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Efecto de bioestimulantes agrícolas en la supervivencia y el crecimiento de plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp ) en la fase de aclimatización ex vitro

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Academic year: 2020

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(1)UNIVERSIDAD CENTRAL ʺMARTA ABREUʺ DE LAS VILLAS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA AGRÍCOLA. Tesis presentada en opción al título académico de Máster en Ingeniería Agrícola. Efecto de bioestimulantes agrícolas en la supervivencia y el crecimiento de plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp.) en la fase de aclimatización ex vitro.. Ing. Dunia Núñez Jaramillo. Santa Clara, 2018.

(2) Universidad Central ʺMarta Abreuʺ de Las Villas Facultad de Ciencias Agropecuarias Departamento de Ingeniería Agrícola. Efecto de bioestimulantes agrícolas en la supervivencia y el crecimiento de plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp.) en la fase de aclimatización ex vitro.. Tesis presentada en opción al título académico de Máster en Ingeniería Agrícola Autora: Ing. Dunia Núñez Jaramillo Tutores: Dra. C. Emma B. Pineda Ruiz Dr. C. Rafael Gómez Kosky. Santa Clara, 2018.

(3) "Con el conocimiento se acrecientan las dudas". Goethe.

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(5) Dedicatoria A mis padres: por ser ellos el faro que me señalaron la ruta a seguir y por dotarme de este bien maravilloso que tanto agradezco: La vida. A mis hijas por ser ellas la fuente de energía que me inspira a seguir adelante. A Pablo: que gracias a él pude hacer más fácil este camino..

(6) Agradecimientos.

(7) Agradecimientos. A través de las siguientes líneas quiero agradecer a todos aquellos a los que debo que este sueño se hiciera realidad: A dios por darme salud para realizar este trabajo. A mis tutores Dra. C Emma Pineda Ruiz y el Dr. C Rafael Gómez Kosky por haber dedicado parte de su preciado tiempo, esfuerzo y cariño. Por ofrecerme además, valiosos conocimientos, los cuales posibilitaron mi desarrollo investigativo. A la dirección de la Estación territorial de investigaciones de la caña de azúcar por haber permitido que me superara e hiciera realidad este sueño. A mi familia que ha estado cerca de mí en la realización de este trabajo. A Pablo que siempre me ha animado a seguir adelante y a luchar por lo que quiero..

(8) Agradecimientos. A todas aquellas personas que de una forma u otra han colaborado y contribuido en la realización de este trabajo de Maestría. A la Revolución por haberme dado la posibilidad de cumplir mi sueño como MSc. En Ingenieria Agrícola; permitirme llegar a este importante momento de la vida y darme la oportunidad de estudiar y superarme, de acuerdo a los principios del socialismo. Gracias.

(9) Resumen.

(10) Resumen RESUMEN Un factor crítico en un protocolo de propagación in vitro de caña de azúcar es la supervivencia y crecimiento de las plantas en condiciones ex vitro de cultivo. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto del Fitomas-E® y el VIUSID Agro® durante la aclimatización ex vitro de caña de azúcar cultivar C90-469, en condiciones de umbráculo. Se evaluaron tres disoluciones (0; 0,5 y 0,8 mL L-1 ) de ambos bioestimulantes y dos aplicaciones diarias, los primeros tres días y posteriormente una vez por semana. Los experimentos se llevaron a cabo en época de seca y lluvia. En la época seca se emplearon plantas in vitro con una altura mayor a 3,0 cm y en la época de lluvia se utilizaron dos grupos de plantas ≤ 3,0 cm y > 3,0 cm.. Las diferentes variables evaluadas fueron la. supervivencia a los 15 días, ahijamiento a los 21 días y las morfo-fisiológicas a los 45 y 60 días después del trasplante. El mejor resultado para la supervivencia se alcanzó con la disolución de 0,5 y 0,8 mL L-1 de VIUSID Agro® y 0,8 mL L-1 Fitomas-E® en plantas mayores de 3,0 cm en la época de seca y ambas del VIUSID para las diferentes variables de crecimiento evaluadas. En la época de lluvia no se encontraron diferencias entre disoluciones y tipo de bioestimulantes, para la variable supervivencia. en plantas menores. de 3,0 cm, pero si superaron al control en más de 21,0%, sin embargo 0.5 fue superior en las plantas mayores de 3,0 cm. Sin embargo, para el ahijamiento, con 0,8 mL L-1 VIUSID Agro® en época seca y ambas disoluciones de VIUSID Agro® en época de lluvia. De forma integral 0,5 mL L-1 de VIUSID Agro®tuvo un mayor efecto sobre las variables morfofisiológicas en las plantas mayores de 3,0 cm y 0,8 mL L-1 para las plantas menores de 3 cm.. Palabras clave: aclimatización ex vitro, caña de azúcar, planta in vitro, supervivencia, VIUSID Agro®.

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(12) Abstract ABSTRACT A critical factor in in vitro propagation sugarcane protocol is the survival and growth of the ex vitro plants in culture conditions. The objective of this work was to determine the effect of Fitomas-E® and VIUSID Agro® during the ex vitro acclimatization of sugarcane cultivar C90-469, under umbrage conditions. Three solutions (0; 0,5 and 0,8 mL L-1 ) of both biostimulants were evaluated and two daily applications, the first three days and then once a week. The experiments were carried out during the dry and rainy seasons. In the dry season in vitro plants with a height greater than 3,0 cm were used and in the rainy season two groups of plants ≤ 3,0 cm and > 3,0 cm were used. The different variables evaluated were survival at 15 days, tillering at 21 days and morpho-physiological at 45 and 60 days after transplantation. The best result for survival was reached with the dissolution of of VIUSID Agro® 0,5 and 0,8 mL L-1 and Fitomas-E® 0,8 mL L-1 in plants greater than 3,0 cm at the time of dry and both of the VIUSID for the different growth variables evaluated. In the rainy season, no differences were found between solutions and type of biostimulants, for the survival variable in plants less than 3,0 cm, but they exceeded the control by more than 21,0%, however 0,5 mL L-1 was higher in plants greater than 3,0 cm. However, for tillering, with VIUSID Agro® 0,8 mL L-1 in the dry season and both solutions of VIUSID Agro® in the rainy season. Integrally VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 of had a greater effect on morpho-physiological variables in plants greater than 3,0 cm and 0,8 mL L-1 for plants smaller than 3 cm.. Keywords: ex vitro acclimatization, in vitro plant, sugarcane, survival, VIUSID Agro®.

(13) Índice.

(14) Índice Índice 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 6 2.1 La caña de azúcar. Generalidades del cultivo ............................................................... 6 2.1.1 Taxonomía y origen ............................................................................................... 6 2.1.2 Importancia económica.......................................................................................... 7 2.1.3 Cultivar C90-469 ................................................................................................... 8 2.1.4 Principales enfermedades ...................................................................................... 8 2.2.2 Propagación in vitro de la caña de azúcar ............................................................. 9 2.3 Fase de Aclimatización ex vitro.................................................................................. 11 2.4. Los bioestimulantes. Su importancia ......................................................................... 13 2.4.1 FitoMas-E® .......................................................................................................... 14 2.4.2 VIUSID Agro® ..................................................................................................... 15 3. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 20 3.1 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en la supervivencia y el ahijamiento ....................................................................................................................... 22 3.2 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en el crecimiento de las plantas in vitro en condiciones de aclimatización ex vitro .............................................. 22 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 25 4.1 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en la supervivencia y el ahijamiento ....................................................................................................................... 25 4.2 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en el crecimiento de las plantas in vitro en condiciones de aclimatización ex vitro .............................................. 35 5. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 47 6. RECOMENDACIONES................................................................................................... 48 7. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 8. ANEXOS.

(15) Introducción.

