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CRIOCONSERVACIÓN DE EJES EMBRIONARIOS Y ÁPICES CAULINARES DE CASTAÑO (Castanea sativa Mill.) Y ROBLE (Quercus robur L.)

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Facultad de Biología

Departamento de Genética

CRIOCONSERVACIÓN DE EJES EMBRIONARIOS

Y ÁPICES CAULINARES DE CASTAÑO (Castanea

sativa Mill.) Y ROBLE (Quercus robur L.)

TESIS DOCTORAL

LORENA JORQUERA MARTÍNEZ

Santiago de Compostela 2009

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Facultad de Biología

Departamento de Genética

CRIOCONSERVACIÓN DE EJES EMBRIONARIOS Y

ÁPICES CAULINARES DE CASTAÑO (Castanea sativa

Mill.) Y Roble (Quercus robur L.)

MEMORIA PRESENTADA POR: LORENA JORQUERA MARTÍNEZ

PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA EN BIOLOGÍA Santiago de Compostela, junio 2009

Instituto de Investigaciones

Agrobiológicas de Galicia

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ANA MARÍA VIEITEZ MARTÍN Y MARÍA CONCEPCIÓN SÁNCHEZ FERNÁNDEZ, PROFESORA DE INVESTIGACIÓN Y CIENTÍFICO TITULAR RESPECTIVAMENTE DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

CERTIFICAN:

Que la presente memoria titulada “CRIOCONSERVACIÓN DE EJES EMBRIONARIOS Y ÁPICES CAULINARES DE CASTAÑO (Castanea sativa

Mill.) Y ROBLE (Quercus robur L.)”, que presenta Lorena Jorquera Martínez para optar al Grado de Doctor en Biología, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Fisiología Vegetal del Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia.

Que consideran que representa un trabajo de Tesis y autorizan su presentación en el Departamento de Genética de la Universidad de Santiago de Compostela

Y para que así conste, se firma el presente certificado en Santiago de Compostela, junio 2009

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RAFAELA MARIA AMARO GONZÁLEZ. PROFESORA TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE GENÉTICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.

Como tutor de la doctoranda Lorena Jorquera Martínez, autoriza la presentación de la Memoria titulada “CRIOCONSERVACIÓN DE EJES EMBRIONARIOS Y APICES CAULINARES DE CASTAÑO (Castanea sativa Mill.) Y ROBLE (Quercus robur L.)”, en el Departamento de Genética para optar al grado de Doctor.

Y para que así conste, firmo el presente certificado en Santiago de Compostela, junio 2009.

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1. Conservación de recursos forestales

La conservación de los recursos genéticos de las especies forestales ha adquirido gran importancia ya que de una situación inicial, en la cual las políticas de conservación biológica se planeaban a escala específica, hoy en día, constituye una prioridad dentro de las estrategias nacionales de conservación (Martín Albertos y González Martínez, 2000).

El aumento de la población mundial, así como el necesario incremento en la calidad de vida de sus habitantes, particularmente en los países en vías de desarrollo, está generando una demanda considerable de productos de la agricultura y la selvicultura, situación que ha aumentado la presión sobre los bosques, causando un considerable problema medioambiental, provocando la pérdida de especies y hábitats (Alía et al., 2003; Bhalerao, 2003; Walter, 2004). Esta problemática fue abordada desde los años sesenta, por los organismos internacionales, que comenzaron a preocuparse seriamente por la erosión genética de los recursos naturales en el mundo; de esta manera a partir una iniciativa de la FAO se creo en el año 1965 un grupo de expertos en prospección e introducción de plantas (Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR)). Este grupo coordinó durante varios años, diversas acciones en materia de conservación de germoplasma y en el año 1974, dio lugar a la aparición del Consejo Internacional de Recursos Fitogenéticos (IBPGR, actualmente IPGRI), cuya misión fue la creación de una red internacional de instituciones nacionales y regionales dedicadas a la conservación de recursos genéticos de interés agrícola (Esquinas- Alcázar, 1981). Esta iniciativa se vio continuada por las Conferencias Ministeriales de Estrasburgo (1990), Helsinki (1993) y Lisboa (1998) y el Convenio sobre Diversidad de la Conferencia de las Naciones Unidas sobre Medio Ambiente y Desarrollo, celebrada en Río de Janeiro (1992). En esta última, se prevé el papel relevante que deben tener las plantaciones forestales de producción intensiva y en las que la mejora (genética y cultural) juegue un papel importante (Pâques, 1999; Martín Albertos y González Martínez, 2000, Toribio y Celestino, 2000).

La gestión y conservación de los recursos genéticos forestales comienza con el estudio del estado actual de los bosques. Al realizar un análisis de los riesgos y las presiones que los afectan actualmente, se señalan como los principales, la fragmentación y pérdida de hábitats de las especies, así como importantes cambios en la composición genética de sus poblaciones. En este sentido se pueden mencionar como amenazas a la integridad

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genética de las masas forestales en España, las actividades humanas, los incendios y el cambio climático.

El efecto antrópico sobre el estado actual de la cubierta arbórea de España es el resultado de la gestión forestal tradicional, lo que ha llevado a la sobreexplotación de los recursos con la consiguiente fragmentación y degradación de los montes por el cambio en el uso de los suelos y la presión urbanística.

El fuego es un elemento permanente en los ecosistemas de España y la repetición de estos eventos, impiden la regeneración natural de la cobertura arbórea, lo cual se ve agravado por el tipo de estructura forestal actual que produce incendios de gran intensidad, lo que les convierte en una de las causas mas importantes de la desaparición de las áreas forestales.

Una de las amenazas más serias a largo plazo, es el cambio climático. Este fenómeno ejerce su influencia en todo el mundo y es consecuencia de la interacción humana sobre el ambiente, afectando al rango de distribución de las especies forestales así como a la calidad de dichas masas, sobre todo en las zonas más áridas y de alta montaña (Martín Albertos y González Martínez, 2000).

El mantenimiento a largo plazo de la viabilidad evolutiva de las especies forestales necesita el mantenimiento de la diversidad de los bosques naturales, así como la conservación y utilización de los recursos genéticos, ligado a la mejora genética y cultural, con el fin de maximizar las posibilidades de supervivencia de las masas forestales (Ledig, 1988; Erikson y col., 1993, Rajora y Mosseler, 2001). Las estrategias de conservación deben estar diseñadas de forma que cumplan efectivamente dicho propósito, con el fin de mantener la variabilidad intraespecífica existente en el área de distribución de una especie determinada (Turok, 1995). Según la convención de diversidad biológica, existen dos tipos de estrategias que se aplican en la conservación de los recursos genéticos vegetales, la conservación in situ y la ex situ (UNCED, 1992).

1.1 Conservación in situ

Se denomina conservación in situ, a la conservación de los recursos genéticos en su ambiente natural, tanto para producción forestal como para la preservación de áreas protegidas, lo que implica el mantenimiento de una población dada dentro del ecosistema del que forma parte independientemente que dicho ecosistema esté sujeto a

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la interacción humana. Este término se aplica generalmente a poblaciones silvestres que se regeneran de forma natural en áreas protegidas y que pueden ser integradas para uso múltiple forestal (Frankel, 1976). La unidad de conservación genética in situ se define como una masa forestal autóctona, en buen estado de conservación, con estructura irregular y que puede estar constituida por una mezcla de especies (Koski y col., 1997; Thomson y col., 2001).

Para la protección de masas forestales degradadas se han generado diversas figuras de protección de espacios naturales (reservas, parques nacionales, parques naturales, etc.), para cuyo manejo se deberán tomar una serie de medidas de gestión, como asegurar el medio ante las amenazas anteriormente indicadas, conservar la biodiversidad desde un punto de vista integral, considerando no sólo la especie amenazada sino también las acompañantes (Adams y col., 1998; Martín Albertos y González Martínez, 2000).

1.2 Conservación ex situ

La conservación ex situ se refiere a cualquier colección mantenida fuera del habitat natural del germoplasma (Roberts, 1973; UNED, 1992, Maxted y col, 1997). La salvaguarda de los valiosos recursos genéticos no debe depender exclusivamente de los métodos in situ; aunque sería preferible conservar “toda” la diversidad in situ, más que trasladar el germoplasma a un ambiente artificial para ser conservado, la existencia de las colecciones ex situ actúan como un seguro contra pérdidas totales o extinción y además permiten un fácil acceso para la evaluación del material (Maxted y Kell, 2003). El objetivo de la conservación ex situ es mantener una colección de genotipos de una especie determinada que posea la mayor cantidad de alelos posibles, es decir, que represente un rango de combinaciones genéticas tan amplio como sea posible, de forma que pueda ser utilizada para la investigación y mejora, lo cual implica una eficiente prospección y caracterización de la especie. Para la recolección de muestras de la especie a conservar, se debe tener en cuenta la adquisición de la mayor diversidad genética de la zona, con el fin de combatir la erosión genética. También hay que procurar que la colección contenga material novedoso desde un punto de vista genético, incluyendo material que beneficie un objetivo particular de mejora y que permita la realización de ensayos de distribución de la biodiversidad (Hayward y Sackville-Hamilton, 1998).

