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EFECTO DE LOS LÍPIDOS DE LA DIETA SOBRE LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS EN TEJIDO PLACENTARIO DE RATA QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

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Academic year: 2022

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(1)

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

P R E S E N T A :

A N G E L A R A G Ó N M A N C E R A

México, D. F. 2013 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

EFECTO DE LOS LÍPIDOS DE LA DIETA SOBRE LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS EN TEJIDO PLACENTARIO DE RATA

(2)

PRESIDENTE: Profesora: Marisol López López VOCAL: Profesora: Elena Zambrano González SECRETARIO: Profesora: Maricela Rodríguez Cruz

1er. SUPLENTE: Profesor: Guillermo Celestino Cardoso Saldaña 2°SUPLENTE: Profesora: María Benita Leonor Fernández Salgado

SITIODONDESEDESARROLLÓELTEMA:

Laboratorio de Biología Molecular, Unidad de Investigación Médica en Nutrición, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social.

ASESOR DEL TEMA: Dra. Maricela Rodríguez Cruz

SUSTENTANTE: Angel Aragón Mancera

La investigación de esta tesis fue financiada por la Coordinación de Investigación Médica en Salud, IMSS (Grant #FIS/IMSS/PROT/G09/769) y por CONACYT (Grant

#FIS/IMSS/PROT/7811), México.

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Agradecimientos.

Primeramente a la Universidad Nacional Autónoma de México, por permitirme ser parte de los profesionales que día a día se forman en esta máxima casa de estudios.

A la Facultad de Química, a la cual debo mi formación al hacerme parte sus aulas y laboratorios, por darme el conocimiento de una hermosa licenciatura y por su compromiso con la formación de los mejores profesionales de la Química.

A la Dra. Maricela Rodríguez Cruz, por su paciencia, dedicación y compromiso conmigo durante toda mi estancia en el laboratorio de Biología Molecular.

Particularmente gracias por su ayuda invaluable en la realización de este trabajo con el cual obtengo el título profesional.

Al M.C. Raúl Sánchez, a la QFB Kristel González, al QFB Filiberto Jasso y al M.

en S.P. Jorge Maldonado, por su colaboración, enseñanza y apoyo en la elaboración de este trabajo.

Al laboratorio de Biología Molecular de la Unidad de Investigación Médica en Nutrición.

A la Unidad de Investigación Médica en Nutrición del Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional S.XXI, IMSS.

A la Dra. Marisol López y a la Dra. Elena Zambrano por su colaboración en la revisión del trabajo escrito.

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Índice

1 Índice

1 Índice ... 1

2 Resumen ... 3

3 Marco teórico... 5

3.1 Generalidades del embarazo ... 5

3.2 Fisiología de la placenta ... 6

3.3 Síntesis de los ácidos grasos ... 9

3.3.1 Saturados ... 10

3.3.2 Monoinsaturados ... 13

3.3.3 Poli-insaturados ... 16

3.3.4 Regulación de la síntesis de ácidos grasos ... 19

3.4 Función de los ácidos grasos ... 20

3.4.1 Saturados ... 20

3.4.2 Monoinsaturados ... 21

3.4.3 Poli-insaturados ... 21

3.5 Antecedentes ... 23

4 Justificación ... 25

5 Pregunta de investigación ... 26

6 Objetivo general ... 27

6.1 Objetivos particulares ... 27

7 Hipótesis ... 28

8 Metodología ... 29

9 Resultados ... 34

9.1 Peso de las madres y consumo de alimento ... 34

9.2 Expresión de enzimas que sintetizan ácidos grasos durante el embarazo ... 36

9.2.1 Saturados ... 36

9.2.2 Monoinsaturados ... 36

9.2.3 Poli-insaturados ... 38

9.3 Efecto de los lípidos de la dieta sobre la expresión de enzimas que sintetizan ácidos grasos ... 40

9.3.1 Saturados ... 40

9.3.2 Monoinsaturados ... 44

9.3.3 Poli-insaturados ... 46

9.4 Composición de ácidos grasos ... 52

9.4.1 Composición de ácidos grasos de la placenta ... 52

(5)

Índice

9.4.1.1 Saturados ... 52

9.4.1.2 Monoinsaturados ... 52

9.4.1.3 Poli-insaturados ... 53

9.4.2 Composición de ácidos grasos de fetos y recién nacidos ... 55

9.4.2.1 Saturados ... 55

9.4.2.2 Monoinsaturados ... 55

9.4.2.3 Poli-insaturados ... 55

9.4.3 Efecto de los lípidos de la dieta materna sobre la composición de ácidos grasos en la placenta ... 57

9.4.3.1 Saturados ... 57

9.4.3.2 Monoinsaturados ... 57

9.4.3.3 Poli-insaturados ... 57

9.4.4 Efecto de los lípidos de la dieta materna sobre la composición de ácidos grasos en los fetos ... 59

9.4.4.1 Saturados ... 59

9.4.4.2 Monoinsaturados ... 59

9.4.4.3 Poli-insaturados ... 59

10 Discusión de resultados ... 61

11 Conclusiones ... 67

12 Referencias bibliográficas ... 68

13 Anexos ... 73

Anexo I. Extracción de RNA ... 73

Anexo II. Síntesis de cDNA ... 74

Anexo III. PCR punto final ... 75

Anexo IV. PCR tiempo real (qRT-PCR) ... 77

Anexo V. Determinación de lípidos por el método de Folch modificado ... 79

Anexo VI. Metilación de ácidos grasos ... 80

Anexo VII. Cromatografía de gases ... 81

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Resumen

2. Resumen

Marco Teórico. El embarazo es un estado fisiológico donde es importante que el feto reciba los nutrimentos y componentes necesarios para su desarrollo corporal, inmune y neurológico, los cuales son suministrados por la madre a través de la placenta. Entre los nutrimentos se encuentran los ácidos grasos, éstos se pueden clasificar en saturados e insaturados (monoinsaturados o poli-insaturados), dependiendo de la presencia de dobles enlaces que contengan. Los ácidos grasos son utilizados por el feto para formar parte de las membranas celulares, como reguladores de inflamación, como reserva de energía y para el desarrollo del cerebro y la retina. Los ácidos grasos que la madre le proporciona al feto a través de la placenta provienen de la dieta, de la movilización del tejido adiposo o bien de la síntesis endógena de tejidos como el tejido adiposo, glándula mamaria e hígado. Siendo este último el principal órgano donde se encuentran todas las enzimas que llevan a cabo el metabolismo y la síntesis de los ácidos grasos. Sin embargo, se desconoce si la placenta participa en esta síntesis. La síntesis endógena de ácidos grasos saturados se lleva a cabo por enzimas como la sintasa de ácidos grasos (fasn), elongasas (elovl) 1, 4, 3 y 7. Los ácidos grasos monoinsaturados son sintetizados por las enzimas; desaturasa delta 9 (Δ9D) y elovl 6. Mientras que para la síntesis de los ácidos grasos poli-insaturados se requiere de las desaturasas delta 5 y 6 (∆5D y ∆6D) y elovl 2 y 5. Estas enzimas son reguladas por factores de transcripción como srebp-1c, el cual aumenta la expresión del transcrito de las enzimas que sintetizan ácidos grasos. Se ha observado en hígado y tejido mamario de ratas embarazadas y lactantes, que el incremento en la síntesis endógena, puede compensar al organismo materno de la falta de ácidos grasos en la dieta. Sin embargo, se desconoce si la placenta aumenta su participación en la síntesis de ácidos grasos cuando el organismo materno es alimentado con una dieta deficiente en lípidos durante la gestación.

