PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 51
Int. Cl.: C07K 14/74 (2006.01) C07K 16/28 (2006.01) A61K 38/16 (2006.01) C12N 5/08 (2006.01) 12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86
Número de solicitud europea:96911119 .4 86
Fecha de presentación :25.04.1996 87
Número de publicación de la solicitud:0840750 87
Fecha de publicación de la solicitud:13.05.1998
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Título:Péptido antigénico HA-2. 30
Prioridad:25.07.1995 EP 95202039
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Fecha de publicación de la mención BOPI: 16.09.2006
45
Fecha de la publicación del folleto de la patente: 16.09.2006
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Titular/es:Rijksuniversiteit te Leiden Stationsweg 46
2312 AV Leiden, NL
The University of Virginia Patent Foundation
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Inventor/es:Goulmy, Els, A., J., M.; Hunt, Donald, F. y
Engelhard, Victor, H.
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Agente:Carpintero López, Francisco
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
ES
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5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 DESCRIPCIÓN Péptido antigénico HA-2.
Esta invención se refiere al campo de la inmunología, especialmente de la inmunología celular. De forma parti-cular se refiere al área del transplante de órganos, tejidos o células (en especial médula ósea) y posibles reacciones inmunológicas provocadas por tales transplantes.
El transplante de médula ósea (TMO) encuentra su aplicación clínica en el tratamiento de, por ejemplo, anemia aplásica grave, leucemia y enfermedad de inmunodeficiencia.
En los primeros intentos, muchos de estos transplantes terminaban en rechazo del transplante o en la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH). Actualmente es obvio que estos efectos son debidos en gran parte a la presencia de antígenos H mayores que funcionan como una barrera muy importante al transplante. En consecuencia, se reseñó un éxito mejorado en el transplante de médula ósea cuando se tomó en cuenta la compatibilidad de los antígenos HLA. Actualmente, se usan principalmente hermanos con HLA idénticos o individuos no relacionados con HLA compatible como fuente del material donante. Aún así, a pesar de las mejoras en la compatibilidad de los HLA, así como las mejoras en la quimioterapia y/o radioterapia previa el transplante y el uso de potentes fármacos inmunosupresores como profilaxis, así como de mejores antibióticos y mejores técnicas de aislamiento del material donante, aproxi-madamente 20-70% (dependiendo de la edad) de los receptores todavía padecen EICH. En la EICH los linfocitos T inmunocompetentes reaccionan contra los tejidos del hospedador. Por lo tanto, un tratamiento que se ha vuelto fre-cuente es la donación de médula de la que se han eliminado los linfocitos T maduros. Sin embargo, esto a menudo conlleva rechazo o fallo del injerto, así como recaídas de la enfermedad inicial, lo que es particularmente dramático en la leucemia.
Los problemas todavía asociados a (en particular) el transplante humano difícilmente pueden atribuirse a los antí-genos H mayores, dado que el donante y el receptor se seleccionan de forma rutinaria por la identidad de los HLA. Por lo tanto la EICH puede estar provocada por la disparidad de los productos de los denominados sistemas H menores (mHag), es decir antígenos de histocompatibilidad distintos de los que codifica el CHM.
Los mHag han sido descubiertos originariamente en estudios de rechazo de tumores y piel entre cepas congénicas de ratones. Se han definido más de 40 locus de mHag, dispersos por el genoma, pero las estimaciones predicen la existencia de varios cientos de locus. Uno de los antígenos H menores mejor conocidos es el antígeno HY.
Varios artículos han demostrado la presencia de LTC específicos contra mHag del hospedador en pacientes que padecen EICH tras TMO con HLA de genotipos idénticos (1-7). En nuestro laboratorio, se realizó un gran esfuerzo para caracterizar adicionalmente un (pequeño) número de LTC específicos contra mHag del hospedador. Para esto, se aislaron clones de LTC específicos para mHag del hospedador en la sangre periférica de (SP) de pacientes que padecían EICH grave (8).
