PROGRAMA DE DOCTORADO EN INGENIERÍA AGRARIA, ALIMENTARIA, FORESTAL Y DE
DESARROLLO RURAL SOSTENIBLE
Tesis doctoral
Implicación de genes de Pseudomonas simiae PICF7 en endofitismo, control biológico y promoción del crecimiento vegetal.
PhD thesis
Involvement of Pseudomonas simiae PICF7 genes in endophytic lifestyle, biological control and plant growth promotion
Memoria de Tesis Doctoral presentada por NURIA Mª MONTES OSUNA, Licenciada en Ciencias Ambientales, para optar al grado de Doctor por la
Universidad de Córdoba con la mención de Doctorado Internacional.
Directores Jesús Mercado Blanco Carmen Gómez-Lama Cabanás
Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible (IAS), Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Fecha de depósito en el Idep: 03 de noviembre de 2021
AUTOR: Nuria María Montes Osuna
© Edita: UCOPress. 2022 Campus de Rabanales Ctra. Nacional IV, Km. 396 A 14071 Córdoba
https://www.uco.es/ucopress/index.php/es/
Córdoba para la obtención del Título de Doctor con Mención Internacional:
Realización de una estancia mínima de 3 meses fuera de España. La doctoranda ha realizado una estancia internacional de 4 meses (3 de agosto- 29 de noviembre, 2018) en la Universidad Tecnológica de Graz (Technische Universität Graz) bajo la supervisión de la Dra. Gabriele Berg y el Dr.
Tosmislav Cernava, pertenecientes al Institute of Environmental Biotechnology.
Parte de la Tesis Doctoral se ha redactado y se presentará en dos idiomas, castellano en inglés.
Informe previo, acreditado oficialmente, de dos doctores/as expertos y con experiencia investigadora acreditada pertenecientes a alguna institución de educación superior o instituto de investigación distinto de España:
- Dr. Luz de-Bashan, Northwestern Center for Biological Research CIBNOR, Mexico. Bashan Institute of Science, Auburn, AL, USA
Affiliated Faculty, College of Agriculture, Auburn University, AL, USA - Dr. Cécile Vriet, Université de Poitiers, Francia
Un doctor/a perteneciente a alguna institución de educación superior o centro de investigación no española, y distinto del responsable de la estancia de investigación, formará parte del tribunal evaluador de la tesis.
- Dr. Aurelio Ciancio, Institute for Sustanaible Plant Protection, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Italia.
-
Dr. Paula Baptista, Polytechnic Institute of Bragança, Portugal.
La doctoranda:
Fdo: Nuria Mª Montes Osuna
MONTES OSUNA
NURIA MARIA - 50612379M
Firmado digitalmente por MONTES OSUNA NURIA MARIA - 50612379M Fecha: 2021.11.02 18:35:03 +01'00'
Córdoba para su presentación como compendio de artículos, consistente en un mínimo de 3 artículos publicados o aceptados en revistas incluidas en los tres primeros cuartiles de la relación de revistas del ámbito de la especialidad y referenciadas en la última relación publicada por el Journal Citation Reports (SCI y/o SSCI).
1. Montes-Osuna, N.; Mercado-Blanco, J. Verticillium Wilt of Olive and Its Control: What Did We Learn during the Last Decade? Plants 2020, 9, 735.
DOI: 10.3390/plants9060735
Datos de 2021 (JCR): Indice de impacto 3.935, posición 47/235 y primer cuartil (Q1) en el área temática de Plant Sciences.
2. Montes-Osuna, N.; Gómez-Lama Cabanás, C.; Valverde-Corredor, A.;
Berendsen, R.L.; Prieto, P.; Mercado-Blanco, J. Assessing the Involvement of Selected Phenotypes of Pseudomonas simiae PICF7 in Olive Root Colonization and Biological Control of Verticillium dahliae. Plants 2021, 10, 412. DOI: 10.3390/plants10020412
Datos de 2021 (JCR): Indice de impacto 3.935, posición 47/235 y primer cuartil (Q1) en el área temática de Plant Sciences.
3. Montes-Osuna, N.; Gómez-Lama Cabanás, C.; Valverde-Corredor, A.;
Legarda, G.; Prieto, P.; Mercado-Blanco, J. Evaluation of Indigenous Olive Biocontrol Rhizobacteria as Protectants against Drought and Salt Stress.
Microorganisms 2021, 9, 1209. DOI: 10.3390/microorganisms9061209
Datos de 2021 (JCR): Indice de impacto 4.128, posición 52/137 y segundo cuartil (Q2) en el área temática de Microbiology.
La doctoranda:
Fdo: Nuria Mª Montes Osuna
MONTESOSUNA NURIA MARIA - 50612379M
Firmado digitalmente por MONTES OSUNA NURIA MARIA - 50612379M Fecha: 2021.11.02 18:35:20 +01'00'
TÍTULO DE LA TESIS: Involvement of Pseudomonas simiae PICF7 genes in endophytic lifestyle, biological control and plant growth promotion.
DOCTORANDO/A: Nuria Mª Montes Osuna
INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS
(se hará mención a la evolución y desarrollo de la tesis, así como a trabajos y publicaciones derivados de la misma).
El trabajo titulado “Involvement of Pseudomonas simiae PICF7 genes in endophytic lifestyle, biological control and plant growth promotion”, realizado por Nuria Mª Montes Osuna, se considera correctamente finalizado y reúne los requisitos necesarios para su exposición y defensa como Tesis Doctoral. Se ha llevado a cabo en el Departamento de Protección de Cultivos del Instituto de Agricultura Sostenible (IAS) de Córdoba, perteneciente a la Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). El grado de consecución de los objetivos inicialmente planteados ha sido muy satisfactorio, incluso los ha superado permitiendo abordar otros adicionales de forma exitosa. Se ha avanzado en la caracterización de dos rizobacterias indígenas de olivo, la ya bien conocida Pseudomonas fluorescens PICF7, redenominada en esta Tesis como P. simiae PICF7, y Pseudomonas sp. PICF6, apenas estudiada hasta el momento. Se ha determinado el nivel de implicación de tres fenotipos bacterianos de la cepa PICF7, tanto en su capacidad endófita como en el control biológico que ejerce frente a una de las enfermedades más importantes que afectan al olivar: la verticilosis del olivo. Se ha estudiado la emisión de volátiles para las dos rizobacterias y la implicación de los mismos en antagonismo frente a Verticillium dahliae y en promoción de crecimiento en una planta modelo. También se ha investigado el potencial de ambas cepas en el alivio de síntomas causados por dos estreses abióticos: sequía y salinidad. El conocimiento generado permitirá avanzar tanto en el contexto general de la interacción planta-microorganismo como en el desarrollo de medidas para el manejo de estreses bióticos y abióticos que amenazan al olivar.
Los trabajos efectuados han quedado reflejados en varias contribuciones científicas. Son de destacar tres artículos publicados en revistas de impacto, dos de ellos pertenecientes al área de “Plant Sciences” incluida en el primer cuartil (Q1), y un tercero perteneciente al área
“Microbiology”, incluida en segundo cuartil (Q2) de la relación publicada por el “Journal Citation Report” (JCR). Además, un cuarto capítulo de esta Tesis se prevé pueda ser publicado en el futuro en revista internacional. Ha presentado cinco comunicaciones escritas, una en un congreso nacional y cuatro en congresos de ámbito internacional. También es autora de una comunicación oral en el “VI Encuentro de Doctorandos IAS-CSIC”. Por último, ha efectuado durante el periodo de ejecución del trabajo una estancia de cuatro meses en un centro de reconocido prestigio, la Universidad Tecnológica de Graz (Technische Universität Graz), bajo la supervisión de los Drs.
Gabriele Berg y Tomislav Cernava, afiliados al “Institute of Environmental Biotechnology, Section of Plant Pathology and Antagonistic Microorganisms”, que le ha permitido complementar su formación como investigadora.