Objetivo. Determinar si en la placenta se expresan los genes que sintetizan ácidos grasos y si éstos son regulados por los lípidos consumidos en la dieta durante la gestación de la rata.

Metodología. Ratas Sprague Dawley alimentadas con una dieta baja (2%) y adecuada (5%) en lípidos durante el embarazo. Se sacrificaron a diferentes tiempos del embarazo (14, 16 y 20 días y el día del parto), y se extrajeron la placenta y los fetos. A partir de la placenta se extrajo RNA total, para cuantificar mediante PCR en tiempo real el transcrito de enzimas involucradas en la síntesis de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poli-insaturados. Se extrajeron los lípidos totales de la placenta y de los fetos por método de Folch modificado para determinar la composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases. Se realizó un análisis de Anova (P<0.05) de una vía para determinar el día de mayor

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Resumen

expresión del transcrito y el % de ácidos grasos. También se realizó una prueba t- Student (P<0.05) para comparar la expresión génica y % de cada ácido graso entre los dos grupos dietarios.

Resultados. En la placenta se expresan las enzimas que sintetizan ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poli-insaturados, así como el regulador transcripcional srebp-1c. Sin embargo, no se detectó la expresión de la elovl 3. La expresión de la elovl 7 cambia durante el embarazo en ambos grupos dietarios, modificando la cantidad de ácidos grasos de tipo saturado en placenta y fetos.

Además la expresión de elovl 1, elovl 6, elovl 7 y fasn, tienen un patrón similar durante el transcurso del embarazo y se observa que su regulación es independiente a la cantidad de lípidos de la dieta. Las enzimas que sintetizan ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LC-PUFAs) como la elovl 5, ∆5D y ∆6D, aumentan su expresión durante la última etapa del embarazo en el grupo alimentado con una dieta baja en lípidos en comparación con el grupo de una dieta adecuada en lípidos, esta expresión se refleja en el porcentaje de productos como el C20:4ω6 y C22:6ω3 en la placenta y el feto. El factor de transcripción srebp-1c tiene un aumento de su expresión en la última etapa del embarazo con ello regula positivamente la expresión de las enzimas elovl 4, elovl 5, ∆5D, ∆6D y

∆9D, como respuesta a la baja cantidad de lípidos consumidos en la dieta de la madre.

Conclusiones. Debido a que en la placenta se expresan las enzimas de síntesis de ácidos grasos de tipo saturado, monoinsaturado y poli-insaturado, sugerimos que una parte de los ácidos grasos transferidos al feto provienen de la síntesis en la placenta. Una dieta baja en lípidos influye positivamente en la expresión de las enzimas que sintetizan ácidos grasos saturados, elovl 4; monoinsaturados, ∆9 y poli-insaturados, elovl 5, ∆5 y ∆6 en la placenta. La placenta tiene una minima expresión de la enzima elovl 3. Una dieta baja en lípidos influye positivamente en la expresión del regulador transcripcional srebp-1c que activa la expresión de las elongasas elovl 4 y elovl 5, así como las desaturasas ∆5, ∆6 y ∆9. El incremento en la expresión de enzimas que sintetizan LC-PUFAs en la placenta de ratas alimentadas con una dieta baja en lípidos, posiblemente es un mecanismo que se desencadena para que junto con el hígado se sinteticen estos ácidos grasos para igualar e inclusive ser mayor a la cantidad de AA, EPA y DHA al final del embarazo en el feto de ratas alimentadas con una dieta adecuada en lípidos.

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Marco teórico Generalidades del embarazo

3. Marco teórico

3.1 Generalidades del embarazo

El embarazo se considera como un estado de anabolismo donde se produce una serie de cambios funcionales y metabólicos, así como cambios hormonales;

además de adaptaciones fisiológicas donde se eleva la masa corporal de la madre debido a la formación del feto, la placenta y el líquido amniótico y por aumento de las glándulas mamarias y del útero (Ayoubi J.M., et al. 2012). En la primera mitad del embarazo se lleva a cabo en el tejido adiposo el almacenamiento de grasa e incrementa la lipogénesis. Ambos procesos para compensar el gasto energético, en caso de que la madre disminuya su consumo de alimento y así poder mantener el embarazo (Arancela B.J., et al. 2008; Torres N., et al. 2010).

La dieta materna es fundamental para que se lleve a cabo de manera exitosa la gestación, por lo que la madre debe de consumir una dieta mayor en cantidad y calidad, ya que el desarrollo fetal depende del tipo de nutrientes consumidos por la madre (Nizzoli F. 2007; Torres N., et al. 2010). El feto recibe los nutrientes por medio de la placenta, la cual suministra y regula los nutrientes con la finalidad de tener un buen desarrollo del feto (García R.E. 2012). El principal componente utilizado para el crecimiento fetal es la glucosa, aunque se necesitan de otros nutrientes importantes, como son los ácidos grasos. Los ácidos grasos se suministran al feto para que se incorporen a las membranas celulares, para formar el cerebro y la retina, y son precursores de moléculas con actividad biológica (Sanjurjo C.P. 2009). Durante la etapa final del embarazo se lleva de manera más rápida el desarrollo de los tejidos en el feto, por lo cual requiere mayor cantidad de ácidos grasos, mientras que en la madre la tasa de almacenamiento de ácidos grasos disminuye notablemente (Gil C.M, et al. 2010).

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Marco teórico Fisiología de la placenta

3.2 Fisiología de la placenta

Dado que la placenta es el órgano que da el aporte nutritivo al feto es necesario que lleve a cabo diferentes funciones para mantener la sobrevivencia del feto en condiciones óptimas, análogas a las que tienen otros órganos de los mamíferos (Tabla 1) (Botella L.J. 1993).

Tabla 1. Funciones de la placenta (Botella L.J. 1993; Roa I., et al. 2012)

Función Ejemplo

Respiratoria Toma O2 de la sangre materna y devuelve CO2.

Absorción Absorbe nutrientes de la sangre materna.

Excreción Elimina agua, electrolitos, urea y catabólitos.

Metabolismo Almacena glucógeno, sintetiza proteínas, almacena sustancias.

Endocrina Secreta diferentes hormonas

La formación de la placenta es un proceso complejo, donde participan la madre y el feto para su establecimiento. Cuando el ovocito es fecundado por el espermatozoide, se forma un blastocito, el cual tiene estructura en forma de vesícula y cuya pared llamada trofoblasto, tiene contacto directo con la sangre materna (Welsch U. 2006).

Después de la formación del blastocito, éste se implanta en el endometrio y participa en la formación de la placenta, en donde se llevan diferentes procesos como la provisión de alimento al embrión, la invasión del trofoblasto, la inhibición de reacciones en contra del embrión y secreción de lactógeno placentario. En el caso de la placenta de rata el lactógeno placentario estimula al cuerpo lúteo para que sintetice progesterona, la cual es necesaria para que se lleve a cabo la

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Marco teórico Fisiología de la placenta

La placenta de rata tiene dos tipos de morfología dependiendo del periodo de desarrollo. Al principio del embarazo la morfología que presenta la placenta es la tipo coriovitelina y se observa desde la implantación del blastocito al endometrio hasta que se realiza una unión estable. En cambio la placenta corioalantoidea predomina la mayor parte del embarazo y hasta el parto, este tipo de placenta está conformada por la zona de unión y la zona laberíntica. La zona de unión consta de células trofoblásticas y canales vasculares maternos unidos adyacentemente a la decidua basal y la zona laberíntica está compuesta de igual manera por células trofoblásticas, vasos maternos y fetales (Figura 1) (Krinke G.J. 2000; Soares M.J., et al. 2012).

