Establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Kunt

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(3) Índice 1- Introducción________________________________________________ 1 2- Revisión Bibliográfica _______________________________________ 4 2.1- Clasificación taxonómica de la especie Guadua angustifolia Kunt____ 4 2.2-Importancia económica y ambiental ______________________________ 6 2.3- Algunos cultivares de interés económico en Cuba _________________ 8 2.4- Métodos de propagación de bambúes ___________________________ 8 2.4.1- Propagación por Semilla____________________________________ 8 2.4. 2- Rizomas con segmento de tallo _____________________________ 9 2.4.3- Segmentos de culmo_______________________________________ 9 2.4.4- Segmentos de ramas _____________________________________ 10 2.4.5- Segmentos de riendas o "ganchos" _________________________ 10 2.5- Métodos de propagación in vitro de los bambúes _________________ 11 2.5.1- Propagación vía organogénesis ____________________________ 12 2.6- Fase Preparativa o Fase 0 ____________________________________ 12 2.7- Desinfección de los explantes para su establecimiento in vitro _____ 14 2.8- Fase de Establecimiento o Fase I ______________________________ 16 2.9- Métodos de análisis cualitativos y cuantitativos para la identificación de compuestos orgánicos _________________________________________ 19 2.9.1- Tamizaje fitoquímico ______________________________________ 20 2.9.2-Métodos cromatográficos __________________________________ 21 3- Materiales y métodos _______________________________________ 23 3.1- Establecimiento de Guadua angustifolia en período de seca _______ 24 3.1.1- Influencia de la aplicación de fungicidas en fase preparativa (fase 0) sobre el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia ____________________________________________________ 24 3.1.2- Acción de diferentes tipos y concentraciones de desinfectantes en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia __ 27 3.1.3- Efecto de diferentes tiempos de desinfección con hipoclorito de sodio en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia ____________________________________________________ 28 3.1.4- Efecto del estado físico del medio de cultivo en el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua angustifolia _______________ 29 3.2- Establecimiento de Guadua angustifolia en período de lluvia _______ 30 3.2.1- Efecto de diferentes tiempos de desinfección en período de lluvia sobre el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia ____________________________________________________ 30 3.2.2- Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y las condiciones de luz solar y oscuridad en el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua angustifolia __________________________________ 31 3.3- Identificación cualitativa de compuestos orgánicos presentes en yemas axilares ex vitro e in vitro de Guadua angustifolia ______________ 31 3.4- Identificación cuantitativa de polifenoles en el medio de cultivo durante el establecimiento in vitro de Guadua angustifolia ____________________ 33.

(4) 4- Resultados y Discusión _____________________________________ 36 4.1 Establecimiento de Guadua angustifolia en período de seca ________ 36 4.1.1- Influencia de la aplicación de fungicidas en fase preparativa (fase 0) sobre el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia ____________________________________________________ 36 4.1.2- Acción de diferentes tipos y concentraciones de desinfectantes en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia __ 39 4.1.3- Efecto de diferentes tiempos de desinfección con hipoclorito de sodio para el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia ____________________________________________________ 42 4.1.4- Efecto del estado físico del medio de cultivo en el establecimiento in vitro de las axilares de Guadua angustifolia______________________ 43 4.2- Establecimiento de Guadua angustifolia en período de lluvia _____ 47 4.2.2- Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP, y las condiciones de luz solar y oscuridad en el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua angustifolia __________________________________ 49 4.3- Identificación cualitativa de compuestos orgánicos presentes en yemas axilares ex vitro e in vitro de Guadua angustifolia ______________ 53 4.4- Identificación cuantitativa de polifenoles en el medio de cultivo durante el establecimiento in vitro de Guadua angustifolia ____________________ 55 5- Conclusiones______________________________________________ 59 6- Recomendaciones _________________________________________ 60 7- Referencias Bibliográficas ___________________________________ 61 Anexos _____________________________________________________ 73.

(5) Introducción. 1- Introducción Los bambúes, por su rápido crecimiento, gran versatilidad y resistencia, han sido de gran utilidad para el hombre a lo largo de la historia. Son plantas extremadamente diversas y económicamente importantes que crecen en regiones tropicales y templadas de Asia y América. La Guadua angustifolia Kunt, es uno de los bambúes más importantes en el desarrollo cultural, económico y de conservación de los recursos hídricos, en países de América Latina, especialmente en México, Costa Rica, Panamá, Colombia, Ecuador y Brasil. Las cualidades físicas de esta especie, su bajo costo y disponibilidad; hacen de esta, el material ideal para la construcción de viviendas, muebles, artículos decorativos utilitarios y artesanía. Es un recurso natural renovable de rápido crecimiento y fácil manejo, que además aporta importantes beneficios ecológicos durante su crecimiento (Matínez, 2001). En Cuba los recursos maderables son escasos, por ello se hace imprescindible la búsqueda de recursos rápidamente renovables. Problemática que puede resolverse mediante el establecimiento de una tecnología eficiente para la propagación acelerada del cultivo del bambú en condiciones in vitro, principalmente para la Guadua, de mayor utilidad y aprovechamiento con fines constructivos. Contar con un sistema eficiente de propagación, garantizaría elevar los niveles poblacionales de esta planta. Las vías de propagación para esta especie, resultan limitadas; debido a que la regeneración natural ocurre estacionalmente por medio de semillas y de manera asexual, por la activación de las yemas del rizoma. Por estas razones se hace necesaria regeneración y multiplicación de plantas in vitro, como una alternativa a la propagación vegetativa (Daquinta, 2004). En Cuba es muy 1.

(6) Introducción limitado el germoplasma de Guadua. Se han empleado principalmente dos métodos para la multiplicación in vitro en bambú, embriogénesis somática (Lin et al., 2004) y propagación por yemas axilares y microestacas (Bag et al., 2000; Ramanayake et al., 2001). Las especies asiáticas, se han propagado in vitro con mayor facilidad, (Saxena 1990, Prutpongse y Gavinlertvana 1992, Chang y Hung-Lan 1995, Saxena y Dhawan 1999); existiendo sistemas de propagación a gran escala con fines principalmente comerciales (Marulanda et al., 2005). Sin embargo en especies americanas, como la Guadua angustifolia, aún no existen sistemas de propagación eficientes. Los principales problemas que se han presentado en la micropropagación, son los derivados de varios factores como: la presencia de contaminantes endógenos, la necrosis apical, la hiperhidricidad, la oxidación fenólica, el enraizamiento, disponibilidad y repuesta estacional de los explantes y la superviviencia ex vitro. Además, la edad y estado de desarrollo de la planta madre, representan aún hoy significativas limitaciones para la multiplicación masiva. Tomando en consideración lo antes expuesto, nos propusimos desarrollar la siguiente Hipótesis. Es posible desarrollar las fases preparativas y de establecimiento para la propagación vía organogénesis de la especie Guadua angustifolia Kunt. Para dar cumplimiento a la hipótesis planteada en esta investigación se trazaron los siguientes objetivos:. 2.

(7) Introducción 1. Determinar la efectividad de la aplicación de fungicidas a plantas rejuvenecidas para el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Kunt. 2. Definir protocolos de desinfección de yemas axilares de Guadua angustifolia para los explantes colectados en períodos de seca y lluvia. 3. Determinar la concentración de 6-BAP adecuada, las condiciones de iluminación a emplear y el estado físico del medio de cultivo, durante la fase de establecimiento in vitro de las yemas axilares. 4. Determinar la presencia de fenoles en los tejidos vegetales y en el medio de cultivo, mediante métodos cualitativos y cuantitativos.. 3.

(8) Revisión Bibliográfica. 2- Revisión Bibliográfica 2.1- Clasificación taxonómica de la especie Guadua angustifolia Kunt Los bambúes constituyen plantas que pertenecen a la familia Poaceae. De las cinco subfamilias, Bambusoidae es la más primitiva (Londoño, 1993). Taxonómicamente los bambúes pertenecen a: Familia: Poaceae. Subfamilia: Bambusoideae. Se han dividido en dos grandes tribus: 1) Los bambúes herbáceos u Olyrodae, 2) Los bambúes leñosos o Bambusodae, según Londoño (1993). En el mundo existe un total de 21 géneros y 107 especies agrupados en una tribu, Olyreae. América aporta el 95 % de la diversidad genérica mundial, 20 géneros y 106 especies. La tribu Bambusodae en América reúne los bambúes leñosos y tienen como centro de diversidad la cordillera de los Andes, albergando el 87% de las especies (Clark, 2001). El género Guadua Este género, reúne las especies de bambúes más grandes y económicamente más importantes de América tropical; es endémico del Nuevo Mundo con aproximadamente 30 especies que se distribuyen desde México (22º 55'N), hasta el norte de la Argentina (30º S), y desde el nivel del mar hasta un máximo de 2800 m, a bajas altitudes (0-1500 m) y regiones húmedas. La temperatura parece ser el factor limitante en su distribución latitudinal y altitudinal. Camargo (2004), plantea que para este cultivo, se alcanza el mejor desarrollo con precipitaciones entre 2000-4000 mm promedio anual. Fue clasificada en 1820, 4.