Por todo ello, se autoriza la presentación de la Tesis Doctoral.
Córdoba, 03 de noviembre de 2021.
Firma del/de los director/es
Fdo.: Jesús Mercado Blanco Fdo.: Carmen Gómez-Lama Cabanás GOMEZ-LAMA
CABANAS CARMEN - 44365915L
Firmado digitalmente por GOMEZ-LAMA CABANAS CARMEN - 44365915L
Nombre de reconocimiento (DN): c=ES, serialNumber=IDCES-44365915L, givenName=CARMEN, sn=GOMEZ-LAMA CABANAS, cn=GOMEZ-LAMA CABANAS CARMEN - 44365915L Fecha: 2021.11.03 05:26:34 +01'00'
MERCADO BLANCO JESUS - 24299722S
Firmado digitalmente por MERCADO BLANCO JESUS - 24299722S Fecha: 2021.11.03 11:21:21 +01'00'
TÍTULO DE LA TESIS: Involvement of Pseudomonas simiae PICF7 genes in endophytic lifestyle, biological control and plant growth promotion.
DOCTORANDO/A: Nuria Mª Montes Osuna
INFORME RAZONADO DEL TUTOR
(Ratificando el informe favorable del director. Sólo cuando el director no pertenezca a la Universidad de Córdoba).
Francisco Javier López Escudero, profesor titular de la Universidad de Córdoba, perteneciente al área de Producción Vegetal, como tutor de la doctoranda Nuria Mª Montes Osuna, informa que el trabajo de tesis ha tenido una evolución y desarrollo satisfactorio, ratificando el informe favorable de los directores.
Por todo ello, se autoriza la presentación de la Tesis Doctoral.
Córdoba, 02 de noviembre de 2021.
Firma del responsable de línea de investigación Firma del tutor
Fdo.: Antonio Trapero Casas Fdo.: Francisco Javier López Escudero
TRAPERO CASAS ANTONIO JOSE - 30399664N
Firmado digitalmente por TRAPERO CASAS ANTONIO JOSE - 30399664N Fecha: 2021.11.02 19:08:45 +01'00'
LOPEZ ESCUDERO FRANCISCO JAVIER - 30524833S
Firmado digitalmente por LOPEZ ESCUDERO FRANCISCO JAVIER - 30524833S Fecha: 2021.11.02 21:42:19 +01'00'
Competitividad/Agencia Estatal de Investigación, grant number AGL2016-75729-
C2-1-R, and Junta de Andalucía (Consejería de Economía, Innovación y Ciencia),
grant number P12-AGR-0667, both co-financed by the European Regional
Development Fund (ERDF). The international short-term stay at Institute of
Environmental Biotechnology in Graz University of Technology (Technische
Universität Graz) was supported by the University of Córdoba (“Ayudas de
movilidad internacional para el fomento de tesis con mención internacional o en
régimen de cotutela”).
La agricultura es la profesión propia del sabio, la más adecuada al sencillo y la ocupación más digna para todo hombre libre Cicerón Que nunca se nos olvide el propósito de nuestra Ciencia, para quién investigamos, para quién divulgamos…
A mis directores de tesis, Jesús y Carmen. Jesús, gracias por darme la oportunidad de haber formado parte de tu grupo de trabajo, por abrirme las puertas de tu laboratorio, por tu paciencia, tu humildad y por todas las cosas que me has enseñado, gracias por dejar que me equivoque y al mismo tiempo ofrecerme las claves para que me supere a mi misma. Carmen, gracias por haber sido una de mis maestras en el laboratorio, gracias por tu amistad, y especialmente en esta última etapa gracias por tu apoyo y ánimo en cada email. Ojalá que algún día más pronto que tarde, tu esfuerzo, constancia y tesón se vean recompensados, te lo mereces.
A Antonio, mi otro gran maestro en el laboratorio, gracias por enseñarme a abrir las puertas con los codos, o a preparar un gel usando varios guantes, un par de manoplas y un trozo de papel, a la par que lo tenías todo controlado y no tocabas con una mano lo que había tocado la otra; por enseñarme que hay bolis “limpios” y “sucios”, en definitiva, gracias por prepararme (sin esperarlo) para sobrevivir a esta pandemia. Gracias por siempre-siempre tener un hueco para repasar los ensayos o para visitar “mis olivos”, por hacerme pensar y cuestionarme todo y como no, por los viernes (o cualquier otro día) al ritmo de los Planetas. A Martina, la última incorporación a nuestro laboratorio, gracias por revolucionar, para bien, el mundo de los predoc.
A mi tutor de tesis el Dr. Fco. Javier López Escudero, gracias por estar al pie del cañón en la UCO en todos sus papeles (y firmas). De igual manera, a la Dra. Leovigilda Ortiz, por hacer fácil cualquiera de los difíciles trámites burocráticos ideados por el idep, gracias por no dejarnos caer como Asterix y Obelix en la casa que enloquece. A la Dra. Pilar Prieto, gracias por tu apoyo, tu simpatía, tu buen hacer, tu disponibilidad, tus horas de confocal…en fin, ya sabes lo que te aprecio Pilar, eres una gran profesional y mejor persona aún si cabe.
Thanks to Professor Gabriele Berg, Dr. Tomislav Cernava and all laboratoty technicians (Maria, Monika, Barbara and Angelika) for allowing me to join their group during my predoctoral stay in Graz. Thank you for teaching me new techniques and give me the opportunity to work and discover new phytopathogens. Thanks to Mel, Julian, Ale, Pascal, Manu, Tashya, Wisnu, Tobi, Adrian, Anna, Lisa 1, Lisa 2 and Birgitt (compisss) for making me feel at home being so far away. Thanks to Ayisha, the best roommate in Graz.
I will always remember your delicious food. I hope to visit you in Pakistan someday my
“sweety”.
A Antonio, mi “compi Graz UCO”, ¿cómo me he tenido que ir tan lejos para conocerte, teniéndote tan cerca? Gracias por facilitar mi llegada a Graz y por ser un gran compañero y amigo.
A Álvaro y Ludo, mis dos grandes amistades formadas desde el minuto 1:00 que llegué al IAS. Álvaro, gracias por estar ahí, a cualquier hora del día, por ser siempre tan oportuno
casillas, eres y serás un gran amigo. A Ludo, mi italo-trianera-sevillana, por demostrarme que la amistad no entiende de Km, ni de tiempo sin vernos, es un placer ver que sigue reinando entre nosotras la misma complicidad, tengo mil y una ganas de verte amiga mía, y de conocer a mi sobrino italiano.
El doctorado no hubiera sido lo mismo sin la gran familia de amigos que he formado en esta ciudad. Gracias por los viajes, las cervezas, los planes improvisados, los peroles en los jardines del IAS (y fuera del IAS), los conciertos, las catas, las ferias, las cruces, los patios, los almuerzos en el IAS… gracias a los del siempre y a las nuevas incorporaciones…a Leti, Juanma, Carmen Ortiz, Rosa, Carlos Salamanca, Fran Canales, Salva, Loli, Manu, Belén, Juan, Luis Felipe, Manuel, Wohor, Luis, Susana, Miriam, Tomás y Galle. Mención especial a Helena (con H), mi mejor vecina de invernadero. No he visto plantas de arroz y de olivo mejor, y durante más tiempo acompañadas que las nuestras. A Elena (Teruel), mi mejor compañera de conciertos alternativos o talleres mas artísticos. A Valle, por ser fiel compañera de los viernes de inauguración de feria, con eso de: vemos encender la portada, una vueltecita y “pa casa” (no comments sobre el desenlace). Has sido un gran apoyo en esta última fase, así que gracias por tener siempre buenas y acertadas palabras.
