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Biotransformaciones catalizadas por enzimas multiméricas: ingeniería del biocatalizador

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Academic year: 2022

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BIOTRANSFORMACIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMÉRICAS:

INGENIERÍA DEL BIOCATALIZADOR

ALEJANDRO HERRERA ORREGO

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ALEJANDRO HERRERA ORREGO

Licenciado en Bioquímica

BIOTRANSFORMACIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMÉRICAS: INGENIERÍA DEL BIOCATALIZADOR.

Memoria presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid.

DIRECTORES:

JOSÉ MANUEL GUISÁN SEIJAS JAVIER ROCHA MARTÍN

Instituto de Catálisis y Petroleoquímica – CSIC

Departamento de Biología Molecular Madrid, 2018

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José Manuel Guisán Seijas, Doctor en Ciencias Químicas y profesor de Investigación del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Javier Rocha Martín, Doctor en Biociencias Moleculares e investigador del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid (España),

CERTIFICAN:

Que ALEJANDRO HERRERA ORREGO, ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo que con título: BIOTRANSFORMACIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMÉRICAS:

INGENIERÍA DEL BIOCATALIZADOR, presenta en esta memoria, la cual constituye su tesis para optar al grado de Doctor en Biociencias Moleculares.

Y para que conste a los efectos oportunos que corresponda, prestamos al Departamento de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias de la Universidad Autónoma de Madrid el trabajo citado, firmando el presente certificado en Madrid, a 24 de septiembre de 2018.

José Manuel Guisán Seijas Javier Rocha Martín

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AGRADECIMIENTOS

Quisiera expresar mi total gratitud y agradecimiento a todas aquellas personas, sin las cuales, no se habría podido desarrollar esta Tesis Doctoral.

A José Manuel Guisán, co-director de esta Tesis, por acogerme en su grupo de investigación y darme la oportunidad de realizar la Tesis Doctoral en su laboratorio y bajo su supervisión, por todos sus conocimientos y enseñanzas, tanto a nivel científico como personal, por sus grandes ideas y su entusiasmo para llevarlas a cabo, por el gran esfuerzo y el tiempo dedicado. Sin su ayuda, esta Tesis Doctoral no habría visto la luz.

A Javier Rocha Martín, por guiarme desde mi inicio en el laboratorio, por compartir conmigo todos sus conocimientos, por su incalculable ayuda y apoyo en los momentos más duros, por todas esas horas de trabajo y esfuerzo en estos últimos años, que han permitido acabar de perfilar esta Tesis Doctoral.

A José Berenguer, tutor de la presente Tesis Doctoral, por su ayuda y disponibilidad, facilitándome una colaboración en la búsqueda de nuevas deshidrogenasas en Thermus, sin la cual no hubiera podido realizar esta Tesis. Y a todos los miembros de su laboratorio por acogerme y enseñarme durante unos meses todo lo que sé de Biología Molecular.

A Fernando López Gallego, por introducirme en el maravilloso mundo de la investigación y servir de guía en los primeros meses de actividad investigadora. Fruto de la cual, ha sido posible un capítulo de esta Tesis.

A todos mis compañeros de laboratorio y amigos: Susana, César, María, Lara, Sonia, Sandro, Rita y Janaina. Por todos esos momentos de risas, locuras y música, y por su apoyo en los momentos más difíciles. A Mari Carmen, por mejorarme como persona. A Roberto y Gloria, por los buenos momentos durante los desayunos. A todos los que han pasado por el laboratorio, aunque de una manera más breve, Eri, Marita, Antonio, Douglas, Erick, Caio, Adriana, Soussane, Paulina, Honoria, Malena, Rohollah y Bettina. También a todos aquellos estudiantes a los cuales he tenido el placer de transmitir mis pocos conocimientos y que también ellos me han conseguido enseñar.

Al proyecto SuSy que ha permitido la financiación de esta Tesis Doctoral y mi formación como investigador, incluida la parte humana del proyecto, que han fomentado un espíritu de cooperación y colaboración, a todos ellos, gracias por toda la ciencia y los valores aprendidos durante las reuniones.

Al personal del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (Mantenimiento, Unidad de Apoyo, Secretaría y Limpieza) por las facilidades prestadas y su disposición permanente, en especial a Carmen

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la devoción por sus asignaturas me marcaron el camino a seguir, y Aurelio, que me enseñó el valor de las enzimas.

A todos mis amigos, por su eterno apoyo y compañía.

A mi familia, por su cariño y por convertirme en el hombre que soy.

A Marta, por entrar en mi vida y convertirla en una aventura maravillosa, por su apoyo y comprensión.

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“La medida del carácter de un hombre es lo que sería capaz de hacer si supiera que nadie se enteraría jamás de ello.”

Barón Thomas Babington Macaulay

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Resumen

RESUMEN

En los últimos años, el uso de enzimas en la industria como biocatalizadores se ha ido incrementando, esto se debe a las excelentes propiedades de las enzimas, como altas actividades catalíticas y altas selectividades, que las hacen grandes candidatas para sustituir los procesos químicos convencionales. Pero, por lo general, las enzimas no son estables en las condiciones de reacción industriales, por lo que es necesaria su mejora antes de incorporarlas a procesos industriales. Una técnica relativamente sencilla y de bajo coste, que permite la mejora de la estabilidad de las enzimas es su inmovilización sobre un soporte rígido que, además, tiene la ventaja adicional de que permite su reutilización. La inmovilización por unión covalente multipuntual sobre soportes activados por aldehídos, como la agarosa glioxil, ha demostrado ser una excelente técnica de inmovilización para promover aumentos de estabilidad de proteínas.

El objetivo de esta Tesis Doctoral fue la preparación de diversos biocatalizadores de enzimas multiméricas mediante unión covalente multipuntual y su uso en biotransformaciones. Se pondrán de manifiesto los problemas de inmovilizar enzimas multiméricas mediante esta metodología, como pueden ser, sensibilidad a la rigidificación de su estructura, inactivación del cofactor o inactivación por borohidruro de sodio, etapa imprescindible en esta metodología. Desarrollar soluciones a este tipo de problemas es de una gran importancia debido a la cada vez mayor cantidad y complejidad de enzimas empleadas en procesos industriales.

Se inmovilizó y estabilizó, más de 60 veces, una sacarosa sintasa sensible a rigidificación de su estructura cuaternaria, y se empleó el mejor biocatalizador inmovilizado en la producción de UDP- glucosa. Se produjeron tres α-cetoácidos diferentes gracias a un sistema trienzimático inmovilizado mediante resolución cinética dinámica de una mezcla racémica del correspondiente aminoácido, la cual, se pudo llevar a cabo con un biocatalizador inmovilizado de una aminoácido racemasa de Vibrio cholerae PLP-dependiente, que mantuvo el enlace aldimida intacto entre el cofactor y la enzima, con un aumento de la estabilidad de más de 3000 veces. También se caracterizó, inmovilizó y estabilizó una 3- hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB27, el biocatalizador óptimo fue 470 veces más estable en condiciones de reacción.

Por último, se desarrolló una metodología alternativa de reducción empleando un agente reductor quimioselectivo de bases de Schiff: el 2-picolino borano. Mediante esta reducción alternativa, se co- inmovilizó una Mandelato deshidrogenasa bacteriana y una Formiato deshidrogenasa de Candida boidinii, y se aplicó este biocatalizador co-inmovilizado en la producción de ácido (R)-mandélico.

Además, gracias a esta técnica, se consiguió generar microambientes hidrofílicos sobre soportes

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Abstract

6

ABSTRACT

In recent years, the use of enzymes as catalysts in industrial processes has been increasing; this is due to the excellent properties of enzymes, such as high catalytic activity and high selectivity, make them great candidates to replace conventional chemical processes. However, enzymes are not stable under industrial reaction conditions, so their improvement is necessary before its incorporation into industrial processes. A relatively simple and low-cost technique, which allows the enzyme stability improvement, is the protein immobilization on a rigid support. This technique also allows the reusability of the biocatalyst during several reaction cycles. Enzyme immobilization by multipoint covalent attachment on aldehyde-activated supports, such as glyoxyl agarose, has proven to be an excellent immobilization technique to promote enzyme stabilization.