(9) Revisión Bibliográfica por el botánico Kunth, y se acepta la clasificación realizada por Londoño (1993). Reino: Plantae División: Espermatofita Subdivisión: Angiospermae Clase: Liliopsida /Monocotiledónea Subclase: Commelinidae Orden: Cyperales/ Glumiforales Familia: Gramineae o Poaceae Subfamilia: Bambusoidae Supertribu: Bambusodae Tribu: Bambuseae Subtribu: Guaduinae Género: Guadua Especie: G. angustifolia La especie Guadua agustifolia sobresale dentro del género por sus propiedades físico - mecánicas y por el tamaño de sus culmos; que alcanzan hasta 30 metros de altura y 25 centímetros de diámetro. Ha sido seleccionada como una de las veinte especies de bambúes mejores del mundo por su capacidad para absorber energía y admitir una mayor flexión, la convierten en un material ideal para construcciones sismorresistentes. Esta especie crece naturalmente en Colombia, Ecuador y Venezuela, pero ha sido introducida a Centro América, Isla del Caribe, Hawai y Asia. Reúne dos variedades: G. angustifolia var. bicolor y G. angustifolia var. nigra, y varias formas: “cebolla”, “macana” y “castilla” (Londoño, 1990).. 5.

(10) Revisión Bibliográfica 2.2-Importancia económica y ambiental Económica La Guadua cuenta con grandes posibilidades económicas, ya que su utilización permite disminuir costos cuando es empleada como materia prima. Por sus excelentes propiedades físico-mecánicas, su resistencia al ataque de insectos, su belleza y por la diversidad de aplicaciones que se le dan; representa una valiosa alternativa económica que ha coadyuvado a mitigar la problemática social del campo. Los guaduales viven y se desarrollan asociados a áreas de gran potencial agrícola, es decir, suelos ricos, jóvenes y de buena capacidad productiva, constituyendo además una importante fuente de ingreso (Rodríguez, 2003). La mayor aplicación del bambú se da en la construcción, en la fabricación de muebles, cestería, artesanías, papel, rayón, como alimento, y como recurso natural para la conservación y transformación del medio ambiente. Ambiental. Es un importante fijador de dióxido de carbono (CO 2), hasta el punto que su madera no libera a la atmósfera el gas retenido después de ser transformada o ser usada en construcción, sino que éste queda fijo en las obras realizadas con ella. Por el tipo de sistema radicular de esta especie, evita la movilización de tierra y conserva efectivamente los suelos, de allí que su siembra resulte ideal en áreas propensas a deslizamientos, derrumbes, erosión y remociones, sin contar su gran capacidad para el almacenamiento de agua. A estas características se suma que la Guadua angustifolia posee propiedades. 6.

(11) Revisión Bibliográfica estructurales, que no sólo superan a las de la mayoría de las maderas sino que además pueden ser comparadas con las del acero y algunas fibras de alta tecnología (Colorado, 2001). Su rápido crecimiento, según los estudios realizados por el Centro Nacional para el Estudio del Bambú-Guadua, de Colombia, puede aportar al suelo de 2 4 ton /ha/año de biomasa. Volumen que varía según el grado de intervención del guadual; esta biomasa constituye entre el 10 y el 14% de la totalidad de material vegetal que se genera en un guadual. La biomasa es importante, ya que contribuye a enriquecer y mejorar la textura y estructura del suelo. El aporte anual de biomasa general de un guadual en pleno desarrollo oscila entre 30 y 35 t/ha/año. Los rizomas y hojas en descomposición conforman en el suelo, símiles de esponjas, evitando que el agua fluya de manera rápida y continua, con lo cual se propicia la regulación de los caudales y la protección del suelo a la erosión. El sistema entretejido de rizomas y raicillas origina una malla, que le permite comportarse como eficiente muro biológico de contención; que controla la socavación lateral y sujeta fuertemente el suelo, previniendo la erosión. Por ello, se le confiere a los Guaduales una función protectora, especial para ser usada en suelos de ladera de cuencas hidrográficas. Entre los aportes más valiosos de la especie se debe mencionar su comportamiento como una bomba de almacenamiento de agua, cuyo funcionamiento es el principio de “Vasos Comunicantes”. A la Guadua se asocia una vegetación muy variada y numerosa que le permite conformar. una. estructura vertical. triestratofítica,. característica. de. las. 7.

(12) Revisión Bibliográfica sociedades vegetales altamente desarrolladas y evolucionadas, que tolera una amplia interrelación entre los diferentes componentes del sistema (Rodríguez, 2003). 2.3- Algunos cultivares de interés económico en Cuba La familia Bambusaseae en Cuba está formada por 8 géneros y 21 especies (Catasús, 2002a). Los bambúes leñosos, de interés para la construcción, presentan poca distribución en Cuba. Especies como: Bambusa vulgaris schrad, Bambusa vulgaris var. Vittata, Guadua angustifolia Kunth kunth, Dentrocalamus strictus, Bambusa blumeana, Bambusa bambos y Phyllostachys pubensis, sólo se encuentran en los jardines botánicos de Cienfuegos y Holguín, el Banco de germoplasma de la ACTAF de Granma y Topes de Collantes (Catasús, 2002b). 2.4- Métodos de propagación de bambúes Métodos de propagación tradicionales Bajo condiciones naturales la regeneración del bambú ocurre a través de rizomas, semillas y ramas laterales enterradas. El hombre para su cultivo ha implementado varios métodos de propagación, cinco de los cuales se describen a continuación. 2.4.1- Propagación por Semilla La posibilidad de propagar bambúes por semilla no es un método práctico debido a los largos ciclos de semillación de los bambúes y a la dificultad de obtener semillas en algunos de ellos; sin embargo en Asia, especies como Dendrocalamus strictus se han propagado a partir de semilla, facilitándose además la distribución a diferentes partes del mundo. En América, las semillas. 8.

(13) Revisión Bibliográfica de algunas especies como Guadua angustifolia presentan porcentajes altos de germinación, 95-100%, sin embargo la probabilidad de que esta especie produzca semillas es escasa ya que un alto porcentaje de los flósculos de la espiguilla son parasitados en estado inmaduro por larvas de insectos principalmente de los ordenes Díptera e Himenóptera "(Londoño, 2002). 2.4. 2- Rizomas con segmento de tallo Se considera como el mejor método de propagación, sin embargo no se recomienda en muchos países asiáticos para plantaciones a gran escala por lo pesado y difícil del transporte. La actividad de brotes se da generalmente después del año de sembrado (Vongvijitra, 1988; Kamondo y Haq, 1988). En Colombia, sin embargo, este método ha sido implementado por las Corporaciones Regionales para las reforestaciones con Guadua angustifolia, mediante el uso del "chusquin" y se considera el método más ventajoso por la facilidad de obtención del material, la alta eficiencia y economía. A diferencia de muchas especies de bambúes asiáticos, un plantón de G. angustifolia se caracteriza por la alta emisión de "chusquines"(Londoño, 2002). 2.4.3- Segmentos de culmo Este método es efectivo para propagar bambúes de gran tamaño y pared gruesa tales como Bambusa vulgaris, B. blumeana, Dendrocalamus asper, y D. latiflorus. Experimentos en India han indicado que este método provee solución al problema de escasez y peso del material a plantar pero el éxito en la germinación ha sido limitado. Se observa que se debe utilizar culmos de un año de edad, y segmentos de culmo con uno o dos nudos por segmento; la siembra es mejor horizontal que vertical u oblicua, y se deben enterrar a 20 cm de profundidad, regando dos veces al día. Los nuevos brotes se pueden empezar. 9.