A Alvarito, porque es siempre un gustazo hablar contigo, gracias por cederme casa, piscina y gato en las calurosas noches de verano cordobesas. A David, por ser el mejor maestro de barbacoas, al más mínimo rayo de sol y calor, él ve la oportunidad de montar un perol o proponer tomar unos gintonics. A Manolo, por tragarse toda mi etapa
“pretesica” y aguantarla como un campeón (gracias por los consejos y palabras), por su capacidad de adivinar cuando necesitaba una llamada y por convertirme en “yogui”. A los tres últimos junto a Carlos Camino y Chicha por meterme en el mundo de Agronomía con todos vuestros cacharros molones…bomba de Schölander, porómetro y Dualex, y por estar siempre disponibles para comentar resultados.
A Roman y Pilar, los mejores “compis” de piso de toda Villa Bosquecito, responsables de hacer que la cuarentena fuera más fácil entre recetas de pan, jardinería, clases de Fausto Murillo y Go fit, excursiones a tender a la terraza combinadas con charlas existenciales, sol en el puf, maratones de Harry Potter y cualquier serie o película que se precie; y trabajo, mucho trabajo en nuestro reacondicionado salón-despacho.
A Pepi, por ser la alegría de mis tardes, recordaré con muchísimo cariño tus frases: ¿qué haces aquí todavía chiquita?, “cógete una galleta” o “se te va a hacer de noche, espérate que te busco con quien irte”. Gracias por cuidarme.
A David, por darme cobijo en tierras manchegas en la casa situada en Mordor, por el servicio directo cocina-despacho de zumo recién exprimido, ya formas parte del PICF7 team.
mamás y guerreras, en definitiva, super mujeres, gracias, porque también lleváis un pedacito de esta Tesis.
A mis padres, mi tita Mª Carmen, mi tito de la casa y mi prima Encarni, por su incondicional apoyo, aun cuando a veces no tenían ni idea de que estaba haciendo, gracias por apoyarme a ciegas. Al resto de mi familia, la mejor familia que se pueda tener, por su interés en mi trabajo. A Joaquín y Ana.
A Joaquín, mi compañero de vida, uno de los mayores responsables de que haya sido capaz de llegar hasta aquí. Gracias por aguantar estoica y pacientemente mis penas
“tesicas” y por haber compartido conmigo muchos de los también mejores momentos y logros que ha tenido esta Tesis. Gracias por poner música a mi vida, hacer mi mundo más bonito y alegrar mis días, ojalá pronto se cumplan nuestros sueños... dsfsdfsdfsdsdfsdfsd
List of tables ... iv
List of abbreviations ... vi
Summary ... xi
Resumen ... xv
Chapter 1. General Introduction ... 1
1.1. Introduction ... 2
1.2. Modern Olive Cropping Systems and Verticillium Wilt: Finding the Balance between Management Practices and Disease Risk ... 4
1.3. Knowing the Enemy and Its Most Dangerous Representative for Olive: The Defoliating Isolates of Verticillium dahliae ... 6
1.4. Understanding the Molecular Bases of the Verticillium dahliae-Olive Interaction ... 7
1.4.1. Microsclerotia: The Main Infective Propagule under Natural Conditions ... 7
1.4.2. Understanding the Olive-Verticillium dahliae Interaction ... 9
1.5. Advances in Verticillium dahliae Detection ... 12
1.5.1. Detecting the Pathogen: From Remote Sensing ... 13
1.5.2. To on Ground Diagnosis ... 14
1.6. Advances in the Management of Verticillium Wilt of Olive ... 15
1.6.1. The Continuous Search for Sources of VWO Tolerance/Resistance ... 15
1.6.2. The Key Is in the Water Treatment ... 18
1.6.3. Heat Treatments in Sanitation of Olive Plants ... 19
1.6.4. Organic Amendments: A Second Life for Agricultural Waste to Control VWO ... 19
1.6.5. The Continuous Search for Effective Biological Control Agents Against VWO and the Mechanisms Involved ... 21
1.6.6. The Olive Belowground Microbiota: Yet to Be Fully Uncovered and Understood ... 24
1.6.7. Plant Extracts, Essential Oils and Seaweeds ... 25
1.7. Conclusions ... 26
Objectives of This Thesis... 29
2.1. Introduction ... 32
2.2. Materials and Methods ... 35
2.2.1. Culturing Media and Conditions, Microorganisms and Plasmid ... 35
2.2.2. Comparative Analysis of Pseudomonas simiae Genomes ... 37
2.2.3. Screening of Pseudomonas simiae PICF7 Mutants ... 37
2.2.3.1. Identification and Selection of Mutants Impaired in Copper Tolerance ... 37
2.2.3.2. Identification and Selection of Mutants Impaired in Biofilm Formation... 38
2.2.3.3. Identification and Selection of Mutants Defective in Phytase Activity ... 38
2.2.4. Identification of Transposon Insertion Sites in Selected PICF7 Mutants ... 38
2.2.5. Evaluation of the Olive Root Colonization Ability by Pseudomonas simiae PICF7 Mutants ... 39
2.2.6. In Vitro Antagonism Assays ... 40
2.2.7. Biocontrol Effectiveness of Pseudomonas simiae PICF7 Mutants against Verticillium Wilt of Olive... 41
2.3. Results ... 42
2.3.1. Comparative Genomics Supports the Taxonomic Assignment of Pseudomonas simiae PICF7 ... 42
2.3.2. Screening of a PICF7 Mutant Bank to Identify Altered Target Phenotypes ... 43
2.3.3. Identification of the Disrupted Gene in the Genomes of Selected Mutants of Pseudomonas simiae PICF7 ... 44
2.3.4. Only PICF7 Mutants Impaired in Biofilm Formation Are Unable to Internally Colonize Olive Roots ... 46
2.3.5. PICF7 Mutants Defective in Phytase Activity Show a Significant Reduction of In Vitro Antagonism against Verticillium dahliae ... 49
2.3.6. PICF7 Mutants Were Not Affected in Biological Control Ability against Verticillium Wilt of Olive ... 50
2.4. Discussion ... 51
2.5. Conclusions ... 55
Chapter 3. Evaluation of Indigenous Olive Biocontrol Rhizobacteria as Protectants against Drought and Salt Stress ... 57
3.2.1. In Vitro Detection of ACD Activity in Selected Olive Rhizobacteria ... 60
3.2.2. Sequence Analysis of ACD- and Related Deaminase-Coding Genes of Pseudomonas sp. PICF6 and Pseudomonas simiae PICF7 ... 61
3.2.3. Sequencing and Assembly of the Pseudomonas sp. PICF6 Genome ... 61
3.2.4. Phylogenetic Analysis of Pseudomonas sp. PICF6 ... 62
3.2.5. Colonization Ability of Olive Roots by Pseudomonas sp. PICF6... 62
3.2.6. Tolerance of Olive Rhizobacteria to Salt Stress ... 63
3.2.7. Assessment of Olive Rhizobateria as Saline or Water Stress Protectants ... 64
3.2.8. Assessment of Plant Physiological and Biochemical Parameters ... 66
3.2.9. Electrical Conductivity (EC) of the Potting Substrate ... 67
3.2.10. Persistence of PICF6 and PICF7 Cells in Olive Roots under Drought Conditions . 67 3.2.11. Statistical Analysis ... 67
3.3. Results ... 68
3.3.1. Presence of ACD Activity in Selected Indigenous Olive Rhizobacteria ... 68
3.3.2. Presence of an ACD-Coding Gene in Pseudomonas sp. PICF6 ... 68
3.3.3. General Features of the Pseudomonas sp. PICF6 Genome ... 70
3.3.4. Phylogenetic Analyses of Pseudomonas sp. PICF6 Strain ... 71
3.3.5. Pseudomonas sp. PICF6 is Able to Colonize the Interior of Olive Roots ... 73
3.3.6. Effects of the Treatment of Biocontrol Rhizobacteria on Olive Plants Subjected to Water Stress ... 74
3.3.7. Effects of the Treatment of Biocontrol Rhizobacteria on Olive Plants Subjected to Salt Stress ... 77
