IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA
Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.
A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo):
1) Obtener un cultivo puro
2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.
3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.
4) Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.
producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)
1) Enzimas vinculadas con la respiración
a) oxidasa b) catalasa
2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros
2.1) Requerimientos de oxígeno
OF (óxido-fermentación)
Crecimiento en caldo tioglicolato
2.2) Producción de ácido, o ácido y gas
Fermentación de carbohidratos
2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas
a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato
c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico) d) Esculina
e) Hipurato
3) Fuente única de carbono
c) hipurato para coliformes
4) Utilización de compuestos nitrogenados
4.1) Reducción de nitrato
a) asimilación b) denitrificación
4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros
a) indol b) H2S
c) Fenilalanina
d) Lisina, arginina, ornitina e) Urea
5) Ensayos combinados
a) TSI (Triple Azúcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina
6) Detección de exoenzimas
a) lecitinasa
b) proteasas, coagulasa c) amilasas
d) celulasas
f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)
7) Misceláneos
a) KCN b) Bilis
c) producción de pigmentos
8) Test de crecimiento o inhibición
a) Temperatura b) NaCl
TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BACTERIAS HETERÓTROFAS
tinción gram
(cultivo fresco) + + + + + + + + – – – – –
Forma coco coco coco coco bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón coco
Agrupación racimos racimos cadenas tetradas pares
crecimiento
aerobio + + + + + – + + + + + + +
crecimiento
anaerobio – + + + + + + – – – + + –
Esporas – – – – – + + + – – – – –
movilidad – – – – – + o – + o – + o – + o – + o – + o - + –
catalase + + – – – – + + + + + + +
oxidase + + – + +
fermentación de glucosa a acido
a acido+gas – + + + + + (o –) + – – – + + –
– O F F O
Micrococcus X
Staphylococcus X
Streptococcus X
Lactococcus X
Enterococcus X
Pediococcus X X
Aerococcus X
Lactobacillus X
Clostridium X
Bacillus X X
Alcaligenes X
Pseudomonas X
Enterobacterias X
Aeromonas X
Chromobacterium X
Neisseria X
Bibliografía:
http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html
FERMENTACIÓN DE GLUCOSA A ACIDO O A ACIDO+GAS TSI Agar
glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por
fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
Microorganismo
E. coli ATCC 25922 A/A + -K. pneumoniae ATCC
700603 A/A +
-P. mirabilis ATCC 43071
K/A + +
S. typhimurium ATCC 14028
K/A - +
S. enteritidis ATCC 13076
K/A + +
S. flexneri ATCC 12022 K/A -
-P. aeruginosa ATCC
27853 K/K -
-A: ácido K: alcalino
PRUEBA DE LA CATALASA
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:
1. Método del portaobjetos (recomendado):
Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
2. Método del tubo de ensayo:
Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
PRUEBA DE MOVILIDAD-MEDIO SIM
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.
Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar asa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.
Incubación
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Resultados
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Microorganismo
Movilidad Indol Producción de ácido sulfhídrico
-K. pneumoniae ATCC
700603 - -
-P. mirabilis ATCC 43071
+ - +
S. typhimurium ATCC 14028
+ - +
S. enteritidis ATCC 13076
+ - +
S. flexneri ATCC 12022 - -
-Limitaciones