La placenta tiene el papel de transferir diferentes nutrimentos y excretar componentes de desecho, a través de diferentes mecanismos de transporte como la difusión pasiva, activa, transporte activo y pinocitosis (Tabla 2) (Botella L.J.

1993).

Entre los nutrientes transportados están los carbohidratos, proteínas, vitaminas, electrolitos y lípidos. Estos últimos tienen una gran importancia para nuestro estudio, particularmente los ácidos grasos.

(11)

Marco teórico Fisiología de la placenta

Figura 1. Estructura de la placenta de rata (Soares M.J, et al. 2012).

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Marco teórico Fisiología de la placenta

Tabla 2. Diferentes mecanismos de transporte en la placenta (Botella L.1993)

Mecanismo Moléculas

Difusión pasiva Gases, agua, electrolitos, ácidos grasos libres, ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LC-

PUFAs).

Difusión activa Glucosa, lactato y urea.

Transporte activo Vitaminas hidrosolubles, aminoácidos y calcio

Pinocitosis Proteínas.

Los ácidos grasos que se encuentran en la placenta y son transferidos al feto, provienen de diferentes fuentes; como la dieta, la movilización del tejido adiposo y la síntesis en el organismo materno (Moltó-Pulgmartí C., et al. 2010). Donde la placenta posiblemente participa en la síntesis de ácidos grasos

3.3 Síntesis de los ácidos grasos

Inicialmente se identificó que el hígado es el órgano principal de la síntesis de ácidos grasos. Sin embargo, recientemente se reportó que en estados fisiológicos como el embarazo y la lactancia, otros órganos como la glándula mamaria presentan una expresión mayor que el hígado de los genes que sintetizan ácidos grasos, sugiriendo que el tejido mamario tiene una participación activa en la síntesis de ácidos grasos (Rodríguez-Cruz M., et al. 2011). Además, en condiciones fisiológicas donde no se presenta el embarazo, otros órganos también expresan las enzimas que sintetizan ácidos grasos, como el corazón, pulmón, páncreas, riñón. Aunque esta expresión también se ha reportado en el útero y la placenta, los resultados son controversiales (Moltó-Pulgmartí C., et al. 2010).

La expresión de las enzimas que sintetizan ácidos grasos, es regulada con la finalidad de mantener la homeostasis de ácidos grasos (saturados, monoinsaturados y poli-insaturados) en el organismo y depende de diferentes factores, que influyen en los genes de transcripción maestros de la lipogénesis

(13)

Marco teórico Síntesis de ácidos grasos

Saturados

3.3.1 Saturados

Los ácidos grasos de tipo saturado son aquellos que en su cadena principal de átomos de carbono no tienen ninguna doble ligadura. Las propiedades de estos ácidos grasos es la resistencia a la oxidación, a la luz y al calor. La presencia de ligaduras sencillas en estos ácidos grasos, les permiten la rotación libre, presentar un mayor punto de ebullición y de fusión. Además, tienen tendencia a formar sólidos a temperatura ambiente (Velásquez G. 2006; Martínez S.J, et al. 2013).

En la dieta la mayor parte de grasa se encuentra en forma de triglicéridos, que es un complejo formado por un glicerol y 3 ácidos grasos comúnmente de tipo saturado o monoinsaturado, con una longitud que va desde los 8-22 átomos de carbono. Los triglicéridos son hidrolizados por dos diferentes tipos de lipasas, la lipasa hepática y la lipoproteína lipasa teniendo como resultado, un diacilglicerol y un ácido graso libre o bien 3 ácidos grasos libres, que pueden ser utilizados o almacenados en el organismo (Innis S.M. 2011; Jump D.B. 2009)

Cuando estos ácidos grasos no provienen de la dieta, se sintetizan de manera endógena en el citosol, principalmente en las células hepáticas por acción de la sintetasa de ácidos grasos (fasn) (Figura 2). La fasn puede sintetizar ácidos grasos a partir de acetil-CoA que es su sustrato y malonil-CoA que es el donador de 2 átomos de carbono; o bien a partir de ácidos grasos provenientes de la dieta (<14 C) que estén unidos a un grupo Acil-CoA y que tienen como producto final la formación de ácido palmítico (C16:0) (Brolinson A. 2009; Guillou H., et al. 2010). El C16:0 puede ser elongado para formar ácidos grasos de cadena larga (18:0 C) o bien ácidos grasos de cadena muy larga (> 20 C). Las enzimas involucradas en la elongación de los ácidos grasos son las elongasas de ácidos grasos de cadena larga (elovl), las cuales se encuentran en el retículo endoplásmisco. El proceso de elongación consta de 4 reacciones, la primera de condensación, la segunda una reducción, la tercera una deshidratación y la última una reducción. A la fecha se han identificado que las elongasas elovl 1, elovl 3, elovl 4, elovl 6 y elovl 7 están involucradas en la síntesis de los ácidos grasos saturados (Tabla 3) (Voet J.

2004; Brolinson A. 2009; Guillou H., et al. 2010).

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Marco teórico Síntesis de ácidos grasos

Saturados

Tabla 3. Principales ácidos grasos saturados (Guillou H., et al. 2010;

Martemucci G., et al. 2012).

Símbolo Nombre común

C4:0 Ácido butírico

C6:0 Ácido caproico

C7:0 Ácido heptaenoico

C8:0 Ácido caprílico

C9:0 Ácido nonanoico

C10:0 Ácido cáprico

C11:0 Ácido undecanoico

C12:0 Ácido láurico

C14:0 Ácido mirístico

C16:0 Ácido palmítico

C18:0 Ácido esteárico

C20:0 Ácido araquídico

C21:0 Ácido heneicosaeneoico

C22:0 Ácido behénico

C24:0 Ácido lignocérico

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Marco teórico Síntesis de ácidos grasos

Saturados

Figura 2. Síntesis de ácidos grasos saturados (Guillou H. et al. 2010).

( Glucólisis ]~ Acetil-CoA ]{?(

D D

[ Acetil-CoA

CITOSOL

RETICULO ENDOPLASMICO

] {? 7 ([ Malonil-CoA ] )

D [ fasn

C16:0

I

elovl6

]

(16)

Marco teórico Síntesis de los ácidos grasos Monoinsaturados

3.3.2 Monoinsaturados

Los ácidos grasos monoinsaturados son aquellos que solo contienen una doble ligadura o insaturación en la cadena hidrocarbonada, por lo cual no tienen una rotación en 3 dimensiones. También tienden a formar semisólidos y tienen un menor punto de fusión y de ebullición en comparación con los ácidos grasos saturados (Martínez S.J., et al. 2013). El ácido oleico (C18:1) es el ácido graso monoinsaturado más abundante en los alimentos ya que contienen cerca del 92%

(Velásquez G. 2006).