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Para la conservación del germoplasma ex situ existen diferentes alternativas, dependiendo del tipo de material con el que se trabaje, diseñándose diferentes estrategias que incluyen: jardines botánicos, colecciones de plantas en campo y bancos de germoplasma en los que cabe reseñar, bancos de semillas, bancos de ADN, bancos de polen, bancos de yemas vegetativas, bancos de germoplasma in vitro.

1.2.1 Los jardines botánicos han permitido históricamente, la propagación de ciertos cultivos lejos de sus zonas de origen, particularmente de ciertas especies no cultivadas, plantas medicinales, especies silvestres, especies amenazadas o raras. De hecho, existen muchas especies que actualmente sólo se encuentran en los jardines botánicos debido a que en su lugar de origen se han extinguido, lo que las convierte en un material único y excepcional (Dullo y col., 1998). Se da la paradoja de que la mayoría de los jardines botánicos están localizados en áreas urbanas de clima templado (como Europa y Norteamérica), que son regiones donde no existe mucha diversidad genética, ya que las áreas donde realmente existe una mayor riqueza de especies vegetales son las zonas tropicales, las cuales no poseen los recursos necesarios ni el personal para mantener un jardín botánico (Hawkes y col., 2000). Otro tipo de limitación para mantener colecciones de este tipo, es la falta de diversidad contenida en cada accesión o entrada, debido al limitado espacio que existe para cada especie y el elevado costo de mantenimiento, sobre todo de especies que no son propias de la zona donde se conservan, como es el material de origen tropical (Maxted y Kell, 2003).

1.2.2 Las colecciones de plantas en campo constituyen un método generalmente utilizado para un amplio rango de especies con semillas recalcitrantes, con semillas no viables o estériles, con semillas altamente heterocigotas o especies que deben ser propagadas clonalmente (de reproducción vegetativa) (Maxted y col., 1997). Para formar la colección se recolecta el material que se desea conservar desde las plantaciones agrícolas, jardines y de localizaciones silvestres, transfiriéndolas a una segunda localidad en donde se cultivan y controlan (Hawkes y col., 2000). La ventaja de este sistema es que ofrece un fácil acceso para la caracterización, evaluación y utilización del material; sin embargo, el coste de mantenimiento de la colección es muy elevado debido a que necesita grandes extensiones, sobre todo en especies forestales. Este sistema es además, laborioso y complicado, está expuesto a riesgos de pérdida y

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sólo se puede conservar un limitado número de genotipos de una especie debido a las restricciones de recursos humanos, de financiación y terreno disponible, lo que limita la diversidad genética que se puede conservar (Ford-Lloyd y Jackson, 1986; Hamon y col., 1995). Por otra parte, el hecho de que la especie esté conservada como monocultivo la hace más susceptible al ataque de enfermedades y plagas, y muchas veces el medio ambiente donde se mantiene no es igual a su habitat de origen por lo que no tendrá un desarrollo óptimo. Esta condición también provoca la existencia de una gran presión de selección con la consiguiente erosión genética del material conservado. La alternativa que se debe considerar, para evitar en parte esta situación, es constituir una colección núcleo que represente la mayor variabilidad genética de toda la colección de germoplasma (Frankel, 1984) o bien duplicar la colección en distintos ambientes ecogeográficos (Dulloo y col., 1998).

1.2.3 Bancos de germoplasma

La conservación ex situ de plantas esta basada esencialmente en la utilización de los bancos de germoplasma en los cuales se almacenan los propágulos que representan la variabilidad genética de una determinada especie. Dentro de esta categoría se pueden distinguir, los bancos de semillas, los bancos de genes o ADN, los bancos de polen, bancos de yemas vegetativas y los bancos de material cultivado in vitro (Iriondo Alegría, 2001).

Los bancos de semillas, corresponden al almacenamiento de semillas a largo plazo y es uno de los métodos más utilizado y válido ya que es una operación relativamente simple y económica en términos de tecnología, infraestructuras, personal y gastos de mantenimiento (Maxted y col., 1997). De esta forma se puede mantener un gran número de semillas de distintas especies vegetales durante largos períodos de tiempo y con un mínimo riesgo de daños genéticos. La conservación de semillas ofrece como mínimo un servicio de seguridad y apoyo a otras técnicas de conservación y puede constituir la única opción disponible en aquellos casos en que exista peligro de desaparición de una especie determinada (Reid y Miller, 1989).

Según las recomendaciones de los estándares de bancos de germoplasma de la FAO y el IPGRI (FAO/ IPGRI, 1994), las semillas son almacenadas con un bajo porcentaje de humedad (generalmente 3-4% ) a bajas temperaturas comprendidas entre -20ºC (para almacenamientos a largo plazo) y 4ºC (para períodos medios y cortos). Una gran parte de las especies de clima templado producen semillas, llamadas ortodoxas que pueden

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ser almacenadas de esta manera. Sin embargo, existe un grupo de especies frutales y forestales, la mayoría de origen tropical pero también de clima templado, que producen semillas recalcitrantes o sensibles a la desecación, es decir, semillas que no pueden tolerar bajos contenidos de humedad que permitan su almacenamiento a baja temperatura (Chin y Roberts, 1980). Ejemplos de especies con semillas recalcitrantes de zonas templadas son las del género Quercus (Q.suber, Q.robur), Castanea, Acer saccharinum, Aesculus hippocastanum. Existe otra categoría de semillas que poseen características de almacenamiento intermedias entre las ortodoxas y las recalcitrantes, pueden ser desecadas como las semillas ortodoxas pero su viabilidad desciende rápidamente durante el almacenamiento en frío (Ellis et al., 1990), como es el caso de especies del género Citrus (Hong y Ellis, 1995), Corylus avellana (Degeyter, 1987), Camellia sinensis (Amma y Watanabe, 1983) y especies arbóreas importantes como Acer macrophyllum, Afrocarpus gracilior, Agathis macrophylla, Araucaria columnaris, Araucaria racemosa y Araucaria rulei (Hong y col., 1996).

Los bancos de ADN han surgido recientemente como una técnica potencialmente interesante para la conservación de recursos genéticos. Los extractos de ácidos nucleicos, como secuencias de ADN son considerados recursos genéticos que se pueden obtener de forma rutinaria e inmovilizar en una membrana de nitrocelulosa y ser almacenados a baja temperatura (congeladores a –80 ºC o a –196 ºC) (Adams, 1998). La principal ventaja de esta metodología es que sólo requiere una mínima cantidad de material para almacenar. Sin embargo, se necesita que exista la posibilidad de reintroducir el material en genotipos o especies relacionados, si bien la regeneración de un organismo completo o la expresión de genes particulares es aún un proceso complicado (Miller et al, 1995).

Los bancos de polen. Otro tipo de propágulo que permite el almacenamiento a largo plazo son los granos de polen aunque con este método se conserva la mitad del genoma. Estos bancos son conceptualmente útiles, sin embargo su establecimiento ha sido más frecuente en la industria forestal para constituir huertos semilleros y en programas de mejora genética, ya que facilita los cruces, la distribución e intercambio de germoplasma (Jett y col., 1993; Mercier, 1995). Por otra parte el polen en un estadío inmaduro resulta muy difícil de almacenar porque posee un gran contenido acuoso, y se necesita una colección de campo que proporcione flores femeninas para llevar a cabo una propagación convencional (Wang y col., 1993).

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Los bancos de yemas vegetativas se utilizan en la actualidad en la conservación de clones de especies frutales y requieren la puesta a punto de la técnica del injerto sobre planta patrón. Esta técnica podría ser aplicable a determinados casos de especies arbustivas o arbóreas en peligro de extinción. En ambos casos, el almacenamiento se realiza a bajas temperaturas, siendo aplicables las técnicas de crioconservación (Iriondo-Alegría, 2000).

Bancos de germoplasma in vitro. En la actualidad se reconoce como muy valioso el almacenamiento de germoplasma in vitro, el cual debería ser una herramienta complementaria a los métodos tradicionales de conservación de germoplasma (Taylor, 1997). Las consideraciones sobre sus características y aplicaciones se desarrollarán en el apartado siguiente.