Análisis inmunogenéticos subsiguientes revelaron que los clones de LTC (tal como se describe anteriormente) identificaron cinco mHag no ligados al sexo, denominados HA-1, -2, -3, -4, -5, que se reconocen de un modo restrin-gido de CHM clásica (8). mHag HA-3 es reconocido en presencia de HLA-A1 y mHag HA-1, -2, -4 y -5 requieren la presencia de HLA-A2. Los estudios de segregación demostraron que cada uno de mHag HA-1 a HA-5 es el producto de un único gen que se segrega de forma mendeliana y que HA-1 y HA-2 no están codificados en la región HLA (9). Los mHag difieren los unos de los otros en las frecuencias fenotípicas; mHag HA - 2 apareció muy frecuentemente (es decir 95%) en la población sana positiva para HLA-A2 (10).
Con respecto al mHag expresado en diferentes tejidos, los presentes inventores observaron la distribución tisular omnipresente comparada con la distribución tisular restringida de los mHag analizados (11). La expresión del mHag HA-2 está restringida a las células de la línea celular hematopoyética, tales como timocitos, linfocitos de sangre peri-férica, linfocitos B y/o monocitos. También las células presentadoras de antígeno profesionales derivadas de la médula ósea; las células dendríticas y las células epidérmicas de Langerhans expresan el mHag 2 (11, 12). El mHag HA-2 también se expresa en células germinales hematopoyéticas (13), en células precursoras leucémicas clonógenas (14), así como en células leucémicas mieloides y linfoides recientemente aisladas (15).
Para sustanciar la importancia de los sistemas antígenos mH humanos, los presentes inventores investigaron si los mHag están conservados en la evolución entre los primates humanos y no humanos. Para ello, se transfectaron células de primates no humanos con el gen HLA-A2.1 humano. Análisis subsiguientes con el alo HLA-A2.1 humano de los inventores y cuatro clones de LTC restringidos con mHag HLA-2.1 revelaron la presentación de alo de simio y mono y péptidos mHag HY, HA-1 y HA-2 en el contexto de la molécula de HLA-A2.1 humano transfectado por células diana de simio y mono. Además, se eluyeron péptidos de moléculas HLA-A2.1 expresadas en las células de simio transfectadas. Se identificó una fracción positiva para HA-2 que mostraba el mismo comportamiento en HPLC de fase inversa que la fracción HA-2 derivada de EBV-LCL humano. Esto implica que el péptido HA-2 se ha durante al menos 35 millones de años (16).
Se realizó un estudio prospectivo para documentar el efecto de mHag en TMO con HLA genotípicamente idénticos sobre la aparición de EICH aguda (grado ≥ 2). Los resultados del tipado de los mHag usando los clones de LTC
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específicos para cinco mHag bien definidos HA-1 a HA-5 demostraron una correlación significativa entre la falta de emparejamiento entre mHag HA-1, -2, -4 y -5 y la EICH (17).
Los presentes inventores se centraron en la caracterización bioquímica de antígenos mH humanos. Para ello, usaron técnicas de inmunopurificación y bioquímicas aplicadas con éxito por Rammensee y sus colegas (18, 19) para extraer péptidos mH murinos de moléculas de CHM. De hecho, la separación por HPLC de moléculas con Mr bajo (< kD) obtenidas a partir de una clase de moléculas de CHM clase 1 HLA-A2.1 tratadas con ácido pareció tener éxito. Se aislaron fracciones con actividad de sensibilización para clones de LTC específicos del antígeno mH HA-2 no ligados al sexo (20). Para analizar la naturaleza peptídica del mHag HA-2, se realizaron dos conjuntos de experimentos. Primero, la actividad de sensibilización de las fracciones que contienen mHag, obtenidas tal como se describe anteriormente, es susceptible al tratamiento con proteasas; es decir la incubación de estas fracciones de HPLC que contienen mHag con pronasa o proteinasa K suprimió la actividad de sensibilización (21). Segundo, los productos génicos TAP1 y TAP2 codificados por CHM son necesarios para la presentación del péptido mHag sobre la superficie celular. Los genes transportadores TAP1 y TAP2 asociados a la presentación de antígenos son necesarios para el transporte de péptidos desde el citosol con el retículo endoplásmico (22). La disponibilidad de una línea celular humana “T2”, que carecía tanto de genes de transporte como de las subunidades de proteosomas permitió a los presentes inventores estudiar el procesamiento y presentación de antígenos mH humanos. Los presentes inventores demostraron que los productos génicos de transporte TAP1 y TAP2 (rata) eran necesarios para el procesamiento y presentación de péptidos antigénicos de virus de la gripe y de la proteína intracelular mH HA-2 (23).
