. 100. 8. 99.5. 16. 98.9. 30. 96.61. 50. 64.57. 100. 15.93. 200. 3.59. Los parámetros encontrados en los ensayos de limites de Atterberg y granulométrico que se hicieron en el laboratorio para esta arena se resumen en la tabla 6.3. Con estos parametros se clasifico el suelo a tratar como una arena gravosa mal gradada (SP) segun el sistema de clasificación de suelos USCS.. 38.

(40) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.2: Curva granulométrica del suelo escogido para tratamiento. 6.1.. Ensayos de compresión edométrica. Al suelo seleccionado se le realizaron ensayos de compresión edométrica en seco, con ciclos de carga, descarga y recarga ( 50 kPa 100 kPa 200 kPa 400 kPa 800 kPa 1600 kPa 800 kPa 400 kPa 200 kPa 100 kPa 200 kPa 400 kPa 800 kPa 1600 kPa ) en su estado natural para determinar diferentes propiedades como son el coeficiente de compresibilidad volumétrica (mv ,) los ı́ndices de compresión y recompresión , el modulo de young (E ) y la relación de vacı́os inicial eo y final ef y compararlos con los parámetros obtenidos después realizar los mismos ensayos pero reemplazando el liquido de compactación con un medio nutritivo de precipitación rico en fuentes de carbonatos y calcio y a su vez con la bacteria aislada previamente para analizar el mejoramiento de las propiedades antes mencionadas despues del tratamiento. Adicionalmente se hicieron ensayos de compresión con el suelo mezclado solo con el medio nutritivo para tener más parámetros de comparación. Cabe recordar la diferencia entre medios de cultivo, que son aquellos que permiten el crecimiento bacteriano y los medios de precipitación, que son aquellos que crean unas condiciones favorables para inducir la precipitación de carbonato de calcio. El medio de precipitación utilizado en los ensayos de compresión que se hicieron se describe en la tabla 6.4. De esta forma, se realizaron dos series de ensayos; en la primera se prepararon y compactaron. 39.

(41) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Tabla 6.3: Parámetros encontrados para el suelo escogido para tratamiento Parámetro Valor IP. -. LL. -. LP. -. D60. 0.28. D30. 0.19. D10. 0.13. Cu. 2.15. Cc. 0.99. % de finos. 3.54. Tabla 6.4: Composición del medio nutritivo de precipitación utilizado en el tratamiento Componente Cantidad Caldo nutritivo deshidratado. 3 g/L. Cloruro de Calcio CaCl2. 25 mM. Bicarbonato de Sodio N aHCO3. 25 mM. Urea. 333 mM. 3 muestras diferentes reemplazando cada vez el lı́quido de compactación por medio nutritivo y por medio nutritivo con bacterias suspendidas como se mencionó anteriormente. Figura 6.3. En esta primera prueba la muestra con bacterias tuvo un titulo o concentración bacteriana de 48x109 UFC/ml (unidades formadoras de colonia por ml) y cada muestra se preparó controlando la humedad en el 20 %. Estas muestras se dejaron secar durante 20 dı́as con el fin de darle tiempo a las bacterias de actuar en el suelo, luego se procedió a ensayarlas. Las figuras 6.4 a la 6.5 muestran las diferentes curvas que representan el comportamiento a la compresión de la muestra de suelo natural. Las figuras 6.6 a la 6.7 muestran el comportamiento a la compresiòn de la muestra tratada solo con el medio nutritivo de precipitaciòn y por ultimo las figuras 6.8 a la 6.9 muestran el comportamiento a la compresiòn de la muestra tratada con la bacteria aislada previamente más el medio nutritivo de precipitaciòn. En la tabla 6.5 se muestra un resumen de los parámetros encontrados para cada ensayo. Para la segunda prueba se prepararon las muestras con solo el 10 % de humedad y esta vez en la muestra con bacterias se trabajo una concentración o titulo menor el cual fue de 80x108 UCF/ml.. 40.