En los mamíferos las enzimas llamadas desaturasas colocan el doble enlace en un carbón específico en la cadena hidrocarbonada, cuyo proceso es llamado desaturación. Hay dos familias de enzimas que llevan a cabo la desaturación; la ácido graso desaturasa (FADS por sus siglas en inglés) y la esteroil-CoA desaturasa (SCD por sus siglas en inglés), enzimas de estas familias son las encargadas de colocar el doble enlace a los ácidos grasos. La desaturasa ∆6D de la familia FADS y ∆9D de la familia SCD, colocan el doble enlace a los ácidos grasos saturados, en donde el ∆ es la posición del carbono en el que se coloca el doble enlace a partir del carbono terminal de la cadena hidrocarbonada. Los ácidos grasos que contienen insaturaciones se clasifican en familias, estas se nombran con la última letra del alfabeto griego, omega (ω) y el número del átomo de carbono en el cual se encuentra la primera insaturación, a partir del último carbono de la cadena hidrocarbonda (Voet J. 2004; Guillou H., et al. 2010).

Para alargar las cadenas que contienen ya un doble enlace, participan las elongasas como la elovl 1, elovl 3, elovl 5 y elovl 6 (Figura 3), que realizan la elongación de ácidos grasos monoinsaturados de 16C, 18C, 20C, 22C y 24C (Tabla 4), aunque pueden hacer la elongación de ácidos grasos de mayor número de carbonos. La elongación o bien la desaturación de los ácidos grasos es importante para mantener la homeostasis de los lípidos (Tanaka T., et al. 2009;

Guillou H., et al. 2010).

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Marco teórico Síntesis de los ácidos grasos Monoinsaturados

Figura 3. Síntesis de ácidos grasos monoinsaturados (Guillou H., et al. 2010).

ω9, familia omega 9; ω10, familia omega 10

[ Glucólisis ]~ Acetil-CoA ]cCr[

~ ~

[ Acetil-CoA ) cCr 7 ([ Malonil-CoA

CITOSOL

D [

C16:0

RfTlfULO F.NDOPLASMICO

= [

M

I

L-D.-g

-- U ---'

' ¿

C16:1

?

C18:1

wl0

elovl5 elovl6

C16:1

C18:1

w7

fasn

elovl6

HC03-

j)

1

C18:0

1

D.9

C18:1

1

elovl 3

C20:1

1

elovl 3

C22:1

1

elovl 3

C24:1

w9

(18)

Marco teórico Síntesis de los ácidos grasos Monoinsaturados

Tabla 4. Principales ácidos grasos monoinsaturados. (Guillou H., et al. 2010;

Martemucci G., et al. 2012)

Símbolo Nombre común

C10:1 Ácido decenoico (caproleico)

C12:1 Ácido dodecenoico (lauroleico)

C14:1 Ácido miristoleico

C16:1 (ω7) Ácido palmitoleico

C16:1 (ω10) Ácido sapienico

C18:1 (ω9) Ácido oleico

C20:1 (ω9) Ácido gadoleico

C20:3 (ω9) Ácido eicosatrienoico

C22:1 (ω9) Ácido erúcico

C24:1 (ω9) Ácido nervónico

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Marco teórico Síntesis de los ácidos grasos Poli-insaturados

3.3.3 Poli-insaturados

Los ácidos grasos poli-insaturados, son aquellos que contienen más de una instauración en su estructura. Existen dos familias, la ω3 y la ω6. Los precursores de estas familias, son el ácido linoléico (LA) (C18:2ω6) y el ácido α-linolénico (ALA) (C18:3ω3), considerados como esenciales ya que deben consumirse en la dieta (Costa C.L., et al. 2012; Martínez S.J., et al. 2013).

El ALA y LA son precursores de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LC-PUFAs) como el ácido docosahexaenoico (DHA) (C22:6ω3), ácido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5ω3) y ácido araquidónico (AA) (C20:4ω6) (Tabla 5). Los LC-PUFAs no pueden ser sintetizados por el feto, debido a que no tiene la cantidad adecuada de enzimas como desaturasas (∆5D y ∆6D) y elongasas (elovl 2 y elovl 5) (Figura 4) responsables de su síntesis (Jump D.B. 1999; Dunstan J.A., et al. 2004; Rodríguez-Cruz M., et al. 2005).

El feto requiere de manera preferencial de LC-PUFAs para su desarrollo cerebral y visual, estos ácidos grasos provienen de la dieta de la madre. Sin embargo, la madre puede llevar a cabo su síntesis en caso de que aumente la demanda por parte del feto, dicha síntesis se lleva a cabo en el hígado, donde después de ser sintetizados son transferidos preferencialmente por la placenta para el desarrollo del feto (Tanaka T., et al. 2009; Rodríguez-Cruz M., et al. 2011).

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Marco teórico Síntesis de los ácidos grasos Poli-insaturados

Tabla 5. Principales ácidos grasos poli-insaturados. (Kelder B., et al. 2001;

Guillou H., et al. 2010)

Símbolo Nombre común

C20:2 Ácido eicosadienoico

C18:2 (ω6) Ácido linoléico

C20:4 (ω6) Ácido araquidónico

C22:5 (ω6) Ácido docosapentaenoico

C18:3 (ω3) Ácido α-linolénico

C20:5 (ω3) Ácido eicosapentaenoico

C22:6 (ω3) Ácido docosahexaenoico

ω3, familia omega 3; ω6, familia omega 6.

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Marco teórico Síntesis de los ácidos grasos Poli-insaturados

Figura 4. Síntesis de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga

(Guillou H., et al. 2010). ω3, familia omega 3; ω6, familia omega 6.

r= [ DIETA 1

C18:2 I [ C18:3

D

~6

D

C18:3 I [ C18:4

D

elovl5

D

C20:3 I [ C20:4

D

~5

D

C20:4 I [ C20:5

D

elovl2 elovl5

D

C22:4 I [ C22:5

D

elovl2

D

C24:4 I [ C24:5

D

~6

D

C24:5 I [ C24:6

D

¡3-oxid

D

C22:5 I [ C22:6

w6 w3

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Marco teórico Regulación de la síntesis de ácidos grasos

3.3.4 Regulación de la síntesis de ácidos grasos

La síntesis de ácidos grasos es regulada por diversos factores como la edad, el estado hormonal y la dieta, los cuales desencadenan diferentes mecanismos moleculares, con el fin de llegar a su homeostasis. En este estudio nos enfocamos a la regulación de la síntesis de ácidos grasos por medio de los lípidos de la dieta.

Es sabido que dicha regulación está dada por la participación de la familia de factores de transcripción llamadas proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (srebp, por sus siglas en inglés Sterol Regulatory Element-Binding Protein), cuya familia tiene tres miembros; srebp-1a y 1c y srebp-2 (Matsuzaka T., et al. 2002; Ye J., et al. 2011).

Las srebp están unidas a la membrana del retículo endoplásmico, cuya función es entrar al núcleo y unirse al elemento regulatorio de esteroles (ser, por sus siglas en inglés sterol regulatory element), y de esta forma activar los genes involucrados en la síntesis de ácidos grasos y esteres de colesterol (Matsuzaka T., et al. 2002, Knebel B., et al. 2012).