2. Conservación mediante técnicas de cultivo in vitro

La biotecnología ofrece distintas opciones para la recolección, multiplicación y conservación de recursos genéticos vegetales, sobre todo para el mantenimiento de colecciones de especies recalcitrantes, especies que se propagan única y exclusivamente por vía vegetativa, y también material vegetal de interés proveniente de genotipos elite o genéticamente transformados (Benson 1999; Engelmann, 1994). Entre las aplicaciones potenciales de los métodos de almacenamiento de germoplasma in vitro se puede mencionar también la conservación de la variación somaclonal y gametoclonal, almacenamiento de cultivos de meristemos para la micropropagación, almacenamiento de cultivos celulares para aplicaciones industriales, en especial para la producción de metabolitos secundarios o productos de interés farmacéutico y conservación de plantas en peligro de extinción. El establecimiento de bancos de germoplasma in vitro facilita la propagación de material vegetal en ambientes controlados con un requerimiento de espacio muy inferior a las colecciones de campo, haciendo posible la conservación, el manejo, el transporte e intercambio de material libre de patógenos entre los distintos laboratorios, asegurando la preservación del material hasta el momento oportuno para ser transferido a condiciones de campo (Engelmann 1991; Razdan y Coocking, 1997; Benson, 1999).

La micropropagación basada en la proliferación de brotes axilares o adventicios, es considerada la primera herramienta en lograr la conservación de germoplasma vegetal a través del cultivo in vitro (Lambardi y De Carlo, 2003). Con esta técnica los brotes

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obtenidos se subcultivan cada 3 a 6 semanas en la mayoría de las especies leñosas. La propagación de plantas a través de las técnicas de cultivo in vitro no se ha logrado en todas las especies, algunas se comportan de forma recalcitrante a la regeneración in vitro debido a la influencia que tiene el genotipo, estado ontogénico, así como el estado fisiológico del material de origen. Sin embargo, las técnicas de cultivo in vitro, presentan algunas desventajas; con este método se obtienen grandes volúmenes de material lo que implica problemas en la gestión de una colección in vitro demasiado extensa (Engelmann, 1997). Además existe el peligro de perder el material en cada subcultivo por contaminación o un error humano. Más importante aún es la posibilidad de que ocurra la pérdida de la integridad genética debido a la variación somaclonal cuyo riesgo se incrementa con el número de subcultivos. Es considerado un método costoso de conservación de germoplasma y sólo se emplea a corto o medio plazo; no obstante, utilizando esta herramienta como base, se han diseñado otras metodologías complementarias (Engelmann 1991, 1994). El almacenamiento de germoplasma mediante la metodología de cultivo in vitro se puede llevar a cabo fundamentalmente por medio de dos técnicas: crecimiento reducido y congelación a -196ºC (crioconservación) (Monette, 1995).

2.1 Almacenamiento con crecimiento reducido

El crecimiento reducido in vitro es una opción conveniente para la conservación de plantas leñosas a medio plazo. Esta técnica permite extender los intervalos entre subcultivos, reduciendo los costes de mantenimiento del material así como disminuir los riesgos de contaminación entre subcultivos (Grout, 1995). El objetivo es reducir drásticamente el metabolismo de la planta sin afectar su fisiología, viabilidad, ni su capacidad de regeneración bajo condiciones normales (Lambardi y De Carlo, 2003). Esta reducción de la actividad metabólica puede ocurrir a través de la disminución en la intensidad de la luz, la temperatura, utilizando retardantes del crecimiento, suprimiendo la fuente de carbono o bien elevando la osmolaridad del medio (Staritsky, 1997). En estas condiciones 12 meses de almacenamiento entre subcultivos es la práctica habitual para muchas especies, prolongándose incluso hasta más de dos años.

En el caso de especies leñosas, tolerantes a las bajas temperaturas, se pueden almacenar entre los –3ºC y los 12ºC, siendo lo común un rango de temperatura entre 2ºC y 5ºC. Esta disminución de la temperatura se combina normalmente con la disminución de la intensidad lumínica o aplicación de condiciones de oscuridad.

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Por ejemplo, en cultivos de Prunus armeniaca se logró una supervivencia de los cultivos, después de un almacenamiento de hasta 6 meses en oscuridad a 3ºC (Pérez-Tornero y col., 1999). En Castanea sativa x C. crenata, Quercus sp y Prunus avium se conservaron en frío (2ºC), segmentos nodales y ápices caulinares durante 12 meses con baja intensidad de luz, sin diferencias significativas en la regeneración de plantas entre los dos tipos de explantos (Janeiro y col., 1995). En Quercus suber los cultivos fueron almacenados in vitro durante dos años a 5ºC en oscuridad, obteniendo tasas de multiplicación similares a los controles sin almacenar e incluso con una longitud media del brote significativamente mayor (Romano y Martins-Loução, 1999). Segmentos nodales de brotes in vitro de Malus pumila Mill., fueron almacenados en oscuridad a 4ºC durante 18 meses sin afectar la capacidad de proliferación una vez finalizado el periodo de conservación (Negri y col., 2000).

Las especies de origen tropical, que normalmente son sensibles a bajas temperaturas, generalmente se almacenan a temperaturas superiores a la de las plantas leñosas de clima templado. Por ejemplo los cultivos in vitro de Musa pueden almacenarse a 15ºC hasta 15 meses (Banerjee y De Langhe, 1985) y los ápices de Colocasia esculenta se pueden conservar a 9ºC en oscuridad durante 8 años, transfiriendo el material a medio fresco cada tres años (Bessembinder y col., 1992).

Los retardantes del crecimiento como el ácido abscísico se han aplicado para la conservación de cultivos de brotes de Eucalyptus grandis, lográndose mantenerlos durante 10 meses sin transferencias (Watt y col., 2000). Otra alternativa es la modificación del medio de cultivo, creando un estrés osmótico por medio de sustancias que son metabólicamente inactivas como el manitol; es el caso de ápices de manzano cv. Gala que fueron así mantenidos durante un año (Hao y Deng, 2003). También se comprobó que remplazando la sacarosa por ribosa los cultivos in vitro de plátano podían ser almacenados durante 24 meses (Ko y col., 1991).

Otras técnicas alternativas incluyen la modificación del ambiente gaseoso de los cultivos, disminuyendo la cantidad de oxígeno disponible, lo que se lleva a cabo cubriendo los explantes con parafina, aceite mineral o medio líquido. La disminución de la presión parcial de oxígeno también se puede lograr en una cámara presurizada o a través de la metodología de atmósfera controlada. Dorion y col. (1994), demostraron que la hipoxia a temperaturas medias o normales, puede reemplazar el almacenamiento a bajas temperaturas en brotes de Prunus persica. Los cultivos de callos de arroz pueden

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ser almacenados en atmósferas saturadas, ricas en dióxido de carbono (CO2) o nitrógeno

(N2) (Watanabe y col., 1991).

Por último, otra alternativa de almacenamiento es la utilización de las llamadas semillas sintéticas como ha sido descrito por Redenbaugh y col. (1991), al encapsular embriones somáticos. Los embriones somáticos de Pinus patula fueron encapsulados y almacenados a 2ºC en oscuridad, durante 4 meses, sin afectar la capacidad de germinación (Ravindra y van Staden, 2005). Sin embargo, los ápices caulinares encapsulados de Camellia japónica, presentaron un porcentaje de supervivencia del 10% después de 75 días de almacenamiento (Ballester y col., 1997).

Las limitaciones señaladas para la conservación de germoplasma in vitro también deben ser consideradas en el caso de utilizar el crecimiento reducido. El número de clones que se debe mantener supone un esfuerzo e inversión en tiempo y dinero, a lo que debe sumarse el riesgo asociado de pérdidas por contaminación u otro tipo de error. Por el contrario la metodología de crioconservación se presenta como única estrategia para almacenar germoplasma vegetal a largo plazo utilizando la regeneración in vitro. La técnica se basa en la detención del desarrollo celular debido a que el material es congelado a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC), lo que en teoría permitiría el almacenamiento de germoplasma durante un período de tiempo ilimitado (Lambardi y De Carlo, 2003).

