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Selección y caracterización de cepas de enterococcus aisladas a partir de un queso ahumado andino

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Academic year: 2020

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(1)UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA LAB. DE BIOTECNOLOGÍA DE MICROORGANISMOS “SIXTO DAVID ROJO”. SELECCION Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE ENTEROCOCCUS AISLADAS A PARTIR DE UN QUESO AHUMADO ANDINO. TRABAJO ESPECIAL DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE LICENCADA EN BIOLOGÍA. REALIZADO POR LA BACHILLER MARÍA ELISA RODRÍGUEZ RIANII TUTOR: GUILLERMO LÓPEZ CORCUERA Mérida, Septiembre,2001.

(2)

(3) Indice. Pág. Agradecimientos....................................................................................................III Resumen...............................................................................................................IV Abstract...................................................................................................................V I.Introducción...........................................................................................................1 II. Hipótesis.............................................................................................................8 Objetivos..............................................................................................................9 III. Materiales y métodos. III.1Selección del queso ahumado artesanal.......................................................10 III.2 Aislamiento de bacterias Ácido lácticas.......................................................11 III.3 Identificación del género Enterococcus........................................................12 III.4 Caracterización de las cepas aisladas III.4.1 Capacidad acidificadora............................................................................14 III.4.2 Selección de cepas aisladas................................................................,...14 III.4.3 Compatibilidad entre cepas......................................................................14 III.4.4 Preparación de las mezclas.....................................................................15 III.5 Elaboración de los quesos..........................................................................15 III.6 Análisis sensorial........................................................................................16 IV. Resultados y discusiones IV.1 Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas............................18.

(4) I IV.2 Caracterización de cepas de Enterococcus IV.2.1 Capacidad acidificadora......................................................................... 22 IV.2.2 Selección de cepas.................................................................................24 IV.2.3 Compatibilidad entre cepas y preparación de mezclas de Cepas...............................................................................................................24 IV.3 Análisis sensorial......................................................................................26 V Conclusiones................................................................................................28 VI Anexos........................................................................................................29 VII Bibliografía.................................................................................................33..

(5) II. Agradecimentos A DIOS, en primer lugar por ser la luz que nos guía Al profesor Guillermo Lopez Corcuera que además de ser mi tutor, fue mi maestro y mi amigo; por estar siempre dispuesto a ayudarme, por su apoyo y por su buen animo en todo momento. Al Laboratorio de biotecnología de microorganismos “Sixto David Rojo” por permitir realizar mi trabajo en sus instalaciones y bajo su financiamiento. Al profesor Otoniel Rojas por estar siempre dispuesto darme su colaboración durante el desarrollo de este trabajo. Al profesor Zarack Chacón por su colaboración en este trabajo. Al profesor Ramón Moreno por su colaboración y recomendaciones durante el desarrollo de este trabajo. Al profesor Valmore Guerrero por su colaboración en este trabajo. A mis compañeros de laboratorio muy especialmente a mis dos grandes amigas Ingrid y Soveida. A Carmen Alvarado por toda su ayuda la cual fue de gran valor en este trabajo. A la Nena y Pedro Elias (mis padres), por todo su apoyo, por todo su amor y por creer en mi. A Fabio, por su apoyo y ayuda incondicional y por confiar en mi. A Martha y Felipe, por su apoyo y que ojala les sirva de ejemplo para que alcancen sus metas. A María Fernanda por ser una de mis fuentes de inspiración y Claribeth por creer en mis logros. A la señora Otilia que muy amablemente nos dio la oportunidad de trabajar con el queso que elabora artesanalmente y por toda su colaboración. A todos aquellos de alguna u otra forma colaboro en este trabajo..

(6) III. Resumen. A partir de un queso ahumado andino, fueron aisladas quince cepas del género Enterococcus, las cuales se sometieron a distintas pruebas de identificación especificas para el género, seleccionando siete cepas que cumplían con las características del género de interés. De estas siete se escogieron cuatro cepas que fueron. sometidas a pruebas de caracterización como capacidad. acidificadora y compatibilidad entre las cepas aisladas en este trabajo y cepas de Lactococo y Lactobacilos aisladas en trabajo anterior. La finalidad del aislamiento y la caracterización fue su posterior uso como cultivo iniciador en la elaboración de un queso fresco elaborado con leche pasteurizada y bajo condiciones controladas pero con la metodología artesanal, cumpliendo con el objetivo de obtener un producto tan bueno en cuanto a características organolépticas como el queso artesanal pero con los beneficios higiénicos de la leche pasteurizada y una flora bacteriana conocida..

(7) IV. Abstract Starting from an andino smoked cheese fifteen strains were isolated of the genus Enterococcus, which underwent different identification tests specify for genus, selecting seven strains that fulfilled the characteristics. Four strains were chosen and were subjected to tests of characterization (acidification activity and strains compatibility). The purpose was the use like starters for elaboration of a fresh cheese maufactured with pasteurized milk with artisan methodology. The objective was completed of obtaining such a good product as the artisan one, but with the hygienic benefits of the pasteurized milk ..