El hígado, el tejido adiposo y otros órganos expresan predominantemente srebp-2 y la isoforma srebp-1c. De manera particular, srebp-1c es un regulador maestro de la lipogénesis y existen evidencias de que su expresión es regulada por los lípidos de la dieta. La regulación positiva de este factor se da como efecto de una dieta baja en ácidos grasos. El mecanismo de regulación involucra el bloqueo de la maduración de srebp-1c, en donde los ácidos grasos bloquean la señalización de diferentes proteínas que activan la maduración. El srebp-1c maduro es la forma activa de este factor, aumentando la expresión de enzimas lipogénicas como la fasn, las desaturasas ∆5D, ∆6D y ∆9D y las elongasas elovl 2, elovl 5 y elovl 6 (Igarashi M., et al. 2007; Georgiadi A., et al. 2012).

(23)

Marco teórico Función de los ácidos grasos Saturados

3.4 Función de los ácidos grasos

Los ácidos grasos tienen diferentes funciones en los mamíferos, principalmente como reserva de energía y la formación de complejos como triglicéridos, fosfolípidos, glucolípidos, ceras y colesterol esterificado, que serán parte de las membranas celulares o bien llevan a cabo funciones fisiológicas. La cantidad y tipo de ácidos grasos libres en circulación así como los complejos formados, dependen de la edad, género, estado endocrino y de la genética de cada individuo (Jump D.B. 1999; Martínez S.J., et al. 2013).

3.4.1 Saturados

Estos ácidos grasos son fuente de energía, forman parte de las membranas y el organismo los puede sintetizar o bien consumirlos en la dieta. El exceso de ácidos grasos saturados ocasiona alteraciones en la composición de las membranas celulares, al igual que agregación plaquetaria asociado con arritmias (Velásquez G. 2006; Slater-Jefferies J., et al. 2010).

Además se ha observado que una dieta alta en este tipo de ácidos, incrementa la cantidad de triglicéridos en circulación, promueven resistencia a la insulina, ocasionan hipertensión arterial y provocan la obesidad en roedores (Jump D.B.

2009).

(24)

Marco teórico Función de los ácidos grasos

Monoinsaturados Poli-insaturados

3.4.2 Monoinsaturados

Los ácidos grasos monoinsaturados son sustrato para la formación de complejos lipídicos más complejos como los fosfolípidos, triglicéridos, esteres de colesterol y diacilgliceroles. Estos complejos lipídicos son importantes ya que se incorporan para ser parte de las membranas de diferentes tejidos o bien de manera preferencial son usados como energía en el organismo (Flowers M.T., et al. 2009;

Imamura F., et al. 2013).

Los ácidos grasos se consumen en la dieta o bien se sintetizan en el organismo.

Algunos beneficios de este tipo de ácidos grasos se han observado al reemplazar una ingesta alta en carbohidratos y ácidos grasos saturados por ácidos grasos monoinsaturados, teniendo como efecto la elevación de colesterol-HDL o

“colesterol bueno”, debido a que los ácidos grasos monoinsaturados forman parte de estas estructuras en forma de complejos lipídicos, evitando así la aterosclerosis que es la principal causa de enfermedades cardiovasculares. Además, los ácidos grasos monoinsaturados tienen un efecto benéfico al mantener una presión arterial adecuada, disminuyen los triglicéridos en circulación y ejercen un efecto hipoglucémico (Pérez M.O. 2004; Schwingshackl L., et al. 2012).

3.4.3 Poli-insaturados

Durante el embarazo los LC-PUFAs son transferidos por la placenta, entre ellos el DHA, el cual se incorpora de manera preferencial a las membranas del cerebro, sistema nervioso y de la retina del feto. En el cerebro, el AA participa en la transmisión de señales y en el crecimiento neuronal, al ser parte de las membranas de las células nerviosas. En la retina, este ácido graso se encuentra mayoritariamente en las membranas de los fotorreceptores y actúa como un promotor de precursores para la maduración de los mismos (Trombran-Tink J., et al. 2008; Gil C.M., et al. 2010; Lattka E., et al. 2010; Costa C., et al. 2012). Debido a esto, es necesario una adecuada concentración de LC-PUFAs ω3 y ω6, como el DHA y el AA respectivamente, para el desarrollo del feto y recién nacido, por lo cual la madre debe consumir una dieta balanceada en ambas familias de ácidos

(25)

Marco teórico Función de los ácidos grasos Poli-insaturados grasos durante el embarazo y la lactancia (Igarashi M., et al. 2007; Bautista J., et al. 2010).

El consumo de pescado, aceite de pescado y algunos mariscos proporciona estos ácidos grasos. Durante la última etapa del embarazo hay un aumento en la utilización de DHA y AA en el feto, debido a que se lleva de manera más rápida el crecimiento de los tejidos y estos ácidos grasos se necesitan para formar parte de las membranas celulares, por lo cual se le recomienda a la madre aumentar el consumo de estos ácidos grasos en la dieta (Rodríguez-Cruz M., et al. 2005;

Mesa G.M., et al. 2007; Gil C.M., et al. 2010). Si la madre tiene un consumo bajo en su dieta de los precursores LA y ALA, el producto recibirá una cantidad baja de AA y DHA ocasionando un desarrollo inadecuado de la retina y del cerebro del feto y del recién nacido (Torres N., et al. 2010).

Existen diferentes evidencias que demuestran que aunque el feto o el recién nacido tenga una concentración adecuada de los precursores LA y ALA, la capacidad de conversión a sus derivados AA y DHA respectivamente, es limitada ya que la actividad enzimática para su síntesis es muy inmadura. Debido a esto el producto debe obtener estos ácidos grasos del organismo materno. Los LC- PUFAs que la madre suministra al producto provienen de diferentes fuentes; 1) del tejido adiposo, que es el principal reservorio 2) del hígado donde se lleva a cabo la síntesis de los LC-PUFAs a partir de ácidos grasos esenciales y 3) como LC- PUFAs preformados y que son consumidos en la dieta (Gil C.M., et. al, 2010;

Rombaldi B.J., et al. 2012).

(26)

Marco teórico Antecedentes

3.5 Antecedentes

Durante el embarazo y la lactancia la madre suministra al producto los ácidos grasos. En estos procesos participan diferentes tejidos como el hígado, la glándula mamaria, el tejido adiposo y la placenta ya sea sintetizándolos o simplemente transfiriéndolos (Rodríguez-Cruz M., et al. 2006; Moltó-Pulgimartí C., et al 2010).

Existe evidencia de que las células trofoblasticas de la placenta incorporaran in vitro sustratos para la síntesis de ácidos grasos saturados y monoinsaturados menores a 18 carbonos (Rosalind A.C., et al. 1987). Pero en este estudio no se evaluó si en la placenta se expresan las enzimas que sintetizan estos ácidos grasos.

Sin embargo, debemos considerar que durante el embarazo y la lactancia existen otros órganos que también suministran ácidos grasos ya sea al feto o al recién nacido, como el hígado, el tejido adiposo y la glándula mamaria. Aunque en el embarazo tanto el hígado como la glándula mamaria, tienen una expresión similar de las enzimas como la ∆5D, ∆6D, elovl 2, elovl 5 y fasn, enzimas reguladas por el factor transcripcional srebp-1c (Rodríguez-Cruz M., et al. 2011). Además este factor transcripcional es regulado por la cantidad de lípidos de la dieta, de manera particular de los ácidos grasos de tipo insaturado, los cuales regulan negativamente la expresión de srebp-1c (Ye J., et al. 2011). Por lo que en nuestro estudio, esperamos que este factor también regule la expresión de las enzimas que sintetizan ácidos grasos en la placenta.