2.2 Crioconservación

El término crioconservación se refiere al almacenamiento de material en nitrógeno líquido a una temperatura de –196ºC o en su fase de vapor, a -150ºC, en la cual se detienen los procesos metabólicos y la división celular por lo que teóricamente, el material puede ser almacenado por un tiempo indefinido sin alteraciones ni modificaciones, con la ventaja añadida que se almacena en un espacio reducido, protegido de contaminación y con un mínimo de mantenimiento (Engelmann, 2004). La tecnología de la conservación en nitrógeno líquido comenzó hace algunas décadas con los estudios realizados en células animales y más recientemente en vegetales (Engelmann, 1997). La crioconservación ha sido aplicada con éxito a numerosas especies con semillas recalcitrantes o altamente heterocigotas, plantas de propagación vegetativa, cereales, plantas ornamentales, frutales de ambientes tropicales y templados, leguminosas, oleaginosas, plantas medicinales y aromáticas. En cada caso se han

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utilizado técnicas y objetivos diferentes, entre los que se incluyen la crioconservación de protoplastos, suspensiones celulares, callos, yemas apicales y axilares, meristemos, embriones somáticos y cigóticos, así como también productos biotecnológicos (cultivos productores de metabolitos secundarios y líneas celulares genéticamente modificadas), los cuales debido a su dificultad y costo de producción poseen un valor añadido (Sakai, 1995; Stushnoff y Seufferheld, 1995, Engelmann, 2004). Actualmente se considera que la crioconservación es la técnica más segura para el almacenamiento a largo plazo de germoplasma vegetal.

De acuerdo con Crowe y col., (1988), un 95% del agua presente en las células y tejidos vegetales es agua libre mientras que un pequeño porcentaje se encuentra en forma de agua asociada, formando parte de constituyentes macromoleculares de gran importancia a nivel funcional y/o estructural (Mazur, 1969; Levitt, 1980). Debido al gran contenido hídrico de las células, el mayor desafío para la criobiología es realizar una congelación sin la formación de cristales de hielo en el interior de las células, ya que esta situación conduce a la ruptura de las membranas y como consecuencia la pérdida de la semipermeabilidad y la compartimentalización celular, produciéndose el colapso y la lisis celular. El daño mecánico sufrido por las células se debe a dos fenómenos: por un lado al comportamiento peculiar del agua que se expande en el momento de la congelación y el segundo a la formación de cristales de hielo. Por lo tanto, las células deben ser deshidratadas artificialmente para protegerlas sin comprometer su viabilidad, utilizando para ello diferentes técnicas que se basan en distintos mecanismos físicos empleados en la crioconservación. Las denominadas técnicas clásicas se basan en la deshidratación inducida por congelación, realizándose la congelación en dos fases. Más recientemente se han desarrollado nuevas técnicas basadas en el proceso de vitrificación

2.2.1 Técnica clásica de crioconservación

Los primeros protocolos de crioconservación utilizaron la congelación en dos fases: primero una congelación lenta hasta temperaturas de precongelación (entre 30ºC y -40ºC) a una velocidad de enfriamiento definida (alrededor de 0,5 - 1,0ºC/min), utilizando un congelador programable, seguido de una inmersión directa en nitrógeno líquido. Este método se basa en procesos físico-químicos naturales que ocurren en la congelación y que fueron descritos por Mazur (1969). A medida que la temperatura

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disminuye aproximándose a los 0ºC, el medio externo celular y la célula logran el estado de “supercongelación”, ya que al descender la temperatura se forma hielo en el medio extracelular pero el contenido de la célula permanece descongelado, posiblemente porque la pared celular y la membrana plasmática impiden que los cristales de hielo presentes en los espacios extracelulares, penetren en la célula y desencadenen la congelación del citoplasma. Si la congelación ocurre lentamente el agua difunde del interior de la célula supercongelada hacia el medio externo, debido a la diferencia de presión de vapor de agua, y es convertida en hielo en la superficie de la célula o entre el protoplasto y la pared celular. Este fenómeno produce la deshidratación inducida por congelación, con lo cual la célula disminuye la cantidad de agua libre en su interior evitando la formación de hielo intracelular. En el momento que el potencial hídrico de las células parcialmente deshidratadas igualan al del hielo extracelular se establece un equilibrio y la deshidratación se detiene, a una temperatura constante, que es la de congelación (Mazur, 1969). La velocidad de enfriamiento y congelación, determinará la cantidad de agua que difunda al espacio extracelular antes de que el contenido celular solidifique. En condiciones óptimas, la mayor parte del agua intracelular se elimina, lo que evita o reduce al máximo el daño por la formación de cristales de hielo en el momento de la inmersión en nitrógeno líquido; sin embargo una deshidratación a través de esta técnica puede provocar daños debido al aumento en la concentración de sales y cambios en la membrana celular (Meryman y col., 1977). En resumen esta técnica incluye una serie de pasos sucesivos; precultivo del material, crioprotección, congelación lenta hasta que la temperatura descienda a la de precongelación, seguida de una inmersión rápida del material en nitrógeno líquido, almacenamiento, descongelación rápida y recuperación en medio de cultivo. La técnica, requiere de aparatos de congelación programables para alcanzar los parámetros precisos de velocidad de enfriamiento y temperatura de congelación que determinarán la viabilidad del material a conservar. La congelación de dos fases ha sido aplicada con éxito a sistemas de cultivo poco diferenciados como suspensiones celulares y callos (Kartha y Engelmann, 1994; Withers y Engelmann, 1997), y sobre todo a masas embriogénicas y embriones somáticos de coníferas, como por ejemplo en Picea glauca engelmanii complex (Cyr y col., 1994), Picea abies (Norgaard y col., 1993), Pinus radiata (Hargreaves y Smith, 1994 a,b). Esta técnica ha sido empleada también en ápices caulinares de especies tolerantes al frío (Reed y Chang, 1997), en yemas en

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dormición de Malus (Forsline, 1993), en ápices de Pyrus (Mi y Sanada, 1994), mientras que su utilización en especies tropicales ha sido excepcional (Escobar y col., 1997).

2.2.2 Nuevas técnicas de criconservación

Las nuevas técnicas de congelación desarrolladas están basadas en el proceso de vitrificación, definido como la transición del agua directamente de la fase líquida a una fase amorfa o metaestable, evitando la formación de cristales de hielo (Franks, 1982; Fahy y col., 1984). En este caso el sólido que se forma es en realidad una solución supersaturada de alta viscosidad lo que le confiere las propiedades mecánicas de un sólido aunque no exista la formación de una estructura cristalina como tal. La transición al estado vítreo no implica cambios químicos sino físicos en la viscosidad del líquido (Santos, 2001). Para lograr esto, la deshidratación celular se lleva a cabo antes de la congelación mediante la exposición de las muestras a soluciones crioprotectoras concentradas y/o desecación por exposición a flujos de aire. Estas técnicas son más apropiadas para explantos de estructuras organizadas, con una mayor especialización celular, como ápices y embriones, los cuales contienen varios tipos celulares, cada uno con diferentes requerimientos si se utiliza el método clásico de congelación en dos fases. Además las metodologías basadas en procedimientos de vitrificación son operacionalmente menos complejas y poseen el gran potencial de tener una mayor aplicabilidad, necesitando modificaciones menores según los distintos tipos celulares. Una de las características de estos procedimientos es asegurar la supervivencia mediante un adecuado protocolo de deshidratación hasta valores normalmente bajos de humedad, los cuales varían dependiendo del procedimiento empleado y del tipo de material que se utiliza. Estas técnicas pueden producir altos niveles de recuperación después de la descongelación, son altamente repetitivos, el método de crioconservación es más simple y no requiere equipos sofisticados ni costosos (Engelmann, 1997).

El desarrollo de técnicas basadas en la vitrificación ha permitido crioconservar un gran número de especies vegetales, debido a que son aplicables a distintos tipos de material. Engelmann (1999) ha considerado diferentes tecnologías basadas en el proceso de vitrificación denominadas: encapsulación-deshidratación; vitrificación; encapsulación– vitrificación; deshidratación; precrecimiento; precrecimiento-deshidratación y congelación por gotas.

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2.2.2.1 Encapsulación-deshidratación

El proceso de encapsulación-deshidratación está basado en la tecnología desarrollada para la producción de semillas artificiales, en la cual los embriones somáticos son encapsulados en un gel hidrosoluble (Redenbaugh y col., 1991).