(8) Introducción. El queso es el producto, fermentado o no, constituido esencialmente por la caseína de la leche, en forma de gel más o menos deshidratado que retiene casi toda la materia grasa, si se trata de queso graso, un poco de lactosa en forma de ácido láctico y una fracción variable de sustancias minerales (Veisseyre, 1980).. La fabricación del queso se remonta a épocas muy antiguas, quizás es uno de los primeros alimentos fermentados de la humanidad. Según hallazgos arqueológicos la aparición del queso ocurre en una rica zona agrícola situada entre los ríos Eufrates. y Tigris en Irak. (6.000-. 7.000 a.C.).Este se realizaba de leche de vaca y de cabra (Robinson, R.K.,1998). Existen otras evidencias que datan de 3000 a.C. por ejemplo un friso de El-Ubaid de los sumerios dibuja una rutina de ordeño y cuajado de la leche, también se encontraron en la tumba de Horeis-Aha restos de 1.

(9) materiales utilizados en la fabricación del queso y se han descubiertos numerosos utensilios rupestres para la fabricación de queso en diversas partes del mundo (África, Asia y Europa) que datan de 3000 años a. C.(De Roissart,H. , and Luquet, F. 1994).. Probablemente el descubrimiento de los alimentos fermentados como el queso surgió debido a que las tribus nómadas primitivas transportaban la leche en sacos hechos de tejido animal 1983), brindando las condiciones fermentación. (Chapman H. Y Sharpe M.,. óptimas para llevarse a cabo la. de la leche dando un producto con. característica. distinta y más duradero.. La fermentación ocurre debido a la acción de. microorganismos. presentes como flora natural en los alimentos crudos (leche cruda) (Cuesta, 1996), estos microorganismos medio como los azúcares y. extraen las componentes del. las grasas transformandolos. en otros. distintos; Como ejemplo las bacterias ácido lácticas (BAL) transforman la lactosa de la leche en ácido láctico, produciendo un descenso del pH de esta, y en consecuencia la coagulación ácida de la leche. 2.

(10) La preparación de quesos es de origen doméstico y se desarrolla a un nivel artesanal entre los siglos XII y XIII. En el siglo XIX comienza a desarrollarse la industrialización del producto (De Roissart ,H. and luquet, F. ,1994) y el uso de cultivos bacterianos iniciadores a raíz del desarrollo de la técnicade la pasteurización. Pasteur en 1857 demostró que la fermentación era de origen microbiana, anterior a este hallazgo se ignoraba la causa por la cual la leche se transformaba en productos. con sabor, olor y texturas tan distintas a las de la leche.. A través de la historia cada sitio fue amoldando esta práctica de acuerdo a sus necesidades y costumbres, se establecieron variaciones. en la. preparación y los quesos fueron llamados de acuerdo a su lugar de origen, de esta forma. surgieron. las. diferentes variedades que se. conocen hoy (Alvarado, C., 2000).. A pesar que hace ya. bastante tiempo se desarrollaron técnicas que. permitieron elaborar productos fermentados como el queso bajo estrictas normas de sanidad y siguiendo un patrón. de fabricación, existen. muchas fábricas artesanales de quesos en donde. el producto. es. elaborado con leche cruda aprovechando la flora bacteriana de la leche. 3.

(11) Entre ellos se encuentra el queso ahumado el cual es elaborado artesanalmente en los páramos andinos, este producto es fabricado siguiendo una tradición que se realiza desde tiempos antiguos en esta región y posiblemente surgió por la necesidad de conservar mayor tiempo el queso, ya que para la época y aún en algunas zonas no se cuenta con disponibilidad de servicios y el acceso es bastante difícil.. El queso ahumado se elabora en zonas altas del estado Mérida y se realiza con leche cruda y un procedimiento artesanal que incluye el a ahumado en el fogón de leña (Alvarado,C., 2000).. Existen pocos. estudios sobre el queso Ahumado Andino,. Alvarado elaboró su trabajo especial de grado para. obtener la. Licenciatura en Biología sobre este queso. A partir de un queso elaborado artesanalmente en el páramo Merideño aisló y caracterizó 10 cepas pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Lactococcus, considerados ambas bacterias ácido lácticas (BAL); el fin de clasificar estas bacterias. fue su posterior uso como cultivo iniciador. elaboración de un queso ahumado, con la. en la. metodología usada. por los productores pero con leche pasteurizada y en las condiciones de laboratorio, luego mediante la degustación de los quesos. 4.

(12) elaborados con las cepas. aisladas y comparar sus características. organolépticas con el queso. artesanal, a través del tratamiento. estadístico. se logro determinar que los quesos. correspondiente. estudiados presentaban un alto grado de similaridad.. Además de los géneros ya mencionados en el análisis microbiano de las muestras del queso artesanal se registró una variada flora bacteriana entre los cuales se encontraba el género Enterococcus.. Los Enterococcus, son bacterias gram positivas, se conocen 19 especies en la actualidad (Cuesta E.,1996), arreglo. simple o. en. pareja,. con morfología de cocos, anaerobios. de. facultativos , de. metabolismo homofermentativo ya que extraen la lactosa de la leche y la transforman en ácido láctico L (+) únicamente, sin la producción de otro metabolito o gas(De Roissart, H. and Luquet F., 1994). Además este género posee las siguientes características:. 5.