(42) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.3: Muestras de suelo tratado con bacterias y medio nutritivo. Figura 6.4: Relación de vacios vs P(kPa) - muestra de suelo natural; 20 % humedad. 41.

(43) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.5: Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra de suelo natural; 20 % humedad. Figura 6.6: Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 20 % humedad. 42.

(44) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.7: Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 20 % humedad. Figura 6.8: Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 20 % humedad 43.

(45) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.9: Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 20 % humedad. Tabla 6.5: Resultados de los ensayos de compresión edométrica. Titulo 48x109 UFC/ml y humedad 20 % Parámetro. Natural. Medio. Bacteria. mv. 1,28x10−3. 1,34x10−3. 1,05x10−3. E(MPa). 75. 73. 93. Cc. 0.059. 0.063. 0.049. Cs. 0.026. 0.0099. 0.0066. eo. 0.750. 0.700. 0.702. ef. 0.673. 0.623. 0.623. ∆e. 0.077. 0.074. 0.079. 44.

(46) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Tabla 6.6: Resultados de los ensayos de compresión edométrica. Titulo 80x108 UFC/ml y humedad 10 % Parámetro. Natural. Medio. Bacteria. mv. 1,28x10−3. 1,29x10−3. 1,14x10−3. E(MPa). 75. 75. 85. Cc. 0.059. 0.060. 0.053. Cs. 0.026. 0.0099. 0.0099. eo. 0.750. 0.740. 0.740. ef. 0.673. 0.658. 0.667. ∆e. 0.077. 0.082. 0.073. Las figuras 6.10 a la 6.15 muestran los diferentes comportamientos a la compresiòn para los 3 tipos de muestras preparadas. En la tabla 6.6 se muestran los parametros encontrados en la segunda serie de ensayos. Como se puede ver en los dos ensayos, los resultados favorecen a las muestras de suelo tratadas con la bacteria que se aislò en la primera parte de la investigación, ya que para relaciones de vacı́os iniciales similares en los ensayos de compresión se encontraron, en ambos casos, coeficientes de compresibilidad volumétrica menores y por consiguiente módulos de elasticidad mayores. También se puede observar una disminución de los ı́ndices de compresión y recompresión, lo que demuestra la rigidización y mejoramiento de las propiedades del suelo. Para las muestras tratadas solo con medio nutritivo no se presentaron cambios en ninguno de los parámetros encontrados en los ensayos de compresión. Adicionalmente se llevó un control diario de la medida del pH (figura 6.16) en el suelo para conocer sus condiciones de acidez o alcalinidad y verificar el cambio producido en este al ser tratado con el medio nutritivo y las bacterias. Los resultados arrojaron una tendencia de las muestras a aumentar el pH del suelo y mantener las condiciones alcalinas lo cual es beneficioso para la precipitación del carbonato de calcio.. 45.

(47) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.10: Relación de vacios vs P(kPa) - muestra de suelo natural; 10 % humedad. Figura 6.11: Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra de suelo natural; 10 % humedad. 46.

(48) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.12: Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 10 % humedad. Figura 6.13: Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con medio nutritivo; 10 % humedad. 47.

(49) 6.1. ENSAYOS DE COMPRESIÓN EDOMÉTRICA. MIC 2006-I-21. Figura 6.14: Relación de vacios vs P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 10 % humedad. Figura 6.15: Relación de vacios vs Log P(kPa) - muestra tratada con bacteria y medio nutritivo; 10 % humedad 48.