(14) Revisión Bibliográfica a observar entre la segunda y cuarta semana. Este método no es ventajoso por su costo y por la limitación de usar culmos de un año, los cuales pueden ser usados para otros propósitos (Londoño, 2002). 2.4.4- Segmentos de ramas Este método es útil, práctico y efectivo, además de ser fácilmente manejable. En Asia este método es ideal para establecer plantaciones a gran escala. Comúnmente se aplica en la siembra de Dendrocalamus asper, especie que se caracteriza por sus raíces aéreas en la base de las ramas laterales. Las ramas más gruesas tienen mayor capacidad para enraizar que las más delgadas. El enraizamiento es eficiente en un medio de cascarilla de arroz y carbón. La eficiencia del enraizamiento varía en cada especie y depende del tamaño del culmo y del grosor de la pared. Los bambúes de pared gruesa poseen una mayor emisión de brotes y mejor enraizamiento probablemente debido a una mayor reserva de alimento. La propagación de bambúes de pared delgada como Cephalostachys y Meredithm pergracile del Asia o Elytrostachys typica de América no tiene éxito con este método; las especies que tiene ramas muy pequeñas y delgadas al final del culmo como Trysostachys samensis de Asia o Rhipidocladum racemiflorum de América, difícilmente pueden ser propagadas por este sistema (Londoño, 2002). 2.4.5- Segmentos de riendas o "ganchos" Este sistema se ha implementado en Colombia con Guadua angustifolia, obteniendo el material para propagación de las ramas con espinas que se desarrollan en los entrenudos bajos del culmo y que se conocen con el nombre de riendas o ganchos. Este método es recomendado por las Corporaciones Regionales por la fácil obtención del material, ya que se utiliza una estructura. 10.

(15) Revisión Bibliográfica vegetativa generalmente desaprovechada (riendas) y además presenta un alto porcentaje de prendimiento (Londoño, 2002). 2.5- Métodos de propagación in vitro de los bambúes Los métodos de cultivo más empleados en la micropropagación de bambúes son: la organogénesis y la embriogénesis somática Veasey et al. (1991) y Lin et al., (2004). Se realizan mediante el uso de embriones de semilla o yemas axilares colocados en un medio complementado con fitohormonas y vitaminas. Estos sistemas de propagación, presentan ventajas sobre los demás sistemas antes mencionados, debido a: la múltiple obtención de material que se consigue a partir de una yema. meristemática ya que la multiplicación es. logarítmica; se facilita el intercambio de germoplasma a nivel internacional por el tamaño de la muestra, y se minimiza la. contaminación microbiana. La. propagación "in vitro" de materiales provenientes de semilla, evita la homogeneidad en las plantaciones comerciales futuras. Londoño (1993), reconoce las facilidades del cultivo in vitro. A pesar del gran número de leñosas propagadas por cultivo in vitro, se presentan problemas derivados de varios factores como: la contaminación interna de los explantes, la necrosis apical, la hiperhidricidad, la oxidación fenólica, el enraizamiento, disponibilidad y repuesta estacional de los explantes y la superviviencia ex vitro. Además, la edad de la planta madre y el estado de desarrollo,. representan. aún. hoy,. significativas. limitaciones. para. la. multiplicación masiva. En este proceso, intervienen dos factores importantes: pérdida por contaminación microbiana y por oxidación fenólica (Dalal et al., 1992). Específicamente en Guadua. los principales. problemas en la. micropropagación son, la contaminación endógena y la necrosis de los. 11.

(16) Revisión Bibliográfica explantes. En el mundo se utiliza la micropropagación como la principal biotécnica aplicada a varias especies de bambú. Gielis et al. (1995) expresan la importancia del desarrollo de la biotecnología en Bambúes con el fin de aprovechar el potencial que este tipo de plantas poseen para la construcción, desarrollo de artesanías y protección de suelos. La mayoría de los artículos científicos conocidos en la micropropagación de bambúes, se refieren a especies asiáticas (Saxena, 1990; Prutpongse y Gavinlertvana, 1992; Chang y Hung-Lan, 1995; Saxena y Dhawan, 1994), donde se han desarrollado métodos para la propagación a gran escala con fines principalmente comerciales (Marulanda et al., 2005). 2.5.1- Propagación vía organogénesis Se ha logrado la propagación de bambú por yemas axilares y microestacas (Bag et al., 2000; Ramanayake et al., 2001) Las especies y las variedades de Arundinaria, Chimonobambusa, Fargesia, Phyllostachys, Pleioblastus, Sasa, Sasaella, Semiarundinaria, Shibataea y Meredithshania (bambúes de zonas templadas) y Bambusa, Dendrocalamus, Dinochloa, y Thyrsostachys (bambúes de zonas tropicales) se han reproducido comercialmente vía organogénesis (Cusack, 2000). 2.6- Fase Preparativa o Fase 0 En esta etapa se incluye la selección de la planta donadora y una serie de pretratamientos, cuyo objetivo es mejorar la eficiencia en la implantación y el desarrollo posterior de los cultivos in vitro. La constitución genética de la planta donadora o planta madre es el primer. 12.

(17) Revisión Bibliográfica factor relacionado con la frecuencia de variantes somaclonales resultante del proceso de propagación (García, 1998), por tanto uno de los cuidados especiales que se deben tener al iniciar el proceso de propagación in vitro es la selección del material vegetal de partida. Debiendo asegurarse de que este provenga de una correcta selección individual. Los factores que influyen sobre la calidad del explante son el tipo de órgano que sirve como explante inicial, la edad ontogénica y fisiológica del mismo; la estación en la cual se colecta el material vegetal, el tamaño y el estado sanitario general de la planta donante Olmos et al. (2004). Biasi y Koller (1993) y Rodríguez (1999), establecieron material a partir de plantas donantes de aguacatero. Mantenidas en casas de cultivo sometidas a podas regulares y pulverizaciones con fungicidas sistémicos (Leifert et al., 1994). Las metodologías de propagación in vitro para especies leñosas desarrolladas por Agramonte et al. (2001), Trocones et al. (2001) y Caballero et al. (2002), señalan la importancia del establecimiento de un banco de plantas donantes bajo condiciones de invernadero y la aplicación de mezclas de fungicidas comerciales con el objeto de atenuar el efecto de los microorganismos contaminantes durante la fase de establecimiento. Existe la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento a plantas donadoras de explantes, sobre todo en especies leñosas Olmos et al. (2004), pues la edad fisiológica es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis in vitro y específicamente en leñosas, la edad del explante es un factor crítico,. 13.

(18) Revisión Bibliográfica siendo la micropropagación más exitosa a partir de tejidos jóvenes (Mroginski et al., 2004). Chusquines de G. angustifolia han sido sometidos a podas de rejuvenecimiento para estimular la producción de brotes y nuevas ramas. Además en esta fase se han realizado aplicaciones semanales con fungicidas y fertilización foliar con fórmula completa una vez por semana, obteniéndose buenos resultados en el establecimiento in vitro, según Marulanda et al. (2005). 2.7- Desinfección de los explantes para su establecimiento in vitro La presencia de microorganismos contaminantes, hongos y bacterias, es uno de los aspectos que puede limitar el establecimiento in vitro de explantes procedentes de plantas leñosas, sobretodo de condición adulta y cultivadas directamente en el campo (Biasi y Koller, 1994). La zona de tejido vegetal que se utiliza para iniciar el cultivo in vitro tiene gran influencia en la efectividad de la desinfección, de ahí la importancia de evitar la implantación directa de plantas de campo y la necesidad de la fase preparativa (Hernández et al, 1996). Los desinfectantes comúnmente utilizados son el hipoclorito de sodio (NaClO), y resulta importante determinar la concentración con la cual se garantiza el control de los microorganismos contaminantes y la supervivencia de los tejidos de los explantes (Castillo et al., 1997). Otros desinfectantes utilizados son el hipoclorito de calcio (Ca(ClO)2), etanol y bicloruro de mercurio (HgCl2). Se emplean en concentraciones de 1.0 a 3.0 % en tiempos de 10 a 20 minutos, el alcohol se usa generalmente al 70 % y se emplea en combinación con otros desinfectantes. El bicloruro de mercurio es el. 14.

