Columnas de HPLC XBridge

Versatilidad y rendimiento inigualables

La familia de columnas de HPLC XBridge™ está diseñada para obtener la máxima flexibilidad en

el desarrollo de métodos de HPLC. Se pueden desarrollar separaciones robustas en menos tiempo

y con mayor confianza, permitiendo que los usuarios de sistemas cromatográficos aprovechen

plenamente la potencia del pH. Combinando vanguardistas procesos de enlazado, “endcapping”

y síntesis de partículas con una fabricación y calidad que lideran el sector, las columnas XBridge

constituyen la solución de confianza para las separaciones cromatográficas más exigentes.

■

Flexibilidad para funcionar a lo largo de un rango de pH y temperaturas de fase

móvil sin precedentes

■

Transferencia perfecta de métodos a la tecnología UltraPerformance LC

®

.

Tecnología BeH

[ ]4

Introducida por primera vez en 1999 a través de la familia XTerra® de columnas de HPLC, la tecnología de partículas híbridas (HPT, siglas inglesas)* orgánicas/inorgánicas, patentada por Waters, superó significativas limitaciones de los materiales de relleno de fase reversa con base de sílice: en especial la inestabilidad hidrolítica a pH alto. La HPT de segunda generación, llamada BEH Technology™, incorporada tanto en las columnas ACQUITY UPLC® BEH como en las columnas de HPLC XBridge, marca un nuevo hito en la cromatografía. Finalmente se puede utilizar toda la potencia del pH en el desarrollo sistemático de métodos para LC.

*Patentes de los EE.UU. 6.686.035; 7.223.473; 7.250.214.

En la síntesis de partículas BEH, el monómero bis (trietoxisilil) etano contiene un puente de etileno en su estructura. Este puente de etileno imparte a la estructura de la partícula de sílice la resistencia a la disolución a pH elevado que tienen los polímeros, sin sacrificar en absoluto la integridad estructural ni la eficacia de la partícula de sílice.

SínteSiS de partículaS para la tecnología BeH

diSolución de partículaS a pH elevado

3OH-Si Si(OH)4 O O O Si O O Si O O Si O O Si O O Si O OH OH O Si O O O O O Si O O O O O O Si O O O O O O O O OH OH OH Si O O Si O Si O Si O Si O Si O Si O O Si O Si Núcleo Si O O Si O O Si O O Si O O Si O Si O OH OH O Si O CH2 O O O Si O OH OH O O Si CH2 CH2 O O O O O O O OH OH CH2 CH2 CH2 CH2 Si O O O Si _O Si _O Si _O Si _O Si _O Si Si O O O Si Si O CH2 OH Si _{O O} O O O O Si O Si Núcleo 3OH-Si Si(OH)4 O O O Si O O Si O O Si O O Si O O Si O OH OH O Si O O O O O Si O O O O O O Si O O O O O O O O OH OH OH Si O O Si O Si O Si O Si O Si O Si O O Si O Si Núcleo Si O O Si O O Si O O Si O O Si O Si O OH OH O Si O CH2 O O O Si O OH OH O O Si CH2 CH2 O O O O O O O OH OH CH2 CH2 CH2 CH2 Si O O O Si _O Si _O Si _O Si _O Si _O Si Si O O O Si Si O CH2 OH Si _{O O} O O O O Si O Si Núcleo

■ Sólo hay que hidrolizar 4 enlaces. ■ Hay que hidrolizar hasta 6 enlaces. ■ Si(OH)4 tiene una elevada solubilidad en el agua. ■ Hidrófoba, menos reactiva que la sílice. ■ La sílice es fácil de disolver a pH > 7.

■ Pérdida de eficacia.

■ Se forman enlaces Si-O-Si mientras

otros se rompen.

partícula de sílice

_{partícula XBridge}

Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788 + 4 Si EtO EtO OEt EtO Si EtO EtO EtO Si OEt OEt OEt Si EtO O CH2 CH2 CH2 CH2 Si O Si EtO OEt Si O O OEt Si O Si O O Et O O O Et Et Et _n Polietoxisilano

(BPEOS) Tetraetoxisilano (TEOS)

Bis(trietoxisilil)etano (BTEE)

Tecnología BeH

atributo de la partícula híbrida

Los grupos híbridos superficiales reducen la concentración superficial de silanol.

Los grupos puente internos confieren una elevada interconectividad. Los grupos híbridos internos y superficiales añaden hidrofobicidad.

BeneficioS de la tecnología HíBrida

La tecnología BEH ofrece a los usuarios de sistemas cromatográficos la flexibilidad de transferencia entre las plataformas cromatográficas UltraPerformance LC, analítica y preparativa. Combinando la tecnología BEH con el diseño de columna patentado de óptima densidad del lecho (OBD™), las columnas XBridge Prep OBD ofrecen una elevada capacidad de carga, máxima eficacia y larga vida útil de la columna. Tanto las partículas XBridge HPLC como las partículas ACQUITY UPLC BEH de 1,7 µm tienen tecnología BEH, permitiendo así una transferencia directa de las separaciones por HPLC a la tecnología UPLC. Tanto si un usuario de sistemas cromatográficos está interesado en separaciones por UPLC de menos de 2 µm, como en el desarrollo de métodos de purificación o en separaciones de escala analítica, la tecnología BEH ofrece soluciones precisas y fiables.

Beneficio para la rp-Hplc

Reducción de los factores de cola USP de los picos para las bases. Mayor estabilidad química y mecánica.

Mayor estabilidad de la columna a pH alto.

Tecnología

de Separación de Péptidos

Tecnología

de Separación de Oligonucleótidos

Columnas ACQUITY UPLC BEH

Columnas XBridge

Columnas BEH de bioseparación

Columnas XBridge OBD Prep

xBridge c

₁₈

/c

₈

[ ]6

XBridge C

₁₈

/C

₈

Las dos fases enlazadas de HPLC más populares, C18 y C8, son las fases de primera elección en el desarrollo de métodos de LC. Útiles para una amplia variedad de separaciones, estas columnas son conocidas por todos los científicos dedicados a la separación. Las columnas XBridge C18 y C8 ofrecen flexibilidad para el desarrollo de métodos. Mediante el uso de enlaces trifuncionales y un “endcapping” avanzado, se observa una excelente reproduc-ibilidad, rendimiento y vida útil de la columna a lo largo de todo el rango de pH (1-12).

* Valores nominales. O Si O O O Si O O O Si O O O Si CH Polar Group 3 CH3 O Si O O O Si O O O Si O O O Si CH Polar Group 3 CH3

Tipo de ligando Trifuncional C18 Trifuncional C8

Tamaños de partícula disponibles (µm) 2.5, 3.5, 5, 10 2.5, 3.5, 5, 10

densidad del ligando* 3.1 µmol/m2 _{3.2 µmol/m}2

Carga de carbono* 18% 13%

Tipo de “endcapping” Patentado Patentado

intervalo de pH 1-12 1-12

Límites de temp. a pH bajo 80 °C 60 °C

Límites de temp. a pH alto 45 °C 45 °C

Farmacopea de los estados Unidos. L1 L7

diámetro de poro* 135Å 135Å

Volumen de poro* 0.7 mL/g 0.7 mL/g

Superficie* 185 m2_{/g 185 m}2_/g

Fase enlazada

Partícula BEH

Características de las columnas XBridge C₁₈ y C₈

eStaBilidad a pH Bajo

La inestabilidad a pH bajo se debe a la escisión de los enlaces de siloxano por hidrólisis ácida. Para mejorar la estabilidad a pH bajo de las fases enlazadas, hay que reducir la tasa de hidrólisis. Los tipos de química XBridge C18, C8 y Fenilo utilizan uniones trifuncionales y

“endcapping” patentados para conseguirlo. En ensayos acelerados en condiciones de pH bajo, las columnas XBridge C18 presentan una mínima

pérdida de retención (mayor estabilidad hidrolítica) en comparación con las columnas rellenas con fases preparadas empleando silanos monofuncionales.

eStaBilidad a pH alto

La degradación de las partículas cromatográficas de base sílice a un pH elevado se debe al ataque nucleófilo de los iones hidróxido sobre sus enlaces siloxánicos estructurales. Cromatográficamente, esto ocasiona vacíos en la columna, degradación de la forma de los picos o pérdida de eficacia. Las partículas XBridge incorporan puentes de etileno dentro de la matriz de sílice, que confieren resistencia a la disolución de la partícula. Tendrían que romperse hasta seis enlaces siloxánicos para liberar una sola unidad con puentes de etileno de una partícula. La estabilidad química queda demostrada en el ensayo acelerado a pH alto que se ilustra más abajo.

Zorbax® _{SB C18} XBridge C18 SunFire C18 Intersil® _ODS-3 Ace® _C18 Gemini™ _C18 Luna® _{C18 (2)} 0 20 40 60 80 100

Horas en TFA al 1% a 80 ˚C hasta una pérdida de retención del 20%

XBridge C18 XTerra MS C18 Gemini™ _C18 Zorbax® _{Extend C18} Luna® _{C18 (2)} YMC™ _{Pro C18} 0 50 100 150 200

el pH como Herramienta para un óptimo deSarrollo de métodoS

En la cromatografía de fase reversa, el pH de la fase móvil puede producir cambios en la selectividad y capacidad de retención a los compuestos ionizables. Los compuestos ácidos presentan mayor retención a valores del pH por debajo de su pKa, y los compuestos básicos presentan una retención más prolongada a valores del pH por encima de su pKa. Muchos compuestos farmacológicamente activos son ionizables; así, una columna

con un intervalo útil de pH más amplio permite mayor flexibilidad para el desarrollo de métodos farmacéuticos. Las columnas XBridge tienen un amplio intervalo útil de pH (pH 1-12), lo cual ofrece una flexibilidad inigualable para el desarrollo de métodos.