(13) Catalasa negativo, poseen la capacidad de crecer en un rango de temperatura de 10º C hasta 45º C, siendo su temperatura óptima. de. crecimiento 37º C; crecen en presencia de 6.5% de NaCl y en un medio con pH 9.6; Otra característica distintiva del género es la capacidad de hidrolizar la esculina.. Las especies más comunes encontradas en los quesos son: Enterococcus. durans,. Enterococcus faecalis y. Enterococcus. faecium.(Cuesta,1996). Los Enterococcus son considerado como (BAL), pero como las especies más comunes se encuentran en el intestino humano y. de. animales. domésticos muchas veces se asocia con contaminación fecal en los alimentos. (Satyendra K . and col.,1991),. razón por la. Alvarado en su trabajo los deja de lado. A pesar de esto Enterococcus juegan un papel muy importante en la manufactura. cual los de. productos lácteos, como cultivo iniciador, dando al queso un particular sabor ácido. En la industria lechera representan un gran valor económico ya que se ha demostrado que son altamente resistentes a los ataques 6.

(14) de bacteriófagos los cuales. afectan la actividad fermentativa. ocasionando perdidas económicas en la industria lechera, (Cabrera, y col., 2000).. La finalidad de la presente investigación es aislar y caracterizar las bacterias del genero Enterococcus y utilizarlas como parte de un cultivo iniciador, para la fabricación del queso ahumado junto con las BAL aisladas anteriormente. observando que. nuevas. características. organolépticas introducen este género al queso, siendo el. punto de. mayor interés el logro de un producto igual al tradicional desde el punto de vista organoléptico, pero con los beneficios higiénicos de la leche pasteurizada.. Posteriormente un panel de degustación debidamente. entrenado. determinara el grado de similitud mediante un análisis sensorial de pruebas discriminativas, triangulares, las cuales pongan en evidencia la existencia o no de diferencia entre los productos (Albalat,P. 2000). 7.

(15) Hipótesis. Al agregar a la leche pasteurizada como cultivo iniciador para la fermentación láctica,. bacterias del género Enterococcus junto con. bacterias de los géneros Lactococcus y Lactobacillus podríamos obtener un. queso con. características. similares al. artesanalmente en el páramo Merideño.. 8. queso. elaborado.

(16) Objetivos. 1- Aislar bacterias del género Enterococcus de un queso Ahumado Andino. 2- Caracterizar las cepas, seleccionando las que posean cualidades de cultivo iniciador. 3- Elaborar queso fresco siguiendo la metodología tradicional pero usando leche pasteurizada, agregando las cepas aisladas y otras pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Lactococcus (aisladas también de muestras de queso Ahumado Andino) como cultivos iniciadores. 4- Realización de análisis sensorial a fin de comparar el queso fresco realizado en el laboratorio con el elaborado artesanalmente.. 9.

(17) Materiales y Métodos. III. 1. Selección del queso Ahumado. Se seleccionó un queso ahumado elaborado en la zona del páramo de Mucubají, Estado Mérida. Este queso. ha. sido. objeto de. anteriores en el cual se tomaron en cuenta las. estudio. en trabajos. siguientes características:. “ahumado moderado con sabor y aroma ligeramente a humo, textura suave de la corteza, pasta suave y poco salada” (Alvarado,C., 2000). III.2. Aislamiento de bacterias ácido lácticas: Se tomó estérilmente una muestra de 10 g de la parte central del queso, luego de eliminar la corteza y empleando una licuadora se homogeneizó con 90 ml de agua peptonada estéril al 0.1% p/v. De esta suspensión se hicieron diluciones hasta 10-7, de cada una de las diluciones se sembraron 100 µl en los diferentes medios selectivos para aislar los géneros de interés.(Cuesta,1996). Los medios usados fueron: Agar MRS para Lactobacillus (Himedia), ( De Man y Sharpe,1960). Agar Elliker para Lactococcus (Himedia), (Elliker y col. 1956). Los medios sembrados se incubaron por 48 h a 30ºC. 10 Agar PCA para recuento de gérmenes viables mesófilos (HiMedia) , se incubó por 72 h a 30ºC..

(18) Agar para Leuconostoc. (HiMedia), se incubó por 72 horas a 21ºC. Agar KF para Enterococcus (HiMedia) se incubó durante 48 horas a 37 º C. Pasado el tiempo de incubación se realizó un conteo en aquellas diluciones que tenían entre 100 y 300 colonias obteniéndose un estimado de la población de microorganismos en estudio presentes en el queso. Se seleccionaron de la dilución 10-5 del medio KF 15 colonias aisladas a las que se les realizaron las pruebas de identificación.. III.3. Identificación del género Enterococcus: Para determinar que cepas pertenecían al género Enterococcus se realizaron las siguientes pruebas distintivas del género: ⊗ Morfología celular. Se observaron al microscopio cultivos de 24 horas crecidos en caldo nutritivo, se tomó en cuenta su morfología , motilidad y arreglo celular. ⊗Tinción de Gram. En cultivos frescos de 24 h se realizó la tinción de Gram usando el método correspondiente (Manual BBL, 1994). 11 ⊗ Tinción de esporas. En cultivos de 3-4 días de crecimiento se realizó la tinción de esporas según el método de Dorner (Bailey y Scott, 1970). ⊗ Tinción ácido resistente. Se realizó el método de Ziehl-Neelsen (Collins, 1969)..