(50) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). MIC 2006-I-21. Figura 6.16: Variación del pH para el suelo tratado con medio nutritivo y bacterias.. 6.2.. Ensayos triaxiales consolidados - no drenados ( CU ). Para los ensayos triaxiales CU se procediò de igual forma que para lo ensayos de compresiòn edomètrica; de esta forma se prepararon muestras de 320 gr en moldes cilı̀ndricos de 5 cm de diametro por 10 de alto y se compactaron con un 20 % de humedad. Figura 6.17 Solo se prepararon muestras de suelo natural y muestras de suelo tratadas con medio nutritivo y la bacteria aislada previamente (figura 6.18) ya que como se pudo observar en la seccion 6.1 no ocurriò ninguna mejora en los parametros para los ensayos de compresiòn edomètrica para el suelo tratado solo con el medio nutritivo de precipitaciòn; esto debido a que muy probablemente el suelo seleccionado no posee bacterias calcificates nativas que hallan podido mejorar los parametros del suelo en los anteriores ensayos. Se trabajò unicamente con un titulo de 80x108 UFC/ml para las muestras tratadas con bacteria ya que debido a problemas de las camaras triaxiales y problemas de montaje se perdieron las muestras con titulo de 48x109 UFC/ml y fuè imposible repetir estos ensayos. Pasados 3 dias de armadas las muestras se pudo notar un olor fuerte muy parecido al amoniaco lo cual diò expectativas de que la bacteria estaba actuando el suelo alcalinizandolo favoreciendo el crecimiento de las bacterias y la precipitaciòn de carbonato de calcio. Este olor se mantuvo hasta mas o menos 10 dias despues de haberle adicionado las bacterias al suelo. Adicionalmente durannte 49.

(51) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). MIC 2006-I-21. Figura 6.17: Preparaciòn de muestras para ensayos triaxiales los dias de fraguado se pudo observar que las muestras tratadas con bacteria presentaron menos desprendimiento al tacto, de particulas de suelo que las muestras que se compactaron solo con agua. Cada una de las muestras se dejò fraguando en total por 20 dias con el fin de darle tiempo a las bacterias de actuar en el suelo. Se presentò una varianza de mas o menos 3 diàs debido a problemas de disponibilidad de las camaras triaxiales en el laboratorio de geotecnia del CITEC. En total se hicieron dos triaxiales completos (3 puntos) con presiones de camara de 50 kPa, 100 kPa y 200 kPa ; el primero para conocer las propiedades naturales del suelo (Cohesion y Angulo de fricciòn) y el segundo para conocer la variaciòn de estos parametros despuès del tratamiento con la bacteria y el medio nutritivo.. 6.2.1.. Suelo natural. En esta secciòn se muestran los resultados obtenidos en los ensayos triaxiales realizado a las muestras de suelo natural. La figura 6.19 muestra la grafica de esfuerzo (σ) contra deformaciòn unitaria (), en esfuerzos efectivos. Cabe anotar que por los problemas que se tuvieron con las muestras. 50.

(52) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). MIC 2006-I-21. Figura 6.18: Muestras para ensayos triaxiales a los 20 dias de tratamiento- Arriba: Suelo natural, Abajo: Suelo con bacteria ensayadas a una presion de camara de 100 kPa estos no se tuvieron en cuenta. En la tabla 6.7 se presentan los valores de los esfuerzos desviadores máximos efectivos que se encontraron para presiones de càmara de 50 kPa y 200 kPa fallando las muestras a velocidad de norma (0.00833 mm/min). En la figura 6.20 se presentan los circulos de Mohr en esfuerzos efectivos para las muestras de suelo natural, a su vez la tabla 6.8 muestra los parametros efectivos de ángulo de fricciòn (φ) y cohesion (c) calculados con la linea φ y la linea K.. 6.2.2.. Suelo con bacteria. Al igual que en la secciòn anterior, a continuaciòn se muestran los resultados obtenidos en los ensayo triaxiales realizados a las muestras de suelo tratado con bacteria. La figura 6.21 muestra la grafica de esfuerzo (σ) contra deformaciòn unitaria (), en esfuerzos efectivos. Igualmente, no se tuvieron en cuenta las muestras ensayadas a una presion de camara de 100 kPa. En la tabla 6.9 se presentan los valores de los esfuerzos desviadores máximos efectivos que se encontraron para presiones de càmara de 50 kPa y 200 kPa fallando las muestras tratadas con bacteria tambien a velocidad de norma (0.00833 mm/min). La figura 6.22 muestra los circulos de Mohr en esfuerzos efectivos para las muestras de suelo 51.