El clorhidrato de lincomicina es un fármaco antibiótico bien establecido, utilizado en medicina humana y veterinaria, efectivo prin-cipalmente contra patógenos grampositivos. El actual método USP adolece de una forma deficiente de los picos y de poca sensibili-dad. Para desarrollar un método óptimo, se puede utilizar el pH para obtener mejor forma de los picos y mejor resolución.

Una vez seleccionado el pH, se optimizó la pendiente del gradiente para mejorar la resolución.

xBridge c

₁₈

/c

₈ AU AU AU 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 5 10 15 min Columna: XBridge C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 µm

Fase móvil A1: Fosfato potásico 100 mM, pH 2 Fase móvil A2: Fosfato potásico 100 mM, pH 7 Fase móvil A3: Fosfato potásico 100 mM, pH 12 Fase móvil B: ACN

Fase móvil C: H2O

Caudal: 0.6 mL/min Gradiente: Tiempo Perfil

(min) %A %B %C 0.0 20 5 75 15.0 20 50 30 Temperatura: 30 °C

Volumen de inyección: 20 µL @ 30 mg/mL en agua Detection: UV @ 215 nm

Instrumento: Waters Alliance® _{2695 con PDA 2996}

0 5 10 15 min

Columna: XBridge C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 µm

Fase móvil A: Fosfato potásico 100 mM, pH 12 Fase móvil B: Acetonitrilo

Fase móvil C: Agua Gradiente: Tiempo Perfil

(min) %A %B %C 0.0 20 15 65 15.0 20 35 45 Caudal: 0.6 mL/min

Volumen de inyección: 20 µL @ 30 mg/mL en agua Temperatura: 30 °C

Detección: UV @ 215 nm

Instrumento: Waters Alliance 2695 with 2996 PDA

pH 2

Forma deficiente de los picos Sobrecarga de la columna Baja retención: ionizado

pH 7

Mejor forma de los picos Mejor retención: 50% ionizado Coelución

pH 12

La mejor forma de los picos Buena retención: 100% no ionizado La mejor resolución

excelente carga resolución optimizada excelente forma de picos

0.25%

1.1% 7.3%

xBridge c

₁₈

/c

₈ [ ]8

eliminando el Sangrado en mS

0.0E+00 5.0E+06 1.0E+07 1.5E+07 2.0E+07 2.5E+07 3.0E+07 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 min Sin columna XBridge C18 Re cu en to d e io ne s

La espectrometría de masas, en combinación con la HPLC, ofrece a los químicos analíticos mayor sensibilidad y selectividad. Para obtener todos los beneficios de la LC/MS, es esencial la utilización de columnas de LC de baja degradación. La tecnología BEH incorporada a las columnas XBridge elimina prácticamente la degradación de la LC/MS, al ofrecer mayor sensibilidad hidrolítica y resistencia de las partículas. Como se puede ver más abajo, en comparación con una exploración de fondo por MS, se observa una degradación mínima.

Sacando partido de loS tamponeS de foSfato

Los tampones de fosfato poseen una singular selectividad, excelente transparencia UV y buena capacidad de tamponamiento a múltiples valores del pKa. No obstante, debido

a la naturaleza agresiva del fosfato, las columnas tradicionales de sílice presentan con frecuencia una vida útil muy reducida. Las columnas XBridge demuestran un rendimiento excelente con tampones de fosfato en todo el intervalo de pH, debido a la resistencia química mejorada de las partículas con tecnología BEH.

camBio ent re pH alto y Bajo

La capacidad de cambiar entre un pH alto y uno bajo en una sola columna puede permitir una espectacular reducción del tiempo de parada del instrumento, así como significativas reducciones de coste cuando se trabaja a múltiples niveles de pH. Tradicionalmente, se asignan columnas diferentes para cada nivel de pH, para evitar la degradación prematura de la columna. Las partículas de tecnología BEH, cuando se combinan con fases enlazadas y “endcapping” novedosos e innovadores, permiten el uso de las columnas de HPLC XBridge a un pH más elevado que las columnas convencionales, pero permiten el “cambio de pH” sin reducción en el rendimiento. En otras palabras, una sola columna XBridge puede utilizarse para trabajar en condiciones de pH tanto bajo como alto, eliminando así el tiempo necesario para cambiar de columna, y la necesidad de disponer de múltiples columnas para trabajar a pH bajo y alto por separado.

En esta evaluación se investigó el efecto de cambiar el pH de la fase móvil de forma agresiva para cada inyección, empleando una mezcla de compuestos ácidos, básicos y neutros. Cada columna fue equilibrada primero a pH 3, seguido de una sola inyección de la mezcla de prueba. La columna fue equilibrada después a pH 10, seguido de una sola inyección de la mezcla de prueba. Esta secuencia se repitió para varios miles de inyecciones sin deterioro de la columna XBridge C18. V0 _{A B}N 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Iny. nº 2 Iny. nº 4800 B = base A = ácido N = neutro B = base A = ácido N = neutro V0 B A N 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Iny. nº 2 Iny. nº 1724 V0 _{A B} N 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Iny. nº 2 Iny. n_{º 4800} B = base A = ácido N = neutro B = base A = ácido N = neutro V0 B A N 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 min Iny. nº 2 Iny. n_{º 1724} Columna XBridge gemini™ _Column 0 1 2 3 4 5 6 7 8 min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 min 1 6 6 6 5 5 5 4 4 4 3 3 3 2 2 2 1 1 pH 2 pH 7 pH 12

Instalaciones de fabricación de Waters

La Corporación Waters ha recibido los siguientes registros y certificaciones:

• Registrada por la Food y Drug Administration de los EE.UU.: cGMP y dispositivos médicos de Clase 1.

• ISO9001:2000 • ISO13485:2003

xBridge c

₁₈

/c

₈

eStaBilidad para un rendimiento fiaBle

La tecnología BEH produce partículas diseñadas para mejorar el rendimiento de la columna y prolongar su vida útil en condiciones operativas de LC extremas y exigentes. Utilizando técnicas punteras de síntesis, Waters ha diseñado y fabricado columnas de LC capaces de ofrecer una vida útil que supera con mucho la de las principales marcas de columnas convencionales de HPLC, en condiciones de pH tanto bajo como alto.

Las instalaciones de vanguardia de Waters fabrican columnas de HPLC y de UPLC que aumentan al máximo el rendimiento del laboratorio. Somos fabricantes originales de partículas de sílice e híbridas, y podemos vigilar y controlar continuamente todo el proceso de fabricación a lo largo de la vida útil del producto. Esto permite obtener un control y una repetibilidad sin precedentes entre lotes de material.

reproduciBilidad para el deSarrollo de métodoS

Waters sigue siendo la referencia del sector para la reproducibilidad lote a lote. Desde la gama de columnas Symmetry® _{en 1994 y continuando con las gamas de columnas}

de HPLC XTerra, Atlantis® _{y SunFire™, las columnas de Waters ofrecen resultados}

constantes. Las columnas XBridge se fabrican en las mismas instalaciones certificadas cGMP, ISO9001 e ISO13485 que producen estas gamas de columnas de HPLC, líderes en el sector. Los científicos dedicados al desarrollo de métodos pueden tener la garantía de que las separaciones obtenidas hoy serán reproducibles año tras año.

0 10 20 30 min

Los resultados de arriba se obtuvieron como parte de una extensa evaluación de columnas de HPLC realizada por una importante empresa farmacéutica. Se evaluó un total de 18 columnas en condiciones exigentes para determinar la estabilidad de la eficacia y de la selectividad durante un uso prolongado, así como la reproducibilidad entre lotes. Esta evaluación dio lugar a la selección de las columnas de HPLC XBridge como la principal columna de desarrollo de métodos a nivel mundial.

Datos cortesía de Novartis.