(19) ⊗ Producción de ácido en caldo glucosa rojo-fenol. Tubos con caldo glucosa rojo-fenol fueron inoculados con las diferentes cepas, incubados a 37 º C y. observados. diariamente. hasta. observar el cambio. de. coloración del cultivo de rojo hasta amarillo el cual indica un resultado positivo. (Manual BBL, 1994) ⊗ Reacción de Catalasa. Se colocó una gota de reactivo de catalasa (mezcla en partes iguales de tween 80 al 1% y peróxido de hidrógeno al 30 %), sobre una placa sembrada con la cepa y se observa la aparición de efervescencia la cual indica un resultado positivo. ⊗ Crecimiento a distintas temperaturas. Se observó el crecimiento bacteriano en caldo KF a distintas temperaturas. A 10º C de temperatura se realizaron lecturas luego de 7 días de incubación; A 40, 45 y 50ºC se observó el crecimiento después de 48 h de incubación. ⊗ Crecimiento en presencia de 6.5 %de NaCl. Se usó un medio que contenía 0,5% de glucosa, 0,5% de extracto de carne, 1,5% de peptona y 6,5% de NaCl, los cultivos se incubaron a 37ºC por 24 y 48 horas (Cuesta, 1996). ⊗ Crecimiento a pH 9,6. Se utilizó caldo pH 9,6 utilizando 20% de fosfato tripotásico. nutritivo. el cual fue ajustado a. (K3PO4) y. envasados en tubo de tapa de rosca de baquelita para prevenir. el. 12 intercambio de CO2 con el ambiente. Los tubos inoculados se incubaron a 37ºC durante 48 h. ⊗ Hidrólisis de Esculina. Se utilizó un medio rico con esculina y citrato férrico el cual produce un precipitado marrón cuando reacciona con la.

(20) esculetina proveniente de la hidrólisis de la esculina. Este se considera un resultado positivo.( Manual HiMedia, 1998) III.4. Caracterización de las cepas aisladas: III.4.1. Capacidad acidificadora: 100 ml de leche descremada y estéril (UHT) fueron inoculados con la cantidad tomada con el asa que equivale aproximadamente a 0,01ml, con las cepas a evaluar, se incubaron a 37 º C y se siguió el descenso del pH cada hora. III.4.2. Selección de las cepas aisladas: Se seleccionaran las cepas que puedan ser utilizadas como cultivo iniciador , basándose en su capacidad acidificadora y su compatibilidad con las otras cepas a usar. III.4.3. Compatibilidad entre las cepas: Para evidenciar la compatibilidad entre las cepas del género Enterococcus seleccionadas y las cepas de Lactococcus y Lactobacillus seleccionadas anteriormente (Alvarado,C. 2000) se utilizó el método de 13. difusión. en agar (Collins,c and col.,1991). Cajas de agar MRS y agar KF fueron. sembradas en superficie con cultivos de 24 horas de crecimiento de las cepas de Lactococcus y. Lactobacillus (agar MRS) y Enterococcus (agar KF), luego de. una preincubación de una hora a 37º C se hicieron pocillos en el agar de las cajas con un sacabocado estéril y se llenaron con 50 µl del sobrenadante.

(21) de las cepas a ensayar ( obtenidos por centrifugación a 5000 g por 10 minutos de cultivos. incubados a. 37 ºC por 18 horas). Luego. las. cajas fueron. incubadas por 24 horas a 37 ºC y se observó la presencia o ausencia de halos de inhibición alrededor de los pocillos. La ausencia de halos de inhibición indica compatibilidad.. III.4.4. Preparación de las mezclas: Cada cepa se cultiva independientemente en un volumen de leche durante 12 horas a 37 ºC y luego se preparan las mezclas. Cada mezcla constaba de tres cepas distintas de Enterococcus , una de Lactococcus y otra de Lactobacillus mezclados en un proporción 2:1:1 respectivamente. Se realizó otra mezcla sólo con las cepas seleccionadas de Enterococcus.. III.5. Elaboración de los quesos: Para la elaboración del queso fresco se sigue la metodología artesanal pero usando leche pasteurizada y las mezclas descritas en el punto anterior. Los pasos son los siguientes: ⊗Pasteurización de la leche por calentamiento a 65 ºC por 30 minutos 14 seguida de enfriamiento. Se añadió calcio 20 g por cada 100 litros de leche. ⊗Cuando la leche tenia una temperatura aproximada de 35 ºC se añadió 2% de cultivo iniciador (cada una de las mezclas de cepas). ⊗Se añadió la cantidad de cuajo necesario para obtener la floculación en 20 minutos..