(16) Introducción 1. INTRODUCCIÓN La caña de azúcar (Saccharum spp.) es uno de los cultivos agroindustriales más importantes a nivel mundial. Está distribuida en más de 100 países sobre un área de 26 millones de hectáreas, fundamentalmente en las zonas tropicales y subtropicales. Ocupa el lugar 12 en cuanto al área cultivada de un total de 161 especies de interés agroindustrial (Portal caña, 2018). En Cuba se encuentra distribuida en todo el territorio nacional y ocupa alrededor de 642 243,3 ha, según el censo anual de cultivares realizado por el Instituto de Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA), lo que representa cerca del 40% del área total cultivada (Mesa et al., 2016). La palabra micropropagación ha sido utilizada para definir las distintas técnicas empleadas para la multiplicación de plantas in vitro y tiene como premisa que las plantas resultantes del proceso sean fenotípica y genotípicamente idénticas a la planta que les dio origen. Siendo la técnica de formación de yemas axilares el sistema de regeneración más empleado para la producción de plantas in vitro con fines comerciales, debido a la estabilidad genética del material que se obtiene y la facilidad con que puede ser establecido el método en diferentes especies. En el caso de la caña de azúcar, cobra especial importancia esta forma de propagación dados los problemas sanitarios relacionados con la producción de semilla por métodos tradicionales. Además los bajos coeficientes de multiplicación de esta especie que impide la rápida propagación de plantas libres de enfermedades y la introducción a la producción de cultivares promisorios. La aclimatización de las plantas in vitro es un aspecto fundamental en la culminación de dicho proceso. El cultivo de las misma en condiciones in vitro hace que estas se desarrollen 1.

(17) Introducción muy débiles, puesto que crecen bajo condiciones simuladas y en un frasco de cultivo cuya humedad relativa es alta. El ambiente ex vitro alcanza una humedad relativa del 70% (George, 2008), por lo que al momento de colocar las plantas en condiciones ex vitro, la supervivencia de las mismas se ve afectada. Además las hojas no presentan cutícula y tienen baja actividad fotosintética. Esta es la fase más difícil del cultivo, cuando las plantas in vitro son transferidas del ambiente aséptico y rico en nutrientes del frasco de cultivo para iniciar su desarrollo en condiciones ex vitro. Cuando las plantas in vitro son transferidas del ambiente aséptico y rico en nutrientes en el frasco de cultivo para iniciar su desarrollo en condiciones ex vitro, es la fase más difícil del cultivo. Esto requiere de condiciones adecuadas y grandes cuidados para evitar pérdidas por exceso de agua y el ataque de patógenos (Martínez et al., 2005). Los primeros días en la fase de aclimatización ex vitro son vitales para la planta, esta debe encontrarse bajo una humedad relativa cercana al 90% y con 30% de exposición a la luz. La humedad relativa se disminuye y aumenta la luz en la medida que la planta cree y se adapta a las condiciones ambientales (Clapa, Fira y Joshee, 2013). En los últimos años y a causa de hacer más eficiente los sistemas productivos, varias industrias agroquímicas han dispuesto en el mercado complejos nutritivos que contienen micronutrientes,. aminoácidos y extractos vegetales, los cuales se han denominado. “promotores” de crecimiento o bioestimulantes. Estos influyen en el crecimiento y desarrollo de los cultivos; incrementan la floración y mejoran la fructificación de los mismos. Además, este tipo de producto está demostrado que no afecta el ambiente y la salud de la población (Catalysis, 2017).. 2.

(18) Introducción El VIUSID Agro® y el FitoMas-E® constituyen formulaciones que se utilizan como estimulantes del crecimiento de las plantas. El primero tiene la particularidad de que todos sus componentes (aminoácidos, vitaminas y minerales) son sometidos a la técnica de activación molecular, procedimiento este que le imprime un aumento considerable en la acción biológica de las sustancias (Catalysis, 2017). El VIUSID Agro® fue utilizado en Honduras por Coello (2010), en cultivos hortícolas, frutales y plátano con buenos resultados en el crecimiento en general de las plantas. Este produjo adelantos del ciclo vegetativo y aumentos de consideración en la floración, fructificación y por consiguiente en la producción final. En Cuba se utiliza por primera vez en el municipio de Taguasco en la provincia de Sancti Spíritus por Expósito (2013), Hernández (2013),. Peña et al. (2016) y Pérez (2013), en los. cultivos de tabaco (Nicotiana tabacum L), tomate (Solanum lycopersicum L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.) y cebolla (Allium cepa L.) respectivamente. En todos los casos se obtuvieron importantes resultados relacionados con el crecimiento de las plantas y las producciones finales. El FitoMas-E® bioestimulante, producido por el Instituto Cubano de Investigaciones en Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA), Cuba. Es obtenido como derivado de la industria azucarera cubana, el cual está compuesto por sustancias bioquímicas de alta energía. propias. nitrogenadas,. de. sacáridos. los. vegetales. superiores,. principalmente. y polisacáridos bioactivos.. aminoácidos,. Este producto. bases. puede aplicarse. directamente al área foliar de la planta, así como en sistemas de fertirriego durante cualquier fase fenológica de un cultivo, independientemente de la parte del vegetal que constituya el interés económico de la cosecha (Montano et al., 2007; Reyes et al., 2016). 3.

(19) Introducción En la fase de aclimatización de la biofábrica ubicada en la Estación Territorial de Investigaciones de la Caña de Azúcar (ETICA Centro-Villa Clara) no se aplican productos con el fin de incrementar la supervivencia y estimular el crecimiento de los diferentes cultivares en el proceso de aclimatización ex vitro para acelerar su desarrollo y aumentar la capacidad del umbráculo al reducir el tiempo de las plantas in vitro en esta fase. En la literatura revisada no se encontró información hasta el presente, sobre la utilización del VIUSID Agro® en la propagación in vitro de la caña de azúcar en general, ni en la fase terminal del proceso, que es donde se garantiza una alta supervivencia y crecimiento de las plantas in vitro para que estas puedan ser llevadas al campo. Sobre el FitoMás-E® existe un solo trabajo informado por Reyes et al. (2011), donde los autores evaluaron disolución al 0.1%. una sola. aplicada en diferentes momentos alcanzando resultados positivos en. este cultivo. Tomando en consideración lo anteriormente expuesto se propone el siguiente problema científico: Es conocido que en la Biofábrica del INICA existen dificultades en los porcentajes de supervivencia y el crecimiento de las plantas in vitro, en el umbráculo que se utiliza como área de aclimatización. ¿Cuáles serán las probabilidades que realizando la aplicación de bioestimulantes se pueda disminuir esta problemática? La presente investigación partió de la siguiente hipótesis: Es posible con la aplicación de bioestimulantes durante el proceso de aclimatización ex vitro incrementar la supervivencia y el crecimiento de plantas in vitro de caña de azúcar. Para validar dicha hipótesis de trabajo se trazaron los siguientes objetivos: 4.

(20) Introducción Objetivo general: Incrementar la supervivencia y el crecimiento de plantas in vitro de caña de azúcar cultivadas bajo umbráculo durante la fase de aclimatización ex vitro. Objetivos específicos: 1. Determinar el efecto de los bioestimulantes (Fitomas-E® y VIUSID Agro®) sobre la supervivencia y el ahijamiento de plantas in vitro de caña de azúcar durante la aclimatización ex vitro en dos épocas de plantación. 2. Determinar el efecto de los bioestimulantes en las características morfo-fisiológicas de plantas in vitro de caña de azúcar en la fase de aclimatización ex vitro en dos épocas de plantación. Novedad Científica Por vez primera hasta el momento, se informa el efecto del VIUSID Agro®. sobre la. supervivencia, ahijamiento y crecimiento de plantas in vitro de caña de azúcar en la fase de aclimatización ex vitro. Además de la evaluación del Fitomas-E® en otros momentos y disoluciones durante la aclimatización del cultivar de caña de azúcar C90-469. Valor Práctico El mejoramiento de la tecnología de aclimatización ex vitro en caña de azúcar en condiciones de umbráculo permitirá mayores niveles de supervivencia de las plantas in vitro, con mejor calidad, así como reducir el tiempo de las mismas en esta fase para su plantación en los bancos de semilla.. 5.

(21) Revisión bibliográfica.

(22) Revisión bibliográfica 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 La caña de azúcar. Generalidades del cultivo 2.1.1 Taxonomía y origen La caña de azúcar (Saccharum spp.) es el resultado de una larga evolución a partir de las especies S. spontaneum y S. officinarum., en la que también contribuyeron S. robustum, S. barberi, S. sinense (Altpeter y Oraby, 2010). Como planta cultivada, se originó en Nueva Guinea y en su proceso evolutivo presentó un papel importante la introgresión entre Ripidium, Sclerostachya y Miscanthus, con un alto nivel de variación de ploidía, lo que dio como resultado un grupo de especies que componen este género (Grivet et al., 2004 y 2006). Según el sistema de clasificación sugerido por Cronquist (1988) la taxonomía de la caña de azúcar es la siguiente: División: Magnoliophyta Clase: Liliopsida Subclase: Commelinidae Orden: Cyperales Familia: Poaceae Genero: Saccharum Especie: Saccharum spp.. 6.

