FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
POLIMORFISMO BSP1286 I DEL GEN ATP1A1 Y SU ASOCIACIÓN CON EL RASGO DE TOLERANCIA A
ESTRÉS POR CALOR EN VACAS DE LECHERÍA TROPICAL, EN VERACRUZ, MÉXICO.
TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE:
TESIS
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE
Maestro en Ciencia Animal
PRESENTA:
QC. Arely Olmos García
DIRECTORES:
Director: Dr. Antonio Hernández Beltrán Co-Director: Dr. Belisario Domínguez Mancera Director Externo: Dr. Adalberto Tejeda Martínez
VERACRUZ, VER. A 3 DE ENERO DE 2015
“POLIMORFISMO BSP1286 I DEL GEN ATP1A1 Y SU ASOCIACIÓN CON EL RASGO DE TOLERANCIA A ESTRÉS POR CALOR EN VACAS DE
LECHERÍA TROPICAL, EN VERACRUZ, MÉXICO”
por:
ARELY OLMOS GARCÍA
Tesis propuesta al Colegio de profesores del Posgrado
de la
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
de la
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
Como requerimiento parcial para obtener el grado de
MAESTRÍA EN CIENCIA ANIMAL
ENERO 2015
CONTENIDO
Dedicatoria ……….
Reconocimientos……….
Ïndice ……….
Lista de Cuadros……….
Lista de Figuras………
Resumen ………..
Abstract………..
v vi vii
ix x xi xii
DEDICATORIA
A Fátima:
Tu afecto y tu cariño son los detonantes de mi felicidad, de mi esfuerzo, de mis ganas de buscar lo mejor para ti. Aun a tu corta edad, me has enseñado y me sigues
enseñando muchas cosas de esta vida.
Te agradezco por ayudarme a encontrar el lado dulce y no el amargo de la vida.
Fuiste mi motivación más grande para concluir con éxito este proyecto de tesis.
RECONOCIMIENTOS
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana, por ser la institución que me brindo un espacio para realización de mis estudios de posgrado.
Al Dr. Antonio Hernández Beltrán, porque aun sin conocerme me brindo su confianza y apoyo para llevara a cabo y concluir este proyecto de igual manera al Dr. Belisario Domínguez Mancera y al Dr. Adalberto Tejeda Martínez por el asesoramiento en la realización de la tesis.
A la Dra. Patricia Cervantes Acosta por todo el apoyo incondicional, dedicación y tiempo invertido, por compartir conmigo su valioso conocimiento muchas gracias.
A la Dra. Lorena López de Buen, por ser parte de mi comité tutorial que con sus acertados comentarios me ayudaron a mejorar la elaboración de este trabajo.
Al gremio de investigadores de la Maestría en Ciencia Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, que contribuyeron a mi formación de posgrado y sus intervenciones durante los seminarios que me permitieron mejorar este trabajo.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por el apoyo financiero otorgado durante mi formación profesional.
A mis compañeros y hermanos de la Maestría: Margarita, Marissa, María Eugenia, Karla, Laura, Liliana, Jesús , Francisco, Rubén, Omar , Kayser y de manera especial a mis tres fantásticos: Amado, Michelle y Aida (†) por estar conmigo compartiendo momentos buenos y malos pero sobre todo apoyándome siempre los quiero.
ÍNDICE INTRODUCCIÓN
1. ANTECEDENTES
1.1 Cambio Climático 1.2 Estrés por calor
1.3 Medio ambiente y entorno animal 1.3.1 Termorregulación
1.3.2 Perdida de calor
1.3.3 Efecto del estrés en la producción y reproducción 1.4 Índice de temperatura y humedad
1.5 Respuesta animal al estrés por calor
1.5.1 Adaptación a condiciones ambientales 1.5.2 Respuesta Fisiológica
1.5.2.1. Temperatura rectal (TR) y Frecuencia Respiratoria (FR) 1.5.2.2. Otras respuestas fisiológicas
1.5.2.2.1.Condición corporal y peso corporal 1.5.2.2.2.Perfil Hemático
1.6 Estrés Oxidativo
1.6.1 Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) 1.6.2 Clasificación de los radicales libres 1.6.3 Daño Oxidativo
1.6.4 Evaluación del estrés oxidativo 1.7 Protección antioxidante
1.8 Glutatión peroxidasa 1.9 Cambios en analitos séricos
1.10 Adenosin Trifosfatasa (ATPasa): Función e importancia 1.11 Gen ATP1A1
1.12 Polimorfismo del gen ATP1A1 JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVO GENERAL Y ESPECIFICOS
1 3 5 7 7 8 9 10 11 12 12 13 13 14 15 15 16 16 17 18 20 20 21 22 23 24 25 27 28 29 30
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Ubicación del área de estudio 2.2 Animales experimentales 2.3 Variables de estudio 2.4 Época de muestreo
2.5 Recolección y procesamiento de muestras
2.6 Valores del índice de temperatura y humedad (ITH) 2.7 Evaluación de la respuesta fisiológica clínica
2.8 Determinación de condición corporal y peso corporal 2.9 Determinación de los analitos séricos Na+ y K+ 2.10 Determinación de Hemoglobina y VPC
2.11 Determinación de Glutatión peroxidasa (GSH-Px) 2.12 Polimorfismo Molecular
2.12.1 Extracción de ADN sanguíneo
2.12.2 Amplificación del ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa
2.12.3 Determinación del polimorfismo del gen ATP1A1 por la técnica de polimorfismo de longitud de cadena de restricción Bsp1286I (RFLP Bsp1286I)
2.12.4 Estandarización de revelado de geles de poliacrilamida 2.13 Análisis estadístico
2.14 Diseño experimental 3. Resultados y Discusión
3.1 Índice de temperatura y humedad (ITH)
3.2 Respuesta animal a Temperatura ambiental elevada 3.3 Determinación de polimorfismo del gen ATP1A1 4. Conclusiones
BIBLIOGRAFÍA
30 30 31 32 32 33 33 33 34 34 34 35 35
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37 38 38 39 41 41 42 44 51 52
LISTA DE CUADROS
CUADRO 1. Índice de Temperatura y Humedad (ITH)………
CUADRO 2. Cambios en medidas de variables fisiológicas en vacas Holstein, Jersey y Cebú lechera australiana expuestas a estrés por calor………..
CUADRO 3. Principales especies reactivas de oxigeno………
CUADRO 4. Clasificación de antioxidantes según su origen………....
CUADRO 5. Promedio, desviación estándar y rango de la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa en grupos de animales de rebaños lecheros………
CUADRO 6. Protocolo de amplificación por PCR y secuencia de oligonucleótidos para el locus ATP1A1………
CUADRO 7. Protocolo de preparación de la solución amortiguadora para la amplificación de ADN sanguíneo GoTaq Flexi DNA PROMEGA®………
CUADRO 8. Temperaturas de amplificación por PCR para el locus ATP1A1 de acuerdo a lo indicado por Eguiarte et al (2007)……….
CUADRO 9. Frecuencias genotípicas obtenidas para el gen ATP1a1 en dos hatos de vacas de lechería tropical. ………
CUADRO 10. Frecuencias génicas obtenidas para el gen ATP1a1 en dos hatos de vacas de lechería tropical……….
CUADRO 11. Valores hemáticos (media ± DE) de dos épocas en vacas de lechería tropical……….
CUADRO 12. Concentraciones séricas de Sodio (media ± DE) de dos épocas en vacas de lechería tropical……….
CUADRO 13. Concentraciones séricas de potasio (media ± DE) de dos épocas en vacas de lechería tropical………
CUADRO 14. Actividad enzimática de Glutatión peroxidasa (media ± DE) de dos épocas en vacas de lechería tropical……….
CUADRO 15. Condición corporal (media ± DE) de dos épocas en vacas de lechería tropical……….