0 5 10 15 20 25 30 min

Análisis del lote 1

Análisis del lote 13 Análisis del lote 15 Análisis del lote 34 Análisis del lote 36 Análisis del lote 3

XBridge C18, pH 2

XBridge C18, pH 11.3

1 análisis de lote = 500 volúmenes de la columna 5 µm 5 µm 10 µm 3.5 µm 3.5 µm

xBridge Fenilo

[ ]10

XBridge FeniLo

Las columnas fenilo se utilizan con frecuencia en separaciones donde se necesita una selectividad alternativa, especialmente cuando los analitos de interés contienen un anillo aromático. Tradicionalmente, las columnas de fenilo se han utilizado poco, debido a su inadecuada estabilidad en condiciones de pH bajo. Los científicos dedicados al desarrollo de métodos ya no se ven limitados por el pH cuando utilizan una columna de LC de fenilo. Gracias al novedoso enlazado y “endcapping” de la tecnología de partículas BEH, las columnas XBridge Fenilo ofrecen excelente estabilidad a pH bajo y alto, dando lugar a la columna fenilo más estable y reproducible del mercado.

eXcelente rendimiento

Las columnas XBridge Fenilo combinan una unión trifuncional del ligando fenilo-hexilo con técnicas patentadas de “endcapping” para obtener una estabilidad a pH bajo que lidera el sector, sin dejar de ofrecer una excelente forma de picos.

excelente forma de los picos

10 20 30 40 50 60 70 80 90 min Zorbax®_{SB Fenilo} XBridge Fenilo Amitriptilina NUSP= 9300 TUSP= 1.20 Amitriptilina NUSP= 920 TUSP= 6.59 Sonda: Etilparabeno 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 Horas en TFA al 1% en H2O pH 1,0 a 80 ˚C XBridge™ _Phenyl

Agilent Zorbax® _SB-Phenyl

Phenomemex® _Luna® _Phenyl-Hexyl

Varian Pursuit® _Diphenyl

Agilent Zorbax® _{Eclipse XDB Phenyl}

Restek Ultra Phenyl

% retención inicial O Si O O O Si O O O Si O O O Si CH Polar Group 3 CH3

Tipo de ligando Trifuncional C6 Fenilo

Tamaños de partícula disponibles (µm) 2.5, 3.5, 5

densidad del ligando* 3.0 µmol/m2

Carga de carbono* 15%

Tipo de “endcapping” Patentado

intervalo de pH 1-12

Límites de temp. a pH bajo 80 °C

Límites de temp. a pH alto 45 °C

Farmacopea de los estados Unidos. L11

diámetro de poro* 135Å Volumen de poro* 0.7 mL/g Superficie* 185 m2/g * Valores nominales. Fase enlazada Partícula BEH

Características de las columnas XBridge Fenilo

xBridge Fenilo

Singular Selectividad

Las columnas XBridge Fenilo ofrecen una selectividad alternativa con respecto a las columnas alquílicas de cadena recta, así como a las columnas con grupos polares integrados, en especial para compuestos que contienen un grupo aromático. Esto proporciona gran flexibilidad para desarrollar métodos ortogonales para separaciones difíciles.

uSo del pH Bajo para enfrentarSe a deSafíoS de deSarrollo de métodoS

La separación de ácidos aromáticos ha sido históricamente difícil, utilizando columnas C18 tradicionales. Estos compuestos son derivados del fenol y poseen anillos aromáticos; por tanto, construir una columna de fenilo es una solución lógica. No obstante, se ha demostrado que el pH bajo es crítico para obtener una separación efectiva en esta clase de compuestos, lo cual es problemático para la mayoría de las columnas de fenilo que hay en el mercado, en cuanto a la estabilidad. Las columnas XBridge Fenilo ofrecen la solución. No solo se consigue la selectividad deseada (mediante interacciones pi-pi), sino que la estabilidad química mejorada favorece la vida útil de la columna y un funcionamiento consistente a pH bajo.

4 8 12 16 20 min

Ácidos Bases

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 min

En diversos herbicidas comunes, entre ellos Silvex, Picloram y Weed-B-Gone, se utilizan ácidos aromáticos. Muchos otros ácidos orgánicos son analitos ácidos muy polares que pueden ser difíciles de retener en las columnas C18 tradicionales, y sin embargo se

retienen bien utilizando las columnas XBridge Fenilo.s.

Columna: XBridge Phenyl 4.6 × 100 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003334 Fase móvil A: H2O

Fase móvil B: ACN

Fase móvil C: NH4HCOOH 100 mM, pH 3

Caudal: 1 mL/min Gradiente: Tiempo Perfil

(min) %A %B %C 0.0 85 5 10 8.00 65 25 10 10.00 10 80 10 11.00 10 80 10 12.00 85 5 10 15.00 85 5 10 Volumen de inyección: 20 µL

Disolvente de la muestra: 10 µg/mL of all analytes in H2O

Temperatura de la columna: 35 °C Temperatura de la muestra: 20 °C Detección: UV @ 280 nm Velocidad de adquisición: 5 points/sec Filtro respuesta: 1.0 Lavado de la aguja: 5/95 MeOH/H2O

Instrumento: Alliance 2695 con PDA 2996 Compuestos 1. Ácido gálico 2. Ácido protocatéquico 3. Ácido 3,4 dihidroxifenilacético 4. Ácido 4-hidroxibenzoico 5. Picrolam 6. Ácido vainíllico 7. Ácido siríngico 8. Ácido salicílico 9. Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (Weed-B-Gone) 10. Ácido 2-(2,4,5-triclorofenoxi) propanoico (Silvex)

Con diferentes ligandos se pueden observar cambios de

selectividad. Como se ilustra aquí, el ligando fenilo ofrece mejor retención y una selectividad alternativa para los antidepresivos tricíclicos (picos 6, 7 con respecto al pico 8).

1 1 1 2 2 2 3 3 3 4,5 4 4 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 8 9 9,10 9 11 11 11 10 10 12 12 12 XBridge Fenilo XBridge C18 XBridge Shield rP18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

XBridge SHieLd rP18

Las columnas que contienen grupos polares embebidos se están volviendo más populares entre los científicos dedicados al desarrollo de métodos, debido a su selectividad alternativa en comparación con los tipos de química C18 tradicionales. El XBridge Shield RP18 ofrece una selectividad complementaria

así como una excelente forma de los picos para las bases. La tecnología Shield patentada* incorpora un grupo carbamato integrado en la fase unida, que protege los silanoles superficiales. Además, esta funcionalidad permite la compatibilidad con fases móviles totalmente acuosas sin riesgo de deshumectación de los poros, permitiendo una retención fiable y consistente.

*Patente de los EE.UU. 5.374.755 [Neue et al.]

xBridge SHield rP18

[ ]12 * Valores nominales. O Si O O O Si O O O Si O O O Si CH Polar Group 3 CH3

Tipo de ligando Monofuncional de grupo polar integrado Tamaños de partícula disponibles (µm) 2.5, 3.5, 5, 10

densidad del ligando* 3.3 µmol/m2

Carga de carbono* 17%

Tipo de “endcapping” TMS

intervalo de pH 2-11

Límites de temp. a pH bajo 30 °C

Límites de temp. a pH alto 45 °C

Farmacopea de los estados Unidos. L1

diámetro de poro* 135Å

Volumen de poro* 0.7 mL/g

Superficie* 185 m2_/g

Fase unida

Partícula BEH

Características de la columna XBridge Shield rP18

¿Qué eS la tecnología SHield?

A principios de la década de 1990 se crearon fases enlazadas novedosas en las que se integraban grupos funcionales polares en cadenas alquílicas C18 y C8. Uno de los principales beneficios era una reducción de las interacciones silanólicas con los analitos básicos, permitiendo una mejora de la forma de los picos. Estos materiales de primera generación se preparaban mediante una modificación superficial de dos pasos, en una mezcla de grupos amino derivados y no derivados, que variaban de un lote a otro. Así, los analitos eran retenidos mediante mecanismos de fase reversa y de intercambio aniónico.

Los materiales de segunda generación se preparan utilizando una modificación superficial de un paso, en la que el grupo funcional se integra en un silano. Una sola reacción superficial con el silano da lugar a una única estructura posible del ligando, sin posibilidad alguna de intercambio aniónico. Este enfoque resultó ofrecer una excelente reproducibilidad entre lotes. La eliminación de los mecanismos de intercambio aniónico es también importante, ya que previene la posibilidad de interacciones secundarias con analitos cargados negativamente.

Beneficios de la tecnología Shield:

■ Reducción de las interacciones silanólicas con los analitos básicos.

Esta desactivación o protección ocasiona una mejora de la forma de los picos para los analitos básicos.

■ Se observa también una singular selectividad para las fases unidas

con grupos polares embebidos, reduciéndose generalmente los factores de retención de los analitos polares y básicos, y quedando la retenció de los analitos no polares relativamente inalterada.

■ Las fases enlazadas Shield ofrecen tiempos de retención del analito

estables y reproducibles en fases móviles 100% acuosas. Las fases alquílicas convencionales adolecen de deshumectación en estas condiciones, y los tiempos de retención se reducen significativamente.

A review of Waters’ Bonded Phase Shield Technology and its Use in High Performance Liquid Chromatography (HPLC) White Paper

Referencia bibliográfica 720000207EN

Referencia bibliográfica

optimizar la Selectividad para el deSarrollo de métodoS

Para desarrollar métodos cromatográficos, algunas de las herramientas disponibles para el científico dedicado a la separación incluyen el pH, la química de la columna y el modificador orgánico. La columna XBridge Shield RP18 ofrece una selectividad alternativa, junto con la capacidad de funcionar correctamente en una amplia gama de pH y con diversos eluyentes. Utilizando estas herramientas clave, el usuario de sistemas cromatográficos puede optimizar rápidamente las condiciones de prueba necesarias para lograr una separación efectiva.