(23) Revisión bibliográfica 2.1.2 Importancia económica El rendimiento promedio mundial de la caña de azúcar para la industria es de 59,5 t ha-1 . Este cultivo ocupa el mayor volumen con más de 1 700 millones de toneladas, de ellas 181,5 t producidas en el 2016. El 75% de éstas, se concentra en 10 naciones, en orden decreciente: Brasil (37,80 t), India (26,65 t), países de la Unión Europea (16,01 t), China (14,26 t), Tailandia (11,33 t), Estados Unidos (7,67 t), México (6,38 t), Pakistán (5,21 t), Australia y Rusia (4,40 t) (FAO, 2017). La caña de azúcar puede y debe ayudar a afrontar en un futuro inmediato tres importantes desafíos que hoy enfrenta la humanidad: la producción de alimentos, el déficit energético y la preservación del medio ambiente. La agroindustria cañera puede producir energía eléctrica, etanol (biocombustible) para sustituir parcial o totalmente la gasolina y el diesel empleado en el transporte y la maquinaria agrícola. Las mieles finales (destino consumo animal y otras producciones), biogás y múltiples derivados, con alto valor agregado (Nova, 2015). Esta gramínea es una materia prima con excelentes condiciones para captar y almacenar la energía solar y a partir de ella generar electricidad. De igual forma la caña de azúcar aporta la mayor cantidad de biomasa en relación a otros cultivos (Nova, 2015). Se comprobó que las plantaciones de este cultivo, actúan como áreas absorbentes, las cuales, mediante reacciones bioquímicas toman el dióxido de carbono (CO 2 ) del aire y liberan el oxígeno (O 2 ). Se calcula que en un año una hectárea de caña de azúcar puede absorber más de 60 t de CO 2 y producir 40 t de O 2 puro, lo que da lugar al llamado ʺefecto bosqueʺ (Nova, 2015).. 7.

(24) Revisión bibliográfica 2.1.3 Cultivar C90-469 El cultivar C90-469, recomendado en 2002, emerge en 2005 entre los cultivares que superan el 1,0% de propagación nacional, año a partir del cual promedió una tasa de crecimiento anual de 0,7% (Mesa et al., 2016). Cierra 2011 ocupando el 4,6% del área cañera, válido para mantener el cuarto lugar alcanzado el pasado año. La mayor tasa de crecimiento obtenida en el período fue de 1,3% entre 2006 y 2007. Mostró altos rendimientos agrícola y elevado contenido azucarero en plantaciones de frío y primavera para cosechas de ciclos largo. Adaptable a suelos de mal drenaje y de floración escasa. Es resistente al carbón y escaldadura foliar, intermedia a la roya. Esta última condición sugiere controlar su propagación y mantener una estricta vigilancia fitosanitaria. 2.1.4 Principales enfermedades En Cuba existen informadas 59 enfermedades en el cultivo (Chinea et al., 2012). Dentro de estas, el carbón [Sporisorium scitamineum (Syd.) M.Piepenbr., M.Stoll & Oberwy], la roya parda (Puccinia melanocephala Sydow), la escaldadura foliar (Xanthomonas albilineans) y el mosaico (Sugarcane Mosaic Virus) son consideradas criterios de selección de nuevos cultivares por su importancia económica y distribución nacional (González et al., 2015). La enfemedad raya roja causada por la bacteria Axidovorax avenae subp. avenae, está informada en Cuba, en la actualidad se cuenta con cultivares resistentes (González et al., 2015; Betani, 2016). Las condiciones climáticas de Cuba son favorables para el desarrollo de la enfermedad causada por el Sugar Cane Mosaic Virus (SCMV) y está presente su vector. La. 8.

(25) Revisión bibliográfica incorporación de progenitores resistentes a los programas de cruzamiento y las medidas de cuarentena ha posibilitado mantener bajo control la enfermedad (Puchades et al., 2016). 2.2 Formas de propagación 2.2.1 Propagación convencional La caña de azúcar se reproduce de forma gámica (sexual) y ágamica (asexual). La primera sólo se emplea con fines de mejoramiento genético y la segunda para la propagación comercial, a través de esquejes (estacas), que contienen una o más yemas. Esto garantiza que la totalidad de la información genética esté presente en cada nueva generación. Esta forma de multiplicación se utiliza por el hombre desde antes del descubrimiento de la reproducción sexual (González, 2014). Los métodos de propagación agámica de este cultivo son lentos y para introducir un nuevo cultivar (sea nacional o foráneo) el tiempo que media desde la selección tiene una duración entre ocho a diez años (González et al., 2006). En Cuba, la producción de semilla comercial es de 32 a 36 meses, desde que se planta como semilla básica, hasta que se cosecha como certificada (González et al., 2006). El empleo de la propagación in vitro permite acelerar dicho proceso en 12 meses. 2.2.2 Propagación in vitro de la caña de azúcar La propagación in vitro se ha convertido en una metodología muy empleada en la caña de azúcar, desde que comenzaron las investigaciones relacionadas con este tema en Hawai, en 1961 (Naik, 2001). En Cuba se comenzó a aplicar en gran escala en laboratorios comerciales (Biofábrica) en la década de los 80 del siglo pasado (Montes de Oca, 2010).. 9.

(26) Revisión bibliográfica Existen dos vías de regeneración o morfogénesis de plantas in vitro: la organogénesis y la embriogénesis somática. Organogénesis La tecnología de propagación in vitro se basa en la aplicación de las potencialidades de los tejidos meristemáticos para formar brotes, lo cual es conocido como organogénesis. Este proceso se caracteriza por el desarrollo unipolar del brote en condiciones apropiadas de luz, temperatura y balance de nutrientes (Pérez, 1998). El banco de donantes es el área destinada a conservar la semilla de fundación en su más alto grado de pureza y durante todo su ciclo de desarrollo recibe atenciones culturales especiales. El objetivo de este es garantizar el material inicial del cual partirá la producción de semilla básica tradicional y para la propagación in vitro (Santana et al., 2014). La propagación vía organógenesis consta de cinco fases (Pérez, 1998) que a continuación se describen: Fase 0: Preparativa. En esta fase se incluye la selección de la planta donadora y el tratamiento de hidrotermoterapia a 50 o C durante 10 min, con el objetivo de disminuir las concentraciones de patógenos y otros contaminantes. A partir de este momento, las tres fases siguientes se realizan en condiciones asépticas. Fase I: Establecimiento o iniciación de los cultivos. El objetivo de esta fase es establecer cultivos de tejidos viables hasta regenerar brotes in vitro que se utilizarán en la fase siguiente. Fase II: Multiplicación. Es considerada la fase más importante del proceso donde se debe de garantizar la estabilidad genética de los brotes in vitro producidos. 10.

(27) Revisión bibliográfica Fase III: Enraizamiento. Su objetivo es la formación de las raíces de los brotes in vitro y prepararlos para pasar a condiciones de aclimatización ex vitro. Fase IV: Aclimatización. Es la fase final del proceso y su meta es lograr plantas listas para su trasplante definitivo a campos comerciales de producción. Existen numerosos protocolos para la propagación in vitro de la caña de azúcar. Estos se modifican a través de los años, adaptados para cada uno de los cultivares (Santana et al., 2014). Embriogénesis somática La embriogénesis somática tiene un gran potencial para ser desarrollada como una técnica excelente para la propagación in vitro de la caña de azúcar. Aunque su desarrollo en las especies de la familia Poaceae es difícil. Se ha trabajado por más de 35 años, pero los resultados aún no son comparables con los notables avances obtenidos en las dicotiledóneas (Ilman et al., 2016). La aplicación de esta técnica ayuda a acelerar la producción de un gran número de plantas obtenidas a partir de embriones somáticos en un corto tiempo (Purnamaningsih, 2002). En esta especie la fuente de explante más utilizada para la formación de los embriones somáticos es a partir de hojas de plantas cultivadas in vitro (Freire et al., 2006). 2.3 Fase de Aclimatización ex vitro Un gran número de plantas producidas in vitro no sobreviven el traslado desde el medio ambiente in vitro para un ambiente ex vitro en condiciones de casa de cultivo o de campo. Debido a sus características anatómicas y fisiológicas, este tipo de plantas necesitan una adaptación gradual a este ambiente con el fin de sobrevivir y ser productivo. 11.