(22) ⊗Al transcurrir 40 minutos la cuajada se cortó. ⊗Se esperó que la cuajada desuerara, se braceó y se dejó reposar por unos 15 min. Luego se sacó colocándola en un colador para drenar el resto del suero. ⊗La cuajada fue amasada con sal en una proporción de 30 g/Kg. de cuajada. Finalmente se moldeó en recipientes cilíndricos de 6 pulgadas de diámetro, con volteos a los 15 min, 1 h y 3h de haberse moldeado. A la mañana siguiente se desmoldaron. ⊗Una vez desmoldados los quesos se sumergieron en agua caliente por un minuto. Se dejaron escurrir durante unas 12 h luego de lo cual estaban listos para las siguientes pruebas.. III.6. Análisis sensorial: Se seleccionó un grupo de nueve personas debidamente entrenadas para realizar el análisis sensorial, el cual permitió determinar el grado de 15 similaridad entre los quesos experimentales y un queso artesanal. El análisis sensorial se basó en pruebas discriminativas, triangulares, a fin de poner en evidencia la existencia o no de diferencias entre los quesos. Para realizar las pruebas cada catador probó tres muestras de quesos, dos iguales y una distinta que en este caso era el queso artesanal, y los catadores determinaron la muestra diferente. Luego los catadores ofrecieron su percepción en cuanto a características organolépticas (sabor, textura, olor y color)..

(23) Las pruebas de análisis sensorial se realizaron usando los quesos sin ahumar debido a que el ahumado enmascara en parte el sabor y olor original que brindan los cultivos lácticos (Albalat,2000).. 16 IV. Resultados y Discusión. IV.1.Aislamiento e identificación de bacterias ácido lácticas: Las bacterias utilizadas en este trabajo, fueron obtenidas a partir de un queso ahumado andino elaborado de forma artesanal, este queso es elaborado con leche cruda y bajo condiciones higiénicas que no son las más aptas para obtener un producto sano, ya en un trabajo anterior se determinó que.

(24) los quesos tenían un alto contenido de enterobacterias lo que hacía suponer que las condiciones sanitarias de fabricación no eran las más adecuadas. Bajo estas condiciones crece una variada flora bacteriana, proveniente tanto de la leche como del ambiente. En este trabajo decidimos aislar sólo la flora que se considera como bacterias ácido lácticas por ser las de interés para crear cultivos iniciadores. Sólo se pudo detectar la presencia de Lactococcus, Lactobacillus y Enterococcus, en ninguna de las muestras analizadas se detectó la presencia de Leuconostoc.(Tabla 1). Como se observa los Enterococos son los más abundantes estando estos presentes casi en doble cantidad que el resto de la flora detectada. En general cuando en un producto lácteo se detectan Enterococos, debido a que el hábitat normal de estos microorganismos es el tracto digestivo del hombre y de animales, se supone que las condiciones sanitarias empleadas en la fabricación del producto han sido inadecuadas (Cuesta 1996). Sin embargo, cada vez con más frecuencia estos microorganismos debido a sus propiedades se consideran apropiados para su empleo como fermentos iniciadores, incluso existen 17 quesos en los que los Enterococos son el único o el principal fermento empleado en la fabricación (Queso Egicio) (Boubekri y Otha,1996), queso italiano (Dellaglio, F. 1994) . En muchos casos es de suponer que el sabor propio y típico de algunos quesos se deba no sólo a los fermentos tradicionales sino también a los Enterococos (queso Palmita). En nuestro caso y debido a la población de colonias contadas en las placas de cada microorganismo Lactobacilos, Lactococos y Enterococos se determinó que la proporción de los mismos que integrarían parte del fermento iniciador a emplearse posteriormente en la fabricación de los quesos sería 1:1:2..

(25) En el medio KF se obtuvo en la dilución de 10-5 una población de unas 130 colonias aisladas de aspecto liso y cremoso de coloración crema, de estas se tomaron15 colonias al azar, de tal forma de tener un número que garantice el aislamiento del 95% de los microorganismos allí presentes, y así obtener una flora representativa de la población presente en la muestra inicial (De Roissart, H y luquet, F., 1994). Estas. quince. colonias. se denominaron con la letra E. debido al género al cual suponíamos pertenecian y fueron numeradas desde el número 1 hasta el 15 de forma contínua. Al realizar las pruebas confirmatorias para identificarlas definitivamente como Enterococcos se descartaron 8 que no lograron crecer a 10ºC o en presencia de 6,5% de Na Cl y conservamos sólo 7 que denominamos: E1, E2, E4, E5, E7, E11 y E14; tal como se observa en la Tabla 2. Como puede observarse las pruebas de identificación del género Enterococcus son pruebas muy especificas y además dan fe de las. condiciones tan extremas a las cuales pueden sobrevivir. estas 18 bacterias. por. ejemplo altos valores de pH, altas concentraciones salinas,. crecimiento en temperaturas bajas y altas ; y son estas las características que nos permiten aislarlas de cualquier otro microorganismo y además presentarse como un excelente producto de la industria láctea. la. cual. iniciadores resistentes y duraderos por razones económicas.. busca cultivos Con respecto a. las placas de medio para Leuconostoc, no pudo observarse crecimiento de microorganismos, no conocemos con exactitud la razón de este resultado pero suponemos simplemente que no estaban presentes en el queso. Tabla 1. Población de microorganismos en queso.. Medio selectivo. Microorganismo a seleccionar. Colonias/gramos Aspecto colonia. de. la.