(19) Revisión Bibliográfica de mayor toxicidad y se emplea en concentraciones bajas y corto tiempo (0.1 % durante un tiempo de uno a tres minutos). Se han logrado altos porcentajes de las yemas establecidas, realizando un lavado con agua corriente seguidas de hipoclorito de sodio 0.1%, o inmersión en bicloruro de mercurio (0.1%), en algunas especies de bambúes como: Dendrocalamus. strictus,. Bambusa. arundinacea,. Dendrocalamus. Asier,. Phyllostachys edulis, Dendrocalamus giganteus y Bambusa polymorfa, se logra (ICFRE, 2002). Montes y Andrea (1998), plantea que el tratamiento más efectivo para la desinfección de yemas axilares de Guadua angustifolia Kunth, es utilizando hipoclorito de sodio al 1.0 % durante 10 minutos, para el caso de las microestacas el tratamiento desinfectante más apropiado fue el del hipoclorito de sodio al 1.5% durante cinco minutos. Se ha obtenido hasta un 74,6 % de explantes libres de contaminantes microbianos visibles, realizando un lavado con abundante agua y detergente comercial aplicado con algodón (20 a 30 minutos), individualizando las yemas, y lavándolas con abundante agua. Posteriormente, una pre-desinfección con etanol 70% durante tres minutos, e inmersión en bicloruro de mercurio al 0,3 % por 10 minutos (Marulanda et al., 2005). En segmentos nodales de sauce, (Salix spp,) Chung y Carrasco (2000); plantearon que el método de desinfección que permitió mantener explantes libres de contaminantes de hasta el 70%, fue la inmersión en una mezcla de fungicidas y HCl al 10 % por 30 y 20 minutos respectivamente. Según Ramírez et al., (1999), en Psidium guajava y P. friedrichsthalianum con el uso de nitrato. 15.

(20) Revisión Bibliográfica de plata y cloruro mercúrico se logra eliminar la contaminación de los segmentos nodales, totalmente. 2.8- Fase de Establecimiento o Fase I El objetivo de esta etapa es lograr el establecimiento de cultivos libres de contaminación partiendo de explantes procedentes de plantas genética y sanitariamente caracterizadas, lo cual posibilita un proceso repetible sin riesgos de alta variabilidad o contaminación (Agramonte, 1997). Los contaminantes provienen de la superficie o tejidos de la planta donadora, o pueden aparecer como resultado de fallas en los procedimientos de laboratorios. Estos suelen causar grandes pérdidas en los procesos de propagación in vitro, de ahí la importancia de su eliminación desde la fase de establecimiento, donde los daños son mayores debido al volumen de los explantes. El estado de desarrollo de la planta madre y la edad fisiológica del explante, así como su tamaño, son de gran influencia en el éxito del cultivo in vitro. Olmos et al. (2004) plantean que en general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Algunas bacterias que provocan infecciones sistémicas en plantas en los espacios intercelulares, son difíciles de detectar in vitro. Su presencia puede expresarse como un lento crecimiento o un potencial morfogénico alterado de los tejidos vegetales. Algunas plantas son ricas en compuestos fenólicos. En algunos tejidos sus componentes sufren oxidación por polifenoloxidasas y cambian de color. 16.

(21) Revisión Bibliográfica tomando un tono pardo negrusco. Los productos oxidantes son conocidos como inhibidores de la actividad enzimática, destruyen los explantes y tiñen el medio de cultivo; estos fenómenos imponen serios problemas en el establecimiento de cultivos primarios. En el caso de ocurrir oxidación fenólica es necesario subcultivar los explantes a otro medio, teniendo en cuenta no tomar exudado de alrededor del tejido. Para ello, se lava primeramente el material con el objetivo de eliminar los restos de productos que puedan ser dañinos. Posteriormente son dejadas en agua destilada estéril por dos ó tres horas después del aislamiento. El enjuague de explantes esterilizados sólo elimina cualquier oxidación fenólica que se pueda presentar. Si los explantes no muestran ningún signo de crecimiento después de un período de dos a cuatro semanas, la posibilidad de supervivencia puede estar en el subcultivo a medio fresco (George y Sharrington, 1984). El establecimiento del cultivo in vitro de tejidos procedentes de plantas leñosas se ve impedido frecuentemente por la aparición de ennegrecimiento y necrosis de los tejidos (Marks y Simpon., 1990; Dalal et al., 1992). Varios métodos han sido utilizados con el fin de disminuir este problema. Entre ellos se menciona el (Murashige,. 1974;. pretratamiento de los explantes con antioxidantes. Hildebrandt. y. Harley,. 1988),. la. incorporación. de. antioxidantes o carbón activado al medio de cultivo (Claudebon et al., 1988), el subcultivo frecuente en medio de cultivo fresco (Broome y Zimmerman, 1978), la inmersión en agua destilada estéril algunas horas antes de la siembra in vitro y la modificación de las condiciones ambientales in vitro al iniciar los cultivos en condiciones de oscuridad (Meyer, 1984) o a bajas temperaturas (Hildebrandt y Harney, 1988) lo cual ha disminuido la fenolización del explante. Sin embargo,. 17.

(22) Revisión Bibliográfica el éxito de estas técnicas ha sido limitado, ya que generalmente, afectan las condiciones necesarias para el crecimiento de los explantes (Marks y Simpson 1990). Yu y Meredith (1986) y Dalal et al. (1992), han enfatizado la importancia del tratamiento del material vegetal donante y el efecto del origen del mismo como medio para controlar el ennegrecimiento oxidativo y sus consecuencias en la supervivencia de los explantes al momento de establecerlos in vitro. En algunas leñosas como el aguacatero, diferentes autores señalan que la reducción de la concentración de las sales MS en el medio de cultivo disminuye la aparición de tejido necrótico (Barceló-Muñoz et al., 1999; Witjaksono et al., 1999) mientras que la adición de antioxidantes al medio de cultivo se hace innecesaria y no ventajosa (Barceló-Muñoz et al, 1999). Según Dekkers (1989), las principales fuentes de explantes utilizadas en el establecimiento en los géneros Bambusa, Dendrocalamus, Phyllostachys, Sasa, Sinocalamus, Schizostach y Thyrsostachys, son los embriones cigóticos, callos, nudos, inflorescencias, yemas de culmo, vástagos, entrenudos, hojas y bases de las hojas de los culmos. Veasey et al. (1991), plantean además, el uso de meristemos apicales y raíces. Para G. angustifolia, se han utilizado chusquines rejuvenecidos, obtenidos en vivero, como fuente de explante para el establecimiento in vitro (Marulanda et al., 2005). En cuanto a los medios de cultivo y reguladores del crecimiento es necesario que exista un balance apropiado entre las concentraciones endógenas de auxinas y citoquininas presentes en el explante, las cuales son dependientes. 18.

(23) Revisión Bibliográfica de la especie y del tipo de explante. Algunas especies no requieren la adición de ningún regulador de crecimiento externo, probablemente debido, a que existe suficiente cantidad endógena de reguladores (Jiménez et al, 1998). Segmentos nodales de Dendrocalamus hamiltonii han sido establecidos en el medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog (1962), con 3.0% de sacarosa y 0.8% de agar (Sood et al., 2002). Para Guadua, se ha obtenido el establecimiento en medio de cultivo compuesto por las sales y vitaminas MS suplementado con 2,5 mg. L-1 de 6-BAP (Marulanda et al., 2005). Chambres et al. (1991), obtuvo brotes de explantes nodales de plantas jóvenes de Dendrocalamus hamiltonii, cuando éstos fueron cultivados en medio de cultivo MS, suplementado con 6-benzyladenina (BA). Se han obtenido altas tasas de crecimiento vegetativo y supervivencia de inflorescencias in vitro de Bambusa edulis, con la utilización de auxinas como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido idolbutírico (AIB) y ácido naftalenacético (ANA) (Choun-Sea et al., 2005). 2.9- Métodos de análisis cualitativos y cuantitativos para la identificación de compuestos orgánicos Con el empleo de métodos cuantitativos y cuantitativos pueden ser determinados un sinnúmero de compuestos orgánicos beneficiosos y perjudiciales para las plantas. Los polifenoles constituyen una de las principales clases de metabolitos secundarios, se conocen más de 8000 estructuras, de difícil clasificación pero se pueden subdividir en 4 grandes grupos: ácidos fenólicos, lignanos, taninos y. 19.