Sin embargo, hasta la presente invención nadie ha tenido éxito en la identificación de secuencias de aminoácidos de péptidos antigénicos relevantes en el sistema mHag, ni nadie ha tenido éxito en la identificación de las proteínas de las que pueden derivarse. Los presentes inventores ahora, por primera vez, han identificado un péptido que es una parte relevante de mHag HA-2.
Así, esta invención proporciona un (poli)péptido que comprende un epítopo de linfocito T que puede obtenerse a partir del antígeno de histocompatibilidad menor HA-2 que comprende la secuencia de acuerdo con la reivindicación 1.
La forma en la que se obtienen estas secuencias se describe en la parte experimental. Una parte importante de este procedimiento novedoso para llegar a dichas secuencias es la purificación y la elección del material inicial. Dicho pro-cedimiento novedoso también es, por lo tanto, parte del alcance de esta invención. Sin embargo, ahora que la secuencia es conocida, por supuesto ya no es necesario seguir ese procedimiento, porque los péptidos pueden prepararse fácil-mente sintéticafácil-mente, tal como es notorio en la técnica. Dado que existen técnicas rutinarias disponibles para producir péptidos sintéticos, también está dentro de la experiencia de la técnica lograr análogos o derivados de los péptidos descritos explícitamente, análogos y/o derivados que pueden tener las mismas o al menos similares propiedades y/o actividad. Por otra parte, los análogos que contrarrestan la actividad de los péptidos descritos explícitamente también están dentro de la experiencia de la técnica, dadas las enseñanzas de la presente invención.
Una realización preferida de la presente invención es el péptido con la secuencia YIGEVLVSV que induce la lisis de la célula que lo presenta a una concentración muy baja de péptido presente. Esto no implica que los péptidos que inducen la lisis a concentraciones más elevadas no sean adecuados. Esto, en gran medida, dependerá de la aplicación y de otras propiedades de los péptidos, que no podían analizarse todas en el alcance de la presente invención.
Los péptidos y otras moléculas de acuerdo con la invención encuentran su utilidad en que pueden usarse para inducir tolerancia en el sistema inmunitario del donante en donantes negativos para HA-2, de forma que los linfocitos de sangre periférica residuales en el órgano o la médula ósea eventualmente transplantadas, según sea el caso, no responda a material HA-2 del hospedador en un receptor positivo para HA-2. De este modo, puede prevenirse la EICH. Por otra parte, puede inducirse la tolerancia en receptores negativos para HA-2 básicamente del mismo modo, de forma que al recibir un órgano o médula ósea de un donante positivo para HA-2 no se produzca rechazo en base al material HA-2. Puede ser el caso de que el péptido HA-2 actúe en una forma no restringida a alelos. En ese caso, la inducción de la tolerancia no está restringida a individuos negativos para HA-2.
Para la inducción de la tolerancia pueden administrarse dosis muy pequeñas repetidamente, por ejemplo por vía intravenosa, aunque muy bien pueden ser adecuadas también otras vías de administración. Otra posibilidad es la administración oral repetida de altas dosis de los péptidos. Los péptidos pueden administrarse solos, o combinados con otros péptidos, o como parte de moléculas mayores, o acoplados a materiales transportadores en cualesquiera excipientes adecuados.
Aplicaciones adicionales del péptido o sus derivados se localizan en la administración profiláctica a tales indivi-duos transplantados para prevenir la EICH. Esto puede realizarse bien con agonistas, posiblemente combinados con un adyuvante, o con antagonistas que pueden bloquear las células responsables. Esto puede realizarse con o sin la administración concomitante de citoquinas.