(26) MRS. 4.6x105. Lactobacilos. Lisa, cremosa,blanca (1-2mm). Elliker. Lactococos. 4.0x10. 5. Lisa,. cremosa,. blanca,. (0.5-. 3mm) PCA. 10x106. Gérmenes. Formas, colores. mesofilos totales. y. tamaños. diversos. KF. 70x105. Enterococos. Lisa,. cremosa,. color crema, (12mm) Medio. Leuconostoc. 0. Leuconostoc 19 Tabla 2. Resultados de pruebas de identificación del género Enterococcus Prueba. E1 E2 E4 E5 E6. E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15. Morfología.* c. c. c. c. c. C. c. c. c. c. c. c. c. c. Gram. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. Esporas.. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. Ácido. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. Prod.. de +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. ácido. en -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. a +. +. +. +. -. +. -. -. -. +. -. -. +. +. a +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. Resistente.. GRF Catalasa Crec. 10ºC Crec..

(27) temp. 40ºC Crec.. a +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. -. p.H. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. Crec. 6,5% +. +. +. +. -. +. -. -. -. +. -. -. +. -. +. +. +. NP** +. Temp.45ºC Crec.. a -. Temp..50ºC Crec. 9,6 NaCl Hidrólisis. +. NP NP NP +. NP NP +. NP. de esculina *Morfología c=coco **NP= No probadas. 20. IV.2. Caracterización de las cepas aisladas: IV.2.1. Capacidad acidificadora. A las 7 cepas restantes se les estudió la capacidad acidificadora en leche con el fin de observar sus cualidades como cultivo iniciador. La capacidad acidificadora de las cepas en leche, es la habilidad de producir ácido láctico a partir de la lactosa de la leche. Esta característica es una de las principales funciones de un cultivo iniciador, ya que participa en la coagulación, en. las. características. organolépticas. y. microorganismos indeseables (Alvarado, 2000).. también. en. la. inhibición. de.

(28) La cepa E11 acidificó la leche más rápido que las otras alcanzando un pH de 5.8 en ocho horas y se observó coagulación de la leche en 24 horas, presentando un coagulo liso, homogéneo y con poco suero; en cuanto a las otras cepas la E1, E2, E4,E5,E7 y E14 como se demuestra en la gráfica 1 la acidificación es más lenta y se observó coagulación de la leche en 48 horas, estas cepas presentaron un coagulo liso, homogéneo y poco suero.. 21. Gráfico 1. Curva de acidificación en leche de las cepas de Enterococcus. Tiempo (h). Hp. 0 5,8 5,9 6 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6. 2. 4. 6. 8. 10 cepa E14 cepa E11 cepa E7 cepa E5 cepaE4 cepa E2 cepa E1.

(29) 22 Las cepas de bacterias ácido lácticas pueden ser clasificadas en lentas o rápidas según su capacidad de crecer en leche a la temperatura de fabricación (21-30ºC) (Reinheinmer y col; 1996) . Las cepas rápidas son capaces de coagular la leche en 24 horas y las cepas lentas más de 48horas. Otro criterio usado comercialmente indica que las cepas rápidas disminuyen el pH de la leche fresca a 5,8 durante un lapso menor a ocho horas. Observando el patrón de coagulación de las cepas probadas y comparándolo con curvas de acidificación. de. cepas. usadas comercialmente como cultivos. iniciadores se puede decir que son lentas excepto la cepa E11 que coaguló la leche en 24 horas.. IV.2.2. Selección de cepas. Tomando en cuenta los resultados obtenidos en la curva de acidificación fueron seleccionadas cuatro cepas E4, E5, E7 y E11, las cuales presentaron mayor capacidad acidificadora en menor tiempo..

(30) IV.2.3. Compatibilidad entre cepas y elaboración de mezclas de cepas Con las 4 cepas seleccionadas en el paso anterior se realizaron pruebas de compatibilidad, de esta forma se evidencia la presencia de sustancias producidas por las cepas que inhiben el crecimiento de otras cepas la capacidad de inhibir otras bacterias, la cual no solo depende de la capacidad de producir ácidos sino también de la capacidad que. tienen. de producir otras sustancias con actividad microbiana como lo son los metabolitos de oxigeno(peroxido de hidrógeno), bacteriocinas, acetaldehídos, diacetil y D isómeros de aminoácidos que. contribuyen. grandemente a aumentar la capacidad inhibitoria.(Alvarado, 2000). Por esta cusa es muy importante el estudio de la compatibilidad al realizar 23 las mezclas para la elaboración del queso.. En los ensayos se probaron todas las cepas de Enterococos entre si y además también se estudió si estas eran compatibles con la cepa B1 y la M6 cepas de Lactococo y de Lactobacilo aisladas en un trabajo anterior a partir de una muestra de queso Ahumado Andino (Alvarado 2000) y que en este estudio por sus características se emplearán como parte del cultivo iniciador. Como se observa en la Tabla 3 todas las cepas son compatibles entre si. cepa. E4. E4. E5. E7. E11. M6. B1. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. +. E5. +. E7. +. +. E11. +. +. +. M6. +. +. +. +. B1. +. +. +. +. + +.