The main goal of this Doctoral Thesis was the development of supported biocatalysts through multipoint covalent attachment of multimeric enzymes and its application into biotransformations. The immobilization of multimeric enzymes through this methodology revealed some problems, such as sensitivity to ridigification, inactivation of the cofactor or inactivation by the indispensable reduction step with sodium borohydride. The solution to this kind of problems is of great importance due the increasing number and complexity of the new enzymes used in industrial processes.

A sucrose synthase (SuSy) from Nitrosomonas europaea, sensitive to the rigidification of its quaternary structure, was immobilized and stabilized more than 60-fold. The optimal immobilized biocatalyst of SuSy was used to produce UDP-glucose. Three different α-ketoacids were produced using a supported trienzymatic system through dynamic kinetic resolution of a racemic mixture of the corresponding amino acid. This reaction could not be carried out without an immobilized biocatalyst of a PLP-dependent broad spectrum amino acid racemase from Vibrio cholerae. This immobilized biocatalyst conserved the aldimide bond between the cofactor and the enzyme and it was 3000-fold more stable than the soluble enzyme. In addition, a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase from Thermus thermophilus HB27 was characterized, immobilized and stabilized (470-fold more stable than the

soluble enzyme in reaction conditions).

Finally, an alternative reduction methodology was developed to replace sodium borohydride by 2- picoline borane. A more chemoselective reducing agent of Schiff’s bases. By means of this alternative reduction step, a bacterial Mandelate dehydrogenase and a Formate dehydrogenase from Candida boidinii were co-immobilized. This co-immobilized biocatalyst was applied to produce (R)-mandelic acid. Furthermore, it was possible to generate hydrophilic microenvironments onto hydrophobic supports, such as methacrylate derivatives, eliminating the negative effects that provides these supports surface on the immobilized enzyme.

(11)

Índice

ÍNDICE

ÍNDICE DE TÍTULOS

Agradecimientos ... 1

Resumen ... 5

Abstract ... 6

Índice ... 7

Clave de Abreviaturas ... 11

Introducción ... 13

1.1 Química sostenible y Biocatálisis. ... 13

1.2 Selectividad y Quiralidad. ... 14

1.3 Inmovilización de proteínas ... 16

1.3.1 Unión covalente multipuntual. Soportes activados con aldehídos. ... 17

1.3.2 Estabilización de enzimas multiméricas mediante técnicas de inmovilización y post- inmovilización. ... 19

1.4 Sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas. ... 20

1.4.1 Inmovilización de sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas heterogéneos. ... 22

Objetivos ... 25

Materiales y Métodos ... 27

2. Materiales ... 27

3. Métodos ... 29

3.1 Preparación de soluciones enzimáticas ... 29

3.1.1 Expresión y purificación de la enzima recombinante SuSy ... 29

3.1.2 Expresión y purificación de la racemasa de amplio espectro de Vibrio cholerae (BsrV) ... 29

3.1.3 Expresión y purificación de la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB27 ... 29

(12)

Índice

8

3.2.2 Determinación de la actividad enzimática de BsrV ... 30

3.2.3 Determinación de la actividad enzimática de Tt27-HBDH ... 31

3.2.4 Determinación de la actividad enzimática de PGA ... 31

3.2.5 Determinación de la actividad enzimática de DAAO ... 31

3.2.6 Determinación de la actividad enzimática de ADH2 ... 32

3.2.7 Determinación de la actividad enzimática de GlyDH ... 32

3.2.8 Determinación de la actividad enzimática de ManDH ... 32

3.2.9 Determinación de la actividad enzimática de FDH ... 32

3.3 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática de Tt27-HBDH ... 32

3.4 Preparación de soportes de inmovilización ... 32

3.4.1 Glioxil agarosa (GX-A) ... 32

3.4.2 Glioxil relizyme (GX-Rz)... 33

3.4.3 Glioxil Relisorb (GX-Rs) ... 33

3.4.4 Glioxil Purolite (GX-P) ... 33

3.4.5 Monoamino-N-aminoetil agarosa (MANAE-A) ... 33

3.4.6 Amino-epóxido agarosa (AEP-A) ... 33

3.4.7 Glutaraldehído agarosa (GT-A) ... 33

3.4.8 Epóxido agarosa (EP-A) ... 34

3.4.9 Polietilenimina-agarosa (PEI-A) ... 34

3.4.10 Polialilamina-agarosa (PAA-A) ... 34

3.5 Inmovilización de proteínas ... 34

3.5.1 Generalidades ... 34

3.5.2 Inmovilización de enzimas sobre agarosa bromocianógeno. (CNBr-A) ... 34

3.5.3 Inmovilización de SuSy sobre glioxil agarosa (GX-A) a pH 8.5 ... 35

3.5.4 Inmovilización de enzimas sobre soportes glioxil a pH 10 ... 35

3.5.5 Inmovilización sobre glutaraldehído agarosa (GT-A) ... 36

3.5.6 Inmovilización sobre epóxido agarosa ... 36

3.5.7 Inmovilización sobre AEP-agarosa ... 36

3.5.8 Inmovilización sobre PEI o PAA-agarosa ... 36

(13)

Índice

3.6 Modificaciones físico-químicas post-inmovilización. ... 37

3.6.1 Recubrimiento de SuSy con polietilenimina (PEI) ... 37

3.7 Inactivaciones térmicas o en presencia de solventes ... 37

3.8 Electroforesis en condiciones desnaturalizantes... 37

3.9 Análisis de fluorescencia de los biocatalizadores soportados de BsrV. ... 37

3.10 Estimación del número de lisinas involucradas en la inmovilización de diferentes enzimas sobre el soporte glioxil agarosa ... 38

3.11 Biotransformaciones ... 38

3.11.1 Producción de UDP-glucosa ... 38

3.11.2 Producción de α-cetoácidos ... 38

3.11.3 Producción de ácido (R)-mandélico ... 39

Resultados y discusión ... 41

4. Inmovilización-estabilización de una Sacarosa Sintasa recombinante de Nitrosomonas europea. Síntesis de UDP-Glucosa. ... 41

4.1 Estabilización de SuSy sobre diferentes métodos de inmovilización ... 42

4.2 Optimización de la estabilización de SuSy en soportes glioxil agarosa ... 44

4.3 Análisis de la estabilidad de los inmovilizados de SuSy sobre glioxil agarosa ... 46

4.4 Síntesis de UDP-Glucosa ... 47

5. Síntesis de 2-cetoácidos, desde mezclas racémicas de aminoácidos, catalizada por un sistema multienzimático inmovilizado. ... 50

5.1 Inmovilización de BsrV sobre soportes derivados de agarosa ... 51

5.2 Reconstitución de la actividad enzimática de la enzima PLP-dependiente BsrV inmovilizada sobre glioxil agarosa: Optimización de la inmovilización... 54

5.3 Estabilidad térmica de los biocatalizadores óptimos de BsrV. ... 57

5.4 Producción de α-cetoácidos por un sistema trienzimático heterogéneo ... 59

6. Purificación, caracterización e inmovilización-estabilización de una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa recombinante de Thermus thermophilus HB27 (Tt27-HBDH). ... 63

6.1 Expresión en E. coli y purificación de la enzima Tt27-HBDH ... 64

(14)

Índice

10

6.2.2 Parámetros cinéticos ... 67

6.2.3 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática ... 69

6.3 Inmovilización de Tt27-HBDH sobre diferentes soportes derivados de la agarosa ... 70

6.4 Optimización del biocatalizador HBDH-GX-A ... 72

7. 2-Picolino borano como agente reductor alternativo para la estabilización de enzimas por unión covalente multipuntual sobre soportes activados con aldehídos. ... 74

7.1 Reducción del soporte glioxil agarosa con 2-picolino borano... 75

7.2 Comparación de las preparaciones enzimáticas reducidas con NaBH4 o 2-PB: actividad expresada y estabilidad térmica. ... 76

7.3 Evaluación de la correlación entre la estabilidad térmica y el número de enlaces covalentes enzima-soporte. ... 78

7.4 Inmovilización y estabilización de dos enzimas sensibles a la reducción con borohidruro ... 80

7.5 Co-inmovilización de ManDH y FDH sobre glioxil agarosa. Producción de Ácido (R)- Mandélico. ... 82

7.6 Estabilización de proteínas inmovilizadas sobre soportes glioxiles mediante generación de microambientes. ... 85

Conclusiones ... 89

Bibliografía ... 91 Anexo... ¡Error! Marcador no definido.