Además los péptidos de acuerdo con la invención pueden usarse para preparar agentes terapéuticos capaces de eliminar un subconjunto de células, de forma directa o indirecta, en especial células de origen hematopoyético. Esto puede ilustrarse mediante los siguientes ejemplos, que se refieren a agentes terapéuticos relacionados con la leucemia.
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a) Un receptor positivo para HA-2 (en el transplante de médula ósea) puede someterse a un tratamiento adicional de acondicionamiento previo al transplante de médula ósea. Esto quiere decir que un agente que de forma específica reconoce un péptido de acuerdo con la invención (un péptido HA-2) tal como se presenta en las células hematopo-yéticas, agente que induce la eliminación de las células que presentan dicho péptido, se administra al receptor antes del transplante. Este agente eliminará todas las células residuales (células leucémicas) de origen hematopoyético. Tal agente incluye, pero sin limitación linfocitos T (preferiblemente proporcionados con un gen suicida) y/o anticuerpos acoplados a restos tóxicos.
b) Un donante negativo para HA-2 para el transplante de médula ósea puede ser vacunado con un péptido de acuerdo con la invención, un péptido HA-2. Tras el transplante a un receptor positivo para HA-2, el sistema inmunitario del donante puede eliminar cualquier célula residual o recurrente que presente el péptido HA-2 en el receptor que, por supuesto son leucémicos.
c) Un receptor positivo para HA-2 trasplantado, trasplantado con médula ósea negativa para HA-2 (o positivo para HA-2) y que padece enfermedad recurrente (recaída), es decir células leucémicas positivas para HA-2, puede ser tratado (de nuevo) con un agente que reconoce específicamente un péptido de acuerdo con la invención (un péptido HA-2) tal como se presenta en células hematopoyéticas, agente que induce la eliminación de las células que presentan dicho péptido. En el caso de que se transplante médula ósea positiva para HA-2 al receptor positivo para HA-2, todavía es esencial (en el caso de enfermedad recurrente) eliminar todas las células positivas para HA-2 aunque esto incluya el material transplantado, porque si no se hace así, la leucemia positiva para HA-2 matará al receptor. En éste caso, el paciente puede volver a ser transplantado, si fuera necesario.
Las aplicaciones diagnósticas están claramente dentro del alcance de la técnica. Incluyen, pero sin limitación, tipado de HA-2, detección de aberraciones genéticas y similares.
Otras aplicaciones terapéuticas del péptido incluyen la inducción de tolerancia a proteínas HA-2 en enfermedades (auto)inmunitarias relacionadas con HA-2, tales como posiblemente la artritis reumatoide. Por otra parte, puede usarse en vacunas en enfermedades (auto)inmunitarias relacionadas con HA-2.
Basándose en el péptido que se describe en el presente documento, pueden producirse sondas genéticas que pueden usarse para seleccionar el gen que codifica la proteína. Por otra parte, tales sondas pueden ser útiles también en kits de detección. Basándose en el péptido que se describe en el presente documento, pueden producirse linfocitos B y/o linfocitos T y anticuerpos contra idiotipos. Todas estas realizaciones han sido posibles por la presente descripción y por lo tanto son parte de la presente invención.
Las técnicas para producir estas realizaciones están todas dentro de la experiencia de la técnica.
Intervalos de dosis de péptidos y anticuerpos y/o otras moléculas de acuerdo con la invención a usar en las apli-caciones terapéuticas tal como se describen anteriormente, habitualmente se diseñan basándose en estudios de dosis crecientes en clínica. Las dosis para los péptidos pueden variar entre aproximadamente 0,1 y 1000 µg por kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 10 µg por kg de peso corporal.