Grandes cambios de selectividad cuando se comparan las químicas de columnas ortogonales en diferentes modificadores orgánicos.

eXcelente Separación de BaSeS

Algunas columnas C18 muestran interacciones secundarias con los compuestos básicos, debido a un débil intercambio catiónico con los silanoles

superficiales residuales, dando lugar a una asimetría deficiente de los picos. La columna XBridge Shield RP18, con tecnología Shield patentada, reduce la interacción silanólica con los analitos básicos, produciendo picos simétricos muy eficientes.

xBridge SHield rP18

0.00 0.02 0.04 0.06 AU 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 min Compuestos 1. Nordoxepina 2. Trimetoprim 3. Nortriptilina 4. Doxepina 5. Imipramina 6. Amitriptilina 7. Trimipramina Columna: XBridge Shield rP18,

4.6 X 50 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003042 Fase móvil A: H2O

Fase móvil B: MeOH Fase móvil C: NH4HCO3 100 mM

Caudal: 1.0 mL/min

Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B %C 0 90 0 10 2 30 60 10 10 16 74 10 11 90 0 10 13 90 0 10 Volumen de inyección: 20 µL Concentración y diluyente de la muestra: 10 µg/mL in H2O Temperatura: 35 °C Detección: UV @ 254 Velocidad de adquisición: 5 points/second Constante de tiempo: 1.0 Lavado de la aguja: 5/95 MeOH/H2O

Instrumento: Alliance 2695 con PDA 2996

Ácidos Bases 2 0 4 6 8 10 12 14 16 18 min 2 0 4 6 8 10 12 14 16 18 min 2 0 4 6 8 10 12 14 16 18 min 1 2 2 2 1 1 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7,12 7 7 8 8,9 8 9 9 10 10 10 11 11 11 12 12 1 2 3 4 5 6 7 pH 10 XBridge™ _C18 Metanol XBridge™ _{Shield rP18} Metanol XBridge™ _{Shield rP18} Acetonitrilo

* Valores nominales. O Si O O O Si O O O Si O O O Si CH Polar Group 3 CH3

Tipo de ligando BEH no enlazado

Tamaños de partícula disponibles (µm) 2.5, 3.5, 5

intervalo de pH 1 - 8

Límites de temp. a pH bajo 45 °C

Límites de temp. a pH alto 45 °C

Farmacopea de los estados Unidos. L3

diámetro de poro* 130Å

Volumen de poro* 0.7 mL/g

Superficie* 185 m2_/g

Partícula BEH

Características de la columna XBridge Shield rP18

xBridge Hilic

[ ]14

XBridge HiLiC

La cromatografía de interacción hidrófila (HILIC, siglas inglesas) es una técnica cromatográfica que puede emplearse para mejorar la retención de especies muy polares, que se retienen muy poco por cromatografía de fase reversa. Las columnas XBridge HILIC ofrecen una selectividad alternativa a las columnas de fase reversa, al tiempo que mejoran la forma de los picos, la retención y la vida útil de la columna, en comparación con las columnas HILIC con base de sílice. Gracias a la fuerte y consistente tecnología BEH, las columnas XBridge HILIC establecen un nuevo estándar de rendimiento para las separaciones HILIC.

retención mejorada

Los mecanismos de retención de HILIC son una compleja combinación de partición, intercambio iónico y enlaces de hidrógeno, dando lugar a una retención mejorada para analitos polares. La retención tiene lugar con una fase estacionaria polar en combinación con fases móviles compuestas de acetonitrilo a concentraciones superiores al 80%, que ofrecen una retención notablemente mayor que la fase reversa.

V0 = 0.35 min

V0 = 0.33 min

Colina

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 min

HO N+

XBridge C18 de fase reversa

Factor de retención = 0

XBridge HiLiC

Factor de retención = 1,8 0 1 2 3 4 5 6 min

El XBridge HILIC ofrece retención donde la fase reversa no consigue retención alguna.

Compuestos 1. 6-acetilmorfina 2. Morfina

3. Morfina-3-β-glucurónido

XBridge C18 de fase reversa

XBridge HiLiC 3 2 1 1 2 3

XBridge HILIC ofrece una selectividad alternativa a la fase reversa. Los metabolitos polares de morfina se retienen más en condiciones HILIC.

Selectividad complementaria

Las columnas XBridge HILIC ofrecen una selectividad complementaria a las columnas de fase reversa. En algunos casos, se observa una inversión del orden de elución, además de una mejor retención, lo cual puede ser ventajoso cuando se desarrollan separaciones ortogonales para analitos polares.

eStaBilidad Química

Con frecuencia se necesita un pH intermedio en la fase móvil para alterar el estado de carga del analito o del sustrato, a fin de promover la retención. Para los materiales con base de sílice, esto provoca frecuentemente una disolución de las partículas, ocasionando una reducción de la vida útil de la columna. Las columnas XBridge HILIC están fabricadas con tecnología BEH, que permite una excepcional longevidad de la columna, permitiendo varios miles de inyecciones sin reducción del rendimiento debida a la degradación química.

xBridge Hilic

2 min 1

0

1. Acetilcolina (Ach) 2. Colina (Ch) 3.0 x 107 2.0 x 107 1.0 x 107 Intensidad 3.0 x 107 2.0 x 107 1.0 x 107 Intensidad 0.2 1.0 2.0 min O N+ O HO N+ Condicionar/equilibrar: 200 µL CH3OH/ 200 µL de H2O Cargar: 300 µL de plasma humano enriquecido con un 2% H3PO4 Lavado 1:200 µL de HCOOH al 2% en H2O Lavado 2: 200 µL CH3OH Lavado 3: 200 µL CH3CN Eluir: 50 µL de NH4OH al 5% en CH3CN

Inyección directa del eluato: elimina los largos pasos de evaporación y reconstitución. 6-acetilmorfina

10 ng/mL añadidos a plasma humano

Morfina

10 ng/mL añadidos a plasma humano

0 2 4 6 min HO O O NCH3 H O HO O HO NCH3 H

XBridge C18 de fase reversa inyección 10 inyección1000 inyección 2000 XBridge HiLiC 1 2 3

Columna: XBridge HiLiC, 2.1 x 50 mm, 3.5 μm

Fase móvil A: Acetonitrilo:agua 95:5 con NH4+ CH3COO- 10 mM pH 5,5

Fase móvil B: Acetonitrilo:agua 50:50 con NH4+ CH3COO- 10 mM pH 5,5

Caudal: 0.5 mL/min

Gradiente: 1 – 99% B a lo largo de 2 minutos, 1% B a 2,1 min, parar 0,4 min Volumen de inyección: 2.0 μL

Temperatura: 30 ˚C Detección: UV @ 254 nm

La XBridge HILIC muestra una excepcional resistencia química, que permite una prolongada vida útil de la columna.

2 1

1 2

respuesta 10,5 x respuesta 8,6 x

La XBridge HILIC ofrece una respuesta mejorada de la espec-trometría de masas, permitiendo límites de detección más bajos.

SenSiBilidad mejorada para eSpectrometría de maSaS

La utilización de HILIC ha adquirido popularidad, principalmente debido a la amplia adopción de la espectrometría de masas como detector, y a la necesidad de mejorar la sensibilidad para la cuantificación de analitos po-lares. A diferencia de la fase reversa, que utiliza fases móviles altamente acuosas para inducir la retención de los compuestos polares, con HILIC se emplea una fase móvil rica en acetonitrilo. Esta fase móvil altamente orgánica se desolvata con facilidad, permitiendo una mejora en la eficacia de ionización y en la respuesta de la espectrometría de masas.

paSoS reducidoS de manipulación de laS mueStraS

Cuando se utilizan métodos de extracción en fase sólida (SPE, siglas inglesas) para la limpieza de las muestras, con frecuencia se utiliza una fracción altamente orgánica, para eluir selectivamente los analitos de interés del dispositivo. Antes de inyectar esta fracción en una columna de fase reversa, hay que evaporar primero la fracción orgánica y después reconstituirla con una porción de disolvente acuoso. Estos dos pasos son frecuentemente los pasos más largos de un procedimiento de SPE. Con las columnas XBridge HILIC, la fracción altamente orgánica se puede inyectar directamente, con lo que se elimina la necesidad de evaporación y se aumenta el rendimiento de las muestras.

La XBridge HILIC ofrece una inyección directa de los eluyentes de SPE, aumentando así el rendimiento de las muestras.

opiáceos en plasma humano Placa µElution Oasis® MCS Compuestos

1. Uracilo 2. 5-fluorocitosina 3. Citosina

Tecnología UPlc

[ ]16

En 2004, Waters revolucionó la ciencia de la separación por LC con la creación del sistema ACQUITY UltraPerformance LC (UPLC). Las separaciones de alta resolución por UPLC se realizan en un sistema capaz de utilizar plenamente unas columnas de LC que están eficazmente rellenas de partículas de menos de 2 µm, con tolerancia a la presión. La tecnología BEH es uno de los principales elementos habilitadores que hay tras esta nueva plataforma de separación, y ofrece la eficacia, resistencia e intervalo de pH necesarios para las separaciones por UPLC.

Como las columnas ACQUITY UPLC BEH y las XBridge HPLC incorporan la misma tecnología BEH, los métodos se pueden transferir sin problemas entre estas plataformas de partículas. Las separaciones cromatográficas se pueden transferir sin esfuerzo entre la tecnología de UPLC, la escala analítica y la preparativa. Los usuarios de sistemas cromatográficos pueden aprovechar una amplia variedad de tamaños de partículas (esto es, 1,7, 2,5, 3,5, 5 y 10 µm) conservando la eficacia del método.

tecnología uplc: v elocidad y reSolución

Para separaciones isocráticas, la resolución (Rs) es proporcional al tamaño de la partícula. Por tanto, las partículas más pequeñas ofrecen mayor resolución.