(53) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). Tabla 6.7: Esfuerzos maximos desviadores (efectivos) - suelo natural Presiòn de Cámara (kPa). Esfuerzo efectivo(kPa). 50. 580. 200. 960. Figura 6.20: Circulos de Mohr esfuerzos efectivos - suelo natural 52. MIC 2006-I-21.

(54) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). MIC 2006-I-21. Tabla 6.8: Valores de φ y c p efectivos - suelo natural Parámetro Valor (o /kPa) Lı́nea φ φ´. 36. c´. 93.5. Lı́nea K φ´. 30. c´. 107. tratado con bacteria, a su vez la tabla 6.10 muestra los parametros efectivos de ángulo de fricciòn (φ) y cohesion (c) calculados con la linea φ y la linea K. Al comparar los valores de cohesiòn(c) y angulo de fricciòn (φ) de las tablas 6.8 y 6.10 encontramos que no hubo aumento, ni mejora de estos parametros en las muestras tratadas con la bacteria aislada como se esperaba. Para los dos casos ensayados se encontraron valores similares e inclusive menores que los del suelo natural; esto debido a la no homegeneidad entre muestras al ser remoldeadas y su rudimentaria fabricaciòn; adicionalmente se encontraron valores de cohesiòn (c) aparente altos debido a que fuè muy dificil alcanzar una saturaciòn total al momento de ensayar las muestras. Lo mas probable es que el cementante producido por las bacterias sea sensible al agua de saturaciòn en esta primera etapa de tratamiento y debido a esto no se halla presentado mejora en los paràmetros.. 53.

(55) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). Tabla 6.9: Esfuerzos maximos desviadores (efectivos) - suelo bacteria Presiòn de Cámara (kPa). Esfuerzo efectivo(kPa). 50. 424. 200. 790. Tabla 6.10: Valores de φ y c p efectivos - suelo bacteria Parámetro Valor (o /kPa) Lı́nea φ φ´. 33. c´. 80. Lı́nea K φ´. 25. c´. 97. 54. MIC 2006-I-21.

(56) 6.2. ENSAYOS TRIAXIALES CONSOLIDADOS - NO DRENADOS ( CU ). Figura 6.22: Circulos de Mohr esfuerzos efectivos - suelo bacteria. 55. MIC 2006-I-21.

(57) Capı́tulo 7. Conclusiones y recomendaciones Las caracterı́sticas formuladas para la selección de la fuente natural y el tratamiento con medio nutritivo B.H.I que se le realizó a este para hacer los aisla-mientos fueron satisfactorias, ya que otro tipo de bacteria del tipo ureasa positivo se logró aislar para realizar futuros ensayos con esta. Cuatro (4) morfotipos distintos fueron encontrados en 13 S.P.C que se sembraron; solo uno dio ureasa positivo. Observando la placa del morfotipo tres (3) al microscopio, dos tipos de estructuras diferentes fueron encontrados; cocobacilos grampositivos y pseudomonas gramvariables. Al realizar las pruebas de urea para las dos estructuras encontradas se determinó una mayor velocidad por parte de los cocobacilos que las pseudomonas en el proceso de degradación de esta. El tratamiento con medio nutritivo (B.H.I) que se hizo en las muestras antes de realizar los pases en los S.P.C fué satisfactorio ya que se pudo aislar otro tipo de bacteria adicional al que se obtuvo en la anterior investigación. Los resultados obtenidos de los ensayos de compresión edométrica demostraron un aumento de la rigidez del suelo en un 25 % para una concentración de bacterias de 48x109 UFC/ml, mientras que para una concentración de 80x108 UCF /ml el aumento de la rigidez fue del 13 % a los 20 dı́as de hacer el tratamiento. Los anteriores resultados son esperazadores ya que abren un camino para seguir la experimentacòn mas profunda con las bacterias aisladas en el transcurso de la presente investigación.. 56.