11
14 18 21
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36
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Modelo de respuesta para animales de granja con desafío térmico ambiental ………
FIGURA 2.Termorregulación en el ganado bovino………
FIGURA 3. Gen ATP1A1 ………
FIGURA 4. Diseño experimental ………
FIGURA 5. Índice de Temperatura y Humedad (ITH) presentados en las épocas de mayor y menor confort……….
FIGURA 6. Efecto del Índice de Temperatura y Humedad (ITH) en la frecuencia respiratoria (movimientos respiratorios/minuto) y la temperatura rectal (°C) en vacas de lechería tropical………
FIGURA 7. Patrón electroforético para gel del gen ATP1a1 en vacas de lechería tropical en Veracruz, México………
FIGURA 8. Perfiles del gen ATP1a1 presentados en dos hatos de vacas de lechería tropical (Técnica PCR-RFLP)………
6 9 24 40
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RESUMEN
Olmos García, Arely. Maestría en Ciencia Animal. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Julio 2014. POLIMORFISMO BSP1286 I DEL GEN ATP1A1 Y SU ASOCIACIÓN CON EL RASGO DE TOLERANCIA A ESTRÉS POR CALOR EN VACAS DE LECHERÍA TROPICAL, EN VERACRUZ, MÉXICO.
Asesores: Dr. Antonio Hernández Beltrán, Dr. Belisario Domínguez Mancera y Dr.
Adalberto Tejeda Martínez.
El objetivo del estudio fue evaluar la asociación de las variantes polimórficas del gen ATP1A1 a variaciones de ITH (Índice de Temperatura y Humedad), respuesta fisiológica y al perfil metabólico energético en vacas de lechería tropical. El estudio se realizó en vacas de un solo grupo racial: Bos taurus x Bos indicus (Bt x Bi) (n=122) en dos hatos del estado de Veracruz – Zona Centro y Sotavento, durante la época de mayor y menor confort ambiental. Las vacas se estudiaron durante las épocas de invierno y verano. En cada época se determinó el ITH, se recolectó muestras de sangre y se evaluó la respuesta fisiológica por temperatura rectal (TR) °C y frecuencia respiratoria (FR) respiraciones/min. Se obtuvo la concentración sérica de Sodio (Na+) mmol/L; Potasio (K+) mmol/L; y Glutation Peroxidasa (GSH-Px) U/gHb, por espectrofotometría UV, la condición corporal (CC) en escala 1 – 9 y los valores hemáticos por volumen de paquete celular (VPC) % y hemoglobina (Hb) mg/dL, así mismo se determinó las variantes de la polimerasa y polimorfismo de Longitud de Cadena de Restricción (PCR – RFLP). Con el paquete estadístico Statistica® v.10, se realizó el análisis de varianza con un modelo factorial. Durante la época de mayor confort el ITH fue en lo general de confort (ITH < 74), mientras que en la época de menor confort no se encontró confort animal (ITH > 74), que indica condición de estrés por calor, reflejado en el aumento de la TR y la FR. Del polimorfismo del gen ATP1A1, solo se encontró el genotipo heterocigoto AB, que indica la variabilidad del gen ante la presencia de los 2 alelos A y B. La condición metabólica de ambos hatos resultó de acuerdo con los valores de referencia y las diferencias se atribuyen a la época y factores de manejo. Se concluye que el genotipo heterocigoto del gen ATP1A1 (AB), favoreció la capacidad de termotolerancia en las vacas estudiadas.
ABSTRACT
Olmos García, Arely. Master of Animal Science. Faculty of Veterinary Medicine, Universidad Veracruzana. July 2014. POLYMORPHISM BSP1286 I ATP1A1 GENE AND ITS PARTNERSHIP WITH THE FEATURE OF HEAT STRESS TOLERANCE IN TROPICAL DAIRY COWS IN VERACRUZ, MEXICO. Advisors: Dr. Antonio Hernández Beltrán, Dr. Belisario Domínguez Mancera Martínez and Dr. Adalberto Tejeda.
The aim of the study was to evaluate the association of polymorphic variants of ATP1A1 gene variations ITH ( Temperature and Humidity Index ) , physiological response and energy metabolic profile in dairy cows tropical al. The study was conducted in cows of one racial group : Bos taurus x Bos indicus (Bt x Bi ) (n = 122 ) in two herds in the state of Veracruz - Downtown Area and Sotavento, during times of major and minor environmental comfort . The cows were studied during winter or summer. In each time was determined ITH , blood samples were collected and the physiological response by rectal temperature (RT ) ° C and respiratory rate (RR ) breaths / min was evaluated . The mmol / L serum sodium ( Na+ ) was obtained ; Potassium ( K+ ) mmol / L ; Glutathione peroxidase and ( GSH -Px ) U / GHB , UV spectrophotometry , body condition (CC ) scale 1-9 hematology and packed cell volume ( VPC ) % and hemoglobin ( Hb) mg / dL , and variants thereof and polymerase chain length polymorphism Restriction (PCR- RFLP ) was determined . In Statistica® v.10 statistical package , analysis of variance with a factorial model was performed. During the period of greatest comfort ITH was in general comfort (ITH <
74 ) , while in the period of least expect it not cow comfort found (ITH > 74 ) , indicating a condition of heat stress , reflected in the increased TR and FR . ATP1A1 gene polymorphism , only the AB heterozygote , indicating the variability of the gene in the presence of two alleles A and B was found both Metabolic herds condition was according to the reference values and the differences are attributed to the time and management factors . We conclude that the heterozygous genotype ATP1A1 gene (AB) , favored the ability to thermotolerance in cows studied.
INTRODUCCIÓN
La influencia del clima en la producción bovina ha sido reconocida desde hace mucho tiempo, así entonces la fisiología, el comportamiento y la salud del ganado son marcadamente influenciados por el medioambiente en el cual el ganado vive (MAFF, 2000). Entre los factores climáticos que conforman el medio ambiente, la temperatura es uno de los que pueden limitar o condicionar una serie de procesos biológicos (Ferreira et al., 2006).
En ciertas ocasiones los animales sufren estrés debido a las oscilaciones en las temperaturas o bien por una combinación de facto res negativos a los que se someten durante un corto período de tiempo, los animales hacen frente a estos períodos desfavorables primordialmente a través de modificaciones fisiológicas y de comportamiento. Así, en la mayoría de los casos esta respuesta se manifiesta en cambios en los requerimientos de nutrientes, siendo el agua y la energía los más afectados (Bicudo et al., 2002 ; Brown-Brandl et al., 2004).
González - Páez (2009), menciona que entre el 35 y 40 % de la energía que los bovinos consumen diariamente se convierte en calor, por lo que al encontrarse en un medio ambiente con temperaturas superiores a 27 °C, parte de la energía destinada a producir leche y carne en temperaturas más confortables se destina a mecanismos de autorregulación, lo cual propicia la disminución en las tasas de crecimiento y producción láctea (Elvinger et al.,1992), además de ocasionar la alteración de las funciones reproductivas y de la secreción de hormonas tiroideas, como respuesta al estrés calórico (Al - Hadary et al., 2001).
Este fenómeno ocasiona reducciones severas en consumo voluntario, aumento en la frecuencia respiratoria, expresada en jadeo y aumento hasta de un grado Celsius, en las temperaturas rectal y timpánica (Lough et al., 1990).
El ganado del trópico tiene una habilidad termorreguladora mayor que la del ganado europeo, lo cual debe ser resultado de la reducida producción de calor, así como de una mayor capacidad para liberar calor hacia el medio ambiente o una combinación de ambas (Hansen, 2004).
Por otro lado, a partir del reconocimiento internacional sobre cambio climático presente y futuro, ha surgido la necesidad de realizar estudios dirigidos a identificar marcadores fisiológicos, metabólicos y moleculares, que posibiliten definir características genéticas de adaptación animal frente a nuevas condiciones como el estrés por calor, preservando sus cualidades productivas y procurando su bienestar (Verde et al., 2011).