Absorbancia a 270 nm 0.04 0.08 Absorbancia a 270 nm 0.08 Absorbancia a 270 nm 0.04 Absorbancia a 270 nm 0.04 Absorbancia a 270 nm Rs (2,3) = 2.90 Rs _(2,3) = 7.42 Rs _(2,3) = 4.58 Rs (2,3) = 4.57 Rs (2,3) = 6.18 2.1 x 30 mm, 1.7 µm 2.1 x 50 mm, 1.7 µm 2.1 x 100 mm, 1.7 µm 2.1 x 150 mm, 5.0 µm

UPLC

HPLC

2.1 x 150 mm, 1.7 µm 0.00 0.50 1.00 1.50 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 0.00 2.00 4.00 6.00 7.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 VELOCIDAD EXTREMA RESOLUCIÓN EXTREMA VELOCIDAD CON RESOLUCIÓN RESOLUCIÓN CON VELOCIDAD

UPLC

Protocolo de desarrollo de métodos

HPLC

Protocolo de desarrollo de métodos

deSarrollo de méTodoS máS ráPido con la Tecnología UPlc

26.8 Horas

TiemPo ToTal de Screening

pH 3 / Acetonitrilo pH 3 / Acetonitrilo pH 3 / Metanol pH 3 / Metanol pH 10 / Acetonitrilo pH 10 / Acetonitrilo pH 10 / Metanol pH 10 / Metanol

Tiempo de análisis: 6,7 horas/columna x 4 columnas

8 Horas

TiemPo ToTal de Screening

Tiempo de screening: 2 horas/columna x 4 columnas

El desarrollo de métodos utilizando un enfoque de screening sistemático es uno de los modos más rápidos y efectivos para crear nuevas separaciones de HPLC. Evaluando combinaciones de pH, química de la columna y modificador orgánico, se racionaliza la información necesaria para permitir una decisión segura acerca del modo de continuar con un método. Pero ¿y si los datos pudieran obtenerse aún más deprisa? La respuesta está en la tecnología de UPLC.

Se ilustra aquí un protocolo convencional de desarrollo de métodos utilizando tecnología HPLC y UPLC. Ambas técnicas proporcionan la misma cantidad de información. La diferencia es la cantidad de tiempo de laboratorio necesaria para obtener esta información. ¡En este ejemplo, la tecnología UPLC dio la respuesta en 1/3 del tiempo! Este protocolo completo se puede terminar en un solo día laborable, manteniendo la misma calidad de la información. La tecnología UPLC aumenta considerablemente la velocidad de desarrollo de métodos y la eficacia del funcionamiento de un laboratorio.

alcanzar un nuevo niv el de duración de laS columnaS preparativaS

La escasa vida útil y el rendimiento irregular de las columnas preparativas han sido fuente de inquietud significativa para el químico dedicado a la purificación. Hay que reducir el coste por purificación, y la pérdida de muestras por fallo prematuro de la columna debe ser reducida al mínimo. Tras muchos años de investigación acerca del relleno y del diseño de las columnas, Waters creó el diseño de columna preparativa con óptima densidad del lecho (OBD)*, resolviendo eficazmente estos problemas. Este formato es reconocido en el sector como el que ofrece las columnas preparativas más estables, eficaces y reproducibles.

La combinación de los robustos rellenos XBridge y el diseño OBD eleva el rendimiento de las columnas preparativas a un nuevo nivel y garantiza una escalabilidad directa, una eficacia máxima y una larga vida útil de las columnas.

Las columnas XBridge Prep ofrecen la misma elevada capacidad de carga y fiabilidad que se espera de nuestros productos XTerra Prep, generando al tiempo menor contrapresión en la columna y mayor eficacia.

eficacia máxima/un 30% menos de contrapresión

0 2 4 6 8 10 min 0 2 4 6 8 10 min 0 2 4 6 8 10 min 0 2 4 6 8 10 min XTerra Prep MS C18, 19 x 50 mm, 5 µm Volumen de inyección: 660 µL Carga total: 198 mg Presión máxima: 1000 psi

XBridge Prep C18, 19 x 50 mm, 5 µm

Volumen de inyección: 660 µL Carga total: 198 mg Maximum

Contrapresión máxima: 700 psi Fase móvil A: 0,1% de DEA en agua

Fase móvil B: 0,1% de DEA en acetonitrilo Concentración de la muestra: 300 mg/mL en DMSO Instrumento: Sistema AutoPurification®

Detección: UV @ 260 nm Compuestos 1. Labetolol (50 mg/mL) 2. Quinina (50 mg/mL) 3. Diltiacem (50 mg/mL) 4. Verapamilo (100 mg/mL) 5. Amitriptilina (50 mg/mL) Caudal: 23.8 mL/min Gradiente: Tiempo Perfil

(min) %A %B 0.0 95 5 1.79 95 5 6.79 5 95 7.79 5 95 Caudal: 23.8 mL/min Gradiente: Tiempo Perfil

(min) %A %B 0.0 95 5 1.79 95 5 6.79 5 95 7.79 5 95 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 min

El diseño de la columna preparativa OBD ofrece una densidad del lecho relleno equivalente a la de la columna analítica, garantizando por tanto una transferencia directa.

XBridge C18, 4.6 x 100 mm, 5 µm

Volumen de inyección: 30 µL Carga total: 6 mg

Fase móvil A: Acetato amónico 10 mM, pH 10

Fase móvil B: Acetonitrilo/bicarbonato amónico 100 mM (90/10) Caudal: 1,06 min/mL (ana); 18 min/mL (prep)

Gradiente: Gradiente de 10 min, desde el 5% de A al 95% de B Detección: UV @ 270 nm Compuestos 1. Econazol (100 mg/mL) 2. Miconazol (100 mg/mL) XBridge Prep C18, 19 x 100 mm, 5 µm Volumen de inyección: 510 µL Carga total: 102 mg Transferencia directa

Tecnología PreParaTiVa oBd

[ ]18

*Patente del Reino Unido nº GB2408469.

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 1 2

0 100 100 100 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 min % % %

BeneficioS del pH en el aiSlamiento y en la purificación

-1 100 100 100 -8 0 0 2 4 6 8 10 min % % %

El pH bajo para analitos ácidos ofrece la más alta capacidad de carga, así como la mejor retención y separación.

El pH elevado para analitos básicos ofrece la mejor capacidad de carga, así como la mejor retención y separación.

XBridge C18

XBridge C18

Carga de bases

Carga de ácidos

reducir el coSte ampliando

la vida útil de la columna

inyección 1

inyección 7.000

Folleto de las columnas preparativas de óptima densidad del lecho (oBd).

Referencia bibliográfica 720002336EN

Referencia bibliográfica

Tecnología PreParaTiVa oBd

La demanda de aislamiento rápido de compuestos con elevada pureza exige integridad y estabilidad de la columna preparativa. Las materias primas complejas, de escasa solubilidad, se disuelven con frecuencia en disolventes fuertes, como el DMSO. Esta combinación de escasa solubilidad y los choques de presión asociados a los grandes volúmenes de inyección de eluyente orgánico puro es la principal responsable del fallo precoz de la columna, y del colapso del lecho cromatográfico.

El diseño OBD muestra una resistencia excepcional al fallo mecánico del lecho cromatográfico y ofrece un rendimiento constante de una columna a otra, reduciendo el coste mediante una vida útil prolongada

1,2 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 Bases 1. Nordoxepina 2. Doxepina 3. Amitriptilina Ácidos 1. Oxacilina 2. Cloxacilina 3. Dicloxacilina x 5 en las ordenadas x 20 en las ordenadas 0.1 mg 0.8 mg 0.1 mg 0.3 mg 0.5 mg 0.2 mg pH 2.3 pH 2.3 pH 7 pH 7 pH 10 pH 10

Tecnología de SeParación de PéPTidoS

[ ]2 0

Las columnas con tecnología de separación de péptidos de Waters incorporan partículas con tecnología BEH. Están especialmente testadas con un mapa de péptidos para garantizar la estabilidad de los métodos de separación de péptidos, así como un comportamiento predecible, con la diversidad de muestras que se encuentran en proteómica, caracterización de proteínas y síntesis peptídica. Disponibles en tamaños de poro de 130 Å o de 300 Å y en tamaños de partícula desde 1,7 µm hasta 10 µm, ofrecen:

■ Picos estrechos y simétricos para obtener la máxima resolución. ■ Excelente separación de una amplia diversidad de péptidos.

■ Excelente forma y retención de los picos en ácido fórmico y en ácido trifluoroacético, para obtener una

óptima cromatografía.

■ Transferencia directa de los métodos desde la tecnología UPLC de menos de 2 µm hasta las separaciones preparatorias por HPLC

Las columnas con tecnología BEH pueden emplearse para aumentar la resolución de digestiones peptídicas complejas. Utilizando las partículas de UPLC BEH de 1,7 µm en dimensiones de columna más largas, el usuario de sistemas cromatográficos puede conseguir una resolución extrema. El poder de resolución de una columna de LC se puede expresar por su cociente de longitud a tamaño de partícula (l/dp). Las columnas con cocientes l/dp más elevados ofrecen mayor eficacia y se utilizan para las separaciones más difíciles. Un ejemplo serían las columnas ACQUITY UPLC BEH con tecnología de separación de péptidos, que están disponibles con una longitud de 150 mm. Su cociente l/dp es superior a 88.000 y ofrecen eficacias de > 35.000 placas por separación.

mapa peptídico de mayor reSolución con uplc

Se muestra arriba la resolución de una mezcla peptídica compleja de una digestión proteica con fosforilasa b. En comparación con el uso de tecnología tradicional de HPLC, se obtiene mejor resolución de los componentes en un sistema ACQUITY UPLC de Waters, utilizando columnas con tecnología de separación de péptidos de Waters, que contienen partículas BEH de 1,7 µm.