(31) Al observar que todas las cepas son compatibles y no producen sustancias que inhiban el crecimiento de las otras, se procede a realizar las mezclas para la elaboración de los quesos. Se realizaron cinco mezclas distintas, una para cada cepa de Enterococo y en todas ellas estaba presente las cepas B1 y M6 de Lactococo y Lactobacilo y una quinta mezcla conformada sólo con el conjunto de las cuatro cepas de Enterococos.. Los fermentos así. conformados se muestran a continuación: 24 E4+B1+M6= 50%:25%:25% E5+B1+M6= 50%:25%:25% E7+B1+M6= 50%:25%:25% E11+B1+M6= 50%:25%:25% E(4,5,7 y 11)+B1+M6= 12.5%c/u:25%:25% Como se puede ver cada mezcla posee un 50% de Enterococcus (E4,E5,E7, E11) un 25%de Lactococcus (B1) y un 25% de Lactobacillus (M6). Como ya se indicó estas proporciones se deben a la cantidad de bacterias contadas en el queso artesanal, ya que los Enterococcus eran aproximadamente el doble de las otras dos bacterias.. IV.3 Análisis sensorial:. Con cada una de las mezclas descritas anteriormente se procedió a la realización de los quesos, seis tipos en total, incluyendo un control el cual no poseía cultivo iniciador . Se utilizo la metodología artesanal, en la elaboración del queso..

(32) Los quesos fueron sometidos a degustación (ver anexos) , por un panel debidamente entrenado que fue seleccionado tomando en cuenta la capacidad de diferenciar sabores y determinando el umbral mínimo de sensibilidad ante gustos dulces, salados, ácidos y astringentes.. En el ensayo se obtuvo el. siguiente resultado: Mezcla %. E4+B1+M6 E5+B1+M6 E7+B1+M6 E11+B1+M6 E(4,5,7,11)+B1+M6. de 33,4. 33,4. 33,4. 11,2. 11,2. similitud 25 El control obtuvo un 0% de similitud con el queso artesanal, lo cual evidencia que los cultivos añadidos influyen favorablemente en la calidad del producto y permiten obtener un queso con características similares a las deseadas.. Aunque los resultados arrojan un mediano porcentaje de similitud, los panelistas aclararon que en los casos que acertaron la muestra distinta, era debido a la cantidad mucho mayor de sal del queso artesanal con respecto a los experimentales, factor que puede haber afectado los resultados. Con seguridad un factor que influyó en el resultado obtenido es la ausencia en los quesos experimentales de Enterobacteriaceas que con seguridad proporcionan al queso artesanal un gusto particular ausente en. los experimentales.. Es. interesante señalar que en los comentarios generales los quesos experimentales tuvieron una gran aceptación y los panelistas hicieron buenas criticas sobre las características organolépticas, es decir, buena textura, buen aroma y buen sabor sobretodo el queso realizado con la cepa E11, esto los califica como muy buenos incluso por encima del queso artesanal que no tuvo comentarios tan favorables.. En relación a la cepa E11 casualmente. fue la más rápida. acidificando la leche y quizás esta característica hizo que los quesos elaborados.

(33) con ella tuvieran una mejor aceptación posiblemente por un contenido mayor de ácido láctico lo que haría que tuviera un gusto y un aroma ligeramente diferente al resto.. 26 Conclusiones y recomendaciones. Es posible a partir de quesos artesanales obtener cepas apropiadas para su utilización como cultivos iniciadores. 1- De las cuatro cepas seleccionadas la que tuvo mejores cualidades como cultivo iniciador fue la cepa E11, ya que podría ser clasificada como rápida en cuanto a la acidificación y además de brindar buen gusto al queso. 2- Los quesos realizados en el laboratorio con las cepas aisladas a partir del queso artesanal obtuvieron una gran aceptación en el. grupo. de degustación el cual realizó comentarios favorables sobre el producto, demostrando así que bajo condiciones higiénicas puede elaborarse un queso de buen gusto con un alto grado de aceptación entre él publico logrando así los objetivos propuestos. 3- Sería conveniente estudiar con más detalle la flora que está presente en el queso Ahumado Andino a fin de lograr con cultivos puros y leche pasteurizada la obtención de un queso igual al artesanal. Seria interesante en particular, estudiar cepas de Enterobacter que son con seguridad proporcionar sabores particulares a los quesos..