3.4. Discussion ... 79
Chapter 4. Soil-Borne Pathogens Antagonism, Growth Promotion Ability and Volatilome Determination of Beneficial Olive Rhizobacteria ... 91
4.1. Introduction ... 92
4.2. Materials and Methods ... 94
4.2.1. Microorganisms and Growth Conditions... 94
4.2.2. In vitro Antagonism Assays ... 96
4.2.5. Identification of Olive Beneficial Rhizobacteria Volatilomes... 97 4.2.6. Effect of Bacterial Volatiles on Mycelial Growth of Verticillium dahliae V937I ... 98 4.2.7 Data analysis ... 99 4.3. Results ... 99 4.3.1. Assessment of In Vitro Antagonism against Selected Fungal Phytopathogens ... 99 4.3.2. Pseudomonas sp. PICF6 and Pseudomonas simiae PICF7 are Able to Efficiently Colonize Oilseed Rape Root Surface ... 101 4.3.3. Evaluated Olive Rhizobacteria Do Not Promote Growth of Oilseed Rape Plants .... 102 4.3.4. Elucidation of the Volatilomes of Beneficial Olive Rhizobacteria ... 103 4.3.5. Volatiles Are Not Responsible of the Antagonistic Effect of Pseudomonas sp. PICF6 and Pseudomonas simiae PICF7 against Verticillium dahliae ... 107 4.4. Discussion ... 107 General Conclusions ... 113 References ... 117
Figure 1.1. A super high-density, hedgerow olive orchard located at Córdoba province (Spain). ... 3 Figure 1.2. Tag-cloud showing the most relevant keywords cited in the bibliography consulted to produce this review article. The figure was built using a free online word cloud generator (Nuage de mots) ... 4 Figure 1.3. The traditional olive trees landscape in the Mediterranean Basin. ... 5 Figure 1.4. Symptoms observed upon the artificial inoculation of the defoliating pathotype of Verticillium dahliae in olive plants cultivar Picual ... 9 Figure 1.5. An idealized compilation of available Verticillium wilt of olive control measures described in this review to be implemented within an integrated management strategy ... 27 Chapter 2. Assessing the Involvement of Selected Phenotypes of Pseudomonas simiae PICF7 in Olive Root Colonization and Biological Control of Verticillium dahliae
Figure 2.1. Similarity plot of type strain Pseudomonas simiae CCUG 50988T, Pseudomonas simiae WCS417 and Pseudomonas simiae PICF7 constructed by using progressive Mauve (see main text, section 2.3.1, for color codes)... 43 Figure 2.2. Phenotypes altered in selected Pseudomonas simiae PICF7 mutants.. ... 44 Figure 2.3. Schemes representing the Tn5-TcR insertion sites (within genes shown in yellow color) in the genome of the Pseudomonas simiae PICF7 selected mutants.. .... 46 Figure 2.4. Confocal laser scanning microscopy images of root hairs from olive (cv.
Picual) internally colonized by GFP-labeled PICF7 mutants..¡Error! Marcador no definido...47
Figure 2.5. Confocal laser scanning microscopy images of olive (cultivar Picual) roots colonized by GFP-labeled Pseudomonas simiae PICF7 and its selected Tn5-TcR insertion mutants. ... 48 Figure 2.6. In vitro antagonistic activity of Pseudomonas simiae PICF7 and its mutants against Verticillium dahliae V937I. ... 50 Chapter 3. Evaluation of Indigenous Olive Biocontrol Rhizobacteria as Protectants against Drought and Salt Stress
Figure 3.1. Schedule of activities performed during a salt stress experiment ... 65 Figure 3.2. Schedule of activities performed during a drought stress experiment ... 66
Figure 3.3. Demonstration of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase (ACD) activity in liquid (A) and solid (B) Dworkin-Foster (DF) medium using ACC as the only N source (see the Materials and Methods section for details)..
... 69 Figure 3.4. Dendrogram based on the comparison among 1-aminocyclopropane-1- carboxylic acid (ACC) deaminase, D-cysteine desulfhydrase and other unidentified
deaminases coding genes from different
(micro)organisms...70
Figure 3.5. Neighbor-Joining phylogenetic tree showing the taxonomic position of Pseudomonas sp. PICF6 (red text) based on the alignment of concatenated partial sequences of the housekeeping genes gyrB and rpoD genes (see text for details).. ... 72 Figure 3.6. Venn diagram showing the comparison of the full sets of orthologous coding sequences present in the genomes of Pseudomonas sp. PICF6, Pseudomonas brassicacearum NFM421, Pseudomonas corrugata RM1-1-4 and Pseudomonas simiae PICF7 ... 73 Figure 3.7. Confocal laser scanning microscopy images showing GFP-labeled Pseudomonas sp. PICF6 (A–C) and Pseudomonas simiae PICF7 (D to F) cells colonizing olive roots (cv. Picual) ... 74 Figure 3.8. Stomatal conductance (gs) in olive plants (cv. Picual) leaves subjected to drought stress ... 76 Figure 3.9. Stomatal conductance (gs) in olive plants cv. Picual. ... 78 Figure S1. Overall appearance of representative olive plants (upper image) cultivar Picual and roots (bottom images) subjected to drought stress. ... 88 Figure S2. Endophytic and epiphytic populations of Pseudomonas simiae PICF7 and Pseudomonas sp. PICF6 in/on olive roots of “Picual” plants subjected to water stress.
... 89 Figure S3. Overall appearance of olive plants cv. Picual subjected to salt stress. .... 90 Chapter 4. Soil-Borne Pathogens Antagonism, Growth Promotion Ability and Volatilome Determination of Beneficial Olive Rhizobacteria
Figure 4.1. Appearance of the pouches system used to grow oilseed rape seedlings.
... 97 Figure 4.2. Culture headspaces sampling setup to characterize the volatile organic
compounds of antagonist rhizobacteria and a
pathogen………98
Figure 4.3. Evaluation of olive rhizobacteria ability to inhibit the mycelial growth of Verticillium dahliae V937I using the Two Clamp VOC Assay (TCVA). ... 99
Figure 4.5 Confocal laser scanning microscopy images of oilseed rape root surface colonized by GFP-labeled Pseudomonas sp. PICF6 (A), Pseudomonas simiae PICF7 (B) and four selected PICF7 mutant derivatives (panels: C for Bfm8, D for Bfm9, E for Phy17 and F for Phy18) ... 102 Figure 4.6. Effect of the olive rhizobacteria Pseudomonas sp. PICF6, Pseudomonas simiae PICF7 and PICF7 mutant derivatives on shoot and root fresh weights of oilseed rape seedlings ... 103
List of tables
Chapter 2. Assessing the Involvement of Selected Phenotypes of Pseudomonas simiae PICF7 in Olive Root Colonization and Biological Control of Verticillium dahliae
Table 2.1. Bacterial strains, fungal pathogen and plasmid used in this study. ... 36 Table 2.2. Disrupted genes identified in the selected Pseudomonas simiae PICF7 mutants. ... 45 Table 2.3. Percentage of growth inhibition exerted over Verticillium dahliae V937I (defoliating pathotype) by wild-type PICF7 and mutants...49 Table 2.4. Assessment of biocontrol activity of Pseudomonas simiae PICF7 and selected mutants against Verticillium dahliae V937I (defoliating pathotype)...51
Chapter 3. Evaluation of Indigenous Olive Biocontrol Rhizobacteria as Protectants against Drought and Salt Stress
Table 3.1. Genomic features, gene prediction and annotation summary of the Pseudomonas sp. PICF6 genome. ... 71 Table 3.2. Measurements of total flavonoids (Flv) and chlorophyll (Chl) in olive (cv.