(15)

Clave de Abreviaturas

CLAVE DE ABREVIATURAS

SuSy Sacarosa Sintasa de Nitrosomonas europaea

UDP Uridina 5'-difosfato

UDP-glucosa Uridina 5’-disfosfoglucosa

NADH / NAD+ Nicotinamida adenina dinucleótido (forma reducida / oxidada)

PEI Polietilenimina

PAA Polialilamina

SP-A Soporte sulfopropil agarosa

PEI-A Soporte polietilenimina agarosa

PAA-A Soporte polialilamina agarosa

CNBr-A / CB-A Soporte bromocianógeno agarosa

G-A / GX-A Soporte glioxil agarosa

EP-A Soporte epóxido agarosa

AEP-A Soporte amino-epóxido agarosa

MANAE-A Soporte monoaminoetil-N-aminoetil agarosa

GT-A Soporte glutaraldehído agarosa

SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes BsrV Aminoácido racemasa de amplio espectro recombinante de Vibrio cholerae DAAO D-aminoácido oxidasa recombinante de Trigonopsis variabilis

CAT Catalasa comercial de hígado bovino

PLP Piridoxal 5’-fosfato

OPD o-fenilendiamina

α-CC Ácido α-cetocaproico

α-CIC Ácido α-cetoisocaproico

α-CMB Ácido α-ceto-γ-metiltiobutanoico

2-PB Complejo 2-Picolino borano (Complejo 2-Metilpiridina borano)

PGA Penicilina G acilasa de E. coli

ManDH Mandelato deshidrogenasa de origen bacteriano (Lactobacillus curvatus) ADH2 Alcohol deshidrogenasa 2 de Thermus thermophilus HB27 GlyDH Glicerol deshidrogenasa de Celullomonas sp.

Xys1Δ Variante de la Xilanasa de Streptomyces halstedii JM8

DMSO Dimetil sulfóxido

NIPAB Ácido 6-nitro-3-fenilacetamidobenzoico

DNS Ácido dinitrosalicílico

BCL Beads Crosslinked

FDH Formiato deshidrogenasa

(16)

Clave de Abreviaturas

12

Tt27-HBDH / HBDH 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa

La nomenclatura general con la que se denominan los diferentes biocatalizadores es la siguiente:

<Nombre de la enzima>-<Funcionalización del soporte>-<Matriz>. Por ejemplo, para la enzima SuSy inmovilizada sobre agarosa funcionalizada con grupos glioxiles sería: SuSy-GX-A. Cualquier modificación a esta nomenclatura general es especificada en cada capítulo.

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Introducción. Química sostenible y Biocatálisis.

INTRODUCCIÓN

1.1 Química sostenible y Biocatálisis.

La química verde o química sostenible es aquella que emplea eficientemente materias primas (preferiblemente renovables), eliminan residuos y evita el uso de sustratos o disolventes tóxicos o peligrosos, en la fabricación y aplicación de productos químicos (1).

En las materias primas se incluyen, en principio, las fuentes de energía ya que conllevan una generación de residuos en forma de CO2. El principio rector es el diseño de productos y procesos ambientalmente benignos que estén incorporados a los doce principios de la química verde formulados por Anastas y Warner (2,3). La química verde es la prevención primaria de la contaminación, en lugar de eliminación de residuos. Formulados por Anastas y Zimmerman en 2006, se propusieron doce principios de la ingeniería verde (4), que contienen las mismas características subyacentes: conservación de energía y materias primas, y eliminación de residuos y materiales peligrosos, pero desde el punto de vista de la ingeniería. Poliakoff y colaboradores propusieron una regla mnemotécnica

“PRODUCTIVELY”, que captura el espíritu de los doce principios de la química verde (5).

Otro concepto importante al que se debe de prestar atención, tanto en la industria como en la sociedad en general, es el desarrollo sostenible, introducido por primera vez en el informe Brundtland a finales de la década de 1980 y definido como: “Satisfacer las necesidades de la presente generación sin comprometer la capacidad de las generaciones futuras para satisfacer sus propias necesidades”.

En los últimos años los conceptos de química verde y desarrollo sostenible se han convertido en un enfoque estratégico tanto en los corredores industriales como académicos y han formado el tema de varios libros (1,6,7). De hecho, los dos conceptos van de la mano: la sostenibilidad es nuestro objetivo común último y la química verde es un medio para lograrlo.

La biocatálisis tiene muchas características atractivas en el contexto de la química sostenible:

condiciones suaves de reacción (en agua a pH y temperaturas fisiológicas) y un biocatalizador biodegradable (enzimas o células enteras de microorganismos) compatible con el medio ambiente y con propiedades como altas actividades y quimio-, regio- y estereoselectividades en reacciones de moléculas polifuncionales. Es más, el uso de enzimas evita la necesidad de la activación y protección del grupo funcional, a menudo requeridos en la síntesis orgánica convencional, permitiendo procesos más atractivos desde el punto de vista medioambiental y económico en menos pasos y, por tanto, produciendo menos desechos (8,9).

El uso de enzimas en la química orgánica se conoce desde los primeros años del siglo 20, pero no

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Introducción. Selectividad y Quiralidad.

14

enantioselectiva de ingredientes farmacéuticos activos (APIs). Este campo, ha ido creciendo con los años gracias al desarrollo de otras tecnologías como el ADN recombinante o la ingeniería de proteínas, que han permitido la identificación y mejora de nuevas proteínas (11,12).

1.2 Selectividad y Quiralidad.

La IUPAC define los conceptos de quimio-, regio-, estereoselectividad y quiralidad como (13):

• Quimioselectividad: Es la reacción preferencial de un reactivo químico con uno de dos o más grupos funcionales distintos entre sí.

• Regioselectividad: Es la preferencia que tiene una reacción para romper o crear un enlace en particular por encima de todos los demás posibles. Una reacción es 100% regioselectiva si la discriminación es completa, o parcialmente regioselectiva, si el producto de la reacción de un sentido predomina sobre el producto de la reacción en el otro sentido.

• Estereoselectividad: Es la formación preferencial en una reacción química de un estereoisómero sobre todos los posibles. Puede ser parcial, donde la formación de un estereoisómero está favorecida sobre el resto, o puede ser total, cuando sólo se forma un estereoisómero de entre los posibles. Cuando los estereoisómeros son enantiómeros, el fenómeno se denomina enantioselectividad y se expresa cuantitativamente mediante el exceso enantiomérico (e.e); cuando son diastereoisómeros se denomina diastereoselectividad y se expresa cuantitativamente como exceso diastereoisómerico.

• Quiralidad: Es la propiedad de un objeto de no ser superponible con su imagen especular.

La quiralidad es una propiedad intrínseca en casi todos los niveles de la materia. En particular, la vida depende de la quiralidad molecular, en donde muchas funciones biológicas son inherentemente asimétricas. Debido a esto, moléculas con estas características juegan un papel muy importante en la ciencia y la tecnología (14).

Figura 2.1. Las manos son un claro ejemplo de imágenes especulares no superponibles.

Está claro que la biocatálisis y la biotecnología están influyendo cada vez más en el completo espectro de la síntesis de compuestos, desde la industria farmacéutica a la química fina pasando por la industria alimentaria y cosmética. Dentro de los 200 fármacos más vendidos el 72% son quirales (15).

(19)

Introducción. Selectividad y Quiralidad.

Muchas moléculas empleadas como centros quirales son sólo accesibles a través de la biocatálisis, como los aminoácidos no proteinogénicos, ácidos carboxílicos, aminas o alcoholes.