(34) 27. VI: ANEXOS ANEXO 1: Medios de cultivo. Caldo glucosa rojo fenol g/L Peptona tripticase..................................................................10.000 Cloruro de sodio.......................................................................5.000 Rojo- fenol................................................................................0.018 Extracto de levadura................................................................0.150 PH final 7,4. KF g/L Peptona especial.......................................................................3.000 Extracto de levadura.................................................................3.000 Cloruro de sodio........................................................................1.500 Glicerolfosfato de sodio.............................................................3.000 Carbonato de sodio...................................................................0.198 Maltosa......................................................................................6.000 Lactosa......................................................................................0.300 Azida de sodio...........................................................................0.120 Rojo fenol...................................................................................5.4e-3 PH final 7.0.

(35) 28 PCA g/L Caseina enzimatica hidrolizada..................................................5.000 Extracto de levadura...................................................................1.500 Extracto de carne........................................................................1.500 NaCl ...........................................................................................5.000 Agar esculina g/L peptona......................................................................................5.000 Extracto de carne.......................................................................0.450 Esculina......................................................................................1.000 Citrato ferrico..............................................................................0.500 Agar............................................................................................15.000.

(36) 29 ANEXO 2.. Clave para la identificación del género Enterococcus Coloración de Gram (+ ) Endospora. (+). (- ) Tinción ácido alcohol resistente (+). fenol. (- ) Ácido en glucosa rojo. (+). (- ) Morfología Cocos. Bacilos. Catalasa (+). (- ) Streptococcus. Crecimiento a p.H.: 9,6 y 6.5% de NaCl.

(37) (-) Otros Streptococcus 30 ANEXO 3. Ficha para análisis sensorial. 1-Indique cual de las tres muestras es distinta:___________ 1056. 1800. 1415. 2-Indique cual de las tres muestras es distinta:____________ 2040. 3200. 2088. 3-Indique cual de las tres muestras es distinta:____________ 5911. 1085. 8120. 4-Indique cual de las tres muestras es distinta:____________ 2010. 1020. 7413. 5-Indique cual de las tres muestras es distinta:____________ 1243. 1987. 4722. (+) Enterococcus.

(38) 6-Indique cual de las tres muestra es distinta:_____________ 2102. 1350. 2540 31. VII BIBLIOGRAFÍA Albalat, P. 2000. Comunicación Personal Alvarado,C. ,2000. Aislamiento, identificación y caracterización de bacterias ácido lácticas de un queso ahumado andino artesanal para su posterior uso como cultivo iniciador.Tesis de licenciatura. Universidad de los Andes. Merida – Venezuela. Bailey, R., and Scott, E.1970. diagnostics Microbology. The C.V. Mosby company. Third edition. Pag.361. saint Louis. Boubekri,K., And Otha.1996. Identification of lactic acid bacteria from Algerian traditional cheese, El _Klila. Sci.Food agrícola, 70:501-505. Cabrera, L. Y col. 2000. Susceptibilidad a Bacteriófagos de cepas deEnterococcus fecalis y lactobacillus casei aisladas de un queso tipo palmita venezolano. Revista científica. LUZ. Vol.X, nº 5, 417-422. Collins, C. (1969).Métodos microbiologicos.(Editorial ACRIBIA); 395p. Zaragoza , España. Cuesta,E. 1996. Desarrollo de un cultivo iniciador para el queso artesanal “afuega´l pitu”. Tesis doctoral (PhD.)Universidad de Oviedo, Oviedo, España. Chapman H., and Sharpe, E 1983. Microbiology of cheese. In Dairy Microbilogy, the microbiology of milk products. Robinson, R. Ed. Vol. 2 Applieds sciens publishers London and New York. De Man, J. and Sharpe, M. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol.., 23:130-135. De Roissart, H.and Luquet, F. 1994 .Bacteries lactiques. LORICA, France. Dellaglio, F y col.1994. Bacteries lactiques. (De Roissart et luquet Eds.) Vol.I. LORICA,France. Elliker, p and col. 1956. An agar culture medium for lactic acid streptococci and lactobacilli. J.Dairy Sci. ., 39:1611-1612.

(39) 32 Hardie, J. and Moore L., 1986. Systematic Bactereology. Editorial Board and truster. Vol.2 ,1063p. USA. MacKey, A, Flores, M. 1984.Evaluación sensorial de los alimentos. 2da. Edición, serie Manuales 2 . Ediciones CIEPE. San felipe. Venezuela. Manual de procedimiento de laboratorio y productos. Catalogo BBL. Becton, Dickinson de México S.A. de C.V., Quinta edición. Reinheimer,j. And col. 1996. The lactic acid microflora of natural whey starters used in Argentina for hard cheese production. Int. dairy J., 6:869-879. Robinson, r, and Wildey, R. 1998. Cheseemaking practice. Aspen publication. Great Britain. Satyendra, K. and col. 1991. Enterococi in milk and products.Criticals reviews in microbiology, 18(1): 15-45. The HiMedia Manual ,for microbiology laboratory practice .1998. HiMedia laboratories. PVT. Limited . India. Veisseyre, R. 1980. Lactología técnica. Editorial Acribia . Zaragoza españa..

(40) 33.

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Referencias

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