La invención se describirá en mayor detalle explicativo en la siguiente parte experimental. Sección experimental
Usando clones de LTC específicos para mHag como herramientas in vitro, se han aislado algunos mHag murinos y humanos de moléculas de CHM mediante elución ácida y se demostró que eran péptidos presentados por moléculas de MHC (13,14). La caracterización adicional, es decir la secuencia exacta de los aminoácidos de los péptidos mHag y la identificación de las proteínas a partir de las que se originan estos mHag, hasta la fecha no han sido reseñadas. Sólo se han caracterizado un pequeño número de mHag murinos “definidos como no convencionales”, como los alelos de microglobulina β2 codificados por H-3 (15) y el antígeno transmitido por vía materna codificado en las mitocondrias restringido Hmt (16). En el presente documento, los presentes inventores reseñan la identificación, por espectrometría de masas en tándem, del epítopo mHag HA-2 restringido a HLA-A2.1.
Para aislar el mHag HA-2, se purificaron moléculas de HLA-A2.1 por cromatografía de afinidad a partir de linfo-citos B transformados con virus de Epstein Bar (EBV) (EBV-BLCL) positivos para HLA-A2.1 que expresaban HA-2. Los péptidos unidos a HLA-AHA-2.1 se aislaron mediante tratamiento ácido seguido de filtración a 10 kD (14). Estas moléculas de baja masa molecular se fraccionaron por HPLC de fase inversa y las fracciones individuales se anali-zaron para determinar la actividad de sensibilización de mHag HA-2 incubando con la línea de linfoblastocitos T2 negativa para mHag HA.2, positiva para HLA-A2.1 en un ensayo de liberación de51Cr. Una fracción (fracción 33)
sensibilizaba T2 para la lisis por el clon de LTC específico para HA-2 5H17 (17) (Figura 1a). Cuando esta fracción se volvió a cromatografiar usando un gradiente menos profundo, se observó la actividad de sensibilización de HA-2 en las fracciones 37 y 38 (Figura 1b). Sin embargo, tal como se evaluó usando HPLC microcapilar/ espectrometría de masas de ionización por electrospray en tándem, las últimas fracciones todavía contenían más de 100 péptidos que se unían a HLA-A2 (18). Para determinar cual de los péptidos era el responsable de la actividad de sensibilización de HA-2, se analizó la fracción 37 usando un difractor en línea (19), permitiendo la comparación de los datos espectro-métricos con los resultados del ensayo funcional. La Figura 2a muestra un solo pico de actividad de sensibilización
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de HA-2 en cuatro pocillos adyacentes. De los muchos péptidos presentes en estos pocillos, el perfil de abundancia iónica relativa de cuatro péptidos (con relaciones entre masa y carga (m/z) de 651, 869, 979, 1000) correspondían al perfil de actividad de actividad de los LTC específicos para de HA-2. El análisis de disociación activada por coli-sión (DAC) realizado para la especie con m/z de 979 reveló la existencia de 2 péptidos diferentes, YXGEVXVSV y SXDFGTXQV (figura 3a y 3b). La X representa L o I, que no pueden distinguirse por espectrometría de masas en estas condiciones. Se prepararon mezclas de péptidos sintéticos con una mezcla equimolar de L e I en lugar de X y se ensayó para determinar la actividad de LTC de sensibilización específica de HA-2. Sólo la incubación con la mezcla de péptidos YXGEVXVSV produjo la lisis de T2 (20).
Para definir adicionalmente el péptido procesado natural, se sintetizaron cuatro péptidos únicos con I o L en las po-siciones dos y seis y se realizaron estudios de elución conjunta en HPLC microcapilar de estos péptidos sintéticos y de la fracción aislada. El péptido YIGEVTVSV no eluyó conjuntamente con el péptido natural procesado y por lo tanto puede excluirse como el epítopo procesado natural, mientras que los otros tres péptidos, YIGEVLVSV, YLGEVLVSV e YLGEVIVSV si eluyeron conjuntamente (21). Estos tres péptidos todos sensibilizaron la línea celular T2 para la lisis por el clon 5H17 (Figura 4a). El péptido YIGEVLVSV indujo una lisis del 50% a una concentración de 40 pM, mientras que estas concentraciones fueron sustancialmente mayores para los péptidos YLGEVLVSV y YLGEVIVSV (1,5 nM y 2,25 nM). Las tres concentraciones están dentro del intervalo de 10 pM - 50 nM establecido para otros epí-topos procesados de forma natural (19, 22). El clon 5H13 es un LTC derivado de forma independiente que, basándose en el análisis grupo de pruebas analíticas, también reconoce HA-2, pero difiere ligeramente en su especificidad fina de reconocimiento de antígenos de 5H17 (10, 23). El clon 5H13 también reconoció todas las variantes de los 3 péptidos (Figura 4b). Aunque la concentración de péptidos necesaria para proporcionar la mitad de la reconstitución máxima de los epítopos fue 5-10 veces mayor que para 5H17, el péptido YIGEVLVSV todavía sensibilizaba a concentraciones 100 veces menores que los otros dos. Estos resultados establecen que, a pesar de sus diferencias de especificidad fina (10, 23), ambos LTC específicos para HA-2 reconocen el mismo epítopo peptídico.