Se conoce muy poco sobre los efectos del estrés por calor a nivel celular, sin embargo se sabe la presencia de moléculas relacionadas al estrés térmico. Existen diferentes estudios en donde se determina su posible asociación con características de tolerancia al calor en vacas lecheras (Kregel, 2002).
Estudios mostraron que el estrés por calor influye a nivel plasmático en las concentraciones de Na+ y K+, y que estas son correlativas con el estrés oxidativo que ocurre después de el estrés por calor
Por tal motivo el gen ATP1a1 bovino representa un pausible indicador de resistencia a condiciones de temperatura elevada y puede ser utilizado para la selección de genotipos resistentes a las condiciones del trópico (Liu et al., 2011).
ANTECEDENTES
1.1. Cambio climático
El cambio climático es definido como un conjunto de condiciones climáticas que se presentan en un periodo prolongado, en el cual se describen cambios en la temperatura, la radiación solar, la sanidad y temperatura del mar, en el ciclo del agua con aumento de precipitaciones, entre otros (IPCC,2007).
De acuerdo con Gay (2000), algunos estudios recientes de organismos como la Organización Meteorológica Mundial (OMM) y el panel Intergubernamental sobre cambio climático (IPCC) han detectado que la temperatura de la tierra ha aumentado 0.7°C durante los últimos 150 años, las temperaturas mínimas del invierno se elevaron casi 3°C y las temperaturas máximas de la primavera se incrementaron 1.4°C en el hemisferio norte; aunque los cambios en la temperatura varían geográficamente y tienden a ser mayores durante los meses más fríos (McCarty, 2001) Lo que coincide con el incremento de un 30% en las concentraciones atmosféricas de bióxido de carbono (CO2) en el mismo periodo.
En los últimos años, las variaciones en el clima han dejado de ser un hecho cotidiano y se han convertido en una preocupación constante entre los productores de carne y leche. El cambio climático está empezando a causar molestias asociadas con el aumento de los gases de efecto invernadero (Salazar et al., 2008).
Las consecuencias de las variaciones climáticas sobre la producción de vacuno lechero son bien conocidas por los ganaderos. Los ambientes extremos afectan negativamente al organismo animal repercutiendo en la expresión del potencial productivo. Los efectos del clima sobre los animales están mediados por cambios
metabólicos, fisiológicos y de comportamiento, y son más o menos acentuados en función de factores como: raza, edad, nivel productivo y características individuales (Johnson 1987). El calor tiene efectos adversos sobre la producción de leche y la reproducción sobre todo en los animales de mayor potencial productivo (West 2003).
Por otro lado, la adaptación al medio ambiente cambiante supone variaciones en las necesidades energéticas de mantenimiento (Blaxter 1964).
En los años 90s, los primeros escenarios regionales de cambio climático se crearon en el país de México (Conde et al., 1994, 2000; Gay, 2000). En estos estudios, los escenarios de temperaturas extremas, precipitación y radiación solar se generaron para duplicar las condiciones del dióxido de carbono (CO2), basados en el escenario obteniendo de forma normal del período 1941-1970 para 23 sitios en México.
Posteriormente, Conde et al. (1995) y Magaña et al. (2000) crearon escenarios base de la temperatura y la precipitación a partir de la media normal mensual de la temperatura y la precipitación a partir del período 1951-1980.
Recientemente, a partir de los modelos del Centro Canadiense del Clima (CCC) y el Geophysical Fluid Dynamics Laboratory (GFDLR30), Conde et al. (2000) hicieron escenarios de posibles cambios en la temperatura y precipitación para México y también para condiciones de CO2 atmosférico. Los resultados de los modelos citados muestran que las temperaturas podrían aumentar entre 1 y 2 º C para el modelo CCC, mientras que los cambios en el modelo GFDLR variará entre 2 y 3 º C.
En el estado de Veracruz, los estudios de impacto ante los posibles escenarios de cambio climático son de interés por las modificaciones del ciclo hidrológico y su impacto en la agricultura y ganadería, así como en sus recursos forestales y el control de inundaciones, presencia y propagación de enfermedades; por lo que iniciaron en México estudios de impacto por cambio climático, que apuntan a los daños de infraestructura de las costas veracruzanas por un posible aumento del nivel del mar y concluyen que existe una situación de vulnerabilidad tanto para la infraestructura de las comunidades como para la agricultura regional. (Conde y Palma, 2007; Barradas et al., 2010; Méndez et al., 2010).
Torres et al. (2010), en un estudio realizado sobre tendencias climáticas en el estado de Veracruz, analizaron los índices de cambio climático obtenidos a partir de datos de temperatura superficial del mar, así como de la presión en la superficie y corroboran
la evidencia de tendencia a condiciones más cálidas en años recientes, aumento en la frecuencia de días calurosos y disminución en días frescos.
En este sentido Hernández et al (2011). Presentan el análisis de temperaturas (ºC) y humedad relativa (RH) combinados, para obtener el índice de temperatura y humedad (THI por sus siglas en inglés) en ganado para la región de Veracruz, con el propósito de hacer futuros escenarios a 2020, 2050 y 2080. Dichos resultados indican que las posibilidades de confort animal son reducidas para el futuro. Los THI fueron obtenidos a partir de los escenarios de emisiones A2 y B2 del IPCC para los modelos GFDL 2020 (80.87), 2050 (81.58), 2080 (82.82); ECHAM 2020 (81.27).
Así mismo, Salazar et al., 2008, mencionan que en la región Veracruz, México, la ganadería bovina se desarrolla con un clima que ofrece reducido confort para los animales y se ve que esta condición se ha agravado en los últimos años (1990-2008).
Además, al realizar proyecciones de los escenarios de cambio climático de algunos municipios del estado de Veracruz, muestran incrementos en la temperatura para el año 2020, siendo más importantes en épocas de verano, donde la zona centro sería la más comprometida, seguida de la zona sur. De acuerdo a esto la Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales en la Cuarta Comunicación Nacional ante la Convención Marco de las Naciones Unidas sobre el Cambio climático 2010, se refiere al sector ganadero y considerando el indicador confort (ITH), se mencionan que entre los meses de abril y octubre es posible que se presenten en el centro de Veracruz situaciones que afecten el confort animal bajo escenarios de cambio climático.
Debido a esto, se plantea como estrategia de adaptación contra los efectos del cambio climático, la conservación de recursos genéticos locales, los cuales ya se encuentran adaptados a condiciones donde se desarrollan (Hoffman, 2010; Berman 2011).
1.2. Estrés por calor
Estrés, es definido como una respuesta biológica provocada, que se da cuando el individuo percibe alguna amenaza frente a su homeostasis, la amenaza que lo causa es conocida como estresor y dependiendo de su duración puede darse un estrés agudo a crónico. En un animal el estrés también se define como la incapacidad para
hacer frente a su entorno, a la incapacidad de adaptarse al medio ambiente y de poder reproducirse de manera efectiva (Dobson y Smith 2000; Borell et al., 2007) El estrés por calor ocurre cuando alguna de las condiciones ambientales como la temperatura del aire, la humedad relativa, el movimiento del aire y la radiación solar causan que la temperatura efectiva del ambiente sea más alta que la zona termoneutral o de confort (Srikandakumar, 2004). Por lo que la combinación de temperatura ambiente y la humedad relativa es la que determina la sensación térmica externa de la vacas. La figura 1 ilustra un modelo de la respuesta animal al estrés calórico (Nienaber y Hanh, 2007).
FIGURA 1. Modelo de respuesta para animales de granja con desafío térmico ambiental. Adaptado de Nienaber y Hanh (2007).
En climas calurosos y húmedos los animales tienen problemas para perder calor, ya que el enfriamiento por evaporación no es eficaz; en el caso de los bovinos, al ser
animales homeotermos, mantienen su temperatura corporal constante a pesar de los cambios considerables de temperatura ambiental, permitiéndoles vivir en ambientes variados (Cunningham et al., 2009)
El régimen alimenticio de la vaca determina también un mayor o menor calor corporal, así mismo influye la agitación a la que está expuesto el animal en el sentido de su manejo y traslado (Moriya, 2000).