Los enantiómeros son moléculas quirales, las dos formas enantioméricas, en principio, tienen las mismas propiedades fisicoquímicas, es decir, poseen el mismo peso molecular, el mismo punto de fusión y de ebullición, etc. Incluso presentan la misma reactividad. Mediante síntesis convencional, cuando se generan centros quirales, se producen en la misma proporción (50:50). Se diferencian en su comportamiento al ser atravesados por un haz de luz polarizada, uno de ellos desviará el plano de la luz polarizada hacia la derecha (D, dextrógiro) y el otro hacia la izquierda (L, levógiro). Por ello, también se los denomina isómeros ópticos.

En la naturaleza se pueden encontrar gran cantidad de compuestos quirales, como aminoácidos, hidroxiácidos, azúcares, etc. Así una gran proporción de productos relacionados con el metabolismo y el correcto funcionamiento de los organismos, contienen al menos un centro quiral. La quiralidad es la clave para la seguridad y eficacia de muchos fármacos y la producción de un solo enantiómero en los productos intermediarios de la síntesis de un fármaco ha tomado una relevancia importante, desde hace unos años, en la industria farmacéutica (16,17). Los enantiómeros aislados se pueden producir mediante síntesis química o biocatalítica (18,19). La biocatálisis ofrece una serie de ventajas sobre la catálisis química dado que los biocatalizadores son altamente enantioselectivos y regioselectivos (20,21). Es por ello que la síntesis biocatalítica de compuestos enantioméricamente puros para compuestos farmacéuticos está ganando mucho impulso. Es el resultados de los avances en genómica, cribado e ingeniería de proteínas, que consiguen incrementar tanto el número como la calidad de los biocatalizadores que serán implementados en aplicaciones a escala industrial y a su vez estas mejoras están siendo estimuladas por la demanda creciente de biocatalizadores capaces de abordar el aumento en la complejidad de fármacos activos (22,23).

O2N

OH OH

NHCOCHCl2

(R,R)-Cloranfenicol - Antibacteriano

O2N

OH OH

NHCOCHCl2

(S,S)-Cloranfenicol - Inactivo

O O

COMe OH

(R)-Warfarina - Anticoagulante

O O

COMe OH

(S)-Warfarina – Anticoagulante (6-5 veces menos activo que el R)

(20)

Introducción. Inmovilización de proteínas

16 N

N S

N O

O

NH OH

(S)-(-)-Timolol – Bloqueante β-adrenérgicos

N N

S N

O

O

NH OH

(R)-(+)-Timolol - Bloqueante β-adrenérgicos (100 veces menos activo que el S, no se usa)

O NC

N

F

(S)-Citalopram (Escitalopram) - Antidepresivo

O NC

N

F

(R)-Escitalopram – Antidepresivo (100 veces menos activo que el S)

Figura 2.2. Ejemplos de fármacos quirales y las diferencias entre enantiómeros.

1.3 Inmovilización de proteínas

Las enzimas son muy conocidas como catalizadores por su alta efectividad y eficiencia en una gran variedad de procesos, y están caracterizadas por su alta selectividad y actividad. Además, las enzimas reducen el número de etapas de reacción y las cantidades de reactivos tóxicos necesarios, haciendo que el proceso sea más barato y más ecológico. Por estas razones, las enzimas han adquirido gran importancia en la industria (24). El uso de enzimas en procesos industriales ha tenido como consecuencia el desarrollo de un gran número de tecnologías que tienen como objetivo mejorar las propiedades de las enzimas (25,26). Una de las técnicas más importantes y más empleadas, por su coste y simplicidad, es la inmovilización de proteínas, la cual consiste en la unión, reversible o irreversible, de una enzima a un soporte sólido insoluble en el medio de reacción (27,28). Las grandes ventajas de la inmovilización de proteínas son la posibilidad de reutilizar el biocatalizador durante una serie de ciclos de reacción y el incremento significativo de la estabilidad de las biomoléculas (29). Además, tras la inmovilización de las moléculas de proteínas, el biocatalizador pasa de ser homogéneo a heterogéneo lo que simplifica la separación del biocatalizador del medio de reacción facilitando la purificación del producto de reacción (29,30). Hasta la actualidad, se han ido desarrollando diferentes técnicas de inmovilización, entre las que se incluyen la adsorción, unión covalente, atrapamiento, encapsulación o entrecruzamiento (28,31).

Se diferencian entre ellos en el mecanismo de interacción enzima-soporte y en el material del soporte que se emplea (Figura 2.3). La selección del método y el material más apropiado depende del tipo y de las condiciones del proceso catalítico, así como de la propia enzima (32). Sin embargo, hay que enfatizar

(21)

Introducción. Inmovilización de proteínas

que la selección del material del soporte es un desafío crucial dado el impacto que puede tener el material del soporte sobre las propiedades características del sistema biocatalítico (33).

En la inmovilización de una enzima están implicadas dos especies, la enzima y el soporte. Como ya se ha comentado, la superficie de ambos es muy importante. Los grupos polares (como los aminos primarios de los residuos lisina o los grupos carboxilo de los ácidos glutámico y aspártico), zonas con la superficie apolar o glicosilaciones, pueden influir en las propiedades de la superficie de la proteína.

En el caso del soporte, además del material del que está constituido, se debe funcionalizar con grupos compatibles con las propiedades de la superficie enzimática. Un requisito esencial del soporte es que debe de tener áreas muy extensas, que se pueden conseguir si: el material son pequeñas partículas o si el material es altamente poroso, cuyos poros deben de poseer volúmenes lo suficientemente grandes como para no limitar la difusión de los sustratos. Además, el material debe de ser química y mecánicamente estable (28).

Figura 2.3. Métodos de inmovilización

1.3.1 Unión covalente multipuntual. Soportes activados con aldehídos.

No existe, en la actualidad, un método general para inmovilizar proteínas. La aproximación más común es la “prueba y error”, hasta que se consiga un biocatalizador que satisfaga el reactor en el que debe de ser empleado. Un punto simple que hay que tener en cuenta, que no siempre se aprecia, es que la enzima debe de ser estable durante todo el proceso de inmovilización.

La unión covalente de una enzima a un soporte tiene como principal ventaja que la enzima está unida irreversiblemente al soporte, evitándose la lixiviación, y por tanto evitando contaminar el medio de reacción con proteína. Como regla de oro, la unión covalente se recomienda cuando se trabaja en

(22)

Introducción. Inmovilización de proteínas

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formado un gran número de enlaces covalentes entre la enzima y el soporte se denomina unión covalente multipuntual, y permite reducir la flexibilidad conformacional y las vibraciones térmicas y, por tanto, prevenir el desplegamiento y desnaturalización de una enzima, frente a condiciones de trabajo no naturales (temperaturas y pHs extremos o presencia de disolventes). En otras palabras, aumenta la rigidez de las proteínas y, por tanto, su estabilidad (28,34-36). Esta rigidificación de la estructura de la proteína es mayor cuando los soportes están altamente activados con brazos espaciadores cortos y cuando se consigue involucrar en la unión un gran número de residuos de la superficie de la proteína (29). Conseguido todo esto, las distancias relativas entre todos los residuos involucrados en la unión covalente multipuntual permanecerán inalterados durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente distorsionante, consiguiendo así incrementar en gran medida la estabilidad de la proteína.