Los explantes se encapsulan generalmente en alginato de calcio. La formación de la cápsula se basa en la capacidad del alginato para formar complejos con cationes metálicos di y trivalentes, mediante la formación de enlaces iónicos entre grupos ácidos carboxílicos sobre las moléculas de ácido glucurónico de alginato. El alginato es soluble en agua a 25ºC y gelifica en el momento de ponerse en contacto con cationes divalentes, normalmente calcio. Desde un punto de vista técnico, las cápsulas se forman fácilmente pipeteando la solución de alginato (que contiene el ápice caulinar o embrión) en la solución de calcio, formándose la cápsula inmediatamente (Redenbaugh y col., 1993). Una vez encapsulado el material, se precultiva en un medio líquido enriquecido con sacarosa de forma que se promueve una deshidratación osmótica, desecándose seguidamente hasta contenidos de humedad de un 20%, empleando sílica gel o bien exponiendo el material en la cámara de flujo laminar. Terminada la deshidratación del material las cápsulas se sumergen directamente en nitrógeno líquido (Dereudre y col., 1991).

Las ventajas de esta metodología incluyen la fácil manipulación de material frágil como ápices caulinares, embriones o tejido embrionario, el control sobre el porcentaje de desecación, los altos porcentajes de supervivencia y la rápida y directa regeneración de brotes. La encapsulación-deshidratación se ha aplicado en plantas leñosas de clima templado, por ejemplo en ápices caulinares de distintas especies de Ribes dando en algún caso porcentajes de regeneración de plantas de un 90% (Reed y col., 2000). Con los ápices caulinares de Actinidia deliciosa (Wu y col., 2001) y yemas axilares de Vitis vinifera (Zhao y col., 2001) encapsulados en alginato, se obtuvieron porcentajes de regeneración después de la descongelación, de 50 y 40% respectivamente.

También se ha utilizado en suspensiones celulares y embriones somáticos (Engelmann, 1997, Engelmann, 2000).

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2.2.2.2 Vitrificación

La vitrificación propiamente dicha, implica una serie de pasos que incluyen el precultivo de las muestras en un medio enriquecido con sustancias crioprotectoras, el pretratamiento de los explantes con soluciones crioprotectoras (“loading”) (Matsumoto y col., 1994), y la deshidratación con soluciones de vitrificación muy concentradas. Estas últimas inducen una deshidratación osmótica de las células y durante esta etapa se produce la vitrificación total del citosol. Seguidamente, se procede a la inmersión rápida de las muestras en nitrógeno líquido y llegado el momento la descongelación rápida, eliminación de las soluciones crioprotectoras y por último el cultivo en un medio de recuperación apropiado.

El éxito de los protocolos de vitrificación radica en lograr la suficiente deshidratación del tejido, pero al mismo tiempo se debe evitar el efecto tóxico de los componentes de la solución de vitrificación; a este respecto, se ha observado que el precultivo de ápices en medio enriquecido con sacarosa (o sorbitol) antes de la exposición a la solución crioprotectora, ha mostrado ser efectivo en mejorar la supervivencia en especies de clima templado (Yamada y col., 1991; Kohmura y col., 1994; Matsumoto y col., 1994, 1995a, 1995b, Niwata, 1995, Hirai y col., 1998). En algunas especies tropicales, este precultivo es indispensable para asegurar la supervivencia de los ápices (Takagi, 2000). También se ha demostrado que disminuyendo la temperatura durante la exposición a la solución de vitrificación se puede evitar su efecto tóxico, aunque aumenta el período del tratamiento. En células embrionarias de espárrago se obtuvieron mejores resultados realizando el proceso de vitrificación entre 5 a 60 minutos a 0ºC que aplicando el mismo tratamiento durante 5 minutos a 25ºC (Nishizawa y col., 1993).

En general los protocolos de vitrificación alcanzan porcentajes aceptables de supervivencia del material (del 50% o incluso superior), la recuperación es generalmente rápida y directa, aunque en ciertas especies se ha observado el desarrollo de callo o desarrollo anormal de las plantas (Towill, 1990; Gonzalez-Benito y Pérez, 1994). Los procedimientos de vitrificación han sido desarrollados para un gran número de especies diferentes, utilizando protoplastos, suspensiones celulares, ápices y embriones somáticos (Cyr, 2000; Sakai, 2000; Sakai y col., 2002).

Una variante de esta metodología ha sido desarrollada con el fín de reducir la toxicidad de la solución de vitrificación en Vitis vinifera, en la cual los ápices axilares se exponen a la solución vitrificadora reducida a la mitad de su concentración en la primera mitad

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del período total de exposición, y en el segundo período se aplica a la concentración total. Con esta metodología se han logrado porcentajes de regeneración de brotes superiores a los alcanzados con la aplicación de la solución en su concentración total durante todo el tiempo de exposición a la solución de vitrificacion (Matsumoto y Sakai, 2003).

2.2.2.3 Encapsulación-vitrificación

Esta técnica es una combinación de las técnicas de encapsulación-deshidratación y vitrificación. Las muestras son encapsuladas en alginato para después proceder al proceso de vitrificación. Esta metodología fue desarrollada por Tannoury y col., (1991) en ápices de clavel aplicando una solución de vitrificación a los ápices encapsulados, alcanzando porcentajes de supervivencia de más del 90%. En el caso del wasabi, los ápices fueron encapsulados en alginato junto con la solución crioprotectora de loadig (glicerol y sacarosa) para después exponerlos a la solución vitrificadora (PVS2), obteniéndose un 95% de recuperación (Matsumoto y col., 1995b). Estos autores observaron que el porcentaje de recuperación de los ápices de Wasabia japonica, fue un 30% mayor que el obtenido mediante la técnica de encapsulación-deshidratación, debido a que la cápsula de alginato podría reducir la toxicidad de la solución de vitrificación. La técnica de encapsulación-vitrificación fue aplicada también en ápices de Armoracia (Puchindawan y col., 1994) y lirio (Matsumoto y col., 1995a).

Aunque esta técnica ha sido utilizada en un número limitado de especies, posee un gran potencial en términos de eficiencia, ya que reduce el número de manipulaciones y la duración de todo el proceso de crioprotección (Engelmann, 1998).

2.2.2.4 Desecación

Este es uno de los procedimientos más simples ya que consiste en la deshidratación del material, hasta cierto contenido de humedad, seguido de la congelación por inmersión rápida en nitrógeno líquido. Esta técnica se ha aplicado preferentemente a embriones cigóticos o ejes embrionarios de varias especies, incluyendo numerosos árboles forestales, así como también a embriones somáticos de algunas especies como en Quercus robur y a ápices caulinares como el caso del olivo (Martínez y col., 1999). La desecación del material se lleva a cabo exponiendo éste al flujo de aire de la cámara de flujo laminar o a la acción desecante de la sílica gel, con la cual se logran condiciones

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más precisas y reproducibles de desecación. En relación con este método se ha aplicado la desecación con aire comprimido a embriones de Landolphia kirkii (Pammenter y col., 1991), y también con sílica gel en un recipiente herméticamente sellado. De esta forma se obtuvo supervivencia cuando el contenido de humedad de los embriones con relación a su peso fresco se encontraba entre el 10% y el 20% (Engelmann, 1992).

El éxito de la técnica va a depender del estado de desarrollo de los embriones en el momento de la recolección, por ejemplo los embriones maduros de Coffea alcanzaron mejores porcentajes de supervivencia que aquellos en un estado inmaduro (Abdelnour-Esquivel y col., 1992). En muchos casos los embriones son excesivamente sensibles a la desecación, como ocurre en las especies con semillas recalcitrantes en las que con una pequeña reducción en los contenidos de humedad se produce un deterioro irreparable del tejido, ya que el contenido de humedad necesario para que no se produzcan daños por congelación está por debajo del umbral crítico de viabilidad de la semilla (Chandel y col., 1995; Pence, 1995; Sun, 1999).

2.2.2.5 Precultivos con crioprotectores

El precultivo es una técnica que consiste en cultivar las muestras en presencia de un crioprotector, para después congelarlas en nitrógeno líquido. El cultivo del material vegetal en un medio con la incorporación de crioprotectores es un método que puede mejorar los resultados de supervivencia tras el proceso de crioconservación. En suspensiones celulares se utiliza a menudo el precultivo durante algunos días, con diferentes concentraciones de azúcares (sacarosa, melobiosa, trealosa), azúcar-alcohol (manitol, sorbitol) o aminoácidos (asparagina, alanina, prolina) (Butenko y col., 1984; Withers, 1985; Göldner y col., 1991). En el caso de callos dicho precultivo se prolonga incluso durante semanas, aumentando en ambos casos la tolerancia a la crioconservación (Reinhoud y col., 1995). Pritchard y col. (1986) y Gnanapragasam y Vasil (1992) observaron que el precultivo de las células vegetales en manitol o sorbitol puede causar una reducción en el volumen vacuolar, debido a la redistribución de una gran vacuola central en pequeñas vesículas. Esta técnica fue aplicada también en la criconservación de embriones somáticos de zanahoria, precultivándolos en sacarosa 0,4 M durante 21 horas y posteriormente congelándolos en nitrógeno líquido con porcentajes de supervivencia del 80% (Thierry y col., 1997). De forma similar ha sido desarrollada en la conservación de germoplasmam de Musa precultivando los

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meristemos en sacarosa (0,4 M) durante dos semanas seguido de la rápida congelación en nitrógeno líquido (Panis y col., 2002).