(24) Revisión Bibliográfica flavonoides, que a su vez, están constituídos en varios subgrupos, entre los que se encuentran las flavonas, isoflavonas y antocianos (Anónimo, 2005). Los ácidos fenólicos pueden provocar alteraciones en el contenido de agua en los tejidos de planta (Sampietro, 2005). Palazón et al. (2000), afirmaron que de forma general, los fenoles actúan como inhibidores del crecimiento de las plantas, al inhibir la degradación de las auxinas. 2.9.1- Tamizaje fitoquímico Mediante el tamizaje fitoquímico pueden ser identificados metabolitos presentes en plantas. Estas técnicas son empleadas fundamentalmente en la rama farmacéutica. Es importante señalar que los resultados obtenidos mediante estas técnicas ofrecen sólo una visión de la composición química de la planta a estudiar y que no puede tomarse en ningún caso, como un resultado concluyente. La presencia o ausencia de un metabolito pueden está determinada por múltiples aspectos como la época de recolección de las muestras vegetales, el estado vegetativo de la planta, las variaciones ocurridas por una deficiente recolección, secado y/o conservación, la concentración de los metabolitos la solubilidad en el solvente empleado y las interferencias de otros metabolitos. La extracción puede realizarse por maceración de la muestra pulverizada o bien triturada, por un tiempo no menor de 48 horas; o por extracción en caliente (contínua o por reflujo) de dos a cuatro horas. En este último caso pueden producirse alteraciones de algunos metabolitos por la influencia de la temperatura (Evans, 1991).. 20.

(25) Revisión Bibliográfica Altos contenidos de fenoles en los explantes nodales in vitro de Bambusa balcoa conllevan a daños importantes en el proceso de morfogénesis in vitro (Das y Pal, 2005). Autores como Castro et al. (2002), identificaron flavonoides, taninos, saponinas, y glicósidos, a través de estas técnicas en varias plantas medicinales Phyllantus niruri L., Geranium dielsianum Knut, Otholobium pubescens, Smallantus sonchifiblia, Chloraphora tincoria. y Taraxacum. officinalis y cuantificaron estos metabolitos, mediante espectroscopia de absorción atómica. En tallo y hojas del maíz, Zea mayz L., se ha determinado la presencia de flavonoides, taninos y alcaloides (Du Dat, 1993). En ramas de Eucalyptus ovata, se han identificado compuestos pertenecientes al grupo de los taninos y flavonoides (Santos y Waterman, 2001). Ogunti et al. (2002) en extracto acuoso a partir de ramas del cultivo del aguacate (Persea americana Mill), determinaron presencia de taninos, flavonoides, alcaloides y azúcares reductores. 2.9.2-Métodos cromatográficos La gran diversidad de compuestos fenólicos dispersos en los tejidos vegetales, así como sus diferentes estructuras químicas, ha traído consigo la necesidad de desarrollar un gran número de técnicas analíticas para su identificación y cuantificación. Dentro de las técnicas de cuantificación, las cromatográficas son unas de las más precisas, y permiten la identificación individualizada de cada uno de los polifenoles de interés (Martínez et al., 2000).. 21.

(26) Revisión Bibliográfica Según la naturaleza de la fase estacionaria y los procesos de separación, las cromatografías se pueden clasificar en cromatografía de absorción, partición, intercambio iónico y de exclusión (Skoog y Leary, 1997; Pradeau, 1998). Las técnicas cromatográficas han permitido la separación, aislamiento, purificación e identificación de compuestos fenólicos, así como el estudio de la interacción entre los polifenoles y otros componentes. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la más empleada para la separación y cuantificación de compuestos fenólicos (Bartolomé et al., 1993). Mediante el empleo de HPLC, podemos determinar un gran número de polifenoles, como fenoles simples, ácidos fenólicos y sus derivados, y los distintos flavonoides, aunque esta técnica requiere la utilización de métodos de extracción optimizados a cada uno de los compuestos que se vayan a analizar (Shahidi y Naczk, 1995). Las técnicas de HPLC han sido utilizadas con éxito para la caracterización de los polifenoles en una gran variedad de extractos vegetales (Justesen et al., 1998). Zhang et al. (2005) emplearon la determinación simultánea (RP-HPLC) con detección ultravioleta para la determinación simultánea de cuatro compuestos pertenecientes al grupo de los flavonoides en hojas de bambú.. 22.

(27) Materiales y Métodos. 3- Materiales y métodos La presente investigación se realizó en el laboratorio de Embriogénesis Somática y Transformación Genética del Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), en el período comprendido de marzo de 2004 hasta diciembre de 2005. Condiciones generales para el trabajo en el laboratorio Los trabajos de laboratorio se realizaron en condiciones asépticas. Los medios de cultivos fueron esterilizados en autoclave vertical a 121 ºC de temperatura y 1.2 kg.cm-2 de presión durante 15 minutos y en todos los experimentos el pH del medio de cultivo se ajustó a 5.8 antes del autoclaveado. El instrumental se desinfectó con hipoclorito de sodio [NaClO] al 1.0 %. La manipulación del material vegetal se realizó en cabinas de flujo laminar. Para la fase de establecimiento in vitro de las yemas se emplearon tubos de ensayo (20 x 1.5 cm) de alto y diámetro respectivamente con tapones de goma. A cada tubo de ensayo se le adicionó 10 ml de medio de cultivo. Análisis estadísticos de los datos. Los datos obtenidos en las evaluaciones de los experimentos se procesaron en Excel Office 2003, y los análisis estadísticos se realizaron en el programa estadístico computacional STATGRAPHICS Plus. 4.1; con plataforma para sistema operativo Windows®. Se realizaron pruebas de. comparación de. proporciones para las variables expresadas en forma porcentual: número de yemas contaminadas, número de yemas brotadas y número de yemas vivas. Para la variable número de yemas por explante, se realizó un análisis de varianza de clasificación simple Cuando existieron diferencias significativas, se aplicó para la comparación de medias, la prueba de rangos múltiples de 23.

(28) Materiales y Métodos Duncan para un nivel de significación del 5.0 %. Para la variable tamaño de brote, se realizaron pruebas no paramétricas a través del análisis de varianza de Krusskall- Wallis para un nivel de significación del 5.0 %. 3.1- Establecimiento de Guadua angustifolia en período de seca 3.1.1- Influencia de la aplicación de fungicidas en fase preparativa (fase 0) sobre el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia En experimentos preliminares, se determinó que las yemas axilares colectadas de plantas adultas mostraban bajos porcentajes de brotación de yemas y elevadas pérdidas por contaminación microbiana. Debido a lo anterior, fue necesario rejuvenecer el material vegetal y mantener las plantas en condiciones semi-controladas de casa de cultivo. Para el establecimiento del banco de plantas donantes rejuvenecidas se colectó material vegetal (secciones de tallos o estacas) de tres plantones de Guadua, ubicados en el Jardín Botánico de Cienfuegos, en el Jardín Botánico Copainicú de la provincia Granma y en el Jardín Botánico de la provincia Holguín. Los tallos se seccionaron de manera que cada segmento contenía una yema. Las estacas, se sembraron en recipientes de cultivo de policarbamato de 500 ml de capacidad, que contenían un sustrato compuesto por una mezcla de zeolita (30%) y materia orgánica (70%). Se mantuvo un ciclo de riego de 81 seg, cada cinco minutos de manera que era posible mantener el sustrato húmedo. Se aplicó una fertilización foliar diaria de fórmula completa con el empleo del fertilizante comercial Bayfolan ® forte (25 ml.L-1).. 24.

(29) Materiales y Métodos A los dos meses de cultivo, cuando las yemas brotadas tenían entre 10 y 20 cm de altura, las estacas se trasplantaron a bolsas de polietileno de 25.0 x 12.5 cm. Durante esta etapa se empleó un sustrato similar al descrito anteriormente. Una vez en bolsas, se realizaron dos riegos diarios. Para estimular la brotación de las yemas de las plantas rejuvenecidas, se realizaron semanalmente, aplicaciones foliares de 6- belcilaminopurina (6-BAP) en una concentración de 500mg.L-1 y 1000 mg.L-1 de giberelina-A-3 (AG3). Con el objetivo de disminuir los niveles de contaminación fúngica durante el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua se realizaron aplicaciones de fungicidas sistémicos y protectactes. Los fungicidas empleados fueron Silvacur Combi CE 30 (Tebuconazol + Triadimenol) en concentración de 2.0 ml.L-1; Mancozeb® (4.0g.L-1) y Cuproflow SC (oxicloruro de cobre) en concentración de 2.0 ml.L-1. Fueron colectadas yemas axilares de plantas a las que no se le aplicaron fungicidas (control), plantas con un ciclo de aplicación de fungicidas y plantas con dos ciclos de aplicación de fungicidas. Un ciclo de fungicidas estuvo compuesto por: aplicación de Silvacur, pasados tres días, se realizó aplicación de Mancozeb® + Cuproflow, en las concentraciones antes mencionadas y comprendió además las fertilizaciones. Entre cada ciclo medió un período de tres días. Para la colecta de las yemas se empleó una tijera de poda y se seleccionaron cuidadosamente. Se cortó a ambos lados de la yema 1.5cm del tallo. Solamente se tomaron aquellas yemas axilares que estaban bien diferenciadas como se muestra en la figura 1 y se colocaron en un frasco de cultivo con agua antes de pasar al proceso de desinfección.. 25.