1.3. Medioambiente y entorno animal
Hay ocasiones en la que los animales sufren estrés debido a las oscilaciones en las temperaturas o bien por una combinación de factores negativos a los que se someten durante un corto periodo. Algunos de estos factores climáticos que repercuten en el desempeño productivo y reproductivo de los bovinos en condiciones tropicales son:
temperatura, velocidad del viento, humedad, precipitación, radiación solar, nubosidad y presión atmosférica. La temperatura ambiental es el factor más importante que limita el bienestar animal, y al modificarse afecta el confort de los animales homeotermos, como es el caso de los bovinos (Córdova et al., 2010). Los animales hacen frente a estos eventos desfavorables primordialmente a través de modificaciones fisiológicas y de comportamiento (Arias, 2008).
Cuando la temperatura del aire es baja, el calor del animal fluirá hacia el exterior provocando falta de confort y reduciendo la eficiencia reproductiva del animal. Por otro lado la humedad relativa es otro factor climático importante ya que afecta reduciendo notablemente la tasa de pérdida de calor. Si la humedad es alta (zonas cálidas y húmedas), la evaporación tiende a ser lenta, de esta manera el equilibrio térmico del animal estará afectado (Renaudeau et al., 2011)
De acuerdo con Nienaber y Hanh (2007), las respuestas de los animales varían de acuerdo al tipo de desafío térmico que presenten: cambios adaptativos a corto plazo (de comportamiento, fisiológicos e inmunológicos.) son la respuesta inicial a eventos agudos mientras que desafíos de mayor duración impactan en respuestas orientadas al desempeño(se altera el consumo voluntario y se afecta el crecimiento, reproducción y eficiencia reproductiva).Al mismo tiempo, los animales de granja pueden minimizar los efectos adversos y compensar el desempeño reducido durante
desafíos térmicos moderados mediante mecanismos de adaptación. La tasa respiratoria es una alerta temprana del incremento del estrés calórico y aumenta marcadamente intentando disipar el exceso de calor mediante la vaporización respiratoria; también hay un decremento en el consumo voluntario a medida que la temperatura corporal aumenta como consecuencia de la temperatura ambiental, lo cual reduce su desempeño productivo y reproductivo además de amenazar su salud y bienestar si las condiciones adversas persisten.
Blanco (2009), precisa que, en ganado lechero, el nivel óptimo de temperatura ambiente para obtener los mejores resultados oscila entre los 13 y 20°C, con temperaturas por debajo de 13°C, el animal sufre de estrés por frío, por el contrario, cuando la temperatura fluctúa entre 20 y 24°C. El animal inicia su utilización de medios para disipar el calor corporal, y a temperaturas por sobre 25°C, el animal se encuentra en estrés por calor (Araujo, 2011).
1.3.1 Termorregulación
La termorregulación es el balance entre la producción de calor y los mecanismos de pérdida de este, manteniendo la temperatura corporal constante. Por tal motivo, la temperatura en el organismo, depende de la entrada (metabolismo de carbohidratos, grasas y proteínas) y la salida del calor (Cunningham et al., 2009; Renaudeau et al., 2011).
Los rumiantes tienen la habilidad de controlar su temperatura corporal dentro de un ajustado margen a través de diferentes procesos fisiológicos (Bianca 1968). Para mantenerse dentro de esta condición los animales necesitan ganar o perder calor del medio ambiente circundante (Bianca 1968, Silanikove 2000).
La zona de termoneutralidad se refiere al rango de temperatura ambiente donde la producción de calor es normal en el animal y puede compensar las pérdidas al ambiente, sin necesidad de incrementar su metabolismo, por debajo de la zona optima donde la productividad, eficiencia son máximos. Está, la zona fría y es cuando el individuo utiliza mecanismos fisiológicos para conservar el calor y por encima se encuentra la zona cálida, donde el animal aumenta la perdida de calor y se dan respuestas fisiológicas, cuando el aumento es muy marcado y es el momento en que el animal se encuentra en estrés hipertérmico severo que puede llegar a ser mortal (Martinez,2006; Renaudeau et al., 2011).
1.3.2 Pérdida de calor
El animal puede perder calor por diversas formas: radiación, convección, evaporación y conducción (figura 2). La radiación que es de tipo solar e infrarrojo, se da en la diferencia de temperatura entre la superficie corporal y las superficies circundantes, incluyendo el aire, puede ser de pérdida de calor o de incremento. La convección se da en función de la diferencia de temperatura entre la piel del animal y el aire que lo rodea y la velocidad de este. La conducción se refiere a la perdida de calor entre la superficie corporal y alguna superficie de contacto como el piso, el lodo, paredes, entre otras. La evaporación está en función de la temperatura del aire y de la presión de vapor de agua y tiende a ser más importante a medida que la temperatura ambiente aumenta y se acerca a la corporal, es así la única forma de perder calor cuando la temperatura ambiental supera a la del cuerpo (Radostits et al., 2002;
Martínez, 2006; Cunningham et al., 2009).
La temperatura corporal es regulada a través de sensores de temperatura que se localizan en varias regiones del cuerpo y que son los que transmiten la información al cerebro y se inician los mecanismos para aumentar la pérdida del calor, las neuronas sensibles al calor se localizan en el núcleo pre-óptico del hipotálamo, que en respuesta al calor inician los mecanismos de pérdida de calor como vasodilatación periférica y sudoración, además de jadeo (Cunningham et al., 2009).
FIGURA 2. Termorregulación en el ganado bovino (adaptado de Meat & Livestock, 2002).
Se debe considerar que en áreas tropicales muy húmedas, el proceso de evaporación puede ser menos eficiente para la perdida de calor (Renaudeau et al., 2011).
En bovinos, se describe la tolerancia al estrés por calor durante su evolución por separado de Bos taurus y Bos indicus, los animales cebuínos adquirieron genes que confieren termotolerancia en lo fisiológico y a nivel celular (Hansen, 2004).
1.3.3 Efecto del Estrés en la producción y reproducción.
Chaiyabutr et al. (2008) y Bernabucci et al. (2010) indican que, en vacas el estrés por calor reduce la producción de leche 14% en lactación temprana y 35% en el periodo intermedio de lactación, este efecto negativo en la producción láctea es explicado por la reducción en el consumo de nutrientes.
En un estudio realizado en EE.UU. se muestra que existe una correlación inversa entre la resistencia al estrés por calor y la producción láctea en vacas Holstein (Sánchez et al., 2009). El efecto del estrés en la producción láctea se debe al incremento en el gasto energético de mantenimiento, a que el animal reduce el consumo de materia seca, perdida de agua y minerales, a la alteración de equilibrio ácido-básico, modificación de flujo sanguíneo a órganos y cambios bioquímicos hormonales (Martínez, 2006).
Se realizaron diversos programas de cruzamiento con el objetivo de mejorar la tolerancia al calor en bovinos de leche entre animales de alto rendimiento lechero y razas adaptadas localmente, lo cual resultó siendo de poco beneficio, reduciendo la capacidad de producción de leche en comparación con las razas de alto rendimiento (McDowell et al., 1996). Mientras se continúe seleccionando animales por la producción láctea, los animales serán más sensibles al estrés por calor (Misztal et al., 2008).
De la misma forma, la reproducción se ve comprometida por el calor prolongado, y el estrés por calor es un factor importante responsable de la baja fertilidad, además se observa presencia de abortos y mortalidad embrionaria en vacas durante y después de los meses de verano en la mayoría de países, estos efectos se ven reflejados en
pérdidas económicas significativas para los hatos productivos (Radostits et al., 2002;
Moghaddam et al., 2009; Crescio et al., 2010).