2.2.2.6 Precultivo-desecación

En esta metodología se combinan las dos técnicas anteriormente descritas. En una primera etapa los explantes son tratados con una solución crioprotectora y seguidamente se someten a desecación parcial en la cámara de flujo laminar o en presencia de sílica gel con la subsecuente inmersión rápida en nitrógeno líquido. Esta técnica ha sido aplicada a un limitado número de especies, como embriones somáticos de palma de aceite (Dumet y col., 1993), palma datilifera, café, guisante (Mycock y col., 1995), melón (Shimonishi y col., 1991), segmentos de brotes de espárrago (Uragami y col., 1990), microesporas de Brassica napus (Uragami y col., 1993) y embriones cigóticos de coco (Assy- Bah y Engelmann, 1992).

2.2.2.7 Congelación en gotas (Droplet freezing)

Esta técnica se basa en la utilización de soluciones crioprotectoras que son dispensadas en los meristemos caulinares, los cuales son transferidos a hojas de aluminio en la que se han dispuesto pequeñas gotas (2-3 µl) de la solución crioprotectora y posteriormente se congelan lentamente como en el caso de meristemos de cassava (Kartha y col., 1982) o de forma rápida sumergiendo directamente el material en nitrógeno líquido como en meristemos de patata (Scháfer- Menuhr, 1996). Esta técnica también se ha aplicado a ápices de manzano (Zhao y col., 1999) y espárrago (Mix-Wagner y col., 2000).

2.2.3 Optimización de las técnicas

2.2.3.1 Mecanismos de tolerancia al frío

Los mecanismos de que disponen algunas especies para la tolerancia al frío pueden resultar ventajosos en el proceso de crioconservación, utilizando explantes que en condiciones naturales logran soportar bajas temperaturas. Existen determinadas especies que en condiciones naturales alcanzan una gran adaptación a los ambientes con bajas temperaturas, con mecanismos de protección que incluyen el aumento de los fosfolípidos hidratados en la cabeza polar de la superficie de las membranas (Steponkus

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y Web, 1992), acumulación de osmolitos compatibles, como carbohidratos solubles en el citoplasma (Sakai y Yoshida, 1968), endurecimiento de la paredes celulares (Rajashekar y Lafta, 1996), acumulación de proteínas de anticongelación (AFP) en los espacios apoplásticos (Griffith y Antikainen, 1996) y cambios a nivel de retículo endoplasmático (ER) (Fujikawa y Takabe, 1996). Varios autores han utilizado yemas en período de dormición de cultivos como manzano (Sakai y Nishiyama, 1978; Wu y col.,2001), cerezo (Towill y Forsline, 1999) y vid (Zhao y col., 2001), aprovechando la capacidad que posee este tipo de material de tolerar el frío de forma natural.

El endurecimiento en frío es una segunda alternativa para preparar el material y consiste en inducir artificialmente los mecanismos de aclimatación; de esta manera las plantas donadoras de explantes son cultivadas a bajas temperaturas (generalmente 4-5ºC) durante algunas semanas (Niino y col., 1992b). La mayoría de las investigaciones apuntan que tres semanas de endurecimiento en frío son suficientes para aclimatar los brotes antes de la excisión de la yema; no obstante en el caso de ciertas especies como cerezo, se necesitaron 45 días de cultivo en frío (Niino y col., 1997). Otra alternativa para inducir la tolerancia al frío, una vez excindido el material de la planta madre o aislado de cultivos embriogénicos, consiste en el cultivo a 4ºC durante diferentes períodos, que pueden oscilar desde 24 horas en Malus ssp. (Wu y col., 1999) a 96 horas en Aesculus hippocastanum (Lambardi y col., 1999).

El precultivo de los explantos en un medio con altas concentraciones de azúcares, normalmente sacarosa es otro de los mecanismos que se ha utilizado en la crioconservación. Esta estrategia se basa en las observaciones realizadas en la naturaleza en donde el mayor recurso disponible para las células es la acumulación de carbohidratos, lo cual previene los daños por congelación y deshidratación, probablemente promoviendo la formación de un estado de vitrificación, y estabilizando las membranas y proteínas (Crowe y col., 1990; Fujikawa y Jitsuyama, 2000). La incorporación de este tipo de precultivos a las técnicas de crioconservación ha dado buenos resultados en frambuesa donde la resistencia al frío mejoró significativamente con la adición de sacarosa al medio de cultivo; este aumento en el potencial osmótico de las células se traduce también como una desecación del material, que permite obtener mejores porcentajes de recuperación después de la crioconservación (Palonen y Junttila, 1999). De forma similar se observó que la tolerancia al frío de los cultivos de brotes de peral aumentó significativamente con el incremento de sacarosa en el medio de

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precultivo (Chang y Reed, 2001), así como también en cultivos de células embriogénicas de espárrago en presencia de sacarosa (Fujikawa y Jitsuyama, 2000). En condiciones naturales se han establecido relaciones entre la capacidad de tolerar el frío por parte de la planta y la síntesis de algunos metabolitos como azúcares, proteínas y ácidos nucleícos (ARN) (Brown, 1978; Kacperska-Palacz, 1978; Levitt, 1980). Las plantas leñosas de clima templado, acumulan carbohidratos solubles en sus tejidos durante la aclimatación al frío al entrar en reposo, y el momento en que son más tolerantes a las bajas temperaturas corresponde a la máxima acumulación de estos carbohidratos solubles (Imanishi y col., 1998). De esta manera se ha observado que al combinar bajas temperaturas con el precultivo de los ápices en un medio con altas concentraciones de sacarosa (0,3 M – 0,7 M) mejora la supervivencia durante la congelación rápida (Niino y col., 1992a, 1992b; Niino y col., 1997; Channuntapipat y col., 2000; Matsumoto y Sakai, 2000; Matsumoto y col., 2001). Sin embargo las concentraciones de sacarosa superiores a 0,9 M son letales como se observó en el caso de Populus (Lambardi y col., 2000) y ciruelo (De Carlo y col., 2000).

2.2.3.2 Crioprotectores

En los protocolos de crioconservación el material debe estar protegido durante dos etapas cruciales que son la congelación y la descongelación. Para lograr este objetivo se utilizan sustancias protectoras que son añadidas al medio de cultivo, o directamente sobre la muestra a crioconservar y que actúan envolviendo o protegiendo a las células (Grout, 1991). Existen un gran número de compuestos como el glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), etilenglicol, polietilenglicol, azúcares (glucosa, sacarosa) y polialcoholes (manitol, glicerol, sorbitol) y aditivos de elevado peso molecular (polivinilpirrolidona, polietilenglicol, dextrano) (Chen y Karta, 1987), que aplicados solos o en acción combinada, son capaces de preservar los tejidos del daño producido durante el proceso de conservación con nitrógeno líquido. El mecanismo exacto de acción de los crioprotectores es hasta el momento poco conocido; se cree que sus propiedades coligativas pueden minimizar la acción letal de una concentración excesiva de electrolitos, como resultado de la deshidratación y la conversión de agua en hielo (Nash, 1966). Estas sustancias crioprotectoras también pueden interactuar directamente con los sistemas de membrana de diferentes formas, neutralizando el efecto tóxico de la alta concentración de solutos (Santarius, 1971; Volger y Herber, 1975), proporcionando

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protección y estabilidad en su configuración y aumentando la resistencia al estrés durante la congelación (Williams y Meryman, 1970). Sin embargo, la mayoría de dichos crioprotectores muestran un cierto grado de toxicidad dependiendo de la concentración a la cual sean aplicados. Los crioprotectores más empleados son el dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicerol en concentraciones de 3 a 15%. El DMSO se caracteriza por tener una velocidad de penetración intracelular mayor que el glicerol por lo que la duración del pretratamiento sería menor; sin embargo, se ha observado que a determinadas concentraciones puede ejercer un efecto tóxico sobre el material y provocar alteraciones a nivel genético. El glicerol es menos tóxico aunque su grado de permeabilidad va a depender de la especie y de la temperatura de actuación (Kartha y Engelmann, 1994). En embriones somáticos de coníferas se ha generalizado el precultivo en un medio conteniendo DMSO (5-10%) además de otros azúcares como glucosa, sorbitol o sacarosa, como paso previo a la congelación en dos fases (Cyr, 1999).