Existen pocos estudios en los que se ha evaluado la expresión de enzimas que sintetizan ácidos grasos en la placenta. La poca información que existe menciona que en la placenta de rata, la expresión de las enzimas elovl 2, ∆5D y ∆6D es baja, aunque los resultados de otros estudios son contradictorios ya que otros reportes no detectan la expresión génica de estas enzimas. Además, se ha identificado en la placenta humana la expresión de las enzimas elovl 1, elovl 2, elovl 4, elovl 5, elovl 6 y elovl 7 (Moltó-Pulgimartí C., et al. 2010; Ohno Y. 2010).

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Marco teórico Antecedentes

A nuestro conocimiento no existe información acerca del efecto que pudieran tener los componentes de la dieta como los lípidos, en la regulación génica de las enzimas que sintetizan ácidos grasos en la placenta, tal como se ha observado en el hígado y la glándula mamaria durante el embarazo (Rodríguez-Cruz M., et al 2011). Es probable que en la placenta los lípidos de la dieta tengan un efecto regulatorio a través del factor de transcripción srebp-1c.

(28)

Justificación

4. Justificación

La placenta es la mediadora de nutrimentos que son transferidos al feto, entre ellos los ácidos grasos, los cuales son importantes para la formación de la retina, del sistema nervioso y forman parte de las membranas celulares del feto. Existe evidencia que la función principal de la placenta es el transporte de los ácidos grasos. Sin embargo, no hay información sobre los mecanismos de síntesis de ácidos grasos en la placenta, por lo que nos enfocaremos a estudiar las enzimas involucradas en este proceso; además de explorar si los lípidos de la dieta regulan la expresión génica de dichas enzimas en el tejido placentario.

(29)

Pregunta de investigación

5. Pregunta de investigación

¿En la placenta de rata se expresan las enzimas que participan en la síntesis de ácidos grasos durante la gestación de la rata?

En caso de ser afirmativo

¿La expresión de las enzimas que sintetizan ácidos grasos en la placenta tienen una regulación como efecto de los lípidos consumidos en la dieta?

(30)

Objetivos

6. Objetivo general

Determinar si en la placenta se expresan los genes que sintetizan ácidos grasos y si éstos son regulados por los lípidos consumidos en la dieta durante la gestación de la rata.

6.1 Objetivos particulares

a) Determinar si en la placenta de rata se expresan los genes que sintetizan ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poli-insaturados.

b) Estudiar el efecto de una dieta baja en lípidos sobre la expresión de genes que sintetizan ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poli-insaturados en la placenta de rata durante la gestación.

c) Determinar la composición de ácidos grasos en la placenta, los fetos y en los recién nacidos de ratas.

d) Estudiar el efecto de una dieta baja en lípidos sobre la composición de ácidos grasos durante la gestación en la placenta, los fetos y recién nacidos de ratas.

(31)

Hipótesis

7. Hipótesis

a) La placenta de rata expresa las enzimas que sintetizan ácidos grasos de tipo saturado, mono y poli-insaturado en el tejido placentario durante el embarazo.

b) Las ratas gestantes que consumen una dieta baja en lípidos, tienen una mayor expresión de las enzimas que sintetizan ácidos grasos saturados, mono y poli-insaturados en la placenta, en comparación con las ratas gestante que consumen una dieta adecuada en lípidos.

(32)

Metodología

8. Metodología

Tipo de estudio.

Retrospectivo, longitudinal, experimental y comparativo.

Población y dietas

Ratas hembras de la cepa Sprague Dawley se dividieron al azar en dos grupos, los cuales a su vez se dividieron en 4 subgrupos (Tabla 6).

Tabla 6. Grupos y subgrupos de las ratas de estudio.

Grupo Subgrupo (n=7)

1. Dieta normal en lípidos (DNL) a) Día de embarazo 14 (E14) b) Día de embarazo 16 (E16) c) Día de embarazo 20 (E20) d) Día de nacimiento (L1) 2. Dieta baja en lípidos (DBL) a) Día de embarazo 14 (E14)

b) Día de embarazo 16 (E16) c) Día de embarazo 20 (E20) d) Día de nacimiento (L1)

Cada grupo de ratas se alimentó con una dieta normal o baja en lípidos. (Tabla 7).

Las dietas se ajustaron a la misma cantidad de energía.

(33)

Metodología

Tabla 7. Composición de las dietas experimentales.

Componentes (g/Kg dieta)

Dieta normal en lípidos (5%)

Dieta baja en lípidos (2%)

Caseína 222 222

Glucosa 307.5 236

Almidón de maíz 307.5 336

Aceite de maíza 50 20

Vitaminasb 10 10

Mineralesc 40 40

Celulosa 63 36

Energía (kJ/g) 15.82 15.65

aComposición de ácidos grasos en el aceite de maíz: ácido palmítico (C16:0), 12.1%; ácido esteárico (C18:0), 2.2%; ácido oleico (C18:1), 30.7%, ácido linolénico (C18:3ω3), 1%; ácido linoléico C18:2ω6), 54%.

bMezcla de vitaminas (por Kg): acido p-aminobenzoico, 11.01g; ácido ascórbico, 101.66g;

biotina, 0.044g; cianocobalamina, 2.97g; ácido fólico, 0.20g; inositol, 11.01g, menadiona, 4.95g; niacina, 9.91g; piridoxina HCl, 2.20g, riboflavina, 2.20g; tiamina HCl, 2.20g: palmitato de retinol seco, 3.96g, ergocalciferol seco, 0.44g; acetato DL--tocoferol, 24.23g, almidón de maíz, 466.67g.

cMezcla de minerales (por Kg): molibdato de amonio, 0.025g; carbonato de calcio, 292.9g;

fosfato de calcio, 4.3g; sulfato cúprico, 1.56g; citrato férrico, 6.23g; sulfato de magenesio,99.8g; sulfato de manganeso, 1.21g; ioduro de potasio, 0.005g; fosfato de potasio 343.1g; cloruro de sodio, 250.6g; selenito de sodio, 0.015g; cloruro de zinc, 0.2g.

Procedimientos

Las ratas se alimentaron con la dieta comercial Chow 5008 desde el destete y hasta las 8 semanas de edad. Al término de la 8° semana se dividieron al azar en dos grupos y se les alimentó con la dieta correspondiente normal (DNL, 5%) o baja (DBL, 2%) en lípidos durante 4 semanas, siendo este un periodo de adaptación a la dieta. Terminado este periodo, las ratas se aparearon y cada grupo se dividió en 4 subgrupos de 7 ratas (por factibilidad) por cada uno de los días de embarazo (14, 16 y 20). Se eligieron estos días que representan la segunda etapa del embarazo, porque es cuando incrementan los requerimientos de los ácidos grasos para el desarrollo del feto.

(34)

Metodología

Se registró el consumo de alimento y el peso de las ratas durante el embarazo y el primer día de lactancia.

Las ratas se sacrificaron por decapitación en los días asignados e inmediatamente se separaron las placentas y los fetos. A partir de la placenta se extrajo el RNA total para el estudio de expresión de enzimas involucradas en la síntesis de ácidos grasos. A la placenta, los fetos y a los recién nacidos se les realizó la extracción de grasa total para determinar el perfil de ácidos grasos.

Expresión de genes involucrados en la síntesis y regulación de ácidos grasos.