1.4 Índice de Temperatura y Humedad
El valor del Índice de Temperatura y Humedad propuesto por Thom (1959) integra los valores meteorológicos de la temperatura y humedad de una zona dada para establecer el grado de confort de un individuo o un grupo animal.
El ITH ha llegado a ser un estándar en las prácticas de manejo del ganado bovino en las últimas décadas y existen a la fecha tablas y rangos que permiten predecir eventuales riesgos de estrés por calor. La caracterización del ambiente térmico de un lugar, permite conocer las condiciones (normal o de confort, de estado de alerta, peligro o emergencia) en que se desenvuelven los animales (Gaughan et al., 2008) Nienaber y Hanh (2007) propusieron una escala donde el tipo de confort se asocia con situaciones que sugieren a los productores un determinado tipo de respuesta al agente estresante (Cuadro 1).
CUADRO 1. Índice de Temperatura y Humedad (ITH) (Nienaber y Hanh, 2007).
El ITH se ha utilizado para tomar decisiones de manejo basadas en información climatológica y meteorológica, logrando así una objetiva consideración de diferentes alternativas de manejo.
El ITH es calculado por la medición de la temperatura ambiental y la humedad relativa, bajo la siguiente formula (Valtorta et al., 2000)
ITH =[1.8 * TA + 32) – ((0.55-0.55 * HR / 100) * (1.8* T – 26.8)
Donde:
TA= Temperatura ambiental (°C) HR= Humedad Relativa (%)
Cuando el ITH es menor o igual a 74 se considera que no hay estrés por calor, que el animal se encuentra en condiciones de confort, cuando es mayor a 74, indica que está en condiciones de estrés, dando diferentes estados: alerta entre 75 y 78; peligro entre 79 – 83, mientras que el estado de amenaza es mayor o igual a 84 (Valtorta et al., 2000)
1.5 Respuesta animal al estrés por calor
1.5.1. Adaptación a condiciones ambientales
La adaptación es la modificación de un organismo o alguna parte de este, para adecuarse a las condiciones de su entorno o del medio ambiente. Al mencionar adaptación en zonas tropicales, se define como la capacidad de un animal de sobrevivir y reproducirse bajo condiciones severas y en ambientes naturales, la adaptación debe darse bajo estrés por calor, enfermedades parasitarias y enfermedades comunes en zonas tropicales, la complejidad de estas condiciones severas, permite observar diferentes genotipos con grado de adaptación (Regitano, et al., 2006)
Adaptación en el contexto de cambio climático, se describe como el grado en que los ajustes son posibles en las prácticas o estructuras dentro de un sistema, en respuesta a los cambios reales o proyectados en el clima (Watson, et al., 2006).
Las diferentes especies de mamíferos desarrollan en el proceso de la adaptación muchas formas de lidiar con el estrés, y a nivel celular incluyen modificaciones temporales en la expresión genética para sobrevivir a los cambios de su entorno, así como la alteración de la estructura y la función celular, para hacer frente a condiciones adversas permanentes (Kregel,2002).
La capacidad celular para resistir y adaptarse rápidamente a condiciones ambientales estresantes para el individuo, es uno de los principales requisitos para el desarrollo de organismos durante la evolución. Los cambios de temperatura, son algunos de los factores más comunes, donde las células tienen una respuesta para poder preservar su integridad estructural y enzimática (Coronato et al., 1999).
1.5.2 Respuesta Fisiológica
1.5.2.1 Temperatura rectal (TR) y Frecuencia Respiratoria (FR)
Los valores de referencia para Frecuencia respiratoria y Temperatura rectal en bovinos son de 20 – 30 rpm y de 37.9 – 39.2 °C respectivamente, en animales con choque térmico o golpe de calor, la elevación de la temperatura corporal es la primera reacción clínica observable cuando la temperatura rectal llega a los 39.5 °C. En la mayoría de los casos la temperatura supera los 42°C y puede alcanzar un valor de 43.5°C (Radostits et al., 2002).
Principalmente, aparece un aumento de la frecuencia cardiaca y respiratoria con un pulso débil de gran amplitud, sudoración, salivación, seguido de ausencia marcada de sudoración. El animal puede estar al inicio inquieto pero pronto se vuelve torpe, tropieza al andar y tiende a echarse. Cuando la temperatura corporal sobrepasa los 41°C se observa dificultad al respirar, volviéndose taquipneica e irregular y el pulso muy rápido y débil, estos signos habitualmente se acompañan de colapso, convulsiones y coma terminal (Radostits et al., 2002; Bernabucci et al., 2010)
Srikandakumar y Johnson (2004), evaluaron la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal en tres razas: seis vacas Holstein, seis Jersey y seis vacas cebú lecheras australianas, en 2 meses del año con ITH de 72 el primero (frío) y con ITH de 93 (calor) el segundo, se determinó que el estrés por calor tiene efecto en el incremento de la temperatura rectal y la frecuencia respiratoria en las 3 razas, se observa que en las vacas Holstein y Jersey los incrementos en los valores de la temperatura rectal y frecuencia respiratoria fueron mayores.
CUADRO 2. Cambios en medidas de variables fisiológicas en vacas Holstein, Jersey y Cebú lechera australiana expuestas a estrés por calor (Srikandakumar y Johnson,
2004).
En un estudio realizado en el Estado de Veracruz, donde se determinó que con un ITH de 83 (peligroso), las vacas 5/8H x 3/8C, muestran una mayor temperatura rectal que aquellas vacas F1 (1/2H x 1/2C) (Muhlach et al., 2010)
En otro estudio realizado en México por Espinoza et al. (2011), sobre la tolerancia al calor y humedad atmosférica de diferentes grupos raciales: Bovino Criollo (Chinampos), Charolais x Brahaman, Holstein y Jersey, se comparó las respuestas fisiológicas temperatura rectal y frecuencia respiratoria, registrando el ITH, se observó que al aumentar el ITH las vacas Jersey y Holstein muestran un aumento significativo en la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal aumentó más en vacas Holstein que en la raza Criolla Chinampos con lo cual se concluyó que los grupos raciales más tolerantes al estrés por calor, determinado con base en la frecuencia respiratoria y temperatura rectal fueron las vacas Chinampos y Charolais x Brahaman.
1.5.2.2 Otras Respuestas Fisiológicas
1.5.2.2.1 Condición corporal y peso corporal
La condición corporal se basa en la cantidad de grasa subcutánea y tejido muscular, ésta es indicativa del estado de nutrición animal y de su reserva de energía, si bien es un ensayo subjetivo que combina la palpación en áreas anatómicas determinadas con la observación visual se ha convertido en una calificación valiosa para la determinación de la relación entre el depósito de grasa corporal y la utilización de energía a partir de la capacidad de su movilización (Plaizier et al., 2000).
Se ha hecho necesario contar con un sistema de evaluación apropiado a las condiciones del sistema de manejo de doble propósito debido a las diferencias entre genotipos la proporción de grasa almacenada en los depósitos corporales de acuerdo a la raza y al sistema de producción (Plaizier et al., 2000). Fox et al.,(1992) empleando el programa Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS) pudieron correlacionar la reserva de energía con un valor para estimar los requerimientos nutricionales de los animales como una calificación previa a la movilización asociándola al peso corporal por lo que es recomendable utilizar ambos valores de predicción metabólica en estudios de respuesta animal.
1.5.2.2.2 Perfil hematológico
Con respecto a los reportes de variaciones en el perfil hemático, según lo descrito por algunos autores se produce incremento en los valores de hemoglobina, atribuido a la hemoconcentración por la deshidratación previa (Srikandakumar y Johnson, 2004).