El tiempo y la temperatura de exposición a los crioprotectores en concentraciones no tóxicas es fundamental para evitar posibles daños de plasmólisis celular y variaciones en el estado fisiológico de los cultivos. En relación a la temperatura se ha observado que la mejor opción es la aplicación a bajas temperaturas (0ºC a 4ºC), ya que el crioprotector se incorpora gradualmente y se minimizan los daños. Así mismo, añadir estas sustancias al medio de cultivo pre- o post-aislamiento de los explantes guarda estrecha relación con la supervivencia del material (Kartha y Engelmann, 1994).

Entre las soluciones de crioprotección utilizadas se ha desarrollado la solución de “loading” como tratamiento previo antes de que el material se trate con una solución de vitrificación deshidratante. Esta solución contiene sustancias crioprotectoras (sacarosa, glicerol, etilenglicol) y se aplica durante cortos períodos de tiempo, de 5 a 90 minutos, dependiendo del material. La más conocida y utilizada es una mezcla de glicerol (2 M) y sacarosa (0,4 M) desarrollada por Matsumoto y col. (1994).

Las soluciones de vitrificación concentradas son mezclas complejas de crioprotectores que han sido formuladas por su gran capacidad de deshidratar el tejido induciendo la formación de una estructura amorfa vitrea. La aplicación de soluciones vitrificadoras comenzó con el trabajo de dos grupos: el de Sakai (Sakai y col., 1990), que utilizó una mezcla de glicerol (22%), etilenglicol (15%), propilenglicol (15%), DMSO (7%) y sorbitol (0,5 M). El segundo tipo de solución de vitrificación fue desarrollado por el grupo de Steponkus (Langis y col., 1989), el cual utilizó etilenglicol (40%), sorbitol (15%) y seroalbumina bovina (6%). Sin embargo la utilización de soluciones

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vitrificadoras se hizo extensiva después de que el grupo de Sakai y col. (1991) definiera la solución de PVS2 (Plant Vitrification Solution nº2) para la crioconservación de células nucelares de Citrus sinensis. Esta mezcla esta compuesta por glicerol (30%), etilenglicol (15%) y dimetilsulfóxido (15%) en medio de cultivo líquido conteniendo 0,4 M de sacarosa. Se ha utilizado en los protocolos de vitrificación y vitrificación-encapsulación en un gran número de especies, lo que ha permitido mejorar los porcentajes de supervivencia y crecimiento de ápices caulinares; por ejemplo, en la crioconservación de ápices de Prunus jamasakura se alcanzaron porcentajes de regeneración de brotes de 97% (Niino y col., 1997), en Populus alba de 90% (Lambardi y col., 2000) y en almendro de 87,5% (Channuntapipat y col., 2000)

2.2.4 Descongelación y recuperación

La descongelación, debe ser lo más rápida posible para evitar la recristalización del agua, ya que los cristales que se forman son de mayor tamaño y por lo tanto más nocivos, lo que puede comprometer la regeneración y recuperación del crecimiento de los tejidos meristemáticos (Mazur, 1984; McFarlane y Forsyth, 1987; Grout, 1995). El método más utilizado para descongelar es sumergir las muestras en un baño de agua o en medio líquido entre 20ºC a 40ºC (Engelmann, 1997). Se observó que la temperatura óptima de descongelación en plantas leñosas como Populus, fue de 40 ºC, lo que permitió el crecimiento de brotes sanos y bien desarrollados (Lambardi, 2002).

Después de la descongelación rápida, el material generalmente se cultiva en un medio semisólido, previamente definido con el fin de promover el crecimiento y desarrollo del material crioconservado. Se ha observado que la utilización de papel de filtro dispuesto sobre el medio, ha permitido disminuir el estrés en el material vegetal, mejorando los resultados de supervivencia y crecimiento de brotes (Lynch y Benson, 1991; Lynch y col., 1994).

El medio de cultivo utilizado para el material descongelado es básicamente similar al empleado para el material no congelado (cultivos stock), con ciertas modificaciones que mejoran en forma sustancial los porcentajes de supervivencia. Por ejemplo, el empleo de un medio libre del ión amonio (Kuriyama y col., 1989), o también un medio suplementado con carbón activo (Scrijnemarkers y Van Iren, 1995), ácido ascórbico (Fretz y Lorz, 1995), surfactantes, como el Pluronic F-68 (Anthony y col., 1996; Craig y col., 1997), hemoglobina como Erythrogen® (Azhakanandam y col., 1998) o un

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agente quelante del hierro, como la desferroxiamina (Benson y col., 1995), son medidas que optimizan los resultados después de la descongelación del material.

2.2.5 Material vegetal utilizado en crioconservación

La crioconservación ha sido aplicada a un gran número de especies, genotipos y variedades, de climas templado y tropical, lo que ha permitido conservar material de cultivos hortícolas, frutales, forestales y ornamentales. La mayoría de los trabajos realizados en crioconservación han utilizado, meristemos, ápices caulinares, cultivo de células o protoplastos, embriones somáticos y embriones cigóticos, con el objetivo de conservar la especie en cuestión o un propágulo determinado manteniendo a la vez la fidelidad genética (Kartha y Engelmann, 1994).

Cada especie que se desee conservar, a través de la crioconservación, deberá tener definido un sistema de regeneración y multiplicación in vitro eficiente. El hecho de poseer un sistema de propagación in vitro permite también sincronizar los cultivos en el momento de iniciar un pretratamiento o un precultivo. De esta forma, se parte de un material similar en relación a tamaño, composición celular y estado fisiológico lo que garantiza un resultado uniforme y comparable (Engelmann, 2004).

Los ápices caulinares son en general, uno de los explantes más utilizados en la crioconservación de especies leñosas debido a la estabilidad que presentan al conservar las características genéticas de la planta que le dió origen, siempre y cuando la regeneración de brotes sea directa y no a través de tejido de callo (Lambardi y De Carlo, 2003; Kartha y Engelmann, 1994). Los ápices caulinares se pueden obtener de yemas apicales y axilares aisladas de los brotes mantenidos en cultivo in vitro. El objetivo es aislar el domo apical acompañado de algunos primordios foliares, con el fin de proteger el meristemo de la desecación y de las sucesivas manipulaciones del explanto durante los protocolos de crioconservación, lo cual ha mejorado sustancialmente los porcentajes de supervivencia (Lambardi y de Carlo, 2003). Otra razón para utilizar este tipo de material, es que la zona meristemática que origina los tejidos más organizados, está compuesta por una población de células pequeñas, relativamente homogénea y en división activa. Estas células se caracterizan por poseer pequeñas vacuolas y una alta relación núcleo citoplasma, circunstancia que permite que estén mejor preparadas para soportar la deshidratación que las células más diferenciadas que poseen una gran vacuola (Benson 1999; Engelmann, 2004).

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Otro tipo de material muy utilizado en la crioconservación de especies forestales son los cultivos embriogénicos y los embriones somáticos. Este método proporciona una alta tasa de multiplicación lo que permite mantener especies con semillas recalcitrantes o con baja producción de semillas. Desde los primeros trabajos en coníferas realizados por Galerne y Dereuddre (1987) crioconservando masas embriogénicas de Picea abies, se ha desarrollado una extensa labor en la crioconservación de especies forestales como Pinus pinaster (Bercectche y Pâques, 1995), Picea glauca, Picea mariana, Larix spp (Charest y Klimaszewska, 1995). La crioconservación de cultivos embriogénicos de coníferas ha avanzado especialmente desde un punto de vista tecnológico; más de 5000 genotipos de 14 especies de coníferas han sido crioconservados y almacenados en el centro BC Inc. en Columbia, Canadá (Cyr, 2000). Uno de los objetivos de la crioconservación en conífieras es el mantener las características juveniles de los cultivos embriogénicos, de forma que después de una selección en campo de los genotipos más interesantes, éstos se recuperan del nitrógeno líquido lo que permite establecer un programa de clonación forestal (Grossnickle y col., 1996; Cyr, 1999).

En el ámbito de las angiospermas leñosas los primeros trabajos de crioconservación de cultivos embriogénicos fueron realizados en células nucelares de naranja Navel (Sakai y col., 1991), y otros ejemplos representativos incluyen la conservación de embriones somáticos de nogal (De Bocaud y col., 1994), olivo (Shibli y Al- Juboory, 2000) fresno (Tonon y col., 2001), Quercus robur (Martínez y col., 2003), Castanea sativa (Corredoira y col, 2004b) y Quercus suber (Valladares y col., 2004).