Estudios de unión con estos tres péptidos demostraron que el péptido YIGEVLVSV era el que se unía más a HLA-A2.1. La concentración que producía una inhibición del 50% de la unión del péptido estándar yodado a HLA-A2.1 purificado era 5,6 nM, mientras que las de YLGEVIVSV e YLGEVLVSV eran 9,5 y 15 nM respectivamente (Figura 5). Estos valores colocan estos péptidos entre los péptidos procesados naturalmente con la afinidad más alta que se han definido hasta la fecha (24). Sin embargo, las diferencias en las afinidades de unión para estos tres péptidos es meramente un factor de 3. El hecho de que YIGEVLVSV sensibilice para el reconocimiento por los clones 5H17 y 5H13 a concentraciones 50 - 100 veces menores que los otros dos péptidos indica que este péptido es reconocido con la afinidad más alta por los RLT y así puede ser el epítopo HA-2 real.
Una búsqueda en bases de datos de secuencias de ADN y proteínas llevó a dos secuencias humanas que ambas correspondían en 7 de los 9 residuos al péptido YIGEVLVSV. El péptido YYGEVCVSV se deriva de la glucoproteína mielina de oligodendrocitos (25) y el péptido YIGSVLISV era de miosina IC no convencional (26). Ambos péptidos humanos se sintetizaron y analizaron para determinar la actividad de sensibilización. Solo el péptido derivado de miosina IC YIGSCLISV pudo sensibilizar células T2 para la lisis por 5H17 y 5H13 con una concentración que induce el 50% de lisis de 5-50 nM (27). La miosina IC humana no convencional pertenece a una gran familia de genes de miosina (28, 29), que consiste en clases diferentes y que se indica que están implicados en la locomoción celular y el transporte de organelos (28, 29). Todos los tipos de células probablemente expresan diversas miosinas de cada clase de forma simultánea. Se ha reseñado la distribución restringida a tejidos de algunas miosinas (26, 29). Búsquedas en bases de datos demostraron que en diferentes miosinas de clase I de orígenes diversos, desde Acanthamoeba castellanii a humanas, esta secuencia peptídica mostró conservación para Y, I, G, V, y V en las posiciones 1, 2, 3, 5 y 9. De forma notable, la secuencia peptídica de HA-2 difiere en las posiciones de los aminoácidos no conservadas de la secuencia peptídica de miosina IC. La miosina IC no convencional humana es el único gen de miosina clase I humano clonado, pero existen indicios de la presencia de al menos otras dos miosinas de clase I en células humanas. Por lo tanto, no es poco probable que exista en los seres humanos una proteína de miosina de clase I todavía desconocida que contenga YIGEVLVSV. De forma interesante, estudios en proceso demuestran la conservación durante la evolución de diversos mHag, incluido HA-2, entre los primates humanos y no humanos (30). Debido a que mHag HA-2 solo es presentado por células hematopoyéticas, esta miosina de clase I desconocida o bien está restringida a las células hematopoyéticas o solo es presentada por células hematopoyéticas debido a procesamiento específico de tejido.