La mayoría de los perfiles incluyen determinaciones de hemoglobina y volumen del paquete celular a causa de las interrelaciones que establecen con la mayoría de metabolitos. Los valores pueden variar por la edad, el parto y las variaciones diurnas
y estacionales; se postula que la hemoglobina es menor en los primeros meses de vida, en la gestación (primera etapa), en el parto y en la lactación (temprana), están relacionados a menores concentraciones de hemoglobina y la variabilidad estacional los que tienen que ver con los cambios dietéticos que se producen en las diferentes épocas y el tipo de alimento existente. La baja en la hemoglobina y hematocrito, indica un cuadro de anemia, que pueden estar relacionados con la deficiencia nutricional, hemolisis, parasitosis e infecciones (Álvarez, 2001).
1.6. Estrés oxidativo
Ante incrementos anómalos en la temperatura, se produce una mayor cantidad de especies reactivas de oxígeno (ERO) (Fitt et al., 2001) esta sobreproducción de ROS genera estrés oxidativo al incrementar la cantidad de radicales O2–; esto compromete la funcionalidad de la célula (Lesser, 2006).
El estrés oxidativo se produce cuando existe un desequilibrio bioquímico ocasionado por la producción excesiva de especies reactivas de oxigeno (ERO), los cuales exceden la capacidad antioxidante de un organismo, provocando daño oxidativo a las biomoléculas (Chihuailaf et al., 2002; Sánchez et al., 2004).
La disminución en la defensa antioxidante como causa de la aparición de un estrés oxidativo, durante la gestación y el momento perinatal es una razón necesaria para establecer qué papel juega el estrés oxidativo en la fisiopatología de las enfermedades que afectan al ganado vacuno, tanto desde su nacimiento como durante la gestación e inicio de la lactación, abordando también las consecuencias que ese estado de estrés no contrarrestado puede tener sobre la salud del individuo(Castillo et al., 2001).
1.6.1 Especies reactivas al oxígeno (ERO)
Las ERO se producen debido a que diversas rutas en la reducción del oxígeno tienen el potencial para producir radicales libres (RL) muy reactivos que dañan las células;
un RL es cualquier componente que puede contener uno o más electrones sin división
y pueden existir de forma independiente, son capaces de provocar inestabilidad y un aumento en la reactividad (Cerolini et al., 2001; Membrillo et al., 2003; Martínez, 2005).
Los RL es un intento de completar sus pares de electrones interaccionan con moléculas adyacentes, donde una de ellas cede electrones libres y otra los recibe (proceso denominado oxido-reducción), y forman en una reacción en cadena nuevos radicales libres (Chihuailaf et al., 2002; Sánchez et al., 2004).
Los RL se forman normalmente en el cuerpo, las fuentes más importantes son el metabolismo anaeróbico a través de la cadena de transporte de electrones a nivel mitocondrial, así como la oxidación de los ácidos grasos, reacciones del citocromo P450 y las células fagocitarias como neutrófilos, monocitos, macrófagos, eosinófilos y las células endoteliales (Olguín et al., 2004)
Los RL se deben considerar como benéficos o tóxicos, dependiendo de su concentración y de los mecanismos antioxidantes que los produzcan (Chihuailaf et al., 2002).Afortunadamente los organismos aeróbicos poseen un sistema antioxidante protector que limita la acción nociva de los radicales libres. Este sistema protector se compone de enzimas y nutrimentos esenciales cuya función es evitar la formación de radicales libres, capturar aquellos que se han formado y remover o reparar las biomoléculas dañadas (Larkins, 1999).
1.6.2 Clasificación de los radicales libres
Según Miller et al. (1993).Debido a la relevancia del oxígeno en los procesos aeróbicos, los radicales libres con oxígeno reactivo son los más comunes, la mayoría de ellos proceden de las reacciones metabólicas normales y se pueden incrementar por efecto de factores exógenos.
Las principales ERO que se conocen son: el anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y la mayoría de radicales hidroxilos (cuadro 3). El H2O2 no posee electrones libres y por lo tanto no es un RL, sin embargo, es una molécula muy reactiva y puede ser precursora de radicales libres –OH en presencia de metales de transición (Hicks, 2001).
CUADRO 3. Principales especies reactivas de oxígeno.
ERO Particularidades
Anión superóxido (-O2) Formado en reacciones de autoxidación (flavoproteínas, ciclo redox).
Radical hidroxilo (OH) Formado en las reacciones de Fenton o en la de Haber- Weiss catalizada por metales (hierro).
Óxido nítrico (NO) Producido por la unión del oxígeno con el nitrógeno, induciendo lipoperoxidación lipídica.
Oxígeno (1O2) Es el oxígeno molecular simple, el primer estado excitado. Se forma por la activación del O2 (luz solar, radiaciones).
Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Formado a partir de la dismutación del -O2 o puede proceder directamente del O2.
(Castillo et al., 2001)
Las fuentes exógenas incrementan en forma notable la producción de las ERO se ha establecido que altas ingestas de algunos metales de transición como el Fe y Cu promueven la generación de radicales libres a partir de peróxidos (Polack et al.
2000). La capacidad de estos iones para aceptar y donar electrones constituye la base para la formación y propagación de muchas reacciones tóxicas. Otras fuentes exógenas descritas son la radiación, algunos solventes orgánicos y pesticidas, los productos de la oxidación de lípidos en alimentos, la radiación solar, las micotoxinas, el trauma, la hiperoxia y el sobre ejercicio (Koracevic et al. 2001).
1.6.3 Daño Oxidativo
Un estrés oxidativo induce en la célula efectos perjudiciales por oxidación de lípidos, proteínas, carbohidratos y nucleótidos. El mayor daño se produce en los lípidos, es un proceso conocido como peroxidación lipídica (POL), la cual afecta a los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) (Venereo, 2002).
La POL se inicia cuando las ERO atacan un AGP y le quitan un átomo de hidrógeno al grupo metileno adyacente al doble enlace, para formar el RL acilácilo graso, esta molécula adiciona oxígeno y se transforma en el RL peroxilo ácido graso, que actúa como transportador de la reacción en cadena ya que ataca a otros AGP e inicia nuevas reacciones (Cárdenas y Pedraza, 2006).
Los productos finales de la POL, son lípidos peróxidos, que al degradarse originan nuevos RL, siendo las consecuencias del daño a la estructura de los AGP más evidentes cuando estos lípidos forman parte de las membranas celulares, ya que se alteran su cohesión, fluidez, permeabilidad y función metabólica (Chihuailaf et al., 2002).
Los factores que influyen en la magnitud de la peroxidación lipídica son: la naturaleza cualitativa y cuantitativa del agente indicador, los contenidos en la membrana de AGP y su accesibilidad, la tensión del oxígeno, la presencia de hierro, el contenido celular de antioxidantes y la activación de enzimas que pueden terminar la cadena de reacción (Cerolini et al., 2001; Venereo, 2002).
Las proteínas también son blanco de las ERO, causando la oxidación de residuos de los aminoácidos, el rompimiento de los enlaces peptídicos y la agregación entre proteínas; así como también causa la pérdida de la actividad catalítica de las enzimas, daños en la integridad de proteínas estructurales o interrumpir la regulación de las vías metabólicas (Cárdenas y Pedraza, 2006).
De igual manera el ADN puede ser afectado por las ERO, principalmente el ADN mitocondrial, el cual se encuentra expuesto a las ERO provenientes de la cadena respiratoria (Tamer et al., 2005). Las ERO dañan el ADN al reaccionar con la bases
nitrogenadas y con la desoxirribosa, lo cual causa fragmentación del ADN (Cárdenas y Pedraza, 2006).
Con la edad un organismo está bajo mayor estrés oxidativo como resultado de un deterioro de la función de la cadena respiratoria mitocondrial, lo que resulta en una disminución de ATP y un aumento en la producción de radicales libres, así como en alteraciones en los niveles de las enzimas antioxidantes causando así, una alteración en la respuesta al estrés oxidativo (Wei y Lee, 2001).
1.6.4. Evaluación del estrés Oxidativo
El estrés oxidativo puede ser evaluado directamente a través de la cuantificación directa de las ERO o por indicadores para determinar el daño mediado por los RL, los cuales incluyen las mediciones de lípidos, proteínas y ADN oxidados; o indirectamente mediante la determinación de la concentración o actividad de los agentes antioxidantes (Sánchez et al., 2004; Li et al., 2010) .