(28) Revisión bibliográfica En condiciones de invernadero y campo existen una humedad relativa menor, mayor nivel de luz y un ambiente séptico que son estresantes para las plantas micropropagadas en comparación con condiciones in vitro (Hazarika, 2003; Hazarika 2006). Estas se desarrollan dentro de los recipientes de cultivo con un nivel bajo de luz, en condiciones asépticas, en un medio de cultivo que contiene azúcar y nutrientes para permitir el crecimiento heterótrofo y una atmósfera con un alto nivel de humedad. Existen fenotipos que no pueden sobrevivir a las condiciones ambientales cuando se colocan directamente en condiciones de invernadero o en el campo. Las características fisiológicas y anatómicas de las plantas in vitro requieren que deban ser aclimatizadas gradualmente antes de su trasplante a su habitad natural (Gutiérrez-Mora et al., 2012). En la organogénesis, la aclimatización ex vitro consiste en trasplantar plántulas obtenidas en condiciones controladas in vitro a condiciones donde las mismas se desarrollan para su cultivo (Morales et al., 2009). Se considera una de las etapas más importantes de la micropropagación (Chandra et al., 2010). Dado fundamentalmente, al hecho de que en su continuo crecimiento y desarrollo, se requiere de un proceso de adaptación a factores bióticos y abióticos (Chacón et al., 2005). Además, Sánchez et al. (2012) señalaron que durante la conversión y aclimatización las plántulas pasan de un estado heterótrofo a uno autótrofo con diferentes niveles de nutrientes. Estos se corresponden con la composición del sustrato, un factor con marcada influencia en la obtención de una planta de óptima calidad (Cruz et al., 2008). En condiciones de casa de cultivo o invernadero, las plántulas con raíces más estructuradas y funcionales, son paulatinamente endurecidas y fisiológicamente activadas, debido tal forma que se va reduciendo la humedad ambiental. Los cambios de temperatura y el 12.

(29) Revisión bibliográfica intercambio gaseoso inician la toma de los nutrientes, los cuales activan mecanismos de fotosíntesis hasta el desarrollo de pares de hojas verdaderas. Al ser trasplantadas para su manejo en casa de cultivo, una vez concluidas las etapas de laboratorio e invernadero, las plantas son completamente funcionales y su respuesta será la misma a la desarrollada a partir de semilla. Una de las ventajas de estas plantas clonadas, es que son genéticamente idénticas a la de aquella sección de hoja que le sirvió de origen (Chandra et al., 2010). La aclimatización de plantas in vitro a las condiciones naturales, es un paso crítico para muchas especies y requiere tiempo e instalaciones caras que restringen la aplicación comercial de los procesos de micropropagación. Estas muestran un marchitamiento rápido cuando se transfieren a condiciones de casa de cultivo e invernadero, por lo que debe mantenerse una humedad relativa alta en el nuevo ambiente, para no dañar los mecanismos que mantienen el volumen de agua en la misma (Fila et al., 1998). Mantener adecuada capacidad fotosintética durante el cultivo in vitro y adecuado equilibrio para el intercambio gaseoso durante la etapa de multiplicación permite garantizar una aclimatización ex vitro exitosa de las plántulas (Isaac et al., 2010). 2.4. Los bioestimulantes. Su importancia La importancia económica de los bioestimulantes se incrementó en los últimos años, debido a factores del mercado y el creciente predominio de una cultura de la sustentabilidad en el desarrollo económico. Estos son los dos principales fenómenos que impulsan la producción y el consumo de estos compuestos en el mundo (Martínez y Ramírez, 2000). Atendiendo a esta situación se hace necesario la búsqueda de alternativas biológicas, que. 13.

(30) Revisión bibliográfica solucionen. los. problemas. de. fertilización. de. los. cultivos. agrícolas. de. interés. agroeconómico (Yu, 2004; Montano, 2007; Alarcón et al., 2012). La fertilización orgánica o bioestimulantes, cada vez adquieren mayor importancia no solo por los rendimientos que suelen alcanzarse sino también por lo económico de su aplicación y su contribución a la preservación del ambiente (Roldos et al., 1994 y Núñez et al. 2010). Los problemas económicos y ecológicos del mundo actual, han revitalizado la idea del reciclaje eficiente de los desechos orgánicos de la agricultura y el uso de productos biológicos. Los bioestimulantes, son una alternativa para reducir al mínimo el empleo de fertilizantes minerales (López y Vera, 2003). Muchos productos naturales se emplearon para potenciar el manejo ecológico de los agroecosistemas,. entre. los. que. se. encuentran. bioplaguicidas,. fitoestimulantes. y. bioestimulantes. En Cuba, en los último años varios productos orgánicos utilizados permiten a las plantas superar las situaciones de estrés en las condiciones adversas del medio, favoreciendo el crecimiento, desarrollo y el rendimiento con una disminución del uso de sustancias químicas (Nguyen, 2014). 2.4.1 FitoMas-E® El FitoMas-E® es un bioestimulante obtenido como derivado de la industria azucarera cubana. El mismo producido a base de sustancias bioquímicas de alta energía, propias de los vegetales superiores, principalmente aminoácidos, bases nitrogenadas, sacáridos y polisacáridos bioactivos (anexo 1). Este producto fue creado y desarrollado por el Instituto Cubano de Investigaciones de los derivados de la caña de azúcar (ICIDCA), en el marco de los proyectos de investigaciones del Grupo Azucarero AZCUBA (Montano et al., 2007).. 14.

(31) Revisión bibliográfica También refieren López et al. (2002) que el FitoMas-E® y elementos asociados son derivados de la caña de azúcar, productos naturales con hasta 20% de materia orgánica. Elaborados mediante una tecnología sencilla y un costo muy inferior a los precios del mercado internacional, a través de procedimientos biológicos y físicos (Montano, 2007). En base a lo anterior Viñals-Verde et al. (2011) y Martínez-Plácido et al. (2013) refieren que el Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar de Cuba (INICA), investiga estos productos desde hace aproximadamente diez años y estos fueron introducidos en la práctica comercial a partir del año 2001. Dentro de este gran grupo, el FitoMas-E® clasifica como uno de los bionutrientes de mayor interés por sus probadas potencialidades y su creciente diversificación en escenarios productivos. El FitoMas-E®, según los criterios de Montano (2008) es una mezcla de sales minerales y sustancias bioquímicas de alta energía (aminoácidos, bases nitrogenadas, sacáridos y polisacáridos biológicamente activos. Es formulado como una suspensión acuosa que se debe agitar antes de su utilización. Además FitoMas-E® no es fitotóxico y se puede mezclar con la mayoría de los agroquímicos de uso corriente, aunque se debe probar previamente si no se tiene experiencia. Es un producto natural, antiestrés que estimula y vigoriza las plantas desde la germinación hasta la fructificación. Se recomienda su uso mediante aplicaciones foliares (Vera y López, 2002; Mariña, 2010). 2.4.2 VIUSID Agro® Catalysis (2017), planteó que VIUSID Agro® es un potenciador del crecimiento vegetal compuesto por:. 15.

(32) Revisión bibliográfica  Ascophyllum nodosum. Alga marina que tiene como componente estructural en las paredes celulares el ácido algínico, un polisacárido que participa decisivamente en el equilibrio hídrico y en la respuesta fisiológica frente al estrés abiótico. Además aporta varios reguladores del crecimiento.  Fosfato Potásico 5%. El fósforo es necesario para la transferencia y almacenamiento de energía en las plantas. Ayuda a su maduración y fomenta la raíz, la flor y el desarrollo de la semilla. El potasio favorece la formación de hidratos de carbono y el desarrollo de las raíces. Equilibra el crecimiento de las plantas haciéndolas más resistentes a heladas, plagas y enfermedades.  Ácido Málico 4,6%. Favorece la función de la fotosíntesis y es fácilmente metabolizado por los microorganismos.  Sulfato de Zinc 0,115%. Estimula la formación y desarrollo de tejidos nuevos, es muy importante para el desarrollo, crecimiento y proceso productivo de las plantas.  Arginina 4,15%. Es la principal fuente de almacenamiento nitrogenado en plantas y constituye el 40% del nitrógeno en proteínas de semillas.  Glicina 2,35%. Es vital para el crecimiento y es un aminoácido importante en el proceso de fotorrespiración.  Ácido Ascórbico (Vitamina C) 1,15%. Es. antioxidante natural, reduce los taninos. oxidados en la superficie de frutos recién cortados. Además aumenta la resistencia contra los cambios ambientales.  Pantotenato Cálcico (Vitamina B5). 0,115%. Es un nutriente esencial para la vida de la planta, interviene de forma directa en sus reacciones fotoperiódicas. Tiene un. 16.