A la placenta se le realizó la extracción de RNA total por método de Chomczynski con TRIzol® Invitrogen™, el cual debe cumplir con características de pureza e integridad (Anexo I). A partir del RNA total se sintetizó cDNA con el kit Taq Man Applied Byosystems (No. 808-0234, Anexo II). Para verificar la síntesis de cDNA se amplifico mediante PCR punto final, usando como gen de referencia a β-actina (Anexo III).

Posteriormente se realizó el PCR tiempo real (qRT-PCR) con el kit LightCycler®

FasStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Anexo IV), de cada una de las enzimas involucradas en las síntesis de ácidos grasos como la delta 5, 6 y 9 desaturasa (∆5D, ∆6D y ∆9D), las elongasas (elovl 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7), así como el regulador srebp-1c y su gen blanco fasn y de los genes de referencia tpb (TATA-binding protein) y sdha (succinate dehydrogenase subunit A) (Coan,et al, 2011). Todos los oligonucleótidos fueron diseñados con el programa Primer 3 (versión 4.0) y se describen en la tabla 8.

(35)

Metodología

Tabla 8. Oligonucleótidos de enzimas involucradas en la síntesis de ácidos grasos, regulador y genes constitutivos.

Gen Oligonucleótidos Tm

Enzimas para síntesis de ácidos grasos

∆5D F-5´CGT CAC CCA CAC AAA CCA3´

R-5´GCC TTG CTG CCT CTC TAC TT 3´

62°C

∆6D F-5´GCC TTT GTC CCTT GCT ACC TC 3´

R-5´ TTG TGG AAG ATG TTG GGC T 3´

62°C

∆9D F-5´GCA AGA AGA AAC GCA GAT AC 3´

R-5´TAT GCC AGA TTT TCA ACT TCA A3´

60°C

elovl 1 F-5´ ACC CCA TCA TCA TCC ACC TC 3´

R-5´ GCT CCA TTT TGC TGA ACT GC 3´

62°C

elovl 2 F-5´GCA AGA AAT ACC TCA CGAC AG 3´

R-5´TGG CTT TTT TCG GTA TGT C 3´

62°C

elovl 3 F-5´CTC ATC CTC TGG TCC TTC TG 3´

R-5´GTA GTC GGT AAA GCA CAC AG 3´

62°C

elovl 4 F-5´AAG ACC GAG AGC CGT TTC AA 3´

R-5´CTG TAT CCT GCG TTG TAT GA 3´

62°C

elovl 5 F-5´CTC ACC CTG CTG TCT CTC TA3´

R-5´ATC TGG TGG TGG TTC TTA CG3´

62°C

elovl 6 F-5´AGA TGC TGA TGG GCT GTC TC 3´

R-5´TGA GTG AGG ACC AGA AGA TG 3´

60°C

elovl 7 F-5´CCT GCT ACT CTT TCT CCA CT3´

R-5´GGC TGT GTT TGC GAT TTA GT 3´

62°C

fasn F-5´GAG TGA GGC TGG GTT GAT AC 3´

R-5´CCA AGC AGG CAC ACA CAA TG 3´

60°C

Regulador

srebp-1c F-5´CCC CAC CAG TAC AGA TGA GTC3´

R-5´TCC CAG AGT AGC CCC TTG TCC3´

60°C

Genes de referencia

tbp F-5´CTC AGT TAC AGG TGG AG CA 3´

R-5´CAG CAC AGA GCA AGC AAC TC 3´

60°C

sdha F-5´ CTC GAG ATC CGT GAA GGA AG3´

R-5´ CTC TGA GAT CCC AGG CAG AC3´

60°C

∆5D, ∆6D y ∆9D, ∆5, ∆6 y ∆9Desaturasa; elovl, elongasa; srebp-1c, proteína de unión a elemento regulador de esteroles; tbp, proteína de unión a cajas TATA; sdha, succinato deshidrogenasa subunidad A.

(36)

Metodología

Perfil de ácidos grasos

Previo a la extracción de grasa se realizó un secado para eliminar el agua de los fetos y los recién nacidos, colocándolos a 90°C en una estufa por 2 días consecutivos. Cuando estos estaban secos se pulverizaron en un mortero. En el caso de la placenta se hizo polvo con ayuda de un mortero y con la adición de N2

líquido para evitar su descongelamiento, y así favorecer la pulverización.

A partir del polvo se realizó la extracción de lípidos por medio de la técnica de Folch modificado (Anexo V), esta técnica extrae la grasa total a través de disolventes no polares.

A la grasa total se le realizó una metilación ácida (Anexo VI), donde 2mg de grasa total era la mínima cantidad para metilar, dicha metilación se realiza para que los ácidos grasos sean identificados por medio de cromatografía de gases.

La cantidad de grasa metilada se disolvió en hexano ajustando a una concentración de 6 mg/mL. Se inyectó una alícuota de 1 µL de la solución en el cromatógrafo de gases, para el análisis de composición de ácidos grasos de cada muestra (Anexo VII).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 20.0, con el que se compararon los resultados de expresión de las enzimas de síntesis y el porcentaje de ácidos grasos tanto de la placenta, los fetos y los recién nacidos. Los valores se presentan como el promedio  desviación estándar. Los cambios que se observaron durante el embarazo se analizaron por una prueba de Anova de una vía (P<0.05), y para comparar entre los grupos dietarios se realizó una prueba de t-Student (P<0.05).

(37)

Resultados Peso y consumo de alimento

9. Resultados

9.1 Peso de las madres y consumo de alimento

Al inicio del embarazo, las madres de ambos grupos DNL y DBL iniciaron con un peso de 264.8+24.7g y 272.2+15.7g respectivamente, llegando al final del embarazo a un valor de peso de 405+29.7g y 402.8+27.4g correspondientemente (Gráfica 1).

El consumo de alimento fue similar en ambos grupos DNL y DBL, al inicio del embarazo consumieron 18.7+5.9g y 17+4.7g respectivamente, y al final el valor del consumo de alimento fue 10.4+4.8 y 15.4+8.4g, de ambos grupos. (Gráfica 2)

Gráfica 1. Peso de las madres durante el embarazo y hasta el nacimiento de las crías, del grupo alimentado con una Dieta Normal (DNL, n= 28) o Baja (DBL, n=

28) en lípidos. Los valores son mostrados como (promedio) + EE (error estándar).

(38)

Resultados Peso y consumo de alimento

Gráfica 2. Consumo de alimento de las madres durante el embarazo y hasta el nacimiento de las crías, del grupo alimentado con una Dieta Normal (DNL, n=28) o Baja (DBL, n=28) en lípidos. Los valores son mostrados como + EE.

(39)

Resultados Expresión

9.2 Expresión de enzimas que sintetizan ácidos grasos durante el embarazo

Primeramente nuestros resultados muestran que en la placenta se expresan los genes elovl 1, elovl 4, elovl 6, elovl 7, fasn y ∆9D, que sintetizan ácidos grasos de tipo saturado y monoinsaturado. Asimismo la expresión de los genes elovl 2, elovl 5, ∆5D y ∆6D, que sintetizan ácidos grasos poli-insaturados fue identificado.

Sin embargo, a pesar de que la placenta expresa a la elovl 3, esta expresión fue insignificante (Cp36), por lo que este gen no se consideró importante para la síntesis de ácidos grasos en nuestro modelo de estudio. Además, los resultados muestran la expresión del factor de trascripción srebp-1c, regulador de la síntesis de ácidos grasos.