De entre todos los soportes existentes, los más idóneos para este tipo de unión son: agarosa, sílica, zeolitas, vidrio poroso o resinas acrílicas (como Relizyme o Purolite) ya que ofrecen extensas áreas superficiales por unidad de volumen, que permiten las interacciones enzima-soporte con una buena congruencia entre sus superficies. Por otra parte, entre las posibles funcionalizaciones, las más adecuadas son los grupos epóxido y los aldehídos (36-39). La unión covalente multipuntual sobre soportes funcionalizados con grupos glioxil (aldehídos alifáticos con un brazo espaciador muy corto) ha demostrado ser una de las más efectivas para el aumento drástico de la estabilidad de una proteína, gracias a su brazo espaciador corto (29,36). Esta unión consiste en la inmovilización irreversible de las proteínas sobre un soporte insoluble como sílica (40), agarosa (41), polímeros derivados del metacrilato (42,43) o nanopartículas magnéticas (44), incluso residuos lignocelulósicos (45,46). Además, tiene la ventaja adicional de que la inmovilización es dirigida, esto significa que todas las moléculas estarán orientadas de la misma manera, a través de la zona de su superficie más rica en residuos lisina, proporcionando por tanto una intensa unión covalente multipuntual (29,36,41). Esta metodología de inmovilización promueve la formación de bases de Schiff entre los aldehídos del soporte y de aminos primarios no protonados de la superficie de la proteína (36,39,41). Esta metodología, puede ser, incluso, reproducida sobre soportes poliacrílicos comerciales, como Purolite o Sepabeads, funcionalizados con grupos epóxido (43), previa hidrólisis ácida del soporte para generar grupos gliceriles (dioles vecinales) en su superficie.

Pero conseguir este tipo de unión no es trivial, es necesario controlar una serie de parámetros como el tiempo de inmovilización, el valor del pH, la temperatura, el tampón o el grado de activación del soporte. Además, tanto la velocidad como el rendimiento de la inmovilización están determinados por estos parámetros. Uno de los soportes más comunes y conocidos para activar con grupos glioxiles son las perlas de agarosa macroporosa, con este soporte se ha podido conseguir la estabilización de más de 100 enzimas industriales, llegando a aumentos de estabilidad de entre 1000 y 10000 veces (29,34). Una

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Introducción. Inmovilización de proteínas

de las principales ventajas de la agarosa macroporosa es que permite la obtención de grandes densidades de grupos glioxiles sobre su superficie (41).

En general, el mecanismo de inmovilización sobre soportes glioxil tiene lugar a través de la zona de la superficie de la enzima con mayor densidad de grupos amino primarios (lisinas) y no sólo a través del grupo amino más reactivo como ocurre en la mayoría de las otras técnicas de inmovilización covalente. En un primer paso, se produce la formación de bases de Schiff (grupos imino) entre los ε- NH2 de los residuos lisina y los aldehídos del soporte (Figura 2.4). Las lisinas son normalmente aminoácidos abundantes en la superficie de la proteína, expuestas al medio y, cuando están desprotonadas, son muy reactivas como nucleófilos por lo que es necesario realizar la inmovilización a un pH que esté por encima del pKa de los grupos ε-NH2 (pKa=9.2) (41). En esta primera interacción entre la enzima y el soporte se producen, al menos, dos enlaces. Quedando la enzima orientada a través de su zona más rica en grupos aminos reactivos. Después, con tiempos de incubación mayores, se van formando más bases de Schiff, que recordemos son reversibles (41). Para finalizar la inmovilización, se reducen estas bases de Schiff a enlaces de tipo amina secundaria con borohidruro de sodio, consiguiéndose que la unión entre la enzima y el soporte sea completamente irreversible, además, dada la baja quimioselectividad del borohidruro de sodio se reducen también los aldehídos libres del soporte en grupos hidroxilos. Como resultado, obtenemos una enzima irreversiblemente unida a un soporte hidrofílico e inerte. Lo cual es importante para evitar reacciones indeseadas o no controladas que desestabilicen la proteína o los sustratos o productos de reacción (36,39,41).

Figura 2.4. Esquema general de la inmovilización de una proteína sobre glioxil agarosa.

1.3.2 Estabilización de enzimas multiméricas mediante técnicas de inmovilización y post- inmovilización.

Un problema especialmente complejo es la estabilización de proteínas multiméricas (47-50). Podría parecer un problema menor, pero el caso es que la gran mayoría de las enzimas interesantes a nivel industrial han resultado ser multiméricas: Deshidrogenasas (50,51), aldolasas (52,53), oxidasas (54,55), glicosiltransferasas (56,57), etc.

Mientras que en la mayoría de las enzimas monoméricas el primer paso de inactivación es la

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Introducción. Sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas.

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pueden incrementar la rigidificación de la proteína, debido a la baja movilidad de los grupos que intervienen en estas interacciones. De esta manera, interacciones muy intensas entre las subunidades es una manera de incrementar la estabilidad térmica de las proteínas, como así atestiguan muchos casos de enzimas de organismos termófilos (62,63). Sin embargo, bajo ciertas condiciones experimentales, esta interacción subunidad-subunidad puede debilitarse y dar lugar a la disociación de los monómeros, inactivando así la enzima. Por lo tanto, estabilizar la estructura cuaternaria de la proteína es el primer objetivo cuando se estabilizan enzimas multiméricas (64).

Se han desarrollado y utilizado varios métodos para estabilizar la estructura cuaternaria de enzimas multiméricas tales como el entrecruzamiento fisicoquímico (65-67), la inmovilización (33,68) o la ingeniería genética. Por una parte, el entrecruzamiento fisicoquímico con polímeros es una técnica muy extendida de post-inmovilización, especialmente útil cuando no se consiguen inmovilizar todas las subunidades sobre el soporte (49,69), entre los polímeros más comunes encontramos el dextrano- aldehído o la polietilenimina (PEI). El primero es un polímero de α-(1-6) glucosa con algunas ramificaciones α-(1-3), que se oxida con periodato de sodio para dar lugar a dos aldehídos por molécula de glucosa, pudiendo reaccionar por el mismo mecanismo que los aldehídos de los soportes glioxil. El segundo es un polímero policatiónico que generará enlaces iónicos con los grupos carboxilos de la superficie de la proteína.

Por otra parte, la inmovilización de todas las subunidades sobre el soporte mediante una inmovilización adecuada y racional será la mejor opción para conseguir el mayor aumento de estabilidad posible, ya que al contrario que el entrecruzamiento con polímeros, no sólo estabilizamos la estructura cuaternaria de la proteína, sino que además estamos rigidificando la estructura terciaria de la proteína.

Pero, el posible inconveniente de esta metodología es que la excesiva rigidificación de la estructura terciara pueda promover una distorsión de la estructura cuaternaria, provocando pérdidas considerables de actividad enzimática (35,70). Por lo que, en ocasiones, será necesaria una solución de compromiso entre altas actividades enzimáticas y altas estabilidades.

1.4 Sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas.

Como ya hemos comentado, las enzimas son los biocatalizadores de la naturaleza, Pueden incrementar la velocidad de una gran cantidad y diversidad de reacciones que ocurren dentro de los organismos vivos. Están involucradas en procesos tan complejos y esenciales como la replicación del ADN, su transcripción y su traducción, también están involucradas en el metabolismo, la transducción de señales y la defensa del propio organismo.

Normalmente, es un grupo de enzimas las que trabajan juntas en reacciones en varios pasos o en cascada. Por ejemplo, en el caso del metabolismo suele ser bastante común que el producto de una enzima sea el sustrato de otra (Figura 2.5). Normalmente, esta actividad está regulada por la organización espacial, consiguiendo así que rutas metabólicas susceptibles de interferirse entre ellas se

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Introducción. Sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas.

localicen en orgánulos separados. Por el contrario, aquellas enzimas que cooperan entre ellas se suelen encontrar localizadas en el mismo compartimento, incluso pueden estar asociadas en complejos macromoleculares (71,72).

Glucosa

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-6-fosfato

Fructosa-1,6-bifosfato ATP

ADP

ATP

ADP HK

GPI

FK

Dihidroxiacetona-fosfato Gliceraldehído-3-fosfato

TPI F2PA

HK - Hexoquinasa

GPI - Glucosa-fosfato isomerasa PFK - Fosfofructoquinasa

F2PA - Fructosa-bifosfato aldolasa TPI - Triosa-fosfato isomerasa

Figura 2.5. La glucolisis es un ejemplo de reacción metabólica en cascada.