(33) Revisión bibliográfica papel determinante en la síntesis y la oxidación de los ácidos grasos y regula el crecimiento.  Piridoxina (Vitamina B6) 0,225%. Promueve el crecimiento de las plantas en particular para los cultivos de tejidos para el enraizamiento.  Ácido Fólico 0,05%. Actúa como un transportador de compuestos. Es una coenzima muy importante para el metabolismo de aminoácidos y en la síntesis de bases nitrogenadas requeridas para la formación de tejido nuevo.  Cianocobalamina (Vitamina B12) 0,0005%. Desempeña un papel importante en la reacción enzimática nitrogenasa en la fijación de N 2 en NH3 inorgánicos.  Glucosamina 4,6%. Vigoriza la planta y la protege de forma natural contra hongos, nematodos e insectos. Mejora la nodulación.  Glicirricinato Monoamónico 0,23%. Aumenta las defensas químicas de las plantas y crea la resistencia contra los microorganismos.  Benzoato Sódico 0,2%  Sorbato Potásico 0,2% VIUSID Agro® puede ser empleado en el agua de riego una vez por semana o en aplicaciones. foliares.. Se puede utilizar de conjunto. con un fertilizante foliar y. preferentemente en horas de la tarde para obtener mayor eficiencia del producto (Catalysis, 2017). Se recomienda almacenar en un lugar fresco y seco a temperatura inferior a 25°C. Bajo estas condiciones alcanza una vida útil en envases sin abrir de tres años desde de la fecha de fabricación. Este producto puede contribuir en la activación del desarrollo vegetativo de los brotes, puesto que produce agrandamiento y multiplicación de las células. Actúa a concentraciones 17.

(34) Revisión bibliográfica extremadamente bajas. Se trasloca en el interior de la planta y generalmente, sólo incide en las partes aéreas induciendo la floración, el alargamiento del tallo y provoca ruptura de la latencia en semillas que necesitan período de reposo. También, inhibe la caída de flores y por consiguiente aumenta el número de frutos, retarda o acelera (dependiendo de las dosis usadas) la maduración de estos sin cambiar la calidad de los mismos, en especial lo relacionado con contenido de carbohidratos y azúcares. Además, incrementa los rendimientos de los cultivos, como consecuencia VIUSID Agro® actúa como un bioregulador natural. Coello (2010), informó que VIUSID Agro® se puede aplicar en todas las etapas del crecimiento vegetal fortaleciendo las plantas propiciando hasta un 75% de aumento en la producción por unidad sembrada, lo que depende de la dosis utilizada. Al respecto Cabrera (2011) señaló la utilización de este bioestimulante en los rebrotes de este cultivo tras el corte del principal. Estos resultados fueron alcanzados con una disolución de 0,5 mL 5 L-1 superando los obtenidos con disoluciones superiores. También, Hernández (2013), planteó que la utilización de VIUSID Agro® en el cultivo del tabaco (Nicotiana tabacum L.) debe realizarse a una dosis de 1,5 mL 5 L-1 con un intervalo de siete días, sin superar el número de cinco aplicaciones. También Expósito (2013), planteó que la utilización de VIUSID Agro® a una disolución de 1,5 mL 5 L-1 propició un buen efecto estimulante en el cultivo del tomate (Solanum licopersicum L.). Este efecto fue acentuado tras la realización de la cuarta aplicación. El VIUSID Agro® tiene un marcado efecto bioestimulante, lo que es atribuido según Catalysis (2017) a la activación molecular a que son sometidos todos sus componentes. Esta. consiste en someter una formulación previamente estudiada a una corriente eléctrica, 18.

(35) Revisión bibliográfica a través de la cual se dota a la molécula de mayor número de protones y por tanto de mayor capacidad de ofrecer efectos superiores con dosis más bajas (González, 2001). En el crecimiento VIUSID Agro® es un producto que contiene esencialmente aminoácidos, vitaminas y minerales y fue sometido a un proceso biocatalítico de activación molecular que mejora su actividad biológica y la reactividad bioquímica de todas sus moléculas. Esto hace posible que se favorezca la fase vegetativa y reproductiva de los cultivos. Además aumenta la longitud de los tallos, el número de hojas e incrementa el número de flores y frutos, con una influencia positiva en el incremento de los rendimientos (Peña et al., 2015a).. 19.

(36) Materiales y Métodos.

(37) Materiales y Métodos 3. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo se desarrolló en la fase de aclimatización ex vitro de la Biofábrica perteneciente a la Estación Territorial de Investigaciones de la Caña de Azúcar (ETICA Centro Villa Clara), del Instituto de Investigaciones de la Caña de Azúcar (INICA). La misma está ubicada en el Municipio de Ranchuelo, provincia Villa Clara. Los experimentos se desarrollaron en el período comprendido entre julio de 2016 y hasta noviembre 2017. Procedimientos generales Material vegetal Se utilizaron plantas in vitro enraizadas de caña de azúcar cultivar C90-469 con 15 días de cultivo en medio de cultivo de enraizamiento propuesto por Jiménez et al. (1996). Previo a la plantación en la fase de aclimatización, las plantas in vitro fueron lavadas con agua corriente. Posteriormente colocadas en bandejas de polipropileno negras de 60 alvéolos (figura 1) con una capacidad de 76 cm3 de sustrato compuesto por compost a partir de cachaza (restos de la industria de la caña de azúcar), al que se le añadió zeolita en proporción de 3:1 (v/v).. Figura 1. Bandeja de polipropileno de 60 alvéolos utilizadas para la aclimatización ex vitro de plantas de Saccharum spp. cv. C90-469 20.

(38) Materiales y Métodos Se comparó el VIUSID Agro® (Catalysis, España) con el Fitomas-E® (ICIDCA, Cuba) aplicando ambos bioestimulantes a las plantas in vitro en tres disoluciones (0; 0,5 y 0,8 mL L-1 ). Las aplicaciones se realizaron con mochila de aspersión (Matabi, España) de 16 L de capacidad, con boquilla de inundación (flood–jet) Lurmark AN 2,5, con una presión de 1,5 a 2,0 bar, según los parámetros técnicos de la misma. Estas fueron los primeros 3 días (dos veces al día) en la mañana (9:00 am) –tarde (4:00 pm), para evaluar el efecto antiestrés de los bioestimulantes. A partir de los 7 días una aplicación por semana hasta los 45 días para evaluar su efecto en el ahijamiento y crecimiento. Como control se utilizaron plantas in vitro a las cuales no se les realizaron aplicaciones de los bioestimulantes. El diseño experimental empleado fue completamente aleatorizado. Por tratamiento se emplearon un total de 180 plantas in vitro. En tres bandejas por tratamiento como repetición. En la época seca se utilizaron plantas in vitro con una altura mayor a 3,0 cm y 3-4 hojas, tamaño recomendado por el instructivo técnico para la micropropagación de este cultivo según Jiménez et al. (1996). En la época de lluvia se utilizaron dos grupos de plantas ≤ 3,0 cm y > 3,0 cm con igual cantidad de hojas a las anteriormente señaladas. Condiciones de cultivo Las bandejas fueron colocadas en condiciones de umbráculo, estructura metálica sin techo de plástico y cubierta con una malla sombra de color negro (Sarán) que permitió la reducción al 50% de la intensidad luminosa que osciló entre 224 y 457 µmol m-2 s-1 medida con un luxómetro LM 76 Lightmeter (París, Francia) y una frecuencia de riego con microaspersores de dos veces al día durante 5 minutos. La humedad relativa del 70-85% y. 21.

(39) Materiales y Métodos temperaturas de 25±2°C en época de seca y 32±2°C en época de lluvia. Las plantas in vitro todo el tiempo que duró el experimento se atendieron según el manual de procedimientos establecido (Jorge et al., 2011). 3.1 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en la supervivencia y el ahijamiento El objetivo de este experimento fue evaluar, durante la aclimatización ex vitro, el efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en la supervivencia y el ahijamiento de las plantas in vitro de S. spp cv. C90-469. A los 15 días de cultivo en el umbráculo se evaluó la supervivencia (%) y a los 21 días el ahijamiento (número de nuevos brotes por planta). En todos los tratamientos se evaluaron el 100% de las plantas in vitro. 3.2 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en el crecimiento de las plantas in vitro en condiciones de aclimatización ex vitro El objetivo de este experimento fue determinar el efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en el crecimiento de las plantas in vitro de caña de azúcar. A los 45 y 60 días en época de seca y a los 60 días época de lluvia después del trasplante, según instructivo técnico para la micropropagación de este cultivo (Jiménez et al., 1996). Además se evaluaron diferentes características morfo-fisiológicas a las plantas in vitro. A 30 plantas seleccionadas al azar les fueron evaluadas las siguientes variables:  Altura de la planta (cm) desde la base de la planta hasta la hoja+1  Diámetro del tallo (mm) con al auxilio de un pie de Rey. 22.