9.2.1 Saturados

Durante el transcurso del embarazo, las enzimas que sintetizan ácidos grasos de tipo saturados elovl 7 y la fasn, muestran diferencias significativas (P<0.05) en su expresión en placenta. La elovl 7 aumentó su expresión al día 16 y 20, con respecto al día 14 del embarazo en ambos grupos de estudio. De manera contraria, fasn disminuyó su expresión en los mimos días, en comparación al día 14, en los dos grupos. Las enzimas elovl 1 y elovl 4, no tuvieron cambios en expresión durante embarazo, en ninguno de los grupos de estudio (Gráficas 3 y 4).

9.2.2 Monoinsaturados

Las enzimas que sintetizan ácidos grasos monoinsaturados como la ∆9D y elovl 6, muestran diferencias significativas (P<0.05) en su expresión en placenta en el grupo DNL, ambas enzimas muestran una disminución en su expresión en los días 16 y 20 en comparación con el día 14 del embarazo. En el grupo DBL la expresión de la elovl 6, tiene un patrón de expresión igual que en el grupo DNL, ya que disminuyó (p<0.05) durante el día 16 y 20, en comparación con el día 14 de gestación. Por otro lado la expresión de la ∆9D en el grupo DBL no muestra diferencias significativas (Gráficas 3 y 4).

(40)

Resultados Expresión

Gráfica 3. Expresión de enzimas de síntesis de ácidos grasos saturados y monoinsaturados en placenta a lo largo del embarazo, de ratas alimentadas con una DNL (n= . ANOVA a,b,1,2,I,II P <0.05. Los valores son mostrados como + EE.

(41)

Resultados Expresión

Gráfica 4.Expresión de enzimas de síntesis de ácidos grasos saturados y monoinsaturados en placenta a lo largo del embarazo, de ratas alimentadas con una DBL (n=7 ratas/día). ANOVA a,b,1,2,P<0.05. Los valores son mostrados como

+ EE.

9.2.3 Poli-insaturados

La expresión en la placenta de elongasas y desaturasas así como el factor de transcripción regulador de la síntesis de los ácidos grasos poli-insaturados muestra diferencias significativas (P<0.05) en ambos grupos.

En el grupo DNL, la ∆5D disminuye su expresión al día 16 y aumenta al día 20, llegando a valores de expresión iguales a los que se presentan en el día 14 del embarazo. En cambio en el grupo DBL la expresión de ∆5D aumenta

(42)

Resultados Expresión

significativamente (P<0.05) a partir del día 16 a comparación con el día 14 del embarazo. Otras de las enzimas que mostraron cambio en la expresión fueron

∆6D, elovl 2 y elovl 5. En el grupo DNL estos genes disminuyeron su expresión a partir del día 16 a comparación con el día 14 del embarazo. Contrario a esto, en el grupo DBL, el transcrito de ∆6D y elovl 5 aumentó hasta el día 20 del embarazo (Gráfica 5 y 6).

Las diferencias en la expresión de las desaturasas y elongasas, son congruentes con la expresión del factor de transcripción srebp-1c en el grupo DBL. En la gráfica 6 se observa que hay un incremento significativo (P<0.05) en la expresión de este factor a medida que transcurre el embarazo en comparación con el día 14 en el grupo DBL. Este patrón de expresión es similar para la ∆5D, ∆6D y elovl 5 del mismo grupo.

Gráfica 5. Expresión de enzimas de síntesis de ácidos grasos poli-insaturados en placenta a lo largo del embarazo, de ratas alimentadas con una DNL (n=7 ratas/día). ANOVA a,b,1,2,I,II

P<0.05 *Kruskal Wallis &,#P<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

(43)

Resultados Expresión

Gráfica 6. Expresión de enzimas de síntesis de ácidos grasos poli-insaturados en placenta a lo largo del embarazo, de ratas alimentadas con una DBL (n=7 ratas/día). ANOVA a,b,1,2,,I,II´P<0.05 *Kruskal Wallis &,#P<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

9.3 Efecto de los lípidos de la dieta sobre la expresión de enzimas que sintetizan ácidos grasos

9.3.1 Saturados

Nuestros resultados indican que únicamente la expresión de elovl 4 muestra una diferencia significativa (P<0.05) al final de la gestación, esta enzima aumenta su expresión en el grupo DBL al día 20, manteniendo una expresión igual en ambas dietas en el día 14 y 16 del embarazo. Por lo contrario, la expresión de la enzimas elovl 1, elovl 7 y fasn en la placenta son iguales en ambas dietas (Gráfica 7, 8, 9 y 10).

(44)

Resultados Expresión

Gráfica 7. Expresión de la elovl 1 en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. Los valores son mostrados como + EE.

(45)

Resultados Expresión

Gráfica 8. Expresión de la elovl 4 en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,b P<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

(46)

Resultados Expresión

Gráfica 9. Expresión de la elovl 7 en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. Los valores son mostrados como + EE.

(47)

Resultados Expresión

Gráfica 10. Expresión de fasn en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. Los valores son mostrados como + EE.

9.3.2 Monoinsaturados

Las enzimas de estudio que sintetizan ácidos grasos monoinsaturados, muestran diferencias significativas (P<0.05) entre los dos grupos de dieta. La ∆9D muestra un aumento en la expresión en el grupo DBL en el día 16 y 20 del embarazo, a comparación con el grupo DNL (Gráfica 11). Contrario a esto, la expresión de elovl 6 muestra una disminución en la expresión en el día 16 del embarazo, siendo igual la expresión en ambos grupos en el día 14 y 20 del embarazo (Gráfica 12).

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Resultados Expresión

Gráfica 11. Expresión de la ∆9 desaturasa en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,b,1,2 P<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

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Resultados Expresión

Gráfica 12. Expresión de la elovl 6 en placenta a diferentes días del embarazo.

Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,bP<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

9.3.3 Poli-insaturados

Los valores de expresión de las enzimas que sintetizan ácidos grasos poli- insaturados, muestran diferencias significativas (P<0.05) al comparar el grupo DNL con el grupo DBL. Ambas desaturasas ∆5D y ∆6D muestran un aumento en la expresión en el grupo DBL a los días 16 y 20 del embarazo (Gráficas 13 y 14).

Pero la elovl 5 y el factor srebp-1c muestran un aumento en su expresión en el grupo DBL sólo en el día 20 del embarazo en comparación con el grupo DNL (Gráficas 15 y 16). Este patrón de expresión fue diferente para el caso de la elovl 2, ya que su expresión disminuye en el grupo DBL en el mismo día (Gráfica 17).

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Resultados Expresión

Gráfica 13. Expresión de ∆5 desaturasa en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,b,1,2P<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

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Resultados Expresión

Gráfica 14. Expresión de ∆6 desaturasa en placenta a diferentes días del embarazo. Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,b,1,2P<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

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Resultados Expresión

Gráfica 15. Expresión de la elovl 5 en placenta a diferentes días del embarazo.

Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante U-Mann Whitney a,bP<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

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Resultados Expresión

Gráfica 16. Expresión de srebp-1c en placenta a diferentes días del embarazo.

Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,bP<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

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Resultados Expresión

Gráfica 17. Expresión de la elovl 2 en placenta a diferentes días del embarazo.

Los valores de expresión se compararon entre las dietas DNL (n=7 ratas/día) vs DBL (n=7 ratas/día) mediante t-Student. a,bP<0.05. Los valores son mostrados como + EE.

Referencias

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