(30) Materiales y Métodos. Figura 1. Aspecto de yemas axilares de Guadua seleccionadas de plantas rejuvenecidas, para establecer in vitro. Los explantes fueron lavados con agua corriente por tres horas. Posteriormente se realizó la desinfección con etanol (70 %) durante tres minutos, seguido de tres lavados con agua estéril e inmersión en NaOCl (3.0 %), durante 20 minutos. Finalmente se hicieron tres enjuagues con agua estéril. Posterior a la desinfección se procedió a eliminar los extremos de cada sección de tallo que contenía la yema y se colocaron en el medio de cultivo (Figura 2).. Figura 2. Yemas axilares en el medio de cultivo para el establecimiento in vitro de Guadua. Para el establecimiento de las yemas se empleó el medio de cultivo compuesto por sales y vitaminas propuesto por Murashige y Skoog (1962), suplementado con 0.2 mg.Lˉ1 de 6-BAP, mio-inositol (100 mg.Lˉ1), sacarosa (30 g.Lˉ1), como. 26.

(31) Materiales y Métodos gelificante se usó Gelrite® (SIGMA), en concentración de 2.5g.Lˉ1. Este medio de cultivo se empleó en los restantes experimentos y se especificará en cada uno las variaciones correspondientes. Los frascos de cultivo fueron colocados en cámaras de crecimiento de luz solar donde la densidad de flujo de fotones fotosintéticos (DFFF) osciló entre 48.062.5 μmol.m-2 s-1 con una temperatura de 27± 2º C. Se realizaron dos repeticiones con 30 explantes por tratamientos. A los 10 días de cultivo se evaluó el número de yemas contaminadas con microorganismos visibles y a los 18 días de cultivo, el número de yemas brotadas y el número de yemas por explante. 3.1.2- Acción de diferentes tipos y concentraciones de desinfectantes en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Este experimento tuvo como objetivo, evaluar el efecto de diferentes desinfectantes y concentraciones de éstos en el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua. Las mismas fueron sometidas a dos ciclos de aplicaciones de fungicidas sistémicos y protectantes. Se estudió el efecto de dos desinfectantes, NaClO y bicloruro de mercurio (HgCl2). En la tabla 1 se muestran los cuatro tratamientos, cada uno contó con 15 explantes. Tabla 1. Tipos y concentraciones de los desinfectantes aplicados a las yemas axilares. Tratamientos Desinfectante Concentración 1 NaClO 1.0 % 2 NaClO 2.0 % 3 NaClO 3.0 % 4 HgCl2 50 mg.L-1. 27.

(32) Materiales y Métodos Las yemas fueron lavadas con agua corriente por tres horas, seguidamente, se sumergieron. en etanol (70 %) durante tres minutos. Posteriormente. permanecieron en las soluciones de desinfectantes. de NaClO (1.0, 2.0 y. 3.0%), y HgCl2 durante 20 minutos. Se realizaron posteriormente, tres enjuagues con agua estéril. Los tallos se seccionaron y se colocaron en el medio de cultivo.. Al emplear la solución de HgCl2, se cumplieron las normas establecidas por la ficha de datos de seguridad Merck (2004). A los 10 días de cultivo se evaluó el número de yemas contaminadas con microorganismos y a los 18 días de cultivo se evaluó el número de yemas brotadas, el número de yemas vivas (% de supervivencia) y número de yemas brotadas por explante. Estos datos se emplearon para calcular el porcentaje correspondiente en cada caso. 3.1.3- Efecto de diferentes tiempos de desinfección con hipoclorito de sodio en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Una vez determinado el desinfectante a utilizar y su concentración, se realizó este experimento, con el objetivo de estudiar el efecto de diferentes tiempos de desinfección en el establecimiento de las yemas axilares. Las yemas brotadas se midieron auxiliándose de un pie de rey (e=0.05) y la desinfección, se realizó tal como se describe en el experimento 3.1.1, con el empleo de hipoclorito de sodio a la mejor concentración del experimento anterior. Los explantes se sometieron a diferentes tiempos de desinfección 5.0, 10 y 20 minutos. Se realizaron dos repeticiones con 15 explantes por tratamientos.. 28.

(33) Materiales y Métodos A los 10 días de cultivo, se evaluó el número de yemas contaminadas con microoganismos y a los 18 días de cultivo el número de yemas brotadas, el número de yemas vivas y tamaño de los brotes, según la escala elaborada (Tabla 2). Estos datos se emplearon para calcular el porcentaje de cada una de las variables evaluadas. Tabla 2. Escala de tamaño para las yemas brotadas. Longitud de la yema axilar Escala cm Grado de tamaño < 0.5 1 ≥ 0.5 -1.0 2 > 1.0 3. 3.1.4- Efecto del estado físico del medio de cultivo en el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua angustifolia Este experimento se realizó con el objetivo de estudiar la influencia del estado físico del medio de cultivo sobre el establecimiento y supervivencia de las yemas axilares. Se estudiaron tres tratamientos, en el primero de ellos se empleó el medio de cultivo en estado líquido y en los otros dos tratamientos, estado semisólido. Se empleó como gelificante el Gelrite® (SIGMA), en concentraciones de 2.5 g.L -1 y 3.5 g.L -1 y cuando se utilizó medio de cultivo líquido, se empleó como soporte, papel de filtro, sobre el cual fueron colocados los explantes, con la parte abaxial en contacto con el medio de cultivo. Se evaluó a los 10 días de cultivo el número de yemas contaminadas con microorganismos y a los 18 días: el número de yemas brotadas y el número de yemas vivas. Estos datos se emplearon para calcular el porcentaje de cada uno de los aspectos evaluados. Se realizaron dos repeticiones con 20 explantes por tratamiento. 29.

(34) Materiales y Métodos A los explantes con 18 días en fase de establecimiento que mostraron cambio de coloración a pardo-negrusco en las yemas brotadas, se les realizaron cortes transversales. Con el objetivo de comprobar la existencia de muerte celular. Para ello se emplearon cuchillas finas. Las secciones de tejido se tiñeron con Diacetato de Fluoresceína (FDA), según la técnica propuesta por Widholm (1972). Las observaciones se realizaron al microscopio óptico AXISKOP, acoplado a una cámara Olympus DP 70; con procesador de imágenes Olympus DP Controller. 3.2- Establecimiento de Guadua angustifolia en período de lluvia Los experimentos correspondientes a este período, se extendieron desde finales del mes de Mayo a principios del mes de Agosto. Mediante observaciones diarias se determinó que la brotación y contaminación microbiana. comenzó a partir del tercer día de cultivo. Por esta razón las. evaluaciones se realizan semanalmente. 3.2.1- Efecto de diferentes tiempos de desinfección en período de lluvia sobre el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia En experimentos preliminares se determinó, que el protocolo de desinfección empleado en época de seca, no era efectivo y los explantes eran afectados por microorganismos contaminantes. Por tal motivo se decidió aumentar la concentración del desinfectante empleado a un 2.0 %, debido a que se comprobó que una concentración mayor, puede disminuir el por ciento de supervivencia de los explantes, debido a los daños que puede ocasionar sobre los haces vasculares. Se evaluó el efecto de la desinfección por diez, 15 y 20 minutos.. 30.

(35) Materiales y Métodos A los siete días de cultivo se evaluó el número de yemas contaminadas, número de yemas brotadas y tamaño de brote. Estos resultados se emplearon para calcular el porcentaje de cada una de las variables evaluadas. 3.2.2- Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP y las condiciones de luz solar y oscuridad en el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua angustifolia Este experimento se realizó con el objetivo de lograr un desarrollo rápido del brote, para ello se estudió la influencia de la luz solar y la oscuridad con diferentes concentraciones de 6-BAP. El medio de cultivo empleado fue similar al descrito en el experimento 3.1.1; pero se estudiaron tres concentraciones de 6-BAP (1.5, 2.5 y 3.5 mg.L-1). Como gelificante se empleó Gelrite® a una concentración de 2.5 g.L-1. Luego de la siembra, los explantes fueron colocados en cámaras de luz solar o en la oscuridad (28± 2º C). Se conformó un experimento bifactorial, con dos repeticiones en el tiempo y 15 explantes por tratamiento. Se evaluó a los siete y a los 15 días de cultivo el número de yemas contaminadas con microorganismos, el número de yemas brotadas, el número de yemas vivas. Estos datos se emplearon para calcular el porcentaje de cada variable evaluada. Además se evaluó el tamaño de las yemas brotadas. 3.3- Identificación cualitativa de compuestos orgánicos presentes en yemas axilares ex vitro e in vitro de Guadua angustifolia En los experimentos en los que se establecieron las yemas en época de seca, se produjo la muerte de las yemas brotadas a partir de los 18 días de cultivo. Este fenómeno pudo estar dado, entre otras causas, por la producción de fenoles.. 31.