Picual) leaves subjected to drought stress. ... 75 Table 3.3. Stem water potential (Ψ) values of olive plants subjected to drought stress. ... 76 Table 3.4. Measurement of total flavonoids (Flv) and chlorophyll (Chl) in olive (cv.
Picual) leaves subjected to salt stress. ... 78 Table 3.5. Measurements of electrical conductivity (EC) and proline content in leaves and roots of “Picual” plants at the end of the salt stress experiment...79
Table S1. Bacterial strains screened for the presence of 1-aminocyclopropane-1- carboxylic acid deaminase (ACD) activity. ... 83 Table S2. General information of the Pseudomonas sp. PICF6 sequencing project. .. 86 Table S3. Number of genes associated with general COG functional categories ... 87 Chapter 4. Soil-Borne Pathogens Antagonism, Growth Promotion Ability and Volatilome Determination of Beneficial Olive Rhizobacteria
Table 4.1. Bacteria and fungi used in this study. ... 95 Table 4.2. Percentage of growth inhibition exerted over different fungal pathogens by Pseudomonas sp. PICF6, Pseudomonas simiae PICF7 and PICF7 selected derivative mutants. ... 100
V937I.. ... 106 Table 4.4. Effect of volatile organic compounds (VOC) produced by Pseudomonas sp.
PICF6, Pseudomonas simiae PICF7, mutants Bfm8 and Bfm9 (impaired in biofilm formation) and mutants Phy17 and Phy18 (defective in phytase activity) on the mycelial growth of Verticillium dahliae V937I evaluated using the Two Clamp VOC Assay (TCVA)... 107
List of abbreviations
ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
ACD 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase
AFP Antifungal protein
AMF Arbuscular mycorrhizal fungi ANI Average nucleotide identity
ANIb Average nucleotide identity algorithm using BLAST ANOVA Analysis of variance
AUDPC Area under disease progress curve B/BG/BR indices Blue/blue–green/blue–red ratios
BCA Biocontrol agents/Biological control agent
Bfm8 PICF7 Tn5-TcR mutant (fleQ:Tn5-TcR) impaired in biofilm fdgdfgdfgdfgdfgdfgdformation
Bfm9 PICF7 Tn5-TcR mutant impaired in biofilm formation
BI Bacterial inoculation
CD Plants subjected to drought (D) stress with no water
CFU Colony forming units
Chl Chlorophyll
CLSM Confocal laser scanning microscopy
co Cortical cells
COG Clusters of Orthologous Groups
Cop1 PICF7 Tn5-TcR mutant (cheV:Tn5-TcR) affected in copper resistance Cop33 PICF7 Tn5-TcR mutant (CusR:Tn5-TcR) affected in copper resistance CS Plants treated with salt (S) solution
CSIC Centro Superior de Investigaciones Científicas
cv Cultivar
CW Control plants just irrigated with distilled water (salinity ddfdfgdfgdfgdfgdfgdexperiment) or with tap water (drought experiment)
D Defoliating
DAI Days after inoculation
DHN Dihydroxynaphthalene
DI Disease incidence
DII Disease intensity index
EC Electrical conductivity
EGFP Enhanced green fluorescent protein
ERF Ethylen response factor
ET Ethylene
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
Flv Flavonoids
FS Final mean severity symptoms
GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry GFP Green fluorescent protein
Gm Gentamicin
GmR Gentamicin-resistance
gs Stomatal conductance
HGT Horizontal gene transfer HSD Honestly-significant-difference IAS Instituto de Agricultura Sostenible IDM Integrated disease management ISR Induced systemic resistance
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
JA Jasmonic acid
JZIM Jasmonate ZIM domain
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
KI Kovats index
LAMP Loop-mediated isothermal amplification
LB Luria Bertani
LS Lineage-specific
LSD Least significant difference
LSRs LS regions
M Mortality
MLSA Multi-locus sequence analysis
MS Microsclerotia
NA Nutrient Agar
NCBI National Center for Biotechnology Information
ND Non-defoliating
nested-PCR Nested polymerase chain reaction NGS Next generation sequencing
Ni Number of plants with Si symptoms severity
Nt Total number of plants
nt Nucleotids
OM Organic amendments
P Phosphorus
PAL Phenylalanine ammonia-lyase PCR Polymerase chain reaction
PDA Potato Dextrose Agar
PGP Plant growth promotion/Plant growth promoters PGPR Plant growth promoting rhizobacteria
Phy17 PICF7 Tn5-TcR mutant deficient in phytase activity Phy18 PICF7 Tn5-TcR mutant deficient in phytase activity
PI Relative inhibition index
PICF6/D Plants inoculated with Pseudomonas sp. PICF6 without subsequent fdfdfddfgdddfgdfgdf watering
PICF6/S Plants inoculated with Pseudomonas sp. PICF6 and treated with S dgdfgdffgddgdfgdfg solution
PICF6+PICF7/D Plants co-inoculated with PICF6 and PICF7 without subsequent dfdfgdfgdfdfgdgdfdvwatering
PICF6+PICF7/S Plants co-inoculated with strains PICF6 and PICF7 and treated with fdfsfsdfsdadadfsssdd S solution
PRI Photochemical reflectance index PSM Phytase Specific Medium
Psv Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi qPCR Quantitative polymerase chain reaction ROS Reactive oxygen species
S Salt
SA Salicylic acid
SAR Systemic acquired resistance
Si Severity of symptoms
SNP Single nucleotide polymorphisms SSM Standard Succinate Medium
tad Tight adhesion
Tc Tetracycline
TcR Tetracycline-resistance
TCS Two-component system
TCVA Two Clamp VOC Assay
TF Transcription factors
UAV Unmanned aerial vehicles VCG Vegetative compatibility groups VOC Volatile organic compounds
vt Vascular tissue
VWO Verticillium wilt of olive WOGB World olive germplasm bank
Ψ Stem water potential
98% of its world´s cultivated area is found in this region. The morphological characteristics of this plant, its excellent adaptation to the typical dry and hot summers of this geographical area and the multiple uses of the cultivated and wild olive, make this tree of a huge economic, social and ecological importance. Spain leads the world´s production of olive oil and table olives. However, a/biotic factors such as the presence of pathogens and pests which are difficult to eradicate, erosion and soil loss, and the foreseeable effects of climate change are major threats to the crop. Currently, Verticillium wilt of olive (VWO), a disease caused by the hemibiotrophic fungus Verticillium dahliae Kleb. is considered one of the most devastating diseases affecting olive trees, and constitutes a limiting factor for the olive oil and table olives production. Moreover, recent studies have predicted an increase in temperature and prolonged periods of drought in the Mediterranean basin, which could lead to restrictions in the use of fresh water for irrigation, making it necessary to use saline or reclaimed water.
To date, individual control measures employed against VWO have been ineffective.
Consequently, integrated control methods combining preventive and palliative measures are considered the best strategy to manage the disease as well as to mitigate the spread of the causal pathogen. Within the integrated management strategy, biological control represents a sustainable and environmentally friendly approach and an alternative to the traditional chemical fungicides. Previous studies have demonstrated that Pseudomonas simiae PICF7 (formerly P. fluorescens PICF7), an indigenous inhabitant of olive roots, is an effective biological control agent (BCA) against VWO. In addition, its ability to promote growth in olive and barley, as well as in the model plant Arabidopsis thaliana, has been demonstrated. So far, strain PICF7 is perhaps the best characterized BCA against VWO.
Nevertheless, the mechanisms involved in disease control and its endophytic root colonization ability in several hosts (i.e. olive, barley and wheat) remain largely unknown.