En especies con semillas recalcitrantes o intermedias, el método normalmente utilizado para la crioconservación, es la deshidratación rápida o relativamente rápida de los ejes embrionarios, acompañado en ciertas ocasiones por pretratamientos previos a la inmersión en nitrógeno líquido. En este caso se debe también establecer un protocolo de desinfección, inoculación in vitro, germinación y desarrollo de las plántulas, como pasos previos al almacenamiento en nitrógeno líquido (Engelmann, 1997b). En general las semillas recalcitrantes son relativamente grandes debido al tamaño de los cotiledones, mientras que el eje embrionario representa sólo una pequeña parte del volumen, y es suficientemente pequeño para poder ser deshidratado rápidamente y teóricamente crioconservado con éxito (Chin y col., 1989). Sin embargo, la desventaja de utilizar este tipo de material es que contiene diferentes tipos de tejidos con diferente grado de complejidad, lo que implica que presentan distinta sensibilidad frente a la desecación y congelación, siendo por lo general el ápice radicular más resistente que el

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ápice caulinar. En todos estos casos existe un contenido hídrico por debajo del cual los tejidos no pueden recuperarse. Por otra parte la selección de embriones en un estado de desarrollo adecuado es crucial para el éxito de un protocolo de crioconservación; sin embargo, las semillas presentan distintos contenidos de humedad y estado de madurez entre los distintos origenes, entre los distintos lotes y dentro de cada uno de éstos, entre las sucesivas recolecciones, lo cual dificulta aun más su crioconservación.

En comparación con los resultados obtenidos con especies que se conservan utilizando otro tipo de explantos como ápices caulinares o embriones somáticos, la crioconservación de semillas recalcitrantes o sub-ortodoxas no ha dado resultados consistentes. Los porcentajes de supervivencia son bastante bajos y en muchos casos la regeneración se limita a la formación de callo o desarrollo incompleto de las plántulas, coincidiendo además con que el número de entradas que se ha ensayado es bastante limitado. Una de las razones para explicar el restringido desarrollo de la crioconservación de este tipo de especies, parece deberse a que en la mayoría de los casos se trata de especies silvestres, de las que poco se conoce del comportamiento de sus semillas en almacenamiento. Además en mucho de estos casos, los protocolos de cultivo in vitro, desde la inoculación hasta la aclimatación no están bien definidos (Engelmann, 1999). La ventaja de utilizar ejes embrionarios es que una vez descongelado el material y optimizando el proceso de recuperación, se regeneran plantas completas (Berjak y col., 2000), si el protocolo de crioconservación está bien definido.

En aquellas especies en las que es impracticable la congelación de todo el embrión o del eje embrionario se ha desarrollado una estrategia alternativa utilizando los ápices caulinares provenientes de la germinación de los embriones, o bien yemas adventicias o embriones somáticos inducidos en tejidos embrionarios (Pence, 1995).

La crioconservación de especies con semillas recalcitrantes se ha estudiado en una gran variedad de trabajos con la finalidad de la conservación a largo plazo, como por ejemplo: Quercus petraea (Jorgensen, 1990), Fagus sylvatica (Ahuja, 1993), Junglans nigra (Pence, 1991), Aesculus hippocastanum (Pence, 1992), Camellia sinensis (Wesley- Smith y col., 1992; Kuranuki y col., 1995), Quercus faginea (González- Benito y Pérez- Ruiz, 1992), Camellia japonica (Janeiro y col., 1997), Quercus rubra (Sun, 1999).

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2.2.6 Utilización a gran escala de la crioconservación de germoplasma vegetal

El uso de la crioconservación aún es limitado, sin embargo existen algunas especies en las que se ha logrado su crioconservación a gran escala utilizando distintos tipos de material.

En el caso de especies con semillas ortodoxas, la crioconservación es utilizada en aquellos casos en los que la longevidad es limitada o se trata de especies en peligro de extinción o endémicas (Pritchard, 1995; Gonzalez-Benito y col., 1999; Pence, 1999). El Centro Nacional de Preservación de Recursos Genéticos NCGRP (National Center for Genetic Resources Preservation, Fort Collins, CO, USA), conserva 37.654 entradas de un total de 360.629 semillas en vapor de nitrógeno líquido (Towill y col., 1998). El Departamento Nacional de Recursos Genéticos Vegetales, NBPGR (National Bureau for Plant Genetic Resources, Nueva Delhi, India) conserva 1.200 entradas de 50 especies diferentes, en su gran mayoría de especies medicinales en peligro de extinción (Mandal, 2000). Esta técnica ha sido utilizada en jardines botánicos, como en el Real Jardín botánico de Perth en Australia, el cual almacena cerca de 110 entradas de especies raras o amenazadas, o el jardín botánico de Cincinnati en Estados Unidos que almacena en nitrógeno líquido especies nativas en peligro de extinción o endémicas (Pence, 1991). En Costa Rica, en el Centro de Educación Superior e Investigación de Agricultura Tropical se almacenan en nitrógeno líquido semillas de 80 entradas de Coffea arabica, que constituyen la colección núcleo de la colección de campo y han sido deshidratadas previamente a su almacenamiento en nitrógeno líquido. De forma similar en Francia, dentro del proyecto nacional de conservación de los recursos genéticos de vid, semillas de cerca de un millar de entradas de germoplasma han sido crioconservados después de una desecación parcial (Dussert y col., 2003).

La crioconservación de yemas en dormición ha permitido el almacenamiento de aproximadamente 2.200 entradas de germoplasma de manzano lo que constituye una duplicación de la colección de campo de germoplasma de manzano en USA (Forsline y col., 1999). En Japón la colección de campo de morera es mantenida por el Instituto Nacional de Recursos Agrobiológicos NIAR, en Yamagata e incluye un total de 756 entradas, de las cuales 420 han sido crioconservadas (Niino, 1995). En Francia, Afocel conserva yemas en dormición de 300 entradas de olmo europeo en nitrógeno líquido. Investigaciones similares se llevan a cabo para congelar yemas de vid, con la ayuda de

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IRD Francia y el NCGRP (National Center for Genetic Resources Preservation, Fort Collins, CO) de Estados Unidos.

La técnica de crioconservación ha permitido el almacenamiento de polen utilizado en los programas de mejora genética en distintas especies vegetales (Towill y Walters, 2000), así como líneas de callo en especies de interés farmacéutico (Spencer, 1999) y líneas embriogénicas en especies forestales (Cyr, 2000).

La crioconservación se ha aplicado en bancos de germoplasma de especies propagadas vegetativamente utilizando ápices caulinares como material de partida. Se ha avanzado mucho en la conservación de la patata, con colecciones de 519 entradas crioconservadas en el Instituto de Ciencias de Cultivos y Pastos en Braunschweig, Alemania (Mix- Wagner y col., 2003) y mas de 200 entradas en el Centro Internacional de la Papa (CIP) en Lima, Perú (Golmirzaie y Panta, 2000). En relación con la conservación de Pyrus se ha duplicado la colección de campo de este género (100 entradas) en el Repositorio Nacional de germoplasma clonal de Estados Unidos (NCGR, Crovallis, OR), con otro duplicado en en el NCGRP en Fort Collins (Reed y col., 2000).

El INIABP (Red internacional para la mejora de la banana y el plátano) con base en Leuven, Bélgica posee 100 entradas de germoplasma de Musa en crioconservación y unas 1.036 están en etapas previas (Panis, 2004). También se están desarrollando protocolos para la crioconservación a gran escala de germoplasma de Cassava y Fragaria (Roca y col., 2002; Engelmann, 2004)

La utilización a gran escala de la técnica de crioconservación implica aumentar la cantidad de material que se maneja normalmente de unos pocos genotipos a nivel de laboratorio, hasta cientos o miles en el banco de crioconservación, por lo que se necesita el establecimiento de procedimientos específicos para su manejo (Dussert y col., 2003). En cuanto al coste que implica un banco de germoplasma de estas características, Hummer y Reed (2000) indican que en el NCGR, el coste de mantenimiento anual de una entrada de una especie frutal de clima templado es de aproximadamente 77 dólares en campo, frente a los 23 dólares que podría costar el mismo ejemplar con la técnica de cultivo reducido in vitro, y 1 dólar si se mantiene almacenada en nitrógeno líquido, a lo cual hay que añadir un coste fijo de inicio de la crioconservación de alrededor de 50-60 dólares.

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