La organización de las enzimas en estos compartimentos es una gran ventaja y se denomina canalización metabólica (73,74). De esta manera, los intermedios se transfieren de un sitio catalítico a otro sin, o con muy pocos, problemas de difusión en el medio. Es por esto, que es de gran utilidad emplear o imitar estos sistemas multienzimáticas. Y los podemos reproducir in vitro al mezclar varias enzimas en un mismo recipiente para realizar procesos multienzimáticos (75-77). Y al contrario de lo que ocurre in vivo, las condiciones de reacción son más fáciles de controlar, y por tanto la optimización del sistema es más eficiente (77,78).

Las reacciones multienzimáticas secuenciales o en cascada, son sin duda un gran avance respecto a la síntesis convencional, en la que etapa a etapa había que ir purificando el intermedio de reacción, por lo que con esta nueva metodología ahorramos costes de purificación y eliminamos la producción de residuos. Además, otra posible ventaja es la de poder trabajar con intermedios de reacción inestables y el control sobre la reacción, que nos permite desplazar el equilibrio de reacción (79,80). Las cascadas multienzimáticas cuentan, para la mayoría de los ejemplos, con el hecho de que las enzimas son muy

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Introducción. Sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas.

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de nuevas técnicas de ingeniería de proteínas y cribados high-throughput, así como nuevas estrategias de expresión de proteínas han facilitado el acceso a enzimas de todo tipo (82,83).

La mayoría de estas cascadas incorporan reacciones que requieren cantidades estequiométricas de cosustratos o cofactores, como NAD(P)H o NTPs, que presentan un elevado coste. Conseguir una regeneración eficiente de estos cosustratos es de suma importancia cuando se trata de obtener un proceso viable económicamente. Se han desarrollado, hasta día de hoy, muchas reacciones bienzimáticas en las que se acopla una enzima auxiliar o regeneradora a la enzima principal, encargada de la síntesis del producto final. Estos sistemas tienen la ventaja de que, además, desplazan el equilibrio de la reacción hacia la formación del producto final (83). Un claro ejemplo son los sistemas redox, en los que una oxidorreductasa principal cataliza la reacción principal y una segunda enzima regeneradora, con ayuda de un cosustrato regenera el cofactor redox para la oxidorreductasa principal. La consecuencia, especialmente para sistemas que dependen de cofactores redox, es que sean sistemas autosuficientes y que posean una alta economía de masa y una alta selectividad molecular (76). Por lo general, para que este sistema sea sostenible, el cofactor debe de regenerarse entre 100 y 106 veces (84).

Desde el año 2015, a esta estrategia para desarrollar y mejorar metabolismos artificiales sin células para la síntesis multienzimática, se la denomina Biocatálisis de sistemas (85). Es una estrategia emergente, de organización de enzimas in vitro para construir cascadas de reacción complejas para una síntesis, eficiente y sostenible, de productos químicos con alto valor añadido. La estrategia fusiona el enfoque sintético de la química con el diseño modular de sistemas biológicos, similar a la ingeniería metabólica de los sistemas de producción celular, pero puede realizarse a un nivel mucho más bajo de complejidad desde un enfoque verdaderamente reduccionista.

1.4.1 Inmovilización de sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas heterogéneos.

Si al diseño de nuevas rutas metabólicas artificiales empleando enzimas en soluble se lo definió como Biocatálisis de sistemas, el mismo concepto, pero empleando enzimas inmovilizadas se lo define como Biocatálisis de sistemas heterogéneos. Ya que, como se ha mencionado anteriormente, el uso de enzimas inmovilizadas tiene como consecuencia que el medio de reacción pase de ser homogéneo a heterogéneo.

Como ya hemos mencionado antes, para el uso industrial las enzimas tienen que ir inmovilizadas de alguna manera, para conseguir su fácil separación del medio de reacción y su posterior reúso. No solamente esto, sino que además con una adecuada estrategia de inmovilización se puede conseguir mejorar su propiedades, tales como su actividad, estabilidad o selectividad (29). Para sistemas multienzimáticos, las enzimas se pueden co-inmovilizar sobre un mismo soporte de manera que tengan una mayor proximidad física entre ellas, para así imitar los mencionados complejos multienzimáticos presentes en las células (77).

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Introducción. Sistemas multienzimáticos. Biocatálisis de sistemas.

Usando una adecuada estrategia de inmovilización y tipo y funcionalización de soporte, se puede conseguir controlar la distribución de las enzimas a lo largo de la estructura del soporte, consiguiendo en muchas ocasiones su co-localización (86-89). Al igual que al inmovilizar enzimas individualizadas, encontrar una estrategia adecuada para co-inmovilizar dos o más enzimas sobre un mismo soporte conlleva un ejercicio de “prueba y error”. Y en la mayoría de las ocasiones será necesario el compromiso entre estrategias para una enzima y otra, fin de obtener un biocatalizador co-inmovilizado óptimo.

Uno de los primeros ejemplos de co-inmovilización de dos enzimas en un mismo soporte fue la unión covalente de una hexoquinasa y una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa sobre dos soportes distintos, agarosa y un co-polímero de acrilamida-ácido acrílico (90). Desde ese trabajo, se han desarrollado nuevas estrategias para co-inmovilizar y co-localizar enzimas (77,91,92): Andamios de ADN (93,94), sólidos porosos (42,95,96), nanopartículas (97-99) o combi-CLEAs (100-102). Dentro de los sólidos porosos, podemos encontrar la agarosa, vidrios porosos o metacrilatos (como Purolite®, Relisorb® o Relizyme®). Llegándose incluso a co-inmovilizar y co-localizar enzimas y cofactores sobre un mismo soporte (42,103).

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Objetivos. Materiales

OBJETIVOS

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es la ingeniería de nuevos biocatalizadores inmovilizados de enzimas multiméricas optimizando su actividad y estabilidad, para su uso en biotransformaciones multienzimáticas secuenciales. Este objetivo nos hace plantearnos una serie de sub- objetivos:

1) Se prepararán nuevos biocatalizadores soportados para una Sacarosa sintasa de Nitrosomonas europaea, una Racemasa PLP-dependiente de Vibrio cholerae, una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB27 y una Mandelato deshidrogenasa bacteriana.

Mediante inmovilización dirigida para estabilizar la estructura cuaternaria, tratando de inmovilizar todas las subunidades de las enzimas.

2) Se estudiará el efecto de la inmovilización-estabilización covalente multipuntual sobre las enzimas multiméricas mencionadas anteriormente, en función de la naturaleza intrínseca de cada una de las enzimas. Solventándose los posibles problemas originados por la rigidificación de su estructura terciaria y cuaternaria.

3) Expresión, purificación y caracterización de una deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB27 codificada por el gen TTC0898.

4) Puesta a punto de una metodología alternativa de la unión covalente multipuntual empleando el agente reductor quimioselectivo de bases de Schiff, el 2-picolino borano, para sustituir al agente reductor inespecífico, el borohidruro de sodio.

a) Inmovilización-estabilización de enzimas sensibles a borohidruro de sodio sobre soportes funcionalizados con aldehídos.

b) Generación de microambientes hidrofílicos sobre soportes glioxil, que eliminen los efectos adversos, provocados por la hidrofobicidad del soporte, sobre las enzimas inmovilizadas. Especialmente útil para soportes acrílicos, que permiten reacciones en medios anhidros o en flujo continuo.

5) Estudio de diferentes biotransformaciones empleando los biocatalizadores optimizados de cada una de las enzimas:

a) Producción de UDP-glucosa empleando un biocatalizador optimizado de la enzima Sacarosa Sintasa.

b) Producción de α-cetoácidos por resolución cinética dinámica de mezclas racémicas de aminoácidos, empleando un sistema trienzimático.

c) Reducción asimétrica del Ácido fenilglioxílico empleando un sistema bienzimático para la producción de Ácido (R)-mandélico.

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Materiales y Métodos. Materiales

MATERIALES Y MÉTODOS

2. MATERIALES

Proveedor Enzimas

Sigma-Aldrich (St. Louis, IL, USA)

Albúmina de suero bovino (BSA), Sistema revelador Piruvato Quinasa/Lactato deshidrogenasa (PK/LDH) de músculo de conejo, Peroxidasa de rábano (HRP),

Catalasa de hígado bovino (CAT), Glicerol deshidrogenasa (GlyDH) de Celullomonas sp.