El polimorfismo de mHag HA-2 es un tema intrigante. El 95% de la población positiva para HLA-A2.1 expresa el HA-2. En consecuencia, los LTC específicos para HA-2 fueron generados in vivo entre una combinación de donan-te/receptor de médula ósea con un mHag HA-2 dispar. El polimorfismo de HA-2 puede explicarse bien por mutaciones en o adyacentes al gen HA-2 o por polimorfismo del sistema de procesamiento de los antígenos.
Hasta ahora, la información sobre mHag ha sido extremadamente escasa. Aunque la función fisiológica de mHag todavía es desconocida, no puede negarse su papel fundamental en el transplante de órganos en general y en el trans-plante de médula ósea en particular. Los presentes inventores en el presente documento reseñan, a su entender por primera vez, la secuencia de aminoácido de un mHag definido por LTC derivados de EICH. La disponibilidad de la secuencia peptídica de mHag puede permitir la modificación in vivo de las respuestas de los linfocitos T relacionadas con EICH. Además, dado que mHag HA-2 se expresa en células de líneas hematopoyéticas que incluyen las células leucémicas, es un candidato para la inmunoterapia de la leucemia antes del transplante de médula ósea.
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Péptidos purificados por HPLC se analizaron para determinar la capacidad de inhibir la unión del péptido antigé-nico del núcleo de hepatitis B yodado FLPSDYFPSV, a moléculas de HLA-A2.1 purificadas tal como se ha descrito anteriormente (23). (círculos negros), YIGEVLVSV; (triángulos negros), YLGEVLVSV; (cuadrados cerrados), YL-GEVIVSV; (diamantes cerrados), el antígeno de la proteína M1 de la gripe GILGFVFTL. Todos los puntos de datos son la media de al menos dos experimentos independientes.
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18. Rötzschke O, Falk X, Wallny H-J, Faath Sand Rammensee H-G (1990). Science 249: 283. 19. Falk K, Rötzschke O y Rammensee H-G (1990). Nature 348: 248.
20. De Bueger M, Verreck F, Blokland E, Drijfhout J-W, Amons R, Koning F y Goulmy E (1993). Isolation of a HLA-A2.1 extracted human minor histocompatibility peptide (1993). Eur. J. Immunol. 23: 614-618.
21. Den Haan JJM, Blokland E, Koning F, Drijfhout J-W y Goulmy E (1994). Structure analysis of human minor histocompatibility antigens HA-1 and HA-2. Abstract NWO retraite.
22. Powis SJ, Twonsend RM, Deverson EV y cols. (1991) Nature 354: 528.
23. Momburg F, Ortiz-Navarrete V, Neefjes J, Goulmy E, v.d. Wal Y, Spits H, Powis SJ, Butcher GW, Howard JC, Walden P y Hammerling GJ (1992). The proteasome subunits encoded by the major histocompatibility complex are not essential for antigen presentation. Nature 360: 174-177.
24. H.J. Wallny y G Rammensee, Nature 343, 275 (1990). O. Rötzschke, K. Falk, B.J. Wallny, S. Faath, H-G. Rammensee, Science 249, 283 (1990). M. Sekimata, P. Griem, K. Egawa, H-H-G. Rammensee, M. Takiguchi, Int. Immunol. 4, 301 (1992). L. Franksson, M. Petersson, R. Kiessling, K. Karre, Eur. J. Immunol., 23, 2606 (1993);
25. M. De Bueger y cols. Eur. J. Immunol. 23, 614 (1993);
26. M.E. Kurtz, R.J. Graff, A. Adelman, D. Martin-Morgan, R.E. Click, J. Immunol. 135, 2847 (1985). H-G Rammensee, P.J. Robinson, A. Grisanti, M.J. Bevan, Nature 319, 502 (1986). B. Perarnau y cols., Nature 346, 751 (1990);
27. B. Loveland, C-R. Wang, H. Yonekawa, E. Hermel, K. Fischer Lindahl, Cell, 60, 971 (1990);
28. El clon de CTL específico para HA-2 5H17 tiene su origen en una paciente mujer que se sometió a trasplante de médula ósea para anemia aplásica grave. El tratamiento de acondicionamiento previo al trasplante consistió en irradiación linfoