ELECTROFORESIS.
V = E z / f v: velocidad de migración de la molécula en un campo eléctrico. E: intensidad de campo eléctrico, z: carga neta de la proteína. f = 6πηr es el coeficiente friccional. η es la viscosidad del medio.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas (PAGE) o en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE):
IEF en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEINAS.
Mr = masa molecular relativa (por ejemplo, 50,000) Masa molecular: Por ejemplo 50,000 daltons (50 kDa).
A) Proteína nativa:
1) Ultracentrifugación.
2) Filtración por gel.
3) Espectrometría de masa.
B) Subunidad:
1) Electroforesis en gel de poliacrilamida en
ULTRACENTRIFUGACION.
Fc = m´ω2r = m(1 – vρ) ω2r Fc= fuerza centrífuga.
r = radio del rotor.
ω = velocidad angular. ω2r = campo centrífugo. v = volumen específico parcial (inversa de la densidad de la proteína). m’ es menor que m porque el flúido desplazado ejerce una fuerza opuesta (1 – vρ) .
f= coeficiente friccional de la partícula = 6πηr , donde η es la viscosidad del medio y r el radio de la partícula.
v = Fc / f = m(1 – vρ) ω2r / f
s = coeficiente de sedimentación (unidades 10-13seg = 1 Svedberg).
s = v / ω2r = m (1 – vρ) / f
Μr = RTS / D (1 – vρ) D = coeficiente de difusión
Ultracentrifugación analítica: Rotor especial, que permite seguir la sedimentación durante la corrida.
Ultracentrifugación zonal (en gradiente): La solución de proteína se corre en
Peso molecular de subunidad:
Determinacion
por SDS-PAGE
COMPORTAMIENTO ELECTROFORETICO DE LA CRUZIPAINA
COMPORTAMIENTO ELECTROFORETICO DE LA CRUZIPAINA
COMPORTAMIENTO ELECTROFORETICO DE LA CRUZIPAINA
EFECTO DE LA PRESENCIA DE PUENTES DISULFURO.
SECUENCIACION DE PEPTIDOS Y
PROTEINAS
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.
Para secuenciar una proteína siempre se debe partir de la proteína purificada. La purificación puede consistir en obtener la proteína pura en un tubo, a través de los métodos de purificación ya mencionados, o, aún si no está completamente homogénea, como una banda discreta en un gel de SDS-PAGE.
Para secuenciar una proteína siempre se la debe fragmentar
para obtener péptidos de menor tamaño, secuenciables por
distintos procedimientos. Esta fragmentación se hace
enzimáticamente (proteasas) o químicamente (p.ej.: BrCN).
1) Método de Edman:
Previa separación de los péptidos por HPLC en fase reversa, secuenciarlos químicamente por reacción con el reactivo de Edman, isotiocianato de fenilo, en un secuenciador automático.
2) Espectrometría de masa (MS):
2a) Sin separar los péptidos, determinar las masas de un cierto número de los mismos por MS e identificar a la proteína en los bancos de datos por comparación con las masas de digeridos virtuales de todas las proteínas ya secuenciadas. Optimo cuando el genoma del organismo del cual proviene la proteína está completamente secuenciado.
2b) Seleccionar un péptido determinado por MS y fragmentarlo, obteniendo su secuencia a partir de las masas de los fragmentos resultantes (MS/MS, espectrometría de masa en tandem con cámara de colisión, o PSD,
SECUENCIACION DE PROTEINAS Y PEPTIDOS.
MDH-1
MDH-2
LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
1er.Ciclo
2
3er.
DEGRADACI ON DE EDMAN
REACCION DEL RESIDUO N- TERMINAL CON ISOTIOCIANATO
DE FENILO
1er. Ciclo
2o. Ciclo
3er. Ciclo
Secuenciación automática por
el Método de Edman
(N-terminal de
la cruzipaína)
ESPECTROMETRIA DE
MASA: SUS APLICACIONES EN DETERMINACION DE PESOS MOLECULARES DE
PROTEINAS Y EN SECUENCIACION DE
PEPTIDOS.
Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una tecnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).
• La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa.
• Cada molécula puede originar iones moleculares con
distinto número de cargas ( y distintas m/z).
Un espectrómetro de masa consiste de tres módulos:
1) Fuente de iones.
2) Analizador de masas.
3) Sistema de detección y adquisición de datos.
Técnicas actuales para trabajo biológico:
1) MALDI-ToF MS (desorción/ionización por laser asistida por matriz, combinada con análisis de masas por tiempo de vuelo)
2) ES/MS (ionización por electrospray combinada con análisis de
Soft ionization methods:
• Electrospray ionization (ESI)
• Matrix assisted laser desorption ionization (MALDI)
(Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F.; Whitehouse, C. M. (1989). "Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules". Science 246: 64–71).
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. (1988). "Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry". Rapid Commun Mass Spectrom2 (20): 151–3.
Nobel Award in Chemistry shared in 2002
Both methods produce pseudomolecular ions (M+nH)n+ or (M-nH)n-
La solución a analizar se pasa a través de una aguja hipodérmica mantenida a un alto potencial. Se forma un cono de gotitas muy finas, altamente cargadas, que irradian de la punta de la aguja. Se evaporan rápidamente, pasando las moléculas a analizar a la fase gaseosa. Si son moléculas grandes se
ES/MS
GENERACION DE IONES MOLECULARES
IONIZACION POR ELECTROSPRAY
(ESI MS)
Aqueous solution
This ionization method arises in the attempt to couple the LC to MS
Sir Geoffrey Taylor (1964). "Disintegration of Water Droplets in an Electric Field". Proc. Roy. Soc. London. Ser. A280 (1382): 383.
dripping, burst, pulsating, cone-jet 1914, John Zeleny
What is the ionization mechanism in ESI?
Lord Rayleigh, 1882
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES .
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES
Los iones se dirigen al vacío del espectrómetro de masa de cuadrupolo a través de un orificio o capilar calentado. El cuadrupolo consta de cuatro barras metálicas paralelas que generan un campo eléctrico oscilatorio. Los iones se separan en este campo:
sólo los de una determinada m/z se dejan pasar a
una determinada amplitud y frecuencia de
oscilación de los potenciales eléctricos aplicados a
las barras, y llegan al detector.
Quadrupole Mass Analyzer
From: http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/quadrupo.html
Ion transmitted along the quadrupole in an stable trajectory
Ions do not have an stable trajectory
•Limited mass range (4 000 Da).
•Were the first mass analyzer to be coupled to ESI.
•Excellent mass filters.
•Acquisition every 0.2-1 Da.
radiofrequency
DC: Direct current RF: Radio frequency
GENERACION DE IONES MOLECULARES
Pseudocristales mixtos de una matriz (p.ej.: ácido 3,5- dimetoxi-4-hidroxicinámico). Se los irradia con un pulso de laser. La sublimación rápida de los cristales lleva a la formación de iones moleculares protonados en fase gaseosa.
MALDI-ToF MS
ANALISIS DE LA MASA DE LOS IONES MOLECULARES .
Se aceleran a una energía cinética de aprox. 25 KeV y se los deja volar a través de una distancia fija sin campo eléctrico.
Teniendo energía cinetica idéntica, los iones chicos se
mueven más rápido que los grandes y llegan antes al
detector. M/z se determina a partir del tiempo de vuelo,
Camera
Laser Sample
plate
Pumping Pumping
Beam guide
Timed ion
selector Reflector
Linear detector Extraction
grids Reflector
detector
ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROMETRO DE MASA
MALDI-TOF
Espectrometro
de masa,
MALDI-ToF
•
Sample mixed with a strong UV absorbing matrix.• The matrix absorbs energy from the laser causing the sample and matrix to be volatilized.
• Ionized matrix molecules transfer a proton to the sample.
• Sample ions are then accelerated down the flight tube for mass analysis (TOF MS).
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization.
Matrix : Analyte 1000:1 – 10000:1
Excess of Matrix
Easy Sample prep:
•Dried droplet
•Layered method
Nd:YAG (355nm) N2 laser (337 nm) Ionization by laser (pulses 1-5nsec
but….high potency: kW→
MW).
Compatible with TOF analyzers
Highly efficient ionization
method
Matrices absorb strongly λ of the laser irradiation
cold matrix
hot matrix
MALDI-MS
1. MALDI-MS spectra are very simple, only singly-charged ions are observed: (M+H)
+or (M-H)
-.
2. Very efficient ionization method. High sensitivity in the analysis of biomolecules and biopolimers.
3. Ideal for the analysis of mixture of tryptic peptides (ID of proteins by PMF, peptide mass fingerprinting).
4. High throughput analysis.
5. Compatible with Time of Flight mass analyzer.
6. Laser intensity may help to induce fragmentations and obtain
structural information.
5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 a .i.
Cr+
39.7 kDa
ProCr+
53.8 kDa
ProCr2+
27.0 kDa
Cr2+
19.9kDa
C-T Cat-D
13.6 kDa 25.5 kDa
Mass spectrometry of recombinant cruzipain
Identification of proteins by
PEPTIDE MASS FINGERPRINTING (PMF)
•The reduced and alkylated sample (in a gel-piece or –spot) is digested with a protease (=trypsin?).
•Resulting peptide mixture is analyzed by MALDI-ToF-MS.
•List of peptide masses is used to scan an in-silica digest of a sequence database over the Internet.
•Search result is presented as probability scores and other measures of confidence.
•Homogeneity of sample and accuracy of measurement are important factors for safe interpretation!
1326.805
1173.652 1394.846 1715.984
873.471 1786.888
835.427 1751.797
1587.900
1430.871
914.555 1135.651 2270.086
1927.941 2071.008
742.410 1366.684 1522.932
1106.592 1258.729
940.505 971.549 1055.614 2306.046 2497.309
1870.913 2110.059
1993.965
663.819 1557.746 1657.811 2211.107 2669.296
2319.140 2375.123 2991.541 3070.587
2872.356
1 2 3 4 5 x104
Intens. [a.u.]
PMF of band # 3
MDH-1
MDH-2
LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE
TRYPANOSOMA CRUZI
MDH-1
MDH-2
Objectives and strategy of a typical sequencing experiment:
•To confirm a suspect protein PMF match
•To identify a target protein via aa sequencing and BLAST search
•To generate an amino acid sequence from an unknown protein
•To identify a PTM
•....
SECUENCIACION POR ESPECTROMETRIA DE MASA
Collision-induced dissociation (CID): Es una técnica de fragmentación usada para obtener información estructural. Se utiliza la colisión con las moléculas de un gas para obtener la fragmentación de un ión seleccionado por su masa.
Post-source decay (PSD): Es una técnica de fragmentación usada con MALDI- ToF MS para obtener información estructural, típicamente a partir de péptidos menores que 2 kDa. El decaimiento de un ion precursor seleccionado por su masa tiene lugar después que el ión deja la fuente de iones, en el tubo de vuelo, y los fragmentos iónicos son separados por el reflectrón.
La trayectoria de vuelo de un ion puede ser incrementada incorporando un
“espejo iónico” o reflectron al final del tubo de vuelo. Tal dispositivo retarda y
luego revierte las velocidades iónicas para corregir diferencias menores en energía
cinética entre iones de la misma relación m/z, y así minimiza variaciones en los
tiempos de vuelo y mejora la resolución y la precisión de los valores de masa.
Ions of equal m/z with different velocities
Reflectron (ion mirror): compensates for the kinetic energy spread of ions from the source (100 eV to 1 keV) by reflecting the ions back along the same flight path prior to detection.
Detector
La ES/MS puede aplicarse directamente a la secuenciación de péptidos, utilizando un ES MS/MS, es decir un espectrómetro de masa de electrospray en tandem, que tiene dos analizadores de masa separados por una celda de colisión, donde el péptido seleccionado se fragmenta y da iones “hijos” que se separan en el segundo analizador y permiten determinar la secuencia.
FRAGMENTACION DE LOS PEPTIDOS
Un péptido cargado puede ser fragmentado en dos trozos de tres maneras, que pueden producir un par de iones a y x, un par de iones b e y, o un par de iones c y z.
Teóricamente una fragmentación puede tener lugar en cualquier lugar de un péptido, y se espera un espectro que contenga todos los posibles picos de iones.
En la práctica, debido a la fortaleza irregular de las ligaduras en las diferentes posiciones, los diferentes iones aparecen con distintas frecuencias.
Los mas abundantes son los iones y, los cuales a menudo forman la serie
completa en un espectro. Los siguientes en frecuencia son los iones a y b, de los
cuales muchos no se observan. Los iones c,
xy
zse presentan mucho menos
frecuentemente. Adicionalmente, estos iones pueden formar nuevos iones por
pérdida de agua o de amonio.
The backbone fragmentation are the most intense signals in the ESI-MSMS spectra of peptides fragmented by CID.
C O
N H
COOH NH 2
y¨ n z´ n x n
C-terminal ions
b n
a n c” n
N-terminal ions
N→ C
N← C
AA sequencing using Post Source Decay MALDI has in principle been possible for many years, but has not been much used due to difficult interpretation.
Peptide fragmentation (2)
A dramatic improvement was the development of derivatizations of the peptide prior to PSD:
Acidification by sulfonation directs fragmentation to the b-y bond and as the b-fragments become neutral, a unique series of y-ion results.
Two common reagents are ”CAF” or ”SPITC” – the former shown below:
N O O
O
O
H2N H
Pep R2
+ H
R2 Pep O
S NH O O S OH HO
O
O RT, pH>9
NHS-ester of 3-Sulfo-
propionic acid anhydride Mass addition, +136 Da
•A tryptic digest (probably from an SDS-PAGE- or a 2-D-gel) is analyzed by PMF.
•The Lys blocking and the sulfonation reactions are performed.
(One can ignore the Lys blocking and only look for Arg-peptides).
•The modified peptide mixture is analyzed again by MALDI.
•Look for masses representing Arg or Lys peptides.
(I. e. those that increased by 136 or 204 Da)
•Switch the MALDI to PSD and select THAT peptide mass.
•Perform the PSD analysis - this takes approximately 2’ in a TOF/TOF MALDI
GE Healthcare discontinued the CAF reagent in 2008.
A variant N-terminal sulfonation reagent, 4-sulfophenyl isothiocyanate (SPITC), is dramatically cheaper and with similar properties. Adds 215 Da at the N-terminal AND free Lys side chain
Wang, Kalb and Cotter, RCM 18, 96-102 (2004)
How can sulfonation at the N-terminus of tryptic peptides improve PSD performance?
1. It favours bond breakage at the b/y position (the peptide bond) 2. It neutralizes the b-fragments (negatively charged sulfogroup +
proton); therefore the b-fragments never leave the target.
3. The resulting series of y-ions is easily interpreted – the distance betwen adjancent peaks represents one amino acid.
The sulfonation reaction derivatizes the N-termini of the tryptic peptides (and the side chain of Lys in approximately half of the peptides)
To avoid the Lys sulfonation, Lys is first blocked by an imidazole reaction, adding 68 Da/Lys. This is specific for the Lys side arm and does not affect the N-terminus.
Peptide mass fingerprinting of T c aconitase (- / + sulfonation)
Post Source Decay (PSD) sequencing of aconitase tryptic peptides
ISOFORMAS DE CRUZIPAINA EN 2D-PAGE
- - WTTQWGEDGYIR
CRUZIPAINA
Phylogenetic relationship of TcMCPs with other members of the M32 family
Pyrococcus horikoshii Pyrococcus furiosus Sulfolobus solfataricus Bacillus anthracis
Bacillus cereus Bacilus subtilis
Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Halobacterium sp.
Thermus aquaticus Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus Yersinia pestis
Rhizobium loti
Rickettsia rickettsii Leishmania major
Trypanosoma cruzi-2 Trypanosoma cruzi-1
Trypanosoma brucei Pyrococcus horikoshii
Pyrococcus furiosus Sulfolobus solfataricus Bacillus anthracis
Bacillus cereus Bacilus subtilis
Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Halobacterium sp.
Thermus aquaticus Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus Yersinia pestis
Rhizobium loti
Rickettsia rickettsii Leishmania major
Trypanosoma cruzi-2 Trypanosoma cruzi-1
Trypanosoma brucei
SINTESIS QUIMICA DE PEPTIDOS
La sintesis quimica de peptidos es muy importante actualmente, pues permite a) estudiar el plegamiento de regiones individuales de una proteína; b) aislar, usandolos como ligandos para cromatografía de afinidad, a receptores y otras proteínas, c) usarlos como drogas, p.ej.: la 1-desamino-8-D-Arg-vasopresina, hormona antidiurética sin efectos sobre la presión sanguinea; d) para generar anticuerpos específicos.
La sintesis se realiza en fase sólida, aplicando el método desarrollado por Merrifield, que le permitió sintetizar interferon (155 residuos) y ribonucleasa (124 residuos), ambos activos
Los aminoácidos que se introducen deben estar bloqueados en los sitios
en que no debe producirse reacción, y luego desbloquearlos para continuar
INTRODUCCION A LA
PROTEOMICA
JUAN JOSE CAZZULO
IIB-INTECH, UNSAM-CONICET
GENOMA Y PROTEOMA
GENOME: “GENes and ChromosOMEs” (Winkler, 1920): Conjunto completo de los cromosomas y sus genes.
PROTEOME: Conjunto completo de las proteínas de un organismo (el conjunto de proteínas codificadas por un genoma, Wilkins y Williams, 1994; Wasinger et al., 1995).
DETERMINACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES
Determinación de las características químicas, bioquímicas y biológicas de las proteínas.
1) Estructura molecular.
2) Modificaciones post-traduccionales.
3) Capacidad de unir ligandos.
4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion intracelular.
Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran en el hombre.
Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas.
El DNA almacena información; las proteínas
hacen todo lo demás.
¿HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES?
NO. Hay frecuentemente mas de una proteína proveniente de un único gen.
Causas principales:
1) Splicing alternativo:
A nivel de la maduración del mRNA. Diferentes proteínas armadas usando diferentes combinaciones de exones.
2) Modificación post-traduccional:
La proteína es modificada después de la traducción, ya sea procesándola proteolíticamente, o modificando quimicamente residuos de aminoácidos, o de ambas maneras.
MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.
Muchas proteínas no están “terminadas” cuando se completa la traducción, y requieren “madurar”, a través de modificaciones post- traduccionales.
Estas modificaciones pueden consistir en:
Modificación covalente de residuos de aminoácidos:
Se estima que hay más de 200 modificaciones posibles en las proteínas, y que hay complejos sistemas regulatorios que controlan esas modificaciones. Se piensa que entre el 5 y el 10 % de los genes de un mamífero codifican proteínas que modifican otras proteínas.
Proteólisis parcial.
Las modificaciones pueden ser:
Reversibles o irreversibles.
Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas.
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES MAS COMUNES EN LAS PROTEINAS.
- Formación de puentes disulfuro.
- N- y O- glicosilación (Asn, Ser/Thr).
- Fosforilación (Ser/Thr; Tyr; His; Arg; Lys; Asp o Glu) - Acetilación (N-terminal)
- Amidación (C-terminal)
- Remoción reversible del C-terminal en tubulinas.
- Metilación (Leu, Isoprenil-Cys, Lys, Arg, His) - Hidroxilación (Pro, Lys)
- Sulfatación (Tyr) - ADP-ribosilación
- Modificaciones para inserción en membranas:
- Palmitoilación y miristoilación.
- Prenilación (farnesilación, geranilgeranilación).
- Unión de ancla de glicosil fosfatidil inositol.
- Procesado proteolítico:
ALGUNAS SECUENCIAS CONSENSO PARA
MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.
1) N-Glicosilación: N*XT/S (X no puede ser Pro).
2) O-glicosilación: PXS*/T*XXP 3) Fosforilación:
Ser/Thr: RRXS* ; KRXXS* ; K/RK/RXS*/T* ; K/RS*/T*XK/R; K/RS*/T*P
Tyr: K/RXXXD/EXXXY*
4) Sulfatación: XE/DY*X
5) Prenilación: C*AAX ; C*C ; C*XC* (en el C-terminal).
6) Miristoilación: M-G*XXXS/T
Para la funcionalidad adecuada de una proteína se requiere mucho mas que la integridad del gen estructural que la codifica. Si este está mutado, y el producto es inactivo, naturalmente la proteína no será funcional. Pero puede suceder algo parecido si el gen estructural está intacto, pero hay mutaciones en otros genes que participan en lo que realmente le interesa a la célula, que es la proteína perfectamente plegada, con las modificaciones post- traduccionales requeridas y localizada en el compartimento subcelular correcto.
Se requerirá la integridad y funcionalidad correcta de otros genes:
LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS.
a) Los que codifican a enzimas que introducen modificaciones post-traduccionales.
b) Los que codifican proteinasas de procesamiento.
c) Los que codifican proteínas requeridas para el transporte e integración de la proteína en el compartimento correcto.
d) Los que codifican enzimas que catalizan la degradación de la proteína.
e) Los genes regulatorios que codifican factores de transcripción necesarios para la expresión de la proteína.
f) Secuencias regulatorias, como enhancers, etc.
g) Genes involucrados en metilación del DNA, estructura de la
DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA.
1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma humano, y que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más proteínas, el número total de proteínas en un organismo superior puede variar entre 50,000 y 500,000.
2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que los ácidos nucleicos. La composición y secuencia de aminoácidos de una proteína determina: a) su masa molecular; b) su carga total a diferentes valores de pH; c) su hidrofobicidad; d) su forma, es decir el plegamiento de la proteína nativa. Esto a su vez determina la solubilidad de las proteínas en diferentes solventes, su comportamiento en los métodos de separación y purificación, y su vida media in vitro. La diversidad de propiedades fisicoquímicas es muchísimo mayor que la de los ácidos nucleicos.
3) Los valores de pI de las proteínas varían entre menos de 3 y más de
4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas, en tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello insolubles en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas totales nunca entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema hidrofobicidad.
5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos miles y varios millones de Daltons, y su tamaño no puede predecirse con certeza a partir de la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de DNA, por las modificaciones post-traduccionales.
6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango muy amplio, probablemente mayor que el rango de los mRNAs. La diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras en los flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud.
MACROMOLECULAS DE UNA CELULA TIPICA HUMANA:
1) DNA: unos 22,000 genes.
2) mRNAs: Alrededor de 40,000 moléculas en todo momento, pertenecientes a alrededor de 5,000 especies moleculares diferentes. Un 80 % están en bajos niveles.
3) Proteínas: Unos 1.000.000.000 de moléculas, de las
cuales las 100 proteínas más abundantes constituyen
alrededor del 90 % de la masa proteica total celular. La
diferencia entre las proteínas de mayor abundancia, como la
actina, y las de menor abundancia, como proteínas
regulatorias, es de alrededor de 10.000.000 de veces.
LAS HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DEL PROTEOMA
La técnica principal utilizada es la separación de las proteínas por electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, seguida de identificación de dichas proteínas por secuenciación o por espectrometría de masa, en general después de hidrólisis enzimatica parcial.
Actualmente se utilizan otras combinaciones de técnicas, por ejemplo cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien combinada con espectrometría de masa. Se está trabajando activamente en la identificación por métodos similares de proteínas en mezclas complejas, previa hidrólisis enzimática parcial.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA.
Ventajas:
Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000 proteínas en un solo gel. Ninguna otra técnica es capaz de analizar simultáneamente miles de proteínas.
Desventajas:
1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes condiciones de rango de pH y de concentración de acrilamida, para resolver las mezclas muy complejas.
2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy ácidas o muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas).
3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden variar en concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver proteínas minoritarias, es necesario en general purificar la organela en que se encuentran y trabajar con ese material. Tambien se puede trabajar previa marcación radioactiva, para aumentar la sensibilidad de detección.
NUMERO DE MANCHAS PROTEICAS REVELADAS EN GELES GRANDES DE 2-DE A PARTIR DE TRES ORGANOS DE RATON.
Fracción tisular Número de manchas
Hígado Cerebro Corazón
(A) Sobrenadante (buffer) 9,204 8,458 4,790 (B) Extracto del pellet
(urea, CHAPS) 1,975 1,692 1,470
(C) Pellet suspendido, DNA
digerido. 73 50 40
Manchas totales por órgano 11,252 10,200 6,300
NOTA: Las manchas contadas en (A) no están en (B) ni en (C), y así
silver Coomassie
μ g
nmole
pmole
fmole
amole ng
pg
fg
1x104
(1 μg) (10 μg) (100 μg) (1mg) (10mg) (100mg) (1g)
1x105 1x106 1x107 1x108 1x109 1x1010
# of cells loaded on gel
10 copies/cell 1000 copies/cell 100000 copies/cell
Relationship between protein copy number and cell level
Relationship between protein copy number
and cell level
Prefix # molecules Amount BSA
1 mole 6x10
2367 kg
1 mmole 6x10
2067 g
1 µmole 6x10
1767 mg
1 nmole 6x10
1467 µg
1 pmole 6x10
1167 ng
1 fmole 6x10
867 pg
1 amole 6x10
567 fg
1 zmole 6x10
267 ag
EDMAN DEGR. MALDI-ToF-MS
Sensitivity Low pmole Low fmole
Clean-up? Yes No
Running cost US$ 150/peptide < 1 ¢/analysis
Analysis time Overnight A few min
# Cell culture
flasks needed 100-150 1
PTM analysis? Only using std’s Possible (?)
ID OF PROTEINS BY EDMAN vs MALDI-ToF-MS
Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) Utilized to identify SUMO-targets in yeast by Wohlschlegel and
co-workers.
1) Yeast expressing an 8His-tagged yeast SUMO (Smt3).
Control, an untagged yeast strain.
2) IMAC affinity chromatography under denaturing conditions.
3) Digestion by sequential addition of LysC and Trypsin.
4) Chromatography on a triphasic microcapillary column loaded with a strong cation exchange (SCX) resin flanked by two segments of reverse phase (RP) material.
5) Elution directly into the mass spectrometer, peptide
Analysis of membrane proteins from mouse brain by multidimensional chromatography.
Frozen mouse brain extracted in 5 steps (the last buffer containing SDS).
Samples submitted to 1D-PAGE; 4 mm slices separately digested with trypsin.
Peptide separation by cation-exchange chromatography; eluate fed on line to ESI mass spectrometer, and MS/MS analysis performed.
Data analysed and 126 membrane proteins identified (twice as many as when 2D PAGE was used).
Lohaus, C. et al. (2007) J. Proteome Res. 6, 105 - 113.
Strategy of protein identification by peptide mass fingerprinting. (A) The unknown
Protein identification by MS/MS. (A) Protein from P. falciparum was resolved on a one-dimensional polyacrylamide gel, excised, and in- gel digested with trypsin. The resulting peptides were ionized by electrospray and analyzed by a Quadrupole-TOF mass spectrometer.
(B) The MS spectrum produced was scanned, and a parent ion of 678.8 was selected for fragmentation. (C) Enlargement of the parent ion peak at 678 shown in panel B. The multiplet of peaks is due to the contribution in mass from the naturally occurring isotope 13C. A mass difference between the peaks of 0.5 Da indicates that the peptide is doubly charged. (D) MS/MS scan of the 678 parent ion and analysis of the daughter ions produced. All y-ions (except for y-11) produced from fragmentation of the peptide are shown. (E) Identification of rhoptry- associated protein-2 using BioAnalyst software (Applied Biosystems, Foster
Comparative 2-D analysis of silver stained soluble proteins from L. infantum promastigote and axenic amastigote cells that were recovered from in vitro cultures at mid-log phase. The soluble protein fractions (150 microg of proteins) were separated by IEF (pI 6–11) and gradient SDS-PAGE (20 to 90 kDa). The first dimension IEF and the second-dimension separation were conducted as indicated
Sixty-two Leishmania infantum protein spots differentially expressed in axenic amastigotes were detected by analyzing several narrow pH 2-D gels using PDQuest image analysis
software.
Immobiline DryStrips pH 3–10, pH 4–7, pH 5–6 and pH 6–11. Some of these
DIFFERENCE GEL ELECTROPHORESIS (DIGE).
Fluorescent tagging of the two protein samples to be compared with two different dyes, amino reactive, and designed to keep the same relative mobility.
The tagged protein samples are mixed and run in the same 2D gel.
After the run fluorescence imaging of the gel is used to create two images, which are superimposed to identify pattern differences.
This technique makes unnecessary to compare different gels.
It is commercially available.
The ICAT method for measuring differential protein expression. (A) Structure of the ICAT reagent. ICAT consists of a biotin affinity group, a linker region that can incorporate heavy (deuterium) or light (hydrogen) atoms, and a thiol-reactive end group for linkage to cysteines. (B) ICAT strategy. Proteins are harvested from two different cell states and labeled on cysteine residues with either the light or heavy form of the ICAT reagent. Following labeling, the two protein samples are mixed and digested with a protease such as trypsin. Peptides labeled with the ICAT reagent can be purified by virtue of the biotin tag by using avidin chromatography. Following puri
Isotope-coded affinity tags (ICAT)
Application of serum proteomics to the Women’s Health Initiative conjugated equine estrogens trial reveals a multitude of effects relevant to
clinical findings. Katayama H et al. (2009) Geneome Medicine 1, 47.
Además, ver S.J. Pitteri et al. (2009) Genome Medicine 1, 121.
Sera from 50 women at baseline and 50 women after an year of estrogen therapy (ET) with conjugated equine estrogens.
5 pools of sera from each group were immunodepleted of the 6 most abundant proteins (albumin, IgG, IgA, transferrin, haptoglobin and antitrypsin) with an affinity column.
The samples were treated with 8 M urea, reduced with DTT, and isotopically labelled in Cys residues with C12 (baseline) or C13(estrogen treated) acrylamide.
Each sample was divided into 12 subsamples by Mono Q chromatography, and each was further divided into 60 fractions by reversed-phase chromatography (Poros R2 column).
Fractions were lyophilized, dissolved, and digested in solution with trypsin. Fractions 4 - 60 from each RP run were pooled in 12 pools, giving 132 total fractions from each
experiment. Tryptic peptides were analyzed with an LTQ-FT mass spectrometer, and submitted to MS/MS analysis.
Quantitative changes after ET in 116 serum proteins related to coagulation,
metabolism, osteogenesis, inflammation and blood pressure maintenance could be