Generosamente donada por el Profesor Tom Desmet (Centro de Biotecnología Industrial y Biocatálisis,

Universidad de Gante, Bélgica)

Sacarosa sintasa de Nitrosomonas europea ATC 19718

Generosamente donada por Recordati SRL. (Milán,

Italia) D-aminoácido oxidasa (DAAO)

Generosamente donada por Antibióticos S.A. (León,

España) Penicilina G acilasa (PGA) de E. coli

Applichem (Darmstadt, Alemania) (R)-Mandelato deshidrogenasa (ManDH) de origen bacteriano

Generosamente donada por el Profesor Ramón I.

Santamaría (Instituto de Microbiología Bioquímica- CSIC, Salamanca, España)

Variante de la Xilanasa (Xys1Δ) de Streptomyces halstedii JM8

Generosamente donada por el Profesor José Berenguer (Centro de Biología Molecular Severo

Ochoa, Madrid, España)

Alcohol deshidrogenasa 2 de Thermus thermophilus HB27

Generosamente donada por el Dr. Fernando López Gallego (Instituto de Síntesis Química y Catálisis

Homogénea, Zaragoza, España)

Formiato deshidrogenasa de Candida boidinii

Proveedor Soportes

Agarose Beads Technologies (Madrid, España)

Agarosa sin funcionalizar de diferentes grados de entrecruzamiento (4%, 6% y 10% BCL), Agarosa

Ni2+-NTA 4BCL

General Electric Healthcare (Uppsala, Suecia)

Agarosa 4BCL funcionalizada con grupos bromocianógenos

Sulfopropil-agarosa 4BCL

Purolite (Pennsylvania, USA) Purolite 8204F

Resindion (Milan, Italia) Relizyme EP403/S y Relisorb HG400/SS

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Materiales y Métodos. Materiales

28 Carbosynth (Berkshire, Reino Unido)

Uridina difosfato (UDP), Nicotinamida adenina dinucleótido (Forma oxidada, NAD+ y reducida,

NADH)

Sigma-Aldrich (St. Louis, IL, USA) Piridoxal-5’-fosfato (PLP)

Proveedor Productos químicos

Sigma-Aldrich (St. Louis, IL, USA)

Cloruro de magnesio, Dextrano de Leuconostoc mesenteroides de diferentes tamaños moleculares (1.5, 6, y 70 kDa), Polietilenimina (PEI) de diferentes

tamaños moleculares, Polialilamina (PAA) de 17 kDa, Bromuro de tetra-n-butilamonio (TBAB),

Borohidruro de sodio (NaBH4), Glicidol, Etilendiamina, Glutaraldehído 37%, Epiclorhidrina,

Etanolamina, Glicerol

Pierce (Rockford, IL, USA) Kit de detección de proteínas (BCA Protein Assay Kit)

Bio-Rad (Hercules, CA, USA) Solución 30% acrilamida/bisacrilamida, Solución de Bisacrilamida 2%

Merck (Darmstadt, Alemania) Metaperiodato de sodio

Scharlab (Barcelona, España) Metanol, Acetonitrilo, Dimetil Sulfóxido (DMSO)

General Electric Healthcare (Uppsala, Suecia) Marcadores de peso molecular para SDS-PAGE (14- 97 kDa; LMW)

Spectrum Labs (Breda, Holanda) Membranas de diálisis de éster de celulosa (CE) de diferentes MWCO

TCI (Tokio, Japón) Complejo 2-Picolino borano

Proveedor Sustratos / Productos de reacción Carbosynth (Berkshire, Reino Unido) Uridina 5’-difosfoglucosa (UDP-Glc)

Sigma-Aldrich (St. Louis, IL, USA)

D-fructosa, Sacarosa, Fosfoenolpiruvato (PEP), o- fenilendiamina (OPD), todos los aminoácidos (enantiómeros y mezclas racémicas), α-cetocaproato de sodio (α-CC), α-cetoisocaproato de sodio (α-CIC),

α-ceto-γ-metiltiobutirato de sodio (α-CMB), 2,2,2- trifluoroacetofenona, Fenilglioxilato de sodio, Ácido

dinitrosalicílico (DNS), Glicerol, Ciclohexanona, D,L-gliceraldehído, Benzoilformiato de etilo, Propiofenona, Acetofenona, Octanal, Benzoilacetato

de etilo, Trifluoroacetofenona, Levulinato de etilo, 1,3-acetonadicarboxilato de etilo, 3-oxohexanoato de

etilo, 4,4,4-trifluoroacetoacetato de etilo, 2,2,2- trifluoroetanol, ciclohexanol, 1-feniletanol, 1-fenil-1-

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Materiales y Métodos. Métodos

propanol, 2-fenil-1-propanol, (S)-3-hidroxibutirato de etilo, (R)-3-hidroxibutirato de etilo

Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) Acetoacetato de etilo, 2-cloroacetoacetato de etilo, 4- cloroacetoacetato de etilo, 3-hidroxibutirato de etilo Fluorochem (Hadfield, Reino Unido) Ácido 6-nitro-3-fenilbenzoico (NIPAB)

Megazyme (Wicklow, Irlanda) Xilano de madera de haya

El resto de los reactivos y solventes, así como tampones fueron de grado analítico o síntesis.

3. MÉTODOS

3.1 Preparación de soluciones enzimáticas

La variante de la xilanasa (Xys1Δ) de Streptomyces halstedii JM8 (104), la alcohol deshidrogenasa 2 de Thermus thermophilus HB27 (105), la formiato deshidrogenasa de Candida boidinii (FDH) (103) se expresaron y purificaron según bibliografía.

3.1.1 Expresión y purificación de la enzima recombinante SuSy

El plásmido de expresión pCXP34h que contenía la secuencia codificante para la proteína Sacarosa Sintasa (SuSy) procedente del organismo Nitrosomonas europaea (ATC 19718) fue donado por el profesor Tom Desmet (Gante, Bélgica). El plásmido fue transformado en E. coli BL21 (DE3) y la enzima recombinante expresada y purificada acorde a la bibliografía (106). Finalmente, la proteína se dializó a 4 ºC en tampón 10 mM fosfato sódico pH 7, se realizaron dos pases de 2 horas y otro de 18 horas.

3.1.2 Expresión y purificación de la racemasa de amplio espectro de Vibrio cholerae (BsrV) El gen codificante para la proteína BsrV se clonó en un plásmido pET28b para ser expresado de manera recombinante en el organismo E.coli BL21(DE3) como se indica en la bibliografía (107). La inducción se realizó a una OD600 de 0.4 con 1 mM IPTG durante 3 horas, tras esto el cultivo se centrifugó a 8000 rpm durante 30 minutos. El pellet de células se resuspendió en tampón 50 mM fosfato sódico a pH 7.4, 150 mM de NaCl, 3 mM de benzamidina y 10 mM de imidazol. La suspensión se liso con 3 pases por French Press a 4 ºC, se centrifugó a 14000 rpm durante 30 minutos. La proteína se purificó por gradiente de imidazol empleando una columna de agarosa Ni-NTA. Finalmente, la enzima pura se dializó frente a tampón 25 mM de fosfato de sodio a pH 7.5.

3.1.3 Expresión y purificación de la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Thermus thermophilus HB27

El gen codificante para la proteína Tt27-HBDH se clonó en un plásmido pET22b para ser expresado de manera recombinante en el organismo E. coli BL21(DE3). La expresión se realizó en el medio de

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Materiales y Métodos. Métodos

30

en tampón 50 mM fosfato de sodio pH 7. La suspensión se lisó mediante 15 minutos de sonicación en ciclos de 10 segundos ON/OFF a una amplitud del 20% en un baño de agua-hielo. Posteriormente, se centrifuga el lisado a 14000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se somete a un choque térmico de 30 minutos a 70 ºC para agregar las proteínas de E. coli (105) y se vuelve a centrifugar otros 30 minutos a 14000 rpm. Finalmente, se dializa frente a 25 mM fosfato de sodio 3 pases de 2 horas cada uno. La pureza de la enzima fue analizada mediante SDS-PAGE y su concentración medida mediante el Kit BCA de Pierce®.