30 40 50 60 70 80 90 min 30 40 50 60 70 80 90 min HPLC Capacidad de picos = 372 UPLC Capacidad de picos = 723

Tecnología de SeParación de oligonUcleóTidoS

Las columnas con tecnología de separación de oligonucleótidos (OST, siglas inglesas) de Waters utilizan la tecnología BEH de partículas híbridas, y están disponibles en formatos de partículas de 1,7 µm para UPLC y de 2,5 µm para HPLC. Esto proporciona la flexibilidad necesaria para cubrir una amplia diversidad de necesidades analíticas y de purificación, sin dejar de ofrecer una excepcional resolución y vida útil de la columna.

La separación de muestras de oligonucleótidos sintéticos destritilados se basa en el método convencional de cromatografía de fase reversa con par iónico. Las columnas ACQUITY UPLC OST C18 y XBridge OST C18 son las adecuadas para este tipo de análisis y ofrecen:

■ Una eficacia de separación equivalente o mejor que la de los métodos PAGE-CGE o HPLC de intercambio iónico.

■ La capacidad de resolver largas secuencias de oligonucleótidos gracias a la mayor potencia de resolución obtenida empleando

partículas de menos de 3 µm.

■ Una amplia oferta de columnas escalables para cubrir las necesidades de aislamiento de escala en el laboratorio. ■ Excepcional vida útil de la columna para reducir el coste por análisis.

eXcepcional duración de laS columnaS

Separación de una cadena de un 55–25mero de oligodesoxitimidina destritilada

Las columnas XBridge OST C18 son adecuadas para la purificación de oligonucleótidos destritilados, debido a su disponibilidad

en diversos tamaños de columna. El científico dedicado a la separación tiene la posibilidad de seleccionar el tamaño de columna más adecuado, basándose en la cantidad de muestra de oligonucleótido disponible. Esto permite la máxima resolución de los componentes y la máxima recuperación del producto de interés en secuencias fallidas no deseadas.

guía de selección de columnas XBridge oST C18 para la purificación de oligonucleótidos destritilados.

Columna: XBridge oST C18, 2.5 µm (2.1 x 50 mm)

Fase móvil: A: 10% de MeOH / 90% de (HFIP 385 mM + TEA 14,3 mM) B: 25% de MeOH / 75% de (HFIP 385 mM + TEA 14,3 mM) Temperatura de

la columna TEA: 60 °C

Gradiente: 0 – 100% de B en 30 min (10-25% MeOH). Caudal: 1.0 mL/min

Detección: 260 nm, 5 barridos por segundo Sistema HPLC: Alliance Bio 2796 de Waters con PDA

Columna (mm) Carga de masas aprox. (µmoles)** Caudal (mL/min)

2.1 x 50 0.04 0.2 4.6 x 50 0.20 1.0 10.0 x 50 1.00 4.5 19.0 x 50* 4.00 16.0 30.0 x 50* 9.00 40.0 50.0 x 50* 25.00 110.0

* Columna OST especial

** Los valores son solo aproximados y varían en función de la longitud del oligonucleótido, su composición de bases y el método de recogida de fracciones utilizado.

[ ]22

■ Análisis de estatinas

Las estatinas (o inhibidores de la HMG-CoA reductasa) forman una clase de agentes hipolipidemiantes, empleados como fármacos para reducir los niveles de colesterol en personas que padecen enfermedad cardiovascular o corren riesgo de padecerla. Reducen el colesterol inhibiendo la enzima HMG-CoA reductasa, que es una enzima limitadora de la velocidad de la vía del mevalonato, implicada en la síntesis del colesterol. La inhibición de esta enzima en el hígado estimula los receptores de LDL, ocasionando un aumento del aclaramiento de lipoproteínas de baja densidad (LDL, siglas inglesas) del torrente circulatorio, y una reducción de los niveles de colesterol en sangre.

Además de la actividad liporreductora, las estatinas presentan propiedades ligadas a la prevención de la ateroesclerosis. Los investigadores especulan también que las estatinas ayudan a prevenir la enfermedad cardiovascular, inhibiendo la formación de trombos, estabilizando los niveles de placa, mejorando la función endotelial y moderando las respuestas inflamatorias.

Compuestos 1. Pravastatina 2. Atorvastatina 3. Lovastatina 4. Simvastatina 0 1 3 5 7 min

Las columnas XBridge Shield RP18 separan eficazmente compuestos estrechamente

relacionados, permitiendo su rápida identificación.

SolUcioneS xBridge: ProdUcToS FarmacéUTicoS

■ Análisis de cafeína y sus metabolitos

La cafeína es un estimulante del sistema nervioso central y del metabolismo, y se utiliza tanto en situaciones sociales como en medicina, para reducir la fatiga física y restaurar la alerta mental cuando se produce una debilidad o somnolencia inusuales. La cafeína estimula el sistema nervioso central primero a los niveles superiores, ocasionando un aumento de la alerta y de la vigilia, un raciocino más rápido y claro, mayor concentración y mejor coordinación corporal general.

Columna: XBridge Phenyl, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003334

Fase móvil A: H2O

Fase móvil B: ACN

Fase móvil C: 100 mM NH4HCO3

Caudal: 1.0 mL/min Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B %C 0.0 89 1 10 9.00 66 24 10 10.00 89 1 10 20.00 89 1 10 Volumen de inyección: 10 µL

Muestra: Cafeína (10 µg/mL), teobromina (10 µg/mL), 1-metilxantina (10 µg/mL), ácido 1,3-dimetilúrico (10 µg/mL), 1,7-dimetilxantina (10 µg/mL), ácido 1,7-dimetilúrico (10 µg/mL) en H2O/NH4HCO3 (90/10) Temp. de la columna: 30 °C Temp. de la muestra: 15 °C Detección: UV @ 280 nm Velocidad de adquisición: 5 puntos/s Respuesta del filtro: 0.2

Instrumento: Waters Alliance 2695 con PDA 2998

Las columnas XBridge Fenilo ofrecen una separación rápida y consistente para el análisis de la cafeína y sus metabolitos.

Compuestos 1. Ácido 1,7-dimetilúrico 2. 1-metilxantina 3. Ácido 1,3-dimetilúrico 4. 1,7-dimetilxantina 5. Teobromina 6. Cafeína 0 2 4 6 8 min

Columna: XBridge Shield rP18, 4.6 x 50 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003042

Fase móvil A: H2O Fase móvil B: ACN

Fase móvil C: NH4HCO3 100 mM, pH 10

Caudal: 1.2 mL/min Volumen de inyección: 20 µL Concentración y diluyente de la muestra: 10 µg/mL en H2O Temperatura: 30 °C Detección: UV @ 248 Velocidad de adquisición: 5 puntos/segundo Filtro respuesta: 1.0

Lavado de la aguja: 5/95 MeOH/H2O

Instrumento: Waters Alliance 2695 con PDA 2996

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4

SolUcioneS xBridge: SegUridad alimenTaria

Para obtener notas de aplicación adicionales del XBridge, visitar www.waters.com/xbridge

Literature Reference

■ Análisis de aditivos y conservantes alimentarios

La sacarina es un edulcorante artificial. El ácido 4-hidroxibenzoico es conocido principalmente como la base para la preparación de sus ésteres, llamados parabenos, que se utilizan como conservantes. El ácido deshidroacético, el metil parabeno y el ácido sórbico son conservantes empleados en cosméticos y alimentos.

La columna XBridge Fenilo permitió una rápida cuantificación de los compuestos de interés.

■ Análisis de patulina en zumo de manzana

La patulina es una micotoxina producida por varias especies de mohos, que puede aparecer en diversos alimentos, incluyendo cereales, frutas y quesos. De los hongos capaces de producir patulina, Penicillum expansum es el más común y se aísla con frecuencia en manzanas podridas. Debido a su toxicidad, diversos organismos reguladores han establecido una ingesta máxima diaria de patulina, siendo la inquietud principal el consumo de zumo de manzana por los niños.

En este método, la patulina se puede resolver completamente del hidroximetilfurfural, un compuesto interferente común.

Los datos han sido ofrecidos por cortesía del Dr. Vural Gökmen, Departamento de Ingeniería Alimentaria, Universidad Hacettepe, Ankara, Turquía.