1.7. Protección antioxidante
Los antioxidantes son aquellas sustancias que previenen la oxidación al actuar como un donador de electrones, capaz de evitar una reacción en cadena de óxido- reducción, sacrificando su propia integridad molecular para evitar alteraciones de moléculas como lípidos, proteínas, ADN; pueden formar parte de enzimas que directa o indirectamente protegen a las células contra los efectos adversos del daño provocado por la reacción al oxigeno (Hicks et al., 2006).
El sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustancias que al estar presente en concentraciones bajas con respecto al sustrato oxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación, se considera como sustrato oxidable a casi todas las moléculas orgánicas o inorgánicas que se encuentran en las células vivas, como: proteínas, lípidos, carbohidratos y las moléculas de ADN (Koppers et al., 2010).
Los antioxidantes se pueden clasificar en enzimáticos y no enzimáticos (Cuadro 4);
también pueden ser clasificados dependiendo su mecanismo con el que ejercen su acción protectora, agrupándolos en los que cumplen una función preventiva en la formación de RL y en aquellos que reparan o eliminan las biomoléculas que han sido dañadas por el ataque de RL (Chihuailaf et al., 2002; Hicks et al., 2006).
CUADRO 4. Clasificación de antioxidantes según su origen.
Enzimáticos No enzimáticos
Superóxido Dismutasa Glutatión Reducido
Glutatión Reductasa Ácido ascórbico
Glutatión Peroxidasa Vitamina E
Catalasa Carotenos
(Castillo et al., 2001) Algunos minerales como el Selenio, Zinc, Manganeso, Hierro y Cobre están ligados a la protección contra el daño oxidativo, aunque su mecanismo de acción es a través de la participación en sistemas enzimáticos asociándose como componentes estructurales o activadores, teniendo la capacidad de ejercer una acción independiente (Chihuailaf et al., 2002).
1.8. Glutatión peroxidasa (GSH-Px)
Durante los procesos de oxidación, los sistemas biológicos previenen una gran cantidad de mecanismos, entre las cuales los antioxidantes tienen una importante función en forma de enzimas.
La glutatión peroxidasa (GSH-Px; EC 1.11.1.9) es una metaloenzima que forma parte del sistema glutatión, cataliza la reacción de oxidación de la glutation a glutation disulfuro utilizando para ello peróxido de hidrógeno, tiene como principal función proteger al organismo del efecto degradante de los hidroperóxidos formados de forma endógena y es señalada como el principal sistema antioxidante en el organismo (Chihuailaf et al., 2002). Se han identificado tres tipos de GSH-Px: celular, extracelular (plasmática) y fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa. La
estructura de la enzima celular está conformada por cuatro subunidades de 22 Kdaltons cada una, donde cada subunidad contiene un residuo de selenocisteína. Las funciones de la GSH-Px son: inactivar algunos de los radicales libres derivados del oxígeno que se forman en el organismo como consecuencia del metabolismo aerobio (Liet al., 2010); así, esta enzima es responsable de la protección de la membrana de las células que funcionan en presencia de oxígeno , intervenir en la cascada de reacciones que catalizan la formación de prostaglandinas,leukotrienos, prostaciclinas y tromboxanos a partir del ácido araquidónico, se relaciona con el normal funcionamiento del sistema inmunológico y con la integridad funcional del tracto reproductivo tanto en machos como en hembras (Ceballos et al., 1999).
En un estudio realizado en Chile por Ceballos et al., (1998) donde se observó la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa en rebaños lecheros a pastoreo en donde terneras lactantes presentaron la mayor actividad enzimática, mientras que las terneras de recría y las vaquillas tuvieron una actividad enzimática menor encontrándose diferencias entre grupos. Las vacas en preparto y en el inicio de la lactancia presentaron una actividad enzimática similar con valores que se ubicaron entre los encontrados para los grupos anteriores.
CUADRO 5. Promedio, desviación estándar y rango de la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa en grupos de animales de rebaños lecheros.
Tomado de Ceballos et al., 2007
1.9. Cambios en analitos séricos
Bernabucci et al . (2002) Demostraron que las altas temperaturas pueden producir estrés térmico moderado y causan estrés oxidativo en vacas lecheras de transición.
Calamari et al (1999). Reveló débil efectos negativos del estrés térmico sobre algunos marcadores plasmáticos del estado oxidativo de vacas lactantes. Coppock et al.
(1982) y Schneider et al. (1986) hacen hincapié en la adición de solutos (NaHCO3 y KCl) ya que benefician en términos de rendimiento de la leche, la regulación del equilibrio acido base, y la baja temperatura del cuerpo, que puede estar relacionada con una deficiencia mayor de iones monovalentes (sodio y potasio) bajo carga de calor (Shalit et al., 1991).
En un estudio realizado por Shehab et al. (2010) muestran cambios metabólicos asociados al estrés por calor; se observó incrementos y en algunos casos disminuyó la concentración de metabolitos en la sangre.
Se ha demostrado que los niveles de Na+ y K+ en plasma son influenciados por el estrés calórico.
El potasio se encuentra principalmente dentro de las células (aproximadamente el 90% del K corporal es intracelular) y por medio de un sistema que necesita energía se relaciona con el movimiento del sodio. El potasio con el sodio y el cloro aparecen distribuidos en los tejidos animales y realiza una importante función en la regulación osmótica de los líquidos del organismo y en el mantenimiento de equilibrio acido- base. El potasio interviene en la excitabilidad nerviosa y muscular, participando en el metabolismo de los carbohidratos (McCutcheon, 2007).
La mayor parte del sodio del organismo se encuentra en los tejidos blandos y líquidos orgánicos. Al igual que el potasio, el sodio participa en el mantenimiento del equilibrio acido-base y en la regulación osmótica de los líquidos del organismo. El sodio es el canon principal del plasma sanguíneo y demás líquidos extracelulares. El contenido de sodio en las células es relativamente bajo estando reemplazado fundamentalmente
por el potasio y magnesio, también participa en la transmisión de los impulsos nerviosos así como en la absorción de los azucares y aminoácidos (Nardone 2000).
1.10. Adenosin Trifosfatasa (ATPasa): Función e Importancia
La bomba sodio potasio ATPasa es un complejo enzimático ubicado en la membrana celular, el cual convierte la energía química del ATP para ayudar al traslado de los iones a través de una gradiente electroquímica. Además, su rol fundamental es mantener altas concentraciones de potasio intracelular y bajas de sodio (Skou, 1965) Esta bomba mantiene el gradiente de sodio entre los compartimientos extra e intracelulares en varios tejidos influyendo en el volumen celular, procesos de absorción en el riñón o en el intestino y excitabilidad en el músculo ( Schwartz, 1975).
El proceso de mantenimiento de las concentraciones de iones Na+ y K+ ha sido denominado como un “ciclo fútil” que consiste en el transporte cíclico de iones sodios donde la energía residual (liberada en forma de calor) ocurre en todas las células del organismo jugando un rol significante en la termogénesis y la regulación del balance energético (Lanello, 2007).
Estudios anteriores demuestran que la concentración de iones es correlativo con el estrés oxidativo que ocurre después del estrés por calor (El-Nouty et al., 1980).
La Na+, K+-ATPasa es especialmente sensible al estrés oxidativo y su función es mantener el gradiente electroquímico de Na+ y K+ iones a través de la citomembrana, que proporciona energía para la membrana, transporte de metabólitos, nutrientes e iones. Por lo tanto, el gen Na+, K+-ATPasa bovino representa un plausible candidato para los rasgos de tolerancia al calor (Morel et al. 1998).