Efforts to unravel the keys to the success of strain PICF7 as a BCA have even been made even by studying its interaction with other pathogens. So far, it has only been demonstrated the ability of strain PICF7 to induce systemic resistance to Botrytis cinerea in A. thaliana. Moreover, it is essential that PICF7 and V. dahliae share the same ecological niche (roots, rhizosphere) for the biocontrol of VWO, since an effective suppression of this pathogen has not been observed when both BCA and fungus are spatially separated ("split-root" system). Similarly, no disease control was observed when the phytopathogenic bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (causal agent of olive knot disease) and PICF7 were inoculated in different parts of the plant (BCA in the roots and pathogen in the stem). However, it was detected a transient reduction of the pathogen population and changes in the morphology of the associated tumors were detected when both microorganisms were applied to the same point (stem). Previous work has also shown that colonization of olive and banana roots by the strain PICF7 results in changes in the expression of genes involved in defensive responses, both locally
(roots) and systemically (aerial part). Finally, it has been studied whether bacterial phenotypes traditionally associated with biological control and root colonization (e.g.
siderophore production or motility) could be involved in VWO control. Interestingly, the results showed that PICF7 mutants altered in these phenotypes were not compromised in their ability to control the disease.
In order to untangle the molecular and genetic bases underlying the effective biocontrol of VWO exerted by strain PICF7, as well as its ability to endophytically colonize olive roots, the present Thesis evaluated the possible contribution of three new phenotypes: 1) biofilm formation, which is traditionally associated with colonization and endophytism; 2) copper tolerance, a metal present in most commercial agricultural antifungals, which could contribute to greater adaptation and survival in soils; and 3) production of phytase, an enzyme involved in phosphorus mobilization and bioavailability, thus promoting plant growth. For this purpose, more than 5.500 Tn5-TcR (Tetracycline-resistance) insertion mutants (transposants) of a pre-existing random transposon insertion mutant bank were screened. Subsequently, for the identification of the Tn5-TcR insertion sites and, consequently, of the altered genes in the selected transposants, nested PCR was used.
Finally, the mutants designated as Bfm8 and Bfm9 (unable to form biofilms), Cop1 and Cop33 (altered in copper tolerance) and Phy17 and Phy18 (deficient in phytase activity) were selected to carry out the olive root colonization and VWO biocontrol assays.
By using confocal microscopy, it has been shown that all mutants affected in the aforementioned phenotypes were able to superficially colonize olive roots, although analysis of longitudinal sections of these roots revealed that mutants defective in biofilm formation (Bfm8 and Bfm9) did not colonize them internally. None of the studied phenotypes seemed to be involved in the biocontrol ability of PICF7 against VWO, since all selected mutants behaved similar to the wild-type strain PICF7, even though phytase defective mutants (Phy17 and Phy18) were impaired in their ability to antagonize V.
dahliae in in vitro assays on one of the culture media used. This fact highlights the importance of contrasting in vitro observations with in planta assays, where the olive- Verticillium-BCA tripartite interaction becomes more complex. This is because there are numerous interactions with and among the remaining plant´s microbiota, as well as with several environmental and pedological factors.
Pseudomonas sp. strain PICF6, another effective BCA against VWO, was included in some experiments performed in this Thesis for comparative purposes in order to accomplish some of the proposed objectives. In contrast to strain PICF7, there is virtually no information concerning the control of phytopathogens or the plant growth promotion capabilities of the beneficial strain PICF6, also originating from the olive rhizosphere. To overcome this lack of knowledge, both BCA and the Bfm and Phy mutants of PICF7, were tested in in vitro experiments against several pathogens of great agroeconomic importance in different crops. Strains PICF6 and PICF7, along with all selected mutants derived from the latter, only exhibited the ability to antagonize Verticillium longisporum ELV25, despite the inhibition rates of PICF7 mutants defective in phytase activity being significantly
were able to colonize the root surface of oilseed rape seedlings. However, no evidence of endophytic colonization was found.
Production of volatile organic compounds (VOC) has been described amongst the possible mechanisms by which beneficial microorganisms are able to inhibit the growth of phytopathogens or promote plant growth. A recent study has shown that strain PICF7 is able to promote plant growth of A. thaliana, not only through direct contact between the BCA and plant roots, but also through the emission of VOC without any physical contact.
Nonetheless, it is unknown whether the ability of strains PICF6 and PICF7 to reduce V.
dahliae growth could be attributed to this mechanism. In this context, the characterization of PICF6 and PICF7 volatilomes, as well as of the Bfm and Phy mutants, using Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS), allowed the identification of several compounds described in the literature for their antimicrobial potential or plant growth- promoting activity. Conversely, in vitro VOC inhibition assays, using TCVA (Two Clamp VOC Assay) methodology, showed that none of the assayed strains were able to antagonize V. dahliae. Nevertheless, the compounds identified in the volatilome of these rhizobacteria, used individually and at a higher concentration, could represent a new avenue to explore substances with antagonistic capacity against V. dahliae and other relevant pathogens, as well as to evaluate their potential for plant growth promotion.
As mentioned above, drought and salinity (abiotic stresses), along with to pathogen infections (biotic stresses), constitute another major threat to olive crop. Several microorganisms have shown high potential to reduce the effects of these stresses in plants.
For this reason, the present Thesis has also been focused on studying the role of Pseudomonas sp. PICF6 and P. simiae PICF7 in the alleviation of the symptoms in plants caused by water scarcity of water or by salt accumulation in the soil. Numerous studies have attributed the beneficial effect of certain rhizobacteria on plants subjected to salt or drought stress to the production of the enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase (ACD). These stresses induce the biosynthesis of ethylene (ET), a phytohormone that, among the numerous processes in which it is involved, causes a negative effect on the plant at high concentrations. ACD catalyzes the conversion of ACC, the immediate precursor of ET, into α-ketobutyrate and ammonia. Therefore, ACD- producing microorganisms contribute to reduce ET levels and, consequently, the stress caused by the accumulation of this phytohormone in the plant. Furthermore, the plant can also develop different defense strategies to mitigate the negative effects caused by this type of stress, including changes in stem water potential (Ψ) and stomatal conductance (gs), or in chlorophyll (Chl), flavonoid (Flv) or proline contents. Experiments were carried out to compare the physiological parameters mentioned above in plants inoculated with an ACD-producing rhizobacteria (Pseudomonas sp. PICF6) and in plants inoculated with a non ACD-producing rhizobacteria (P. simiae PICF7). The results obtained showed that,
under the experimental conditions here used, Flv values were influenced by the presence of the bacteria. However, Ψ, gs and the Chl and proline contents remained unchanged upon inoculation of the different strains. Overall, the assayed rhizobacteria, regardless of whether or not they possess ACD activity, did not alleviate the stress produced by drought or salinity in olive plants under the experimental conditions. Finally, as a consequence of the work carried out in this section, it was also demonstrated that the colonization pattern of olive roots by Pseudomonas sp. PICF6 was similar to that observed for PICF7, including its endophytic capacity.
In summary, the results obtained in this Thesis allow us to conclude that the three phenotypes of P. simiae PICF7 here examined (phytase activity, biofilm formation and copper tolerance) are not involved in the ability of this BCA to control VWO, although in the particular case of mutants altered in biofilm formation no evidence of endophytic colonization of olive roots was found. Therefore, VWO biocontrol by strain PICF7 does not seem to require inner colonization of this organ. Additinally, strains PICF6 and PICF7 did not show the ability to alleviate symptoms caused by salt or drought stress in olive plants, ruling out the involvement of the ACD activity, at least under the conditions analyzed. Colonization pattern studies for both strains showed that the two olive rhizobacteria superficially colonize the root of this model plant. However, neither PICF6 nor PICF7 promoted the growth of this plant. Yet, the characterization of PICF6 and PICF7 volatilomes allowed for the identification of several VOC with a reported antimicrobial activity. Even though the involvement of VOC in the inhibition of V. dahliae growth in vitro was not observed, the collected information could pave the way for further study of these molecules individually and against different pathogens.
concentrándose en esta región el 98% de superficie cultivada de este árbol a nivel mundial. Las características morfológicas de esta planta, su excelente adaptación a los veranos secos y cálidos propios de esta área geográfica, además de los múltiples usos del olivo cultivado y silvestre, hacen que este posea una enorme importancia económica, social y ecológica. España lidera la producción mundial de aceite de oliva y aceituna de mesa. Sin embargo, factores a/bióticos como la presencia de patógenos y plagas de difícil erradicación, la erosión y pérdida de suelo o los previsibles efectos del cambio climático, suponen importantes amenazas para el cultivo. Enfermedades como la verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo hemibiotrófico Verticillium dahliae Kleb. y considerada como una de las afecciones más devastadoras del olivo, constituyen un factor limitante para la producción de aceite de oliva y aceitunas de mesa. Asimismo, estudios recientes prevén un aumento de la temperatura y episodios prolongados de sequía en la cuenca mediterránea, lo que podría conducir a restricciones en el uso de agua dulce para irrigación, haciendo necesaria la utilización de agua salada o regenerada y comprometiendo la producción.