(36) Materiales y Métodos Se tomaron yemas axilares de plantas rejuvenecidas de Guadua tal como se describe en el experimento 3.1.1 y se colectaron además todos los explantes muertos a partir de los 18 días de cultivo en los experimentos desarrollados en época de seca. Se mantuvieron independientes las muestras vegetales provenientes de las plantas rejuvenecidas y los explantes de cada uno de los experimentos de establecimiento in vitro. Tamizaje fitoquímico Para la formación de los extractos, se tomaron tanto para los explantes ex vitro como in vitro, 15 gramos de materia seca, a los que se le adicionaron 150 ml de éter etílico, transcurridas 48 horas, se procedió a la filtración del extracto. Se realizaron los ensayos correspondientes al filtrado. Al remanente, se le adicionó 150 ml de etanol, para la formación del extracto alcohólico y se procedió de igual forma. Por último se adicionaron 150 ml de agua destilada, realizándose también a las 48 horas los ensayos correspondientes al extracto acuoso.. Con la finalidad de lograr el mayor agotamiento de la muestra, el esquema utilizado para esta técnica, fue la extracción sucesiva con solventes de polaridad creciente. Se determinó en cada extracto, los compuestos orgánicos que de a acuerdo con su solubilidad podían ser extraídos en estos solventes. El secado del material vegetal se realizó en estufa con recirculación de aire, durante 48 horas a una temperatura de 45 ± 2 oC. Posteriormente las muestras fueron fragmentadas en un molino de cuchillas, y se tamizaron hasta un tamaño de 0.75 mm. Todos los análisis fitoquímicos (Tabla 3), fueron realizados según el protocolo propuesto por Evans (1991) (Anexo 1).. 32.

(37) Materiales y Métodos Tabla 3. Ensayos realizados en cada uno de los extractos empleados en los tamizajes fitoquímicos de explantes in vivo e in vitro de Guadua. Extracto etéreo. etanólico. acuoso. Ensayos Dragendorff y Mayer Baljet Sudán III Resinas Liebermann- Burchard Espuma Nihidrina Dragendorff y Mayer Baljet Kedde Fehling Cloruro férrico Borntrager Shinoda antocianidinas Espuma Fehling Shinoda Cloruro férrico Dragendorff y Mayer Principios amargos. Compuestos que identifica alcaloides coumarinas ácidos grasos Resinas triterpenos y/o esteroides saponinas aminoácidos libres alcaloides coumarinas glicósidos cardiotónicos carbohidratos reductores fenoles y/o taninos quinonas flavonoides antocianidinas saponinas carbohidratos reductores flavonoides fenoles y/o taninos alcaloides Principios amargos. 3.4- Identificación cuantitativa de polifenoles en el medio de cultivo durante el establecimiento in vitro de Guadua angustifolia Cuantificación de polifenoles totales El objetivo de este experimento fue determinar la presencia de fenoles en el medio de cultivo de explantes muertos, atendiendo a criterios de la literatura científica, donde se atribuye a la aparición de estos compuestos un papel importante en el fenómeno de necrosis. Se colectó el medio de cultivo de las yemas muertas que se emplearon para realizar el tamizaje fitoquímico. Al no encontrarse en la literatura científica referencias de estas técnicas para este fin en Poaceas, para la cuantificación de los fenoles totales previamente identificados en el tamizaje fitoquímico, se tomó como referencia, la técnica. 33.

(38) Materiales y Métodos empleada para esta finalidad en Quimefa-Cuba, para Maguifera indica (Anexo 2). Se prepararon previamente las soluciones patrones de reactivo para taninos, carbonato de sodio (20 %) y ácido tánico (0.25 mg.ml), según normas (Anexo 2) la solución de fenol reactivo (0.180 mg.ml-1) y la disolución de la muestra como sigue: Disolución de la muestra de sustancias secretadas al medio de cultivo Se añadió 5.0 ml de etanol por tubo de ensayo de 20 x 1.5 cm de alto y diámetro respectivamente que contenían 10 ml de medio de cultivo. La extracción de los polifenoles se realizó en etanol durante 72 horas, luego se filtró el extracto etanólico, y se tomó 1ml, se añadió a un matraz de 100 ml y se pesó en balanza analítica. Posteriormente se enrazó con agua destilada estéril y homogenizó.. Para el cálculo de los fenoles totales se empleó la expresión: % de fenoles totales base húmeda =AM x PST x 60 / AST x PM. Donde: AM – absorbancia de la muestra; PST – peso del patrón en mg; AST – absorbancia del patrón y PM – peso de la muestra en mg. Todo el procedimiento, fue realizado según normas (Anexo 2). Análisis cromatográfíco de alta resolución (HPLC) Con el objetivo de lograr la identificación y cuantificación, de fenoles totales, previamente se prepararon los patrones de ácido tánico (0.05 mg.ml -1), y de fenol reactivo (0.180 mg.ml-1). La muestra consistió en el filtrado del extracto etanólico, descrito en la técnica anterior. De estas disoluciones, se inyectaron 20 µL a una columna de fase reversa (KROMASIL 100 C18, 10 µm, 25 cm* 0,4 cm, precolumna C18) acoplada a un. 34.

(39) Materiales y Métodos cromatógrafo líquido de alta resolución (KNAUER) con detector UV-Vis a longitud de onda de 254 nm. Las separaciones se realizaron en sistema isocrático con fase móvil: metanol-H2O-ácido acético (50:50:1) y un flujo de 1.0 ml por minuto, procesándose los resultados en Software ChromGate®.. 35.

(40) Resultados y Discusión. 4- Resultados y Discusión 4.1 Establecimiento de Guadua angustifolia en período de seca Durante el desarrollo de estos experimentos, las yemas tomadas de plantas rejuvenecidas se encontraban poco turgentes, pequeñas y mostraban una coloración verde ténue. 4.1.1- Influencia de la aplicación de fungicidas en fase preparativa (fase 0) sobre el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Se estableció un banco de plantas donantes rejuvenecidas. En el mismo se observó que la brotación de las yemas (Figura 3), comenzó a los 24 días de cultivo y se comprobó que el crecimiento promedio diario de la planta fue de aproximadamente 6.0 mm. A los dos meses de cultivo, las yemas brotadas tenían entre 10 y 20 cm de longitud, y se encontraban en condiciones de ser transplantadas a bolsas. Olmos et al. (2004), plantean la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento a plantas donadoras de explantes, sobre todo en especies leñosas.. A. B. Figura 3. Material vegetal en casa de cultivo. A: Yemas brotadas en frascos de policarbamato; B: Plantas rejuvenecidas en bolsas de polietileno.. Mediante observaciones diarias, se determinó que la brotación in vitro de las yemas comenzó a partir del séptimo día de cultivo. Se logró un 100% de explantes libres de contaminantes microbianos visibles en el medio de cultivo, con la aplicación de dos ciclos de fungicidas (tratamiento. 36.

(41) Resultados y Discusión 3), donde se observó diferencias estadísticas con respecto a los tratamientos restantes (Tabla 4). Autores como Mroginski et al. (2004) sugieren realizar una adecuada preparación de la planta donadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernadero tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos. Con la aplicación de fungicidas en fase 0, se logró disminuir los porcentajes de contaminación microbiana durante el establecimiento in vitro. Con la aplicación de dos ciclos de fungicidas (Tratamiento2), se logró una reducción de los porcentajes de contaminación, con respecto a los tratamientos donde se aplicó un ciclo de fungicidas y al control, con diferencias estadísticamente significativas. La zona de tejido que se utiliza para iniciar el cultivo in vitro tiene gran influencia en la efectividad de la desinfección, de ahí la importancia de evitar la toma directa de plantas de campo y la necesidad de la fase preparativa (Hernández et al., 1996). Resultados similares se han obtenido en otras leñosas como Mangifera indica, donde se logró disminuir la presencia de contaminantes en explantes al utilizar fungicidas (Borges et al., 1997). Tabla 4. Efecto de la aplicación de fungicidas en fase 0, sobre la contaminación y brotación de las yemas axilares in vitro Tratamientos. Yemas contaminadas (%). Yemas Brotadas (%). 1 2 3. 39.13 b 0.00a 81.36 c. 15.22b 23.53b 37.45a. Medias con letras diferentes dentro de una misma columna difieren según prueba de comparación de proporciones. 37.