1.11. Gen ATP1A1
El Gen ATP1A1 se compone de una subunidad catalítica, dicha subunidad lleva los sitios de unión para el sodio, el potasio, el ATP y el inhibidor específico ouabaína, codifica la isoforma α1, la isoforma A1 es la enzima predominante en las células de la sangre y tejidos nerviosos (Geering et al., 1987). El gen ATP1A1 bovino tiene una secuencia codificante de 3152 nucleótidos dispersos en 23 exones (figura 3). Como se sabe, las variaciones de secuencia se pueden utilizar para el mapeo de genes, la definición de la población, la estructura y la realización de estudios funcionales (Dybus, 2006).
FIGURA 3. Gen ATP1A1 (National Center for Biotechnology, 2012)
Hawken et al. (2004) encontraron un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen bovino ATP1A1, es bien sabido que los polimorfismos de nucleótidos únicos contribuyen a la realización de asociación, análisis y evaluación de los mismos como marcadores genéticos de selección (Ren et al. 2009; Lan et al., 2009). También hay evidencias de un posible efecto del choque térmico sobre la síntesis de DNA y la expresión de genes (Lacetera et al., 2009). Sin embargo, se han encontrado pocos estudios sobre la expresión del gen ATP1A1 en las vacas lecheras sometidas a estrés por calor.
1.12. Polimorfismo del gen ATP1A1
Rensetti et al. (2011) describen la técnica para detectar las mutaciones en reacción en cadena de la polimerasa simple (PCR-SSCP-LIS). Esta técnica implica la corrida electroforética de los amplicones de 301pb en geles de poliacrilamida al 12% durante
12-15 h y posterior tinción en NO3Ag. De la misma forma diseñaron una técnica, Reacción en cadena de la polimerasa - Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (PCR-RFLP), accesible al análisis de un gran número de animales que consiste en incubar 1 h a 50 °C del amplicón con la enzima de restricción y corrida electroforética en gel. Todas las muestras se estudiaron con las técnicas de PCR- SSCP-LIS y PCR-RFLP. Los patrones observados por PCR-RFLP para los diferentes genotipos son dos fragmentos de 160 y 141pb para CC, una banda de 301pb para AA y 3 bandas: 301, 160 y 141pb para CA.
Así mismo, Liu et al. (2010) amplificaron cuatro fragmentos de 295, 301,318, y 246 pb donde mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida, muestran el comportamiento polimórfico y se observan tres tipos de bandas llamadas AA, CC, y CA. Mediante la comparación de las secuencias de dos tipos de homocigotos, se encontró una sustitución de C / A en la posición del nucleótido 2789 del ARNm ATP1A1 (Gen-Banco: NM_001076798), que no indujo ningún cambio en aminoácidos del gen bovino ATP1A1.
En otro estudio realizado por Liu et al. (2011) muestran segmentos amplificados con el cebador P14, el tamaño del producto de PCR fue de 330 pb. En donde clasifican los patrones de bandas polimórficas en seis genotipos: AA, AB, BB, AC, BC, y CC.
Analizan la asociación entre el polimorfismo ATP1A1 y parámetros fisiológicos, en donde las vacas con genotipo AC mostraron la mayor ITH (80,22 ± 3,13) y más bajo FR (71,76 ± 5,24) entre los seis genotipos. Estos resultados indican que el genotipo AC fue el más favorable en el locus ATP1A1-P14 para la característica anti-estrés de calor en la población.
JUSTIFICACIÓN
Para garantizar de manera sostenible la producción bovina en las regiones tropicales de México, es necesario considerar el empleo de razas adaptadas, o la preservación de estas últimas como producto de programas que incluyan el empleo de marcadores moleculares, y la evaluación de las condiciones fisiológicas que permitan contar con criterios adecuados en la política de selección de razas tolerantes al ambiente climático adverso en las regiones tropicales, por lo que resulta de suma importancia estudiar la relación medio ambiente – genotipo – respuesta animal.
HIPÓTESIS
El polimorfismo del gen ATP1A1 puede utilizarse para la selección de animales mejor adaptados al estrés por calor, por su capacidad para regular el intercambio de los iones Na+ y K+ de las membranas celulares y la homeóstasis celular.
OBJETIVOS
Objetivo general
Asociar la frecuencia genotípica del gen ATP1A1 con la variación fisiológica debida a las épocas de mayor o menor confort ambiental expresadas como la concentración sérica de Na + y K + y la enzima GSH-Px.
Objetivos específicos
1) Determinar la concentración sérica de Na+ y K+ y de la enzima GHS-Px, en vacas de lechería tropical en el periparto, durante la época de mayor confort ambiental (Nov.-Abril) y la época de menor confort ambiental (Mayo-Octubre).
2) Determinar el confort de las vacas en lactación por medio del valor del ITH y la respuesta fisiológica a través de respiraciones por minuto (rpm) , temperatura rectal en época de mayor confort ambiental (Nov.-Abril) y la época de menor confort ambiental (Mayo-Octubre).
3) Tipificar las variantes polimórficas del gen ATP1A1 en vacas de lechería tropical durante el periparto.
4) Asociar las constantes fisiológicas respiraciones por minuto y temperatura rectal; concentraciones séricas de Na+ y K+, la actividad de la enzima GHS-Px y el índice de confort animal con la frecuencia genotípica del gen ATP1A1.
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Ubicación del área de estudio
La investigación se realizó en dos municipios del estado de Veracruz, México. Se incluyeron dos unidades de producción de bovinos de doble propósito. Una de las unidades de Producción (UP) está ubicada en la comunidad La Unión, perteneciente al municipio de Juan Rodríguez Clara, Veracruz, a latitud 18°06´N y longitud 95°27´O y de 41 metros sobre el nivel del mar (msnm). La otra pertenece a la Posta Zootécnica Torreón de Molino de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana (FMVZ-UV) ubicada en el Municipio de Veracruz y a latitud 19°10´N; longitud 96°12´O y a altitud 21 msnm.
Las temperaturas promedio máximas, medias y mínimas en ambas zonas de muestreo son de 35 °C, 25 °C y 15 °C respectivamente, con clima húmedo- extremoso, con lluvias en verano, clasificado como zona AW2 (Vidal, 2005), humedad relativa de 75% y precipitación pluvial anual de 1418.8 mm, entre los meses de mayo y octubre.
2.2. Animales experimentales
El total de animales de la investigación fueron 122 bovinos hembras, tomando como criterios de inclusión, estado de gestación avanzada a partir de 8 meses, así como recién paridas, con más de una lactación y no más de 7 en aparente buen estado de salud. La muestra consto de 61 animales por UP.
Hatos en estudio
Constituido por 61 animales producto de diversos encastes de Bos taurus x Bos indicus (Bi x Bi), número de animales que cumple para el análisis de polimorfismos, con la indicación de contar con grupos de por menos 50 animales por la Sociedad Internacional para Genética Animal – ISAG, por su siglas en inglés (ISAG, 1997).
2.3. Variables en estudio
El estudio incluyo las siguientes variables a analizar:
El ITH que se obtuvo al momento de realizar los muestreos tanto matutino como vespertino.
La respuesta fisiológica clínica fue evaluada de forma paraclínica a través de las constantes fisiológicas temperatura rectal (°C) y frecuencia respiratoria (movimientos respiratorios/minutos).
La condición corporal (1-9) se calificó, considerando las equivalencias propuestas por Plaizier et al. (2000). La calificación de la condición corporal en cada vaca se determinó por observación directa.
La cuantificación de los analitos metabólicos se realizó en suero sanguíneo obtenido en dos ocasiones, la primera en la época de mayor confort y la segunda durante la época de menor confort en ambos hatos.
El perfil hemático se obtuvo a partir de muestras de sangre se determinaron los valores de hemoglobina (g/dL) y el volumen del paquete celular (VPC %).
El polimorfismo del gen ATP1A1 se determinó en muestras de ADN sanguíneo y por las técnicas PCR – RFLP (Reacción en cadena de la polimerasa – Polimorfismo de Longitud de Cadena de Restricción).