En lo que respecta a la VO, los diferentes métodos de control de la enfermedad empleados de manera individual han sido ineficaces. Es por ello que el control integrado, combinando medidas preventivas y paliativas de diversa índole, se plantea como la mejor estrategia para manejar la enfermedad y mitigar la dispersión del patógeno que la provoca. Una de las medidas dentro de esta estrategia integrada es el control biológico, herramienta sostenible y respetuosa con el medio ambiente que surge como alternativa a los tradicionales fungicidas químicos. Estudios previos demostraron que Pseudomonas simiae PICF7 (anteriormente P. fluorescens PICF7), bacteria aislada de raíces de olivo (cultivar Picual), es un eficaz agente de control biológico (ACB) frente a la VO. Además, se ha comprobado su capacidad para promover el crecimiento en olivo y cebada, así como en la planta modelo Arabidopsis thaliana. La cepa PICF7 es quizás el ACB mejor caracterizado contra la VO, aunque los mecanismos implicados en el control de la enfermedad y en la capacidad de colonización endofítica de raíces en diversos huéspedes (olivo, cebada y trigo) continúan siendo bastante desconocidos.
Las claves del éxito de la cepa PICF7 como ACB se han intentado desvelar incluso estudiando su interacción con otros patógenos. Hasta el momento solo se ha demostrado que induce resistencia sistémica frente a Botrytis cinerea en A. thaliana. Por otra parte, en el caso del control de la VO, es necesario que PICF7 y V. dahliae compartan el mismo nicho ecológico (raíces, rizosfera), pues no se ha observado un control efectivo de este patógeno cuando ACB y hongo se inoculan en raíces separadas en distintos compartimentos (sistema “split-root”). De igual manera, no se observó control cuando la bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (agente causal de la tuberculosis del olivo) y PICF7 se inoculaban en órganos diferentes de la planta (ACB en las raíces y patógeno en el tallo), pero sí se detectó una reducción transitoria de la población del patógeno y un cambio en la morfología de los tumores cuando ambos microorganismos
eran aplicados en el mismo lugar (tallo). Trabajos anteriores también han demostrado que la colonización de las raíces de olivo y platanera por la cepa PICF7 desencadena cambios en la expresión de genes implicados en respuestas defensivas tanto a nivel local (raíces) como sistémico (parte aérea). Finalmente, se ha estudiado si fenotipos bacterianos tradicionalmente asociados con el control biológico y colonización de las raíces (p. ej., producción de sideróforos o motilidad) podían influir en el control de la VO, evidenciándose que mutantes de PICF7 alterados en estos fenotipos no veían mermada su capacidad para controlar la enfermedad.
Con el objetivo de desentrañar las bases moleculares y genéticas que subyacen y explican el control efectivo de la VO ejercido por la cepa PICF7, así como su capacidad para colonizar endofíticamente raíces de olivo, en la presente Tesis se evaluó la posible contribución de tres nuevos fenotipos: 1) formación de biopelículas, fenotipo tradicionalmente asociado a colonización y endofitisimo; 2) tolerancia al cobre, metal presente en la mayoría de antifúngicos agrícolas comerciales, que podría contribuir a una mayor adaptación y supervivencia en suelos; y 3) producción de fitasa, enzima que ayuda a incrementar la movilización y disponibilidad del fósforo promoviendo el crecimiento vegetal. Para ello, se llevó a cabo el escrutinio de más de 5.500 mutantes procedentes de una mutateca preexistente generada mediante inserciones al azar del transposón Tn5-TcR, el cual confiere a los transposantes resistencia al antibiótico tetraciclina. Posteriormente, para la identificación de los lugares de inserción de Tn5-TcR y, consecuentemente, de los genes alterados en los transposantes seleccionados, se empleó la técnica de PCR anidada (“nested”-PCR). Finalmente, los mutantes denominados Bfm8 y Bfm9 (incapaces de formar biopelículas), Cop1 y Cop33 (alterados en tolerancia al cobre) y Phy17 y Phy18 (deficientes en actividad fitasa) se seleccionaron para llevar a cabo los ensayos de colonización de la raíz del olivo y biocontrol de la VO.
En cuanto a colonización, el uso de microscopía confocal demostró que todos los mutantes afectados en los fenotipos mencionados fueron capaces de colonizar superficialmente las raíces de olivo, aunque el análisis de secciones longitudinales de dichas raíces reveló que los mutantes defectivos en formación de biopelículas (Bfm8 y Bfm9) no las colonizaron internamente. En lo que respecta a capacidad de biocontrol, ningún fenotipo pareció estar involucrado en esta habilidad, ya que todos los mutantes seleccionados controlaron la enfermedad al mismo nivel que la cepa parental PICF7, aun cuando los mutantes defectivos en actividad fitasa (Phy17 y Phy18) vieron mermada su capacidad de antagonizar V. dahliae in vitro en uno de los medios de cultivo empleados. Este hecho pone de manifiesto la crucial importancia de contrastar las observaciones efectuadas in vitro con los ensayos in planta, donde la interacción tripartita olivo-Verticillium-ACB se torna más compleja al entrar en juego las interacciones con y entre el resto de la microbiota de la planta, así como de diversos factores ambientales y pedológicos.
La cepa Pseudomonas sp. PICF6, otro ACB eficaz frente a la VO, se incluyó en esta Tesis a efectos comparativos para abordar algunos de los objetivos planteados. Al contrario de lo que ocurre con PICF7, la información sobre esta bacteria beneficiosa originaria de la rizosfera de olivo en lo que respecta al control de fitopatógenos o a la promoción del crecimiento vegetal es prácticamente nula. Para soslayar esta deficiencia, ambos ACB, así como los mutantes Bfm y Phy de PICF7, se enfrentaron en experimentos in vitro a varios
mutantes PICF7 defectivos en actividad fitasa fueron significativamente inferiores.
También se evaluó la capacidad de estas rizobacterias de promover el crecimiento vegetal y de colonizar las raíces de colza, planta huésped de V. longisporum. Aunque ninguna de las cepas ensayadas promovió el crecimiento de esta brasicácea, todas fueron capaces de establecerse superficialmente sobre sus raíces. Sin embargo, no se encontró evidencia de colonización endófita.