(40) Materiales y Métodos  Número de hojas  Longitud de la hoja. +1. (cm).  Contenido de clorofilas totales en hoja. +1. (unidades SPAD) equivalentes a la. cantidad de clorofila y nitrógeno total determinados por métodos tradicionales (Reeves et al., 1993) con el empleo el detector portátil de clorofila SPAD-502 (Minolta, Japón).  Masa fresca (MF) de la planta completa (gMF)  Masa seca de la planta completa (gMS)  MF parte área (gMF)  MF de las raíces (gMF)  Número de raíces  Longitud de la raíz más larga (cm) Determinación de masa fresca y seca: Para la determinación de la masa fresca y seca, se tomaron plantas de los diferentes tratamientos a los 45 y 60 días de cultivo. Se lavaron con agua las raíces para eliminar sustrato. Se determinó la masa fresca con una balanza técnica (Sartorius, Alemania). Posteriormente para la masa seca, el material vegetal fue secado en una estufa (Verticell MMM Medcenter Einrichtugen GmbH, Alemania) a una temperatura de 80°C durante 72 horas hasta peso constante, que se determinó en una balanza técnica (Sartorius, Alemania). Análisis estadístico En el análisis de la normalidad de las variables se utilizó la prueba de Shapiro Wilk y la homogeneidad de varianza por Levene. Para la comparación entre las medias se aplicó un. 23.

(41) Materiales y Métodos Análisis de varianza (ANOVA simple) y la diferencia entre las medias se determinó por la prueba de Tukey. Se utilizó el Paquete Estadístico SPSS versión 23,0 del 2015 para Windows y STATISTICA versión 12,0 para las variables expresadas en porcentajes, la diferencia entre los valores se determinó mediante la prueba de comparación de proporciones para dos muestras. En todos los casos las diferencias significativas fueron establecidas para p≤0.05. Todos los experimentos se repitieron dos veces.. 24.

(42) Resultados y Discusión. Resultados y Discusión.

(43) Resultados y Discusión 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en la supervivencia y el ahijamiento Ambos bioestimulantes tuvieron un efecto positivo sobre la supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar en condiciones de umbráculo. Tanto el VIUSID Agro® como el FitoMas-E® superaron al control en todos los tratamientos en las dos épocas de estudio (seca y lluvia). Las disoluciones de VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 ; VIUSID Agro® 0,8 mL L-1 y FitoMas-E® 0,5 mL L-1 no tuvieron diferencias significativas entre ellas, pero si con el resto de los tratamientos en la época seca de plantación (Tabla 1 y Figura 2). Tabla 1. Efecto de los bioestimulantes VIUSID Agro® y FitoMas-E® sobre la supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp cv. C90-469) a los 15 días después del trasplante en condiciones de aclimatización ex vitro. Época de seca.. Bioestimulante (mL L-1 ). Supervivencia (%) Plantas mayores de 3,0 cm 93,3 b 97,2 a 99,4 a 100 a 78,3 c. FitoMas-E 0,5 FitoMas-E 0,8 VIUSID Agro® 0,5 VIUSID Agro® 0,8 Control. Porcentajes con letras distintas en una misma columna difieren significativamente según la prueba de Proporciones para p<0.05. 25.

(44) Resultados y Discusión. Figura 2. Supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp) cv. C90-469 en condiciones de aclimatización ex vitro a los 15 días después del trasplante. Época seca. (A) Control (B) VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 (C) VIUSID Agro® 0,8 mL L-1. En la época de lluvia se obtuvo la mejor respuesta con la disolución 0,5 mL L-1 de VIUSID Agro® con diferencias significativas con el resto de los tratamientos para las plantas in vitro mayores de 3,0 cm. Al aplicarse, sobre las plantas. menores de 3,0 cm, ambos. bioestimulantes independiente de su concentración, tuvieron efecto positivo con incremento de la supervivencia sin diferencias significativas entre ellos. Sin embargo, todos los tratamientos superaron al control sin aplicación (Tabla 2 y Figura 3 y 4).. 26.

(45) Resultados y Discusión Tabla 2. Efecto de los bioestimulantes VIUSID Agro® y FitoMas-E® sobre la supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp cv. C90-469) a los 15 días después del trasplante en condiciones de aclimatización ex vitro. Época de lluvia. Bioestimulante (mL L-1 ) FitoMas-E® 0,5 FitoMas-E® 0,8 VIUSID Agro® 0,5 VIUSID Agro®0,8 Control. Supervivencia (%) Plantas mayores Plantas menores de de 3,0 cm 3,0 cm 87,5 b 85,5 a 91,6 b 83,3 a 97,7 a 86,7 a 86,1 b 84,5 a 76,6 c 66,1 b. Porcentajes con letras distintas en una misma columna difieren significativamente según la prueba de Proporciones para p<0.05. Figura 3. Supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp) cv. C90469 menores de 3,0 cm, en condiciones de aclimatización ex vitro a los 15 días después del trasplante. Época Lluvia. (A) Control (B) FitoMas-E® 0,5 mL L-1 (C) FitoMas-E® 0,8 mL L-1 (D) VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 (E) VIUSID Agro® 0,8 mL L-1. 27.

(46) Resultados y Discusión. Figura 4. Supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp) cv. C90469 mayores de 3,0 cm, en condiciones de aclimatización ex vitro a los 15 días después del trasplante. Época Lluvia. (A) Control (B) FitoMas-E® 0,5 mL L-1 (C) FitoMas-E® 0,8 mL L-1 (D) VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 (E) VIUSID Agro® 0,8 mL L-1 .. Estos resultados pudieron ser debido al efecto anti-estrés informado para ambos bioestimulantes según la composición de los mismos, donde destaca la presencia de varios aminoácidos (Montano et al., 2007; Catalysis 2017). Al respecto Azcon-Bieto y Talón (2008) señalaron que los aminoácidos son fácilmente absorbidos por las hojas y las raíces 28.

(47) Resultados y Discusión de la planta. Entre un 5 y 20% de estos penetran al primer día de la aplicación foliar. Los mismos tiene un efecto anti-estrés y en el equilibrio hídrico de la célula de las plantas. Según Szabado y Savoure (2010). la prolina es un aminoácido esencial en el metabolismo. primario de las plantas. Esta tiene un profundo efecto en el desarrollo de la misma y en la respuesta a condiciones ambientales adversas. La biosíntesis de esta es por tanto un indicador importante de adaptación de la planta al estrés. Ambos bioestimulantes utilizados en el presente trabajo tienen en su composición este aminoácido. También Catalysis (2017) señaló que el VIUSID Agro® aporta un grupo de aminoácido. En relación con lo anterior Simbaña y Carla (2011) planteó que los efectos sobre la planta pueden producir al aplicar productos con aminoácidos. Estos pueden ser de tres tipos, uno de ellos es hormonal: al ingresar los aminoácidos a las plantas estimulan la formación de clorofila, del ácido indol-3-acético (AIA) y a la vez la producción de vitaminas y la síntesis de numerosos sistemas enzimáticos. También, es importante destacar que Ascophyllum nodosum está presente en un 15% en la formulación del VIUSID Agro®. Es un alga que se encuentra en las costas del Atlántico Norte, donde se nutre de grandes cantidades de minerales arrastrados por los glaciares. El ácido algínico es un polisacárido, componente estructural en las paredes celulares de A. nodosum, que participa decisivamente en el equilibrio hídrico y en la respuesta fisiológica frente al estrés abiótico. Esto pudiera explicar los resultados alcanzados en la supervivencia de las plantas in vitro de caña de azúcar al aplicarse este bioestimulante. La altura inicial de las plantas in vitro tuvo un efecto importante sobre la supervivencia y crecimiento de estas en condiciones de aclimatización ex vitro. Esto se confirmó en este 29.