3 4 5 6 min

Columna: XBridge C18, 4.6 x 100 mm, 3.5 µm

Número de referencia: 186003033

Fase móvil: HCOOH:ACN (95:5, v/v) al 0,1% Caudal: 0,75 mL/min Temperatura: 25 °C Detección: 276 nm 1 2 3 4 5 6 min Compuestos 1. Sacarina 2. Ácido 4-hidroxibenzoico 3. Ácido sórbico 4. Metilparabeno 5. Ácido deshidroacético

Columna: XBridge Phenyl, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003334

Fase móvil A: KH2PO4 20 mM, pH 2,5

Fase móvil B: ACN Caudal: 1.0 mL/min Isocratic Mobile

Composición de la fase

móvil isocrática: 75%A; 25%B Volumen de inyección: 10 µL

Muestra: Sacarina (100 µg/mL), ácido 4-hidroxibenzoico (10 µg/mL), ácido deshidroacético (100 µg/mL), metilparabeno (25 µg/mL), ácido sórbico (10 µg/mL) en KH2PO4/ACN (75/25) Temperatura de la columna: 30 °C Temperatura de la muestra: 15 °C Detección: UV @ 240 nm Velocidad de adquisición: 5 puntos/s Filtro respuesta: 0.2

IInstrumento: Waters Alliance 2695 con PDA 2996

1 2 1 2 3 4 5 Compuestos 1. Hidroximetilfurfural 2. Patulina

SolUcioneS xBridge: medioamBienTaleS

[ ]24

■ Análisis de derivatizados con dnPH

Los organismos reguladores de todo el mundo están interesados en medir el formaldehído y otros aldehídos en el aire. Muchos grupos dedicados a la salud pública están interesados en la implicación de estos aldehídos en la irritación respiratoria y sus posibles efectos cancerígenos con una exposición prolongada. Los fabricantes de productos que pueden contribuir a las emisiones de aldehídos al aire, así como contaminantes en interiores, son los fabricantes de materiales de construcción y productos de madera, tejidos y textiles, y empresas de automoción.

1 3 5 7 min

Las columnas XBridge C18 separan rápidamente

los compuestos de interés para su cuantificación.

Columna: XBridge Phenyl, 3.5 µm, 4.6 × 100 mm Número de referencia: 186003334

Fase móvil A: H2O

Fase móvil B: ACN

Fase móvil C: HCOOH al 0,2% en H2O

Caudal: 1.2 mL/min

Gradiente: Tiempo Perfil (min) (min) %A %B %C 0.0 40 50 10 2.67 40 50 10 6.67 0 90 10 7.33 40 50 10 11.00 40 50 10 Volumen de inyección: 10 µL Muestra: Acetaldehído-DNPH (10 µg/mL), acetona-DNPH (10 µg/mL), ciclohexanona-DNPH (10 µg/mL), formaldehído-DNPH (10 µg/mL), crotonaldehído-DNPH (10 µg/mL) en H2O/ACN (60/40) Temperatura de la columna: 30 °C Temperatura de la muestra: 15 °C Detección: UV @ 254 nm Velocidad de adquisición: 5 puntos/s Filtro respuesta: 0.2

Instrumento: Waters Alliance 2695 con PDA 2996 Compuestos 1. Formaldehído-DNPH 2. Acetaldehído-DNPH 3. Acetona-DNPH 4. Crotonaldehído-DNPH 5. Ciclohexanona-DNPH 1 2 3 4 5 ■ Análisis de explosivos

El método EPA 8330 describe el uso de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con detección ultravioleta (UV) para el análisis de muestras que contienen, o se sospecha que contienen, compuestos explosivos. El método 8330 permite la detección de explosivos en partes por mil millones (ppb, siglas inglesas) en tierra, agua y sedimentos.

2 6 10 14 18 22 min

Columna: XBridge Phenyl, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003324

Fase móvil: Formiato amónico 10 mM/isopropanol Caudal: 0.25 mL/min

Inyección: 10 µL Temperatura: 40 °C Detección UV @ 254 nm

Sistema: Sistema Alliance HPLC de Waters con detector de absorbancia 2487 doble λ. Compuestos 1. HMX 2. RDX 3. 1,3,5-trinitrobenceno 4. 1,3 dinitrobenceno 5. Nitrobenceno 6. TNT 7. Tetrilo 8. 2 amino-4,6 dinitrotolueno 9. 2,4 dinitrotolueno 10. 4 amino-2,6 dinitrotolueno 11. 2,6 dinitrotolueno 12. 4-nitrotolueno 13. 2-nitrotolueno 14. 3-nitrotolueno

Las columnas XBridge Fenilo separaron con precisión 14 compuestos explosivos en muestras de interés. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ₁₁ 12 13 14

SolUcioneS xBridge: medioamBienTaleS

Para obtener notas de aplicación adicionales del XBridge, visitar www.waters.com/xbridge

Referencia bibliográfica

■ Análisis de aldehídos y cetonas como derivados de la dnPH

Los métodos EPA T011, 554 y 8315 describen el uso de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con detección ultravioleta (UV) para la identificación de aldehídos y cetonas, como derivados de la dinitrofenilhidracina (DNPH) en el agua potable (554); tierra, aire, agua, desechos o chimeneas obtenidos por el método 0011 (8315 opción 1) al aire libre (T011), y muestras obtenidas en aire de interiores por el método 0100 (8315 opción 2). Los métodos EPA 554 y 8315 opción 1 están dirigidos a los mismos 12 compuestos. Igualmente, los métodos EPA T011 y 8315 opción 2 están dirigidos a los mismos 15 compuestos. Varios analitos son comunes a los cuatro métodos.

En combinación con estos métodos EPA, las columnas XBridge Fenilo facilitaron la identificación efectiva de derivados de la DNPH en muestras medioambientales.

Columna: XBridge Phenyl, 4.6 x 150 mm, 3.5 µm Número de referencia: 186003335

Fase móvil: Agua/tetrahidrofurano/acetonitrilo Caudal: 1.5 mL/min

Inyección: 20 µL cada uno de mezcla AccuStandard (M-8315-R1-DNPH y M-8315-R2-DNPH) diluida 1:5 en agua/acetonitrilo 40:60. Temperatura: 35 °C

Detección: UV @ 360 nm

Sistema: Sistema Alliance HPLC de Waters con detección UV.

Derivados DNPH de 1. Formaldehído 2. Acetaldehído 3. Propanal 4. Crotonaldehído 5. Butanal 6. Ciclohexanona 7. Pentanal 8. Hexanal 9. Heptanal 10. Octanal 11. Nonanal 12. Decanal Derivados DNPH de 1. Formaldehído 2. Acetaldehído 3. Acetona 4. Acroleína 5. Propanal 6. Crotonaldehído 7. Butanal 8. Benzaldehído 9. Isovaleraldehído 10. Pentanal 11. o-tolualdehído 12. p-tolualdehído 13. m-tolualdehído 14. Hexanal 15. 2-5 dimetilbenzaldehído 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 min 4 6 8 10 12 14 16 18 20 min 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