Entre los posibles mecanismos por los cuales microorganismos beneficiosos son capaces de inhibir el crecimiento de fitopatógenos o promover el crecimiento de las plantas se ha descrito la producción de compuestos orgánicos volátiles (COV). Un estudio reciente ha demostrado que la cepa PICF7 es capaz de promover el crecimiento vegetal de A. thaliana, no solo a través del contacto directo entre el ACB y las raíces de la planta, sino también a través de la emisión de COV sin mediar contacto físico. Sin embargo, se ignora si la capacidad de las cepas PICF6 y PICF7 para reducir el crecimiento de V. dahliae podría deberse a este mecanismo. La caracterización del volatiloma de las rizobacterias PICF6 y PICF7, así como de los mutantes Bfm y Phy de esta última, mediante el uso de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS), permitió identificar numerosos compuestos descritos en la bibliografía por su potencial actividad antimicrobiana o promotora del crecimiento vegetal. Aun así, los ensayos de inhibición in vitro por COV, en los que se usó la metodología TCVA (de sus siglas en inglés “Two Clamp VOC Assay”), mostraron que ninguna de las cepas analizadas era capaz de antagonizar frente V. dahliae. A pesar de todo, los compuestos identificados en el volatiloma de estas rizobacterias, usados de forma individual y a una concentración mayor, podrían suponer una nueva vía para explorar sustancias con poder antagonista frente a V. dahliae y otros patógenos relevantes, así como para evaluar su potencial en la promoción del crecimiento de plantas.
Como se mencionó anteriormente, además de las infecciones por patógenos (estreses bióticos), la sequía y salinidad (estreses abióticos) constituyen otra gran amenaza para el cultivo del olivo. Algunos microorganismos tienen gran potencial para reducir los efectos de estos estreses en las plantas. Es por ello que en esta Tesis también se decidió estudiar el papel de Pseudomonas sp. PICF6 y P. simiae PICF7 en el alivio de los síntomas ocasionados por la escasez de agua y la acumulación de sal en el suelo. Son numerosos los trabajos que atribuyen el efecto beneficioso de determinadas rizobacterias sobre plantas sometidas a estrés salino o sequía a la producción por parte de aquellas de la enzima 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa (ACD). Estos estreses inducen la biosíntesis de etileno (ET), fitohormona que entre los numerosos procesos en los que interviene provoca efectos negativos en la planta a altas concentraciones. La ACD cataliza la conversión de ACC, el precursor inmediato del ET, en α-cetobutirato y amoníaco.
Consecuentemente, los microorganismos productores de ACD contribuyen a reducir los niveles de ET y, por tanto, el estrés causado por la acumulación de esta fitohormona en la planta. Por su parte, la planta también ha desarrollado diferentes estrategias de defensa para paliar los efectos negativos causados por este tipo de estrés, entre los que se encuentran cambios en el potencial hídrico del tallo (Ψ) y la conductancia estomática (gs),
o en los contenidos de clorofila (Chl), flavonoides (Flv) o prolina. Bajo esta premisa se realizaron experimentos en los que se compararon estos parámetros fisiológicos en plantas inoculadas con una rizobacteria productora de ACD (Pseudomonas sp. PICF6) frente a plantas inoculadas con una no productora (P. simiae PICF7). Los resultados indicaron que, bajo las condiciones experimentales utilizadas, los valores de Flv se vieron influenciados por la presencia de las bacterias. Sin embargo, Ψ, gs y las concentraciones de Chl y prolina no cambiaron al aplicar las bacterias ensayadas. En términos generales las rizobacterias ensayadas, con independencia de si producían o no la enzima ACD, no aliviaron el estrés producido por sequía o salinidad en plantas de olivo y bajo las condiciones experimentales ensayadas. Finalmente, como consecuencia de los trabajos efectuados en este bloque, se demostró que el patrón de colonización de las raíces de olivo por parte de Pseudomonas sp. PICF6 era similar al de PICF7, incluyendo su capacidad endófita.
En conclusión, los resultados obtenidos en esta Tesis permiten concluir que los tres fenotipos de P. simiae PICF7 examinados (actividad fitasa, formación de biopelículas y tolerancia al cobre) no están involucrados en la capacidad de este ACB para controlar la VO, a pesar de que en el caso particular de los mutantes alterados en la formación de biopelículas no se obtuvieron evidencias de colonización endófita de raíces de olivo. Por tanto, la capacidad de biocontrol de la VO por la cepa PICF7 no parece necesitar de la colonización interna de este órgano. Por otra parte, las cepas PICF6 y PICF7 no mostraron capacidad para aliviar los síntomas causados por estrés salino e hídrico en plantones de olivo, descartando que la enzima ACD estuviera involucrada, al menos en las condiciones analizadas. El estudio del patrón de colonización de ambas cepas, así como el de promoción de crecimiento en plántulas de colza, mostró que las dos rizobacterias de olivo colonizan superficialmente la raíz de esta planta modelo. Sin embargo, no se constató capacidad para promover su crecimiento. Finalmente, la caracterización de los volatilomas de PICF6 y PICF7 permitió identificar diversos COV con una referenciada actividad antimicrobiana. Si bien no pudo demostrarse la implicación de compuestos volátiles en la inhibición del crecimiento de V. dahliae in vitro, la información obtenida invita a profundizar en el estudio de estas moléculas de manera individual y frente a distintos patógenos.
General Introduction
This chapter has been published as:
Montes-Osuna, N. and Mercado-Blanco, J. Verticillium Wilt of Olive and Its Control: What Did We Learn during the Last Decade? Plants 2020, 9, 735.
doi.org/10.3390/plants9060735
Abstract: Verticillium (Verticillium dahliae Kleb.) wilt is one of the most devastating diseases affecting olive (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea) cultivation. Its effective control strongly relies on integrated management strategies. Olive cultivation systems are experiencing important changes (e.g. high-density orchards, etc.) aiming on improving productivity. The impact of these changes on soil biology and incidence/severity of olive pests and diseases has not yet been sufficiently evaluated. A comprehensive understanding of the biology of the pathogen and its populations, the epidemiological factors contributing to exacerbate the disease, the underlying mechanisms of tolerance/resistance, or the involvement of the olive associated microbiota in tree’s health is needed. This knowledge will be instrumental to develop more effective control measures to confront the disease in regions where the pathogen is present, or to exclude it from V. dahliae-free areas. This review compiles the most recent advances achieved to understand the olive-V. dahliae interaction as well as measures to control the disease. Aspects such as the molecular basis of host-pathogen interaction, the identification of new biocontrol agents, the implementation of “-omics”
approaches to unravel the basis of disease tolerance, or the utilization of remote sensing technology for the early detection of pathogen attacks are highlighted.
1.1. Introduction
Olive (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea) is cultivated between latitudes 300 and 450 in Mediterranean-type climate regions of both hemispheres, a tree crop integrating an unique set of morphological and developmental characteristics suited to the relatively dry, rustic conditions of these geographical areas (Rapoport et al., 2016;
Navero et al., 2017). Olive is the most iconic tree in the Mediterranean Basin with huge economic, social and ecological importance (FAO. FAOSTAT, production statistics, 2018).
The multiple uses of cultivated and wild olives (O. europaea L. subsp. europaea var.
sylvestris Brot.) as source of food, wood and cattle fodder, explain the spread of olive groves with the expansion of human civilization (Rapoport et al., 2016). Approximately 10.5 million ha are currently devoted to olive cultivation around the world, the Mediterranean Basin accounting for 98% of this surface (FAO. FAOSTAT, production statistics, 2018). Spain is the leading producing country of olive oil and table olives, Tunisia ranks second, followed by Italy, Turkey, and Greece (data from the 2017/2018 cropping season available at the International Olive Council database, (International Olive Council, 2019)). Andalusia region, at the southernmost part of the Iberian Peninsula concentrates the largest cultivation area of this tree crop (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, Gobierno de España., 2017).
During the last two decades, changes introduced in modern olive cultivation systems have revolutionized this crop, mostly aiming to increase yield (Lodolini et al., 2016; Marra et al., 2016) and production (Gucci et al., 2007; Beyá-Marshall et al., 2018), and to improve management and mechanization practices (Rallo et al., 2014). For instance, the development of super high-density, hedgerow orchards (Connor et al., 2014) (Figure 1.1) and the use of drip irrigation systems are modifying the traditional olive landscape built along millennia in the Mediterranean countries. While these benefits are desirable, the increasing reduction in the number of cultivars or practices such as high inputs of