(48) Resultados y Discusión experimento donde las plantas mayores de 3,0 cm alcanzaron los mayores porcentajes de supervivencia respecto a las de menor altura, a pesar de la aplicación de los bioestimulantes. Esto indicó la importancia de que las mismas tengan un adecuado tamaño para un buen crecimiento y desarrollo durante la fase de aclimatización ex vitro (Gnanam, 2004). Esta variable unida al número de hojas, juegan un papel importante cuando se transfieren a la fase de aclimatización plantas obtenidas por cultivo in vitro. Al respecto, Pahlares et al. (2004) señalaron que la calidad del material vegetal in vitro tiene gran influencia en el porcentaje de supervivencia. También, Posada et al. (2016) en papaya (Carica papaya L.) informaron que plantas que tuvieron un mayor valor de altura inicial (4,0 cm) y número de hojas (5,0) fueron las que alcanzaron los mayores porcentajes de supervivencia en condiciones de aclimatización ex vitro. La importancia de la altura de las plantas in vitro y por ende su desarrollo en el proceso de aclimatización se demostró para otras especies: Eucalyptus urograndis (Pahlares et al., 2004); en Heliconia standley cv. Macbride (Sosa-Rodríguez et al., 2004) y en papaya (Carica papaya L.) (Gallardo et al., 2002, en el híbrido cubano IBP 42-99; Homhuan et al., 2008; Kaity et al., 2009). Todo lo anteriormente señalado pudo tener un efecto positivo en el proceso de aclimatización ex vitro de las plantas in vitro. Además, pueden ser una posible explicación a los resultados alcanzados. Es necesario tomar en cuenta que las planta in vitro de caña de azúcar provenían de ser cultivadas en condiciones de laboratorio, dentro de frascos de cultivo plásticos donde la humedad relativa varía entre 80-90%. Esto hace que las mismas. 30.

(49) Resultados y Discusión sufran un cambio brusco cuando son expuestas a condiciones ex vitro con humedad relativa más baja, mayor temperatura y luminosidad, lo cual reduce los porcentajes de supervivencia. Al respecto George (2008) señaló que la formación de las plantas en condiciones in vitro hace que estas se desarrollen muy débiles, debido a que crecen bajo condiciones simuladas y en un depósito cuya humedad relativa es alta. El ambiente ex vitro presenta una humedad relativa del 50-60% por lo que al momento de colocar las plantas en condiciones ex vitro, la supervivencia de las mismas se ve afectada. Además, de que las hojas no presentan cutícula y tienen baja actividad fotosintética. Las plantas cuando se encuentran fuera del ambiente in vitro cambian los sistemas fotosintéticos para poder sobrevivir. Es muy importante que antes de ser transferidas a condiciones ambientales tengan más de dos hojas y el sistema de raíces desarrollado, para evitar su deshidratación y muerte. Los primeros días de la aclimatización ex vitro son vitales para la ellas, estas deben encontrarse bajo una humedad relativa cercana al 90% y con 30% de exposición a la luz. Estas condiciones cambian mientras la planta crece y se aclimatiza, la humedad disminuye y se incrementa la luz (Clapa, Fira, Joshee, 2013). Hasta el momento. no. existen referencias bibliográficas en la literatura científica. internacional sobre la aplicación del bioestimulante VIUSID Agro ® en el proceso de aclimatización ex vitro de plantas in vitro de caña de azúcar. Sin embargo, Reyes et al. (2011) señalaron la aplicación una sola disolución (0.1%) del FitoMas-E® en esta fase de la propagación. in. vitro. con. frecuencias y tiempos diferentes. para incrementar la. supervivencia. Los resultados obtenidos en la presente investigación apoyan los informados por estos autores. 31.

(50) Resultados y Discusión Ahijamiento Con la disolución de 0,5 mL L-1 de VIUSID Agro® se alcanzaron los mejores resultados respecto a la variable ahijamiento con diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Es de destacar que solamente el VIUSID Agro® en sus dos disoluciones, tuvo una respuesta superior e igual al control en la época de seca. Sin embargo, con la aplicación del FitoMas-E en ambas disoluciones no se obtuvieron resultados favorables (Tabla 3 y Figura 5). Tabla 3. Efecto del uso del FitoMas-E® y el VIUSID Agro® en el ahijamiento de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp. cv C90-469) a los 21 días de cultivo en condiciones ex vitro. Época seca.. Bioestimulante (mL L-1 ) FitoMas-E® 0,5 FitoMas-E® 0,8 VIUSID Agro® 0,5 VIUSID Agro® 0,8 Control MG±EE. Total de plantas obtenidas. Coeficiente de multiplicación. 110 149 287 374 96. 0,63 c 0,88 c 1,60 b 2,07 a 1,43 b 1,32±0.12. Medias con letras distintas en un misma columna difieren estadísticamente según prueba de Tukey para p≤0.05 n=180. 32.

(51) Resultados y Discusión. Figura 5. Ahijamiento obtenido de plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp) cv. C90-469 en condiciones de aclimatización ex vitro a los 21 días después del transplante. Época seca. (A) VIUSID Agro® 0,8 mL L-1 (B) VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 (C) Control (D) FitoMas-E® 0,8 mL L-1 .. Para la época de lluvia para las plantas mayores de 3,0 cm los mayores resultados se alcanzaron con la disolución de 0,8 ml L-1 con diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Sin embargo, para las plantas menores o iguales a 3,0 cm no se obtuvieron diferencias significativas entre ambas disoluciones del VIUSID, pero si con el resto de los tratamientos (Tabla 4 y 5).. 33.

(52) Resultados y Discusión Tabla 4. Efecto del uso del FitoMas-E® y el VIUSID Agro® en el ahijamiento de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp. cv C90-469) a los 25 días de cultivo en condiciones ex vitro en plantas mayores de 3,0 cm. Época lluvia.. Bioestimulante (mL L-1 ) FitoMas-E® 0,5 FitoMas-E® 0,8 VIUSID Agro® 0,5 VIUSID Agro® 0,8 Control MG±EE. Total de plantas obtenidas 196 133 209 370 166. Coeficiente de multiplicación 1,15 0,84 1,35 2,10 1,20. b c b a b 1.28±0.10. Medias con letras distintas en un misma columna difieren estadísticamente según prueba de Tukey para p≤0.05 n=180. Tabla 5. Efecto del uso del FitoMas-E® y el VIUSID Agro® en el ahijamiento de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp. cv C90-469) a los 21 días de cultivo en condiciones ex vitro en plantas menores o iguales a 3,0 cm. Época lluvia.. Bioestimulante (mL L-1 ) FitoMas-E® 0,5 FitoMas-E® 0,8 VIUSID Agro® 0,5 VIUSID Agro® 0,8 Control MG±EE. Total de plantas obtenidas 280 223 333 320 149. Coeficiente de multiplicación 1,86 1,45 2,29 2,05 1,25. b b a a b 1,78±0.14. Medias con letras distintas en un misma columna difieren estadísticamente según prueba de Tukey para p≤0.05 n=180. Estos resultados alcanzados pudieron ser debido a la presencia de reguladores del crecimiento en el composición del VIUSIS Agro ®, los cuales no están presentes en el FitoMas- E®. En relación con lo anterior Catalysis (2017) refirió que el alga Ascophyllum 34.

(53) Resultados y Discusión nodosum. presente en la formulación del VIUSID Agro® también aporta a la formulación. inductores del crecimiento. La misma contiene citoquininas, especialmente la zeatina, que es de gran actividad biológica. También, se ha constatado la presencia de auxinas y giberelinas. Al respecto, Kim y Kim (2002) informaron que las citoquininas son esenciales para el desarrollo de brotes, ya que la elongación y el incremento en su proliferación depende de la presencia de una fuente externa de estos reguladores del crecimiento. La aplicación foliar del VIUSID Agro® estimuló la formación nuevos brotes en la fase de aclimatización ex vitro para ambas disoluciones evaluadas. Esto permitió incrementar el número de plantas en esta área, lo cual constituye una ventaja para el proceso de propagación in vitro de este cultivo. 4.2 Efecto de los bioestimulantes FitoMas-E® y VIUSID Agro® en el crecimiento de las plantas in vitro en condiciones de aclimatización ex vitro Época de seca Con la aplicación del VIUSID Agro® a la disolución de 0,5 mL L-1 se obtuvieron los mejores resultados de forma integral con diferencias significativas. con el control sin. aplicación e igual en varias variables al resto de los tratamientos. No obstante para las variables longitud de la hoja. +1. y longitud de la raíz más larga no se encontraron diferencias. significativas entre las aplicaciones de ambos bioestimulantes con el control para esta época del año y a los 45 días de cultivo (Tabla 6). Sin embargo, ambos bioestimulante a los 60 días de cultivo después del trasplante superaron al control, con diferencias significativa en la mayoría de las variables evaluadas 35.