inFormación Para PedidoS

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Columnas analíticas XBridge

Dimensiones Tipo Tamaño de las

partículas

C18 C8 Shield RP18 Fenilo HILIC

1.0 x 50 mm Columna 2.5 µm 186003118 186003164 186003136 186003306 — 2.1 x 10 mm Precolumna 2.5 µm 1860030561 _1860030741 _1860030651 _1860033591 _186004455 2.1 x 20 mm IS™ _{Columna 2.5 µm 186003201 186003167 186003139 186003307} — 2.1 x 30 mm Columna 2.5 µm 186003084 186003099 186003091 186003308 186004456 2.1 x 50 mm Columna 2.5 µm 186003085 186003101 186003092 186003309 186004457 3.0 x 20 mm IS Columna 2.5 µm 186003087 186003168 186003140 186003310 — 3.0 x 20 mm Precolumna 2.5 µm 1860030572 _1860030752 _1860030662 _1860033602 _— 3.0 x 30 mm Columna 2.5 µm 186003121 186003169 186003141 186003311 — 3.0 x 50 mm Columna 2.5 µm 186003122 186003170 186003142 186003312 186004458 4.6 x 20 mm IS Columna 2.5 µm 186003088 186003172 186003144 186003313 — 4.6 x 20 mm Precolumna 2.5 µm 1860030582 _1860030762 _1860030672 _1860033612 _186004459 4.6 x 30 mm Columna 2.5 µm 186003089 186003173 186003145 186003314 — 4.6 x 50 mm Columna 2.5 µm 186003090 186003174 186003096 186003315 186004460 4.6 x 75 mm Columna 2.5 µm 186003124 186003175 186003146 186003316 186004461 1.0 x 50 mm Columna 3.5 µm 186003126 186003177 186003148 186003317 186004429 1.0 x 100 mm Columna 3.5 µm 186003127 186003178 186003149 186003318 — 1.0 x 150 mm Columna 3.5 µm 186003128 186003179 186003150 186003319 — 2.1 x 10 mm Precolumna 3.5 µm 1860030591 _1860030771 _1860030681 _1860033621 _186004430 2.1 x 20 mm IS Columna 3.5 µm 186003019 186003180 186003151 186003320 — 2.1 x 30 mm Columna 3.5 µm 186003020 186003046 186003035 186003321 186004431 2.1 x 50 mm Columna 3.5 µm 186003021 186003047 186003036 186003322 186004432 2.1 x 100 mm Columna 3.5 µm 186003022 186003048 186003037 186003323 186004433 2.1 x 150 mm Columna 3.5 µm 186003023 186003049 186003038 186003324 186004434 3.0 x 20 mm IS Columna 3.5 µm 186003024 186003181 186003152 186003325 — 3.0 x 20 mm Precolumna 3.5 µm 1860030602 _1860030782 _1860030692 _1860033632 _— 3.0 x 30 mm Columna 3.5 µm 186003025 186003182 186003153 186003326 — 3.0 x 50 mm Columna 3.5 µm 186003026 186003050 186003039 186003327 186004435 3.0 x 100 mm Columna 3.5 µm 186003027 186003051 186003040 186003328 186004436 3.0 x 150 mm Columna 3.5 µm 186003028 186003052 186003041 186003329 — 4.6 x 20 mm IS Columna 3.5 µm 186003029 186003183 186003154 186003330 — 4.6 x 20 mm Precolumna 3.5 µm 1860030612 _1860030792 _1860030702 _1860033642 _186004437 4.6 x 30 mm Columna 3.5 µm 186003030 186003184 186003155 186003331 186004438 4.6 x 50 mm Columna 3.5 µm 186003031 186003053 186003042 186003332 186004439 4.6 x 75 mm Columna 3.5 µm 186003032 186003185 186003043 186003333 — 4.6 x 100 mm Columna 3.5 µm 186003033 186003054 186003044 186003334 186004440 4.6 x 150 mm Columna 3.5 µm 186003034 186003055 186003045 186003335 186004441 4.6 x 250 mm Columna 3.5 µm 186003943 186003963 186003964 186003965 — 2.1 x 10 mm Precolumna 5 µm 1860030621 _1860030801 _1860030711 _1860033661 _186004442 2.1 x 20 mm IS Columna 5 µm 186003107 186003186 186003156 186003336 — 2.1 x 30 mm Columna 5 µm 186003129 186003187 186003157 186003337 186004443 2.1 x 50 mm Columna 5 µm 186003108 186003011 186002999 186003338 186004444 2.1 x 100 mm Columna 5 µm 186003109 186003012 186003002 186003339 186004445 2.1 x 150 mm Columna 5 µm 186003110 186003013 186003003 186003340 186004446 3.0 x 20 mm IS Columna 5 µm 186003130 186003188 186003158 186003341 — 3.0 x 20 mm Precolumna 5 µm 1860030632 _1860030812 _1860030722 _1860033672 _— 3.0 x 30 mm Columna 5 µm 186003111 186003189 186003159 186003342 — 3.0 x 50 mm Columna 5 µm 186003131 186003190 186003160 186003343 186004447 3.0 x 100 mm Columna 5 µm 186003132 186003191 186003004 186003344 186004448 3.0 x 150 mm Columna 5 µm 186003112 186003014 186003005 186003345 — 3.0 x 250 mm Columna 5 µm 186003133 186003192 186003161 186003346 — 4.6 x 20 mm IS Columna 5 µm 186003134 186003193 186003162 186003347 — 4.6 x 20 mm Precolumna 5 µm 1860030642 _1860030822 _1860030732 _1860033682 _186004449 4.6 x 30 mm Columna 5 µm 186003135 186003194 186003163 186003348 186004450 4.6 x 50 mm Columna 5 µm 186003113 186003015 186003006 186003349 186004451 4.6 x 75 mm Columna 5 µm 186003114 186003195 186003007 186003350 — 4.6 x 100 mm Columna 5 µm 186003115 186003016 186003008 186003351 186004452 4.6 x 150 mm Columna 5 µm 186003116 186003017 186003009 186003352 186004453 4.6 x 250 mm Columna 5 µm 186003117 186003018 186003010 186003353 186004454

ordering inFormaTon

XBridge Preparative Columns

Dimensiones Tipo Tamaño de las

partículas C18 C8 Shield RP18 Fenilo 2.1 x 100 mm MVKit 3.5 µm 186003766 186003777 186003788 186003799 3.0 x 100 mm MVKit 3.5 µm 186003767 186003778 186003789 186003800 3.0 x 150 mm MVKit 3.5 µm 186003768 186003779 186003790 186003801 4.6 x 100 mm MVKit 3.5 µm 186003769 186003780 186003791 186003802 4.6 x 150 mm MVKit 3.5 µm 186003770 186003781 186003792 186003803 2.1 x 150 mm MVKit 5 µm 186003771 186003782 186003793 186003804 3.0 x 100 mm MVKit 5 µm 186003772 186003783 186003794 186003805 3.0 x 150 mm MVKit 5 µm 186003773 186003784 186003795 186003806 4.6 x 100 mm MVKit 5 µm 186003774 186003785 186003796 186003807 4.6 x 150 mm MVKit 5 µm 186003775 186003786 186003797 186003808 4.6 x 250 mm MVKit 5 µm 186003776 186003787 186003798 186003809

XBridge Column Method Validation Kits

1 Requiere soporte universal para precolumnas Sentry: 2,1 x 10 mm WAT097958

2 _{Requiere soporte universal para precolumnas Sentry: 3,0 x 20 mm/4,6 x 20 mm WAT046910} 3 Requiere soporte para precolumnas preparativas de 10 x 10 mm 289000779

4 _{Requiere soporte para precolumnas preparativas de 19 x 10 mm 186000709}

Para obtener información acerca de pedidos de columnas ACQUITY UPLC, visite:

www.waters.com/acquitycolumns Para obtener información acerca

de pedidos para bioseparación y análisis, visite:

www.waters.com/biosep

Dimensiones Tipo Tamaño de las partículas C18 C8 Shield RP18 Fenilo

10 x 10 mm PreColumnaa 5 µm 1860029721 _1860029911 _1860029831 _1860033541 10 x 50 mm Columna 5 µm 186002973 186003264 186003257 186003271 10 x 100 mm Columna 5 µm 186003255 186003265 186003258 186003272 10 x 150 mm Columna 5 µm 186002974 186003266 186003259 186003273 10 x 250 mm Columna 5 µm 186003256 186003267 186003260 186003274 19 x 10 mm PreColumnaa 5 µm 1860029752 _1860029922 _1860029842 _1860033552 OBD 19 x 30 mm Columna 5 µm 186002976 186003268 186003261 186003275 OBD 19 x 50 mm Columna 5 µm 186002977 186002993 186002985 186003356 OBD 19 x 100 mm Columna 5 µm 186002978 186002994 186002986 186003357 OBD 19 x 150 mm Columna 5 µm 186002979 186002995 186002987 186003358 OBD 19 x 250 mm Columna 5 µm 186004021 186004023 186004022 186004024 OBD 30 x 50 mm Columna 5 µm 186002980 186002996 186002988 186003277 OBD 30 x 75 mm Columna 5 µm 186002981 186003269 186003262 186003278 OBD 30 x 100 mm Columna 5 µm 186002982 186002997 186002989 186003279 OBD 30 x 150 mm Columna 5 µm 186003284 186003083 186002990 186003276 OBD 30 x 150 mm Columna 5 µm 186004025 — — — OBD 50 x 50 mm Columna 5 µm 186003933 186003934 186003935 186003936 OBD 50 x 100 mm Columna 5 µm 186003937 186003938 186003939 186003940 OBD 50 x 150 mm Columna 5 µm 186003929 — — — OBD 50 x 250 mm Columna 5 µm 186004107 — — — 10 x 10 mm PreColumnaa 10 µm 1860038893 _1860040033 _1860039883 _— 10 x 150 mm Columna 10 µm 186003890 186004004 186003989 — 10 x 250 mm Columna 10 µm 186003891 186004005 186003990 — OBD 19 x 10 mm PreColumnaa 10 µm 1860038924 _1860040064 _1860039914 _— OBD 19 x 50 mm Columna 10 µm 186003893 186004007 186003992 — OBD 19 x 100 mm Columna 10 µm 186003901 186004008 186003993 — OBD 19 x 150 mm Columna 10 µm 186003894 186004009 186003994 — OBD 19 x 250 mm Columna 10 µm 186003895 186004010 186003995 — OBD 30 x 100 mm Columna 10 µm 186003930 — — — OBD 30 x 150 mm Columna 10 µm 186003896 186004011 186003996 — OBD 30 x 250 mm Columna 10 µm 186003897 186004012 186003997 — OBD 50 x 50 mm Columna 10 µm 186003898 186004013 186003998 — OBD 50 x 100 mm Columna 10 µm 186003902 186004014 186003999 — OBD 50 x 150 mm Columna 10 µm 186003899 186004015 186004001 — OBD 50 x 250 mm Columna 10 µm 186003900 186004016 186004002 —

Austria y exportación europea (Europa cen-tral sudoriental, CEI y Oriente Medio)

43 1 877 18 07 Australia 61 2 9933 1777 Bélgica 32 2 726 1000 Brasil 55 11 5094-3788 Canadá 1 800 252 4752 x2205 China 86 10 8586 8899 CEI/Rusia +7 495 3367000 República Checa 420 2 617 1 1384 Dinamarca 45 46 59 8080 Finlandia 09 5659 6288 Francia 33 1 30 48 72 00 Alemania 49 6196 400600 Hong Kong 852 29 64 1800 Hungría 36 1 350 5086 India y subcontinente indio

91 80 2837 1900 Irlanda 353 1 448 1500 Italia 39 02 27 421 1 Japón 81 3 3471 7191 Corea 82 2 820 2700 México 52 55 5200 1860 Países Bajos 31 76 508 7200 Noruega 47 6 384 60 50 Polonia 48 22 833 4400 Puerto Rico 1 787 747 8445 Singapur 65 6273 1221 España 34 93 600 9300 Suecia 46 8 555 11 500 Suiza 41 56 676 70 00 Taiwán 886 2 2543 1898 Reino Unido 44 208 238 6100 Todos los demás países: Waters Corporation EE.UU.

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720001255ES abril de 2008 SC-W P El sistema de gestión de calidad de las instalaciones de fabricación de Waters

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