(42) Resultados y Discusión. Tratamientos: 1: Aplicación de un ciclo de fungicidas sistémicos y protectantes. 2: Aplicación de dos ciclos de fungicidas sistémicos y protectantes. 3: Control sin aplicación de fungicidas sistémicos y protectantes. A los 18 días de cultivo, se obtuvo un 37.45% de yemas brotadas en el tratamiento control, con diferencias estadísticas respecto a los dos tratamientos restantes. Lo que demostró que la aplicación de fungicidas tuvo un efecto fitotóxico sobre las yemas axilares. Sin embargo, los mayores valores de la variable número de yemas brotadas por explante (0.47 y 0.29) se observaron en los tratamientos donde se aplicó fungicidas (Figura 4), lo cual pudo deberse a que una menor es la carga de microorganismos contaminantes visibles, conlleva a un incremento de la brotación, al disminuir o desaparecer el efecto. Promedio de yemas brotadas. negativo de estos contaminantes sobre el explante.. 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0. 0,47a. 0,29ab 0,17b. T1. T2. T3. Tratamientos. EE ± 0.05 Medias con letras diferentes dentro de una misma columna, difieren (p<0.05) según Duncan.. Figura 4. Efecto de la aplicación de fungicidas en fase 0, sobre el promedio de yemas brotadas por explante de Guadua. 38.

(43) Resultados y Discusión. 4.1.2- Acción de diferentes tipos y concentraciones de desinfectantes en el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Los resultados demostraron (Tabla 5), que el número de yemas contaminadas con microorganismos visibles fue menor cuando se empleó hipoclorito de sodio al 3.0 % y bicloruro de mercurio (50 mg.L-1), cuyos valores difirieron estadísticamente de los tratamientos donde se aplicó hipoclorito de sodio al 1.0 y 2.0 %. Resultados similares obtuvo para esta misma especie, Marulanda et al. (2005), quien alcanzó un 74.6 % de explantes libres de contaminación microbiana al emplear bicloruro de mercurio (0.3%) durante 10 minutos. En otras especies de bambúes como Dendrocalamus strictus, Bambusa arundinacea, Dendrocalamus Asier, Phyllostachys edulis, Dendrocalamus giganteus y Bambusa polymorfa, se emplea para la desinfección de los explantes, hipoclorito de sodio 0.1 %, durante 5 min, combinado con inmersión en bicloruro de mercurio (0.1%), durante cinco minutos (ICFRE, 2002). Sin embargo, en otras plantas leñosas como la caoba (Swietenia macrophylla), Collado et al. (2004) para el establecimiento in vitro de ápices y segmentos nodales obtuvo los mejores resultados con la utilización de NaClO al 3.0 % durante 20 minutos. Autores como Ramírez et al. (1999) lograron la desinfección total de explantes nodales en Psidium guajava y P. friedrichsthalianum con el uso de nitrato de plata y bicloruro de mercurio. Chung y Carrasco (2000) en sauce (Salix spp), para este mismo tipo de explante, utilizaron una mezcla de ácido clorhídrico (HCl) al 10 % y fungicidas por 20 y 30 minutos respectivamente.. 39.

(44) Resultados y Discusión La contaminación de explantes provenientes de plantas leñosas, es sin lugar a dudas, una limitante para el establecimiento in vitro de algunas especies. Tabla 5. Efecto de los tipos y concentraciones de desinfectantes evaluadas para el establecimiento in vitro de las yemas axilares de Guadua angustifolia Tratamientos. Yemas brotadas (%). Supervivencia (%). Yemas contaminadas (%). NaClO (1.0%).. 100ª. 86.67ª. 18.18b. NaClO (2.0%).. 85.71b. 78.57ba. 14.29 b. NaClO (3.0%).. 73.33b. 45.45b. 6.67ª. -1. b. ba. 5.67 a. HgCl2 (50mg.L ). 86.67. 66.67. Medias con letras diferentes dentro de una misma columna difieren según prueba de comparación de proporciones. Para la variable brotación de las yemas, a los 20 días de cultivo, los mejores resultados, se alcanzan en el tratamiento donde se empleó NaClO (1.0%), alcanzándose un 100 % de yemas brotadas y se observó diferencias estadísticas con respecto a los tratamientos donde se empleó NaClO (2.0 y 3.0 %) y HgCl2 con valores de 85.71, 73.33 y 86.67 % respectivamente. Fue este también el tratamiento en el que se obtuvieron los mayores valores de supervivencia (86.67%) y el mayor número de yemas por explante (Figura 5). Este comportamiento pudo estar dado, a que la utilización de una. menor. concentración de NaClO, disminuyó el daño en los tejidos de las yemas. Los valores más bajos de supervivencia (45.45%), se obtuvieron cuando se empleó NaClO (3.0 %). Tanto el tipo de desinfectante, como su concentración tiene una relación directa con cada parámetro estudiado. Se demuestra que la utilización de la mayor concentración NaClO, tuvo un efecto negativo sobre el establecimiento de las yemas axilares, al producir mayor mortalidad por fitotoxicidad.. 40.

(45) Resultados y Discusión Resultados similares obtuvieron (Chung y Carrasco, 2000) en Salix spp, quienes observaron que el empleo de cloro comercial por un tiempo superior a 30 minutos indujo necrosis de los tejidos de los segmentos nodales en establecimiento. El mayor número de yemas por explante (1.36 y 0.93), se alcanzó en los tratamientos en los que se empleó NaClO (1.0 y 2.0 %). Con diferencias estadísticas entre éstos y los tratamientos donde se utilizó NaClO (3.0 %) y. Número de yemas por explante. HgCl2 (50 mg.L-1).. 1,6 1,4. 1,36a. 1,2 0,93a. 1 0,8. 0,64b. 0,6b. 0,6 0,4 0,2 0 NaClO (1.0%). NaClO (2.0%). NaClO (3,0%). HgCl2. Tratamientos. EE ± 0.08 Medias con letras diferentes dentro de una misma columna, difieren (p<0.05) según Duncan. Figura 5. Efecto de los tipos y concentraciones de desinfectantes evaluadas sobre el promedio de yemas axilares brotadas de Guadua angustifolia A partir de los resultados obtenidos, se determinó que para la desinfección de las yemas axilares se debe usar del hipoclorito de sodio (1.0 %). Autores como Ramírez et al. (1999), plantean que es conveniente utilizar desinfectantes superficiales poco tóxicos, como el hipoclorito de sodio.. 41.

(46) Resultados y Discusión 4.1.3- Efecto de diferentes tiempos de desinfección con hipoclorito de sodio para el establecimiento in vitro de yemas axilares de Guadua angustifolia Con la disminución del tiempo de desinfección a cinco minutos, de logró mayor número de yemas brotadas por explante, con diferencias estadísticas con respecto a 10 y 15 minutos (Figura 6). El tiempo de desinfección no mostró influencia sobre las variables yemas contaminadas (23.2 %), brotadas, tamaño y supervivencia de los explantes, pues no se mostraron diferencias estadísticas entre los tratamientos. Resultados similares obtuvieron Montes y Andrea (1998), quienes plantean que el método más efectivo para la desinfección de yemas axilares de Guadua angustifolia Kunth, es el empleo de hipoclorito de sodio al 1.0 % durante 10 minutos.. Promedio de yemas brotadas. 3 2,5. 2.4a. 2. 1.43 b. 1,5. 1.17 b. 1 0,5 0 5. 10. 20. Tiempo de desinfección con NaClO (min). EE ± 0.16 Medias con letras diferentes difieren (p<0.05) según Duncan.. Figura 6. Efecto del tiempo de inmersión en NaClO (2.0 %), sobre el número de yemas brotadas por explante. Los valores de supervivencia de los explantes, son de vital importancia para la etapa de establecimiento in vitro de esta especie. Alrededor de los 18 días de cultivo, se observó un aumento de la necrosis, los porcentajes de supervivencia se encontraron entre el 61.40 y el 56.25 % (Figura 7). Según Marks y Simpson (1990) y Dalal et al. (1992), el establecimiento in vitro de tejidos procedentes de. 42.