(54) Resultados y Discusión excepto el número de hojas para esta época de plantación. La disolución de 0,8 mL L-1 de VIUSID Agro® alcanzó de manera general resultados iguales o superiores con diferencias significativas al resto de los tratamientos para las diferentes variables evaluadas. Para las variables, longitud de la hoja planta,. +1 ,. diámetro del tallo, contenido de clorofila, masa fresca de la. masa fresca de la parte área y raíces todos los tratamiento alcanzaron iguales. resultados, pero superó a la disolución de 0,5 mL L-1 de VIUSID Agro® en variables importantes como masa seca de la planta y número de raíces, las cuales definen el crecimiento y desarrollo logrados por las plantas in vitro en este tratamiento (Tabla 7 y Figura 6). Es de destacar, que los tratamientos donde se aplicaron ambas disoluciones del VIUSID Agro® y 0,8 mL L-1 de FitoMas-E® a los 60 días de cultivo, permitieron obtener plantas in vitro aclimatizadas con una altura superior a los 15 cm en esta época de plantación donde las plantas tienen un crecimiento más lento en estas condiciones de cultivo bajo umbráculo, donde no existe control de las temperaturas, las lluvias y el viento. Según instructivo técnico (Jiménez et al., 1996) las mismas tenían la altura necesaria para la venta a los productores de semilla de caña de azúcar.. 36.

(55) Resultados y Discusión Tabla 6. Efecto de los bioestimulantes sobre el crecimiento de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp.) cv. C90-469 a los 45 días de cultivo en condiciones de aclimatización ex vitro. Época de seca. Bioestimulante (mL L-1 ). Altura (cm). Diámetro (mm). Número de hojas. Longitud hoja +1 (cm). FitoMas-E 0,5 FitoMas-E 0,8 VIUSID 0,5 VIUSID 0,8 Control MG±EE. 10,74 ab 11,20 ab 11,36 a 10,48 ab 10,14 b 10,78±0,13. 3,42 ab 3,38 ab 3,66 a 3,36 ab 3,28 b 3,42±0,45. 4,4 b 4,7 b 5,4 a 5,2 a 4,4 b 4,7±0,81. 40,70 a 40,36 a 43,26 a 40,05 a 39,41 a 40,75±0,61. Contenido de clorofila (SPAD) hoja +1 30,05 b 29,93 b 33,42 a 34,52 a 30,68 b 30,72±0,47. MFplanta (gMF). MSplanta (gMS). MFparte aérea (gMF). MFraíces (gMF). Número raíces. Longitud raíz más larga (cm). 3,32 c 3,28 c 4,85 a 4,40 ab 3,54 bc 3,88±0,12. 0,82 e 0,90 d 1,07 a 0,98 b 0,95 c 0,91±0,14. 2,21 b 2,38 b 3,08 a 2,63 ab 2,28 b 2,51±0,65. 0,95 b 1,05 b 1,98 a 1,99 a 1,16 b 1,40±0,74. 8,9 b 8,7 b 12,8 a 10,0 b 9,9 b 10,08±0,28. 15,20 a 15,80 a 15,05 a 14,36 a 15,80 a 15,03±0,33. Medias con letras distintas en un misma columna difieren estadísticamente según prueba de Tukey para p≤0.05 n=30. Tabla 7. Efecto de los bioestimulantes sobre el crecimiento de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp.) cv. C90-469 a los 60 días de cultivo en condiciones de aclimatización ex vitro. Época de seca. Bioestimulante (mL L-1 ). Altura (cm). Diámetro (mm). Número de hojas. Longitud hoja +1 (cm). FitoMas-E 0,5 FitoMas-E 0,8 VIUSID 0,5 VIUSID 0,8 Control MG±EE. 15,33 b 16,97 a 17,70 a 16,90 a 15,03 b 16,38±0.20. 4,24 a 4,05 a 3,98 a 4,03 a 2,59 b 3,78±0,93. 5,33 a 5,53 a 5,80 a 5,93 a 5,47 a 5,61±0,08. 49,36 a 50,96 a 49,89 a 54,89 a 46,51 b 50,32±0,94. Contenido de clorofila (SPAD) hoja +1 31,09 a 30,91 a 33,84 a 35,52 a 30,32 b 32,34±0,46. MFplanta (gMF). MSplanta (gMS). MFparte aérea (gMF). MFraíces (gMF). Número raíces. Longitud raíz más larga (cm). 7,39 a 7,33 a 7,11 a 7,15 a 3,69 b 6,53±0,22. 1,23 d 1,31 c 1,39 b 1,44 a 1,16 e 1,30±0,01. 4,92 a 5,27 a 5,12 a 5,16 a 2,94 b 4,77±0,15. 2,51 a 2,28 a 2,51 a 2,60 a 0,94 b 2,17±0,10. 10,93 ab 10,06 b 12,06 a 12,33 a 8,53 c 10,38±0,23. 14,89 ab 13,89 bc 15,66 a 16,41 a 12,99 c 14,77±0,26. Medias con letras distintas en un misma columna difieren estadísticamente según prueba de Tukey para p≤0.05 n=30. 37.

(56) Resultados y Discusión. Figura 6. Plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp) cv. C90-469 en condiciones de aclimatización ex vitro a los 60 días después del trasplante. Época seca. (A) Control (B) FitoMas-E® 0,8 mL L-1 (C) VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 (D) VIUSID Agro® 0,8 mL L-1. Época de Lluvia La mejor respuesta integral en las plantas mayores a 3,0 cm se alcanzó con la disolución más baja de VIUSID Agro® 0,5 mL L-1 con diferencias significativas con el resto de los tratamientos para las variables masa seca y fresca de la parte área. Con igual resultado a los tratamientos VIUSID Agro® y FitoMas-E® ambos a igual disoluciones (0,8 mL L-1 ) para el resto de las variables evaluadas. Solo en el contenido de clorofila en esta época las plantas in vitro de todos los tratamientos no manifestaron diferencias entre ellas (Tabla 8). Sin embargo, para las plantas in vitro menores de 3,0 cm el mejor tratamiento integral fue la disolución de 0,8 mL L-1 de VIUSID Agro® con diferencias significativas con el resto de 38.

(57) Resultados y Discusión los tratamientos para las variables: número de hoja, masa fresca y seca de la planta y masa fresca de la parte aérea. Esta disolución también alcanzó iguales resultados para el resto de las variables con los tratamientos a los cuales se las aplicaron los bioestimulantes, pero superó al control para todas las variables evaluadas excepto para la longitud de la raíz más larga (Tabla 8 y Figura 7). Las hojas tienen un importante papel en el desarrollo de las plantas in vitro. Ambos bioestimulantes incrementaron el número de hojas en los distintos tratamientos en ambas épocas de plantación excepto para las plantas menores de 3,0 cm a los 60 días de cultivo donde todos los tratamientos fueron iguales sin diferencias significativas entre ellos (Tabla 7). Al respecto Hazarika (2003) señaló que es conocido que las hojas producidas en condiciones in vitro son empleadas como almacén de sustancias carbonadas, las cuales son utilizadas en el crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuando son transferidas a las condiciones ex vitro mantienen esta función hasta tanto no exista una nueva emisión foliar. El primer par de hojas emitidas en condiciones ex vitro tienen características autotróficas y acumulan temporalmente fotosintatos; donde una parte de estos, es retenida por la hoja para su crecimiento y metabolismo y la otra parte es exportada fuera de la hoja hacia tejidos y órganos no. fotosintéticos.. Los fotoasimilados producidos tienen dos funciones la. producción de energía y la síntesis de nuevos compuestos como coenzima del complejo B, que son esenciales para el desarrollo radicular y el metabolismo respiratorio. La formación de un sistema radicular desarrollado permitirá la absorción de nutrientes del suelo y agua para el mantenimiento de la planta (Hopkins y Hüner, 2004).. 39.

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Figura  1.  Bandeja  de  polipropileno  de  60  alvéolos  utilizadas  para  la  aclimatización  ex  vitro  de plantas  de Saccharum spp
Tabla  1.  Efecto  de  los  bioestimulantes  VIUSID  Agro ®   y  FitoMas-E ®   sobre  la  supervivencia  de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp cv
Figura  2.  Supervivencia  de  las  plantas  in  vitro  de  caña  de  azúcar  (Saccharum  spp)  cv
Tabla  2.  Efecto  de  los  bioestimulantes  VIUSID  Agro ®   y  FitoMas-E ®   sobre  la  supervivencia  de las plantas in vitro de caña de azúcar (Saccharum spp cv
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