(58) MIC 2006-I-21. Comparando los resultados de los ensayos triaxiales para las muestras de suelo natural y las muestras tratadas con bacteria no se observò mejoria en la cohesiòn (c) ni en el àngulo fricciòn (φ); al contrario de lo que se esperaba se encontaron valores un poco menores para una concentraciòn de bacterias de 80x108 despues de 20 dias de fraguado; lo màs probable es que las muestras al ser remoldeadas y tambièn debido a su fabricaciòn rudimentaria no se hayan comportado de igual forma para el suelo natural que para el suelo tratado con la bacteria. Lo màs recomendable serı̀a realizar varias etapas de tratamiento (baños como dice Molendijk) con el medio nutrivo y la bacteria aislada a una mayor concentraciòn durante el tiempo de fraguado, para de esta forma lograr una cementaciòn relevante y que se pueda demostrar en los ensayos triaxiales el aumento de la cohesion. Aun mejor serı̀a practicar el tratamiento en muestras de suelo inalteradas tomadas de bases y subbases de pavimentos de la ciudad de Bogotá. Tambièn es aconsejable realizar una caracterización quı́mica y una verificaciòn microscópica que determine la formación de carbonatos, calcio, magnesio y potasio en el suelo tratado con la bacteria para cuantificar ası́ la interacción suelo-bacteria. En el futuro se espera tener caracterizado el comportamiento de la bacteria en diferentes curvas como las que se muestran en la figura 7.1. Figura 7.1: En el futuro... Al momento de escribir este documento se estaba practicando la secuenciación de ADN de la bacteria que se utilizò para el tratamiento para identificarla y conocer todas sus caracteristicas.. 57.

(59) Referencias Atlas RM y R Bartha, 2002. Ecologı́a Microbiana y Microbiologı́a Ambiental. 4a Ed. Addison Wesley, pp 442-443 Bachmeier KL, Williams AE, Warmington JR, and SS Bang, 2002. Urease activity in microbiologically-induced calcite precipitation. J Biotechnol. 93(2):171-81. Brunella Perito Giorgio Mastromei. Conservation of monumental stones by bacterial biomineralization.Microbiology Today vol 30/aug 03 Castanier, S., G. Le Métayer-Levrel, G. Orial, J. F. Loubière, and J. P. Perthuisot. 2000. Bacterial carbonatogenesis and applications to preservation and restoration of historic property, p. 201-216. Freeman, Bob. A., Microbiologı́a de Burrows. Interamericana - McGraw Hill. 1989. Pág. 19 - 62 Ismail, H. A. , Joer, M. A., Randolph, M. F., Cementation of popous material using calcite. 2002. Geotechnique 52. No. 5, 313 - 324. O. Ciferri, P. Tiano, and G. Mastromei (ed.), Of microbes and art: the role of microbial communities in the degradation and protection of cultural heritage. Plenum, New York, N.Y. O. Echeverri y N. Santander. Aplicación de biotecnologı́a para la estabilización de suelos de subrasante. Universidad Nacional, Medellı́n, Colombia. Pereira. C. E. Mejoramiento de las propiedades mecánicas del suelo mediante bacterias.. 58.

(60) REFERENCIAS. MIC 2006-I-21. Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia. 2004. Revolution in Geotechnics Bacteria Build Biodikes. Geodelft www.geodelft.nl. 2004. Rodrı́guez-Navarro C, Rodrı́guez-Gallego M, Ben Chekroun K, and MTGonzález-Muñoz, 2003. Conservation of ornamental stone by Myxococcus xanthus-induced carbonate biomineralization. Appl Environ Microbiol. Tiano, P., Biagiotti, L.. Mastromei.1999. Bacterial biomediated calcite precipitation for. monumental stones conservation: methods of evaluation. J Microbiol Methods 36, 139-145.. 59.

(61)