3.2 Determinación de las actividades enzimáticas

Todas las medidas enzimáticas de la presente Tesis Doctoral fueron llevadas a cabo en un espectrofotómetro Jasco V-730 (JASCO Analítica Spain S.L., Madrid. España). Equipado con el accesorio STR-773 que permitía el control de la temperatura y la agitación durante los ensayos enzimáticos.

𝑈𝑈

𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑚𝑚𝑒𝑒 =

∆𝐴𝐴𝑛𝑛/ min · 𝑉𝑉𝑒𝑒𝑛𝑛𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 (𝑚𝑚𝑚𝑚) 𝜀𝜀𝑛𝑛· 𝑉𝑉𝑒𝑒𝑛𝑛𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑢𝑢𝑒𝑒𝑒𝑒𝑢𝑢𝑒𝑒 (𝑚𝑚𝑚𝑚) Siendo;

ΔAn / min= Incremento de absorbancia por minuto a la longitud de onda n. ε = Coeficiente de extinción molar de los respectivos compuestos en las condiciones del ensayo en la longitud de onda n.

3.2.1 Determinación de la actividad enzimática de SuSy

La formación de UDP, que ocurre durante la síntesis de sacarosa por la enzima SuSy, se puede acoplar, en una relación equimolar, a la oxidación de NADH a través del sistema piruvato quinasa (PK)/Lactato deshidrogenasa (LDH). Esta oxidación puede seguirse espectrofotométricamente a 340 nm. El ensayo se realizó a 42 ºC en una cubeta de paso de luz de 1 cm y con agitación magnética.

Un mililitro de mezcla de reacción (400 µL de 10 mg/mL de BSA, 200 µL de PK/LD, 1 mL de 6 mM NADH, 150 µL de 40 mM PEP, 1 mL de 100 mM MgCl2 y 7.25 mL de 50 mM fosfato de sodio pH 7) se añadió a una cubeta con 200 µL de 100 mM UDP-glc, 500 µL de 800 mM de fructosa y 300 µL de muestra enzimática. Se define 1 U como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de UDP por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.2 Determinación de la actividad enzimática de BsrV

La actividad de la racemasa se determinó empleando L-arginina como sustrato. A la racemización se le acopló una deaminación oxidativa, catalizada por la enzima DAAO, y posteriormente la reacción, catalizada por HRP, del peróxido de hidrógeno producido con la o-fenilendiamina, la producción de este compuesto fue seguida por incremento de absorbancia a 450 nm (Figura 3.1).

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Materiales y Métodos. Métodos

L-aminoácido

D-aminoácido α−cetoácido BsrV

DAAO

O2 H2O2+NH4+

H2O HRP

OPDred OPDox

Incoloro Marrón

Figura 3.1. Esquema de la cascada enzimática propuesta para la síntesis de α-cetoácidos partiendo de mezclas racémicas de aminoácidos.

La mezcla de reacción consiste en 1.5 mL de 14.6 mM de L-arginina, 0.5 mL de 0.4 mg/mL OPD, 100 µL de 1 mg/mL HRP y 50 µL de 0.2 mg/mL de DAAO, todo ello en tampón 25 mM de fosfato de sodio pH 7.5, preincubado a 25 ºC. La reacción se inicia al añadir la cantidad de racemasa (máximo 0.1 U). Los ensayos se llevan a cabo a 25 ºC con agitación magnética. Se define 1 U de BsrV como la cantidad necesaria de enzima que consume 1 µmol de L-arginina por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.3 Determinación de la actividad enzimática de Tt27-HBDH

La actividad de HBDH se determinó siguiendo a 340 nm el consumo o la producción de NADH.

La reacción de oxidación se llevó a cabo con 0.5 M de (R,S)-3-hidroxibutirato de etilo y 2.5 mM de NAD+. La reacción de reducción se llevó a cabo con 0.2M de acetoacetato de etilo y 0.25 mM de NADH.

Ambas reacciones se realizaron en tampón 0.1 M fosfato de sodio pH 7 a 65 ºC. Se define 1 U de HBDH como la cantidad necesaria de enzima que consume o produce 1 µmol de NADH por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.4 Determinación de la actividad enzimática de PGA

Se determinó la actividad amidasa de la enzima empleando 0.15 mM de NIPAB como sustrato en 50 mM de tampón fosfato sódico pH 7 a 25 ºC. La hidrólisis enzimática del sustrato se determinó a 405 nm. Se define 1 U de PGA como la cantidad necesaria de enzima que hidroliza 1 µmol de NIPAB por minuto en las condiciones descritas anteriormente (108).

3.2.5 Determinación de la actividad enzimática de DAAO

Se determinó la actividad de DAAO empleando D-fenilalanina como sustrato. La mezcla de reacción consiste en 1.5 mL de 14.6 mM de L-arginina, 0.5 mL de 0.4 mg/mL OPD y 100 µL de 1 mg/mL HRP, todo disuelto en tampón 25 mM de fosfato de sodio pH 7, preincubado a 25 ºC. La aminación oxidativa se inicia con la adición de la enzima DAAO (máximo 0.1 U). La aminación

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Materiales y Métodos. Métodos

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la cantidad necesaria de enzima que oxida 1 µmol de D-fenilalanina por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.6 Determinación de la actividad enzimática de ADH2

La actividad de ADH2 se determinó siguiendo a 340 nm el consumo de NADH que se produce en la reducción de 10 mM de 2,2,2-trifluoroacetofenona en tampón 50 mM de fosfato de sodio pH 7 en presencia de 0.25 mM de NADH a 65 ºC. Se define 1 U de ADH2 como la cantidad necesaria de enzima que consume 1 µmol de NADH por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.7 Determinación de la actividad enzimática de GlyDH

La actividad de GlyDH se determinó siguiendo a 340 nm la aparición de NADH que se produce en la oxidación de 100 mM de glicerol en tampón 50 mM de fosfato de sodio pH 7 en presencia de 2.5 mM de NAD+ a 25 ºC. Se define 1 U de GlyDH como la cantidad necesaria de enzima que produce 1 µmol de NADH por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.8 Determinación de la actividad enzimática de ManDH

La actividad de ManDH se determinó siguiendo a 340 nm el consumo de NADH que se produce en la oxidación de 1.5 mM de fenilglioxilato en tampón 0.1 M de fosfato de potasio pH 7 en presencia de 0.25 mM de NADH a 30 ºC. Se define 1 U de ManDH como la cantidad necesaria de enzima que consume 1 µmol de NADH por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.2.9 Determinación de la actividad enzimática de FDH

La actividad de FDH se determinó siguiendo a 340 nm la aparición de NADH que se produce en la oxidación de 100 mM de ácido fórmico en tampón 0.1 M de fosfato de sodio pH 7 en presencia de 2.5 mM de NAD+ a 30 ºC. Se define 1 U de FDH como la cantidad necesaria de enzima que produce 1 µmol de NADH por minuto en las condiciones descritas previamente.

3.3 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática de Tt27-HBDH

La actividad de la enzima soluble se ensayó a diferentes temperaturas en 0.1 M fosfato de sodio pH 7 y diferentes temperaturas, entre 25 y 90 ºC. Los tampones empleados en la determinación de los efectos del pH sobre la enzima soluble fueron 0.1 M citrato de sodio (pH 4, 5 y 6), Tris (pH 7, 8 y 9) y bicarbonato de sodio (pH 10) y se llevaron a cabo los ensayos a 65 ºC. En todos los casos se corrigió la actividad enzimática por la actividad inespecífica producida por la descomposición del NAD(H) en las condiciones del ensayo.

3.4 Preparación de soportes de inmovilización

3.4.1 Glioxil agarosa (GX-A)

Se prepararon diferentes soportes glioxil agarosa por esterificación de la agarosa 4, 6 o 10 BCL con glicidol y posterior oxidación de los resultantes grupos gliceriles de la superficie de la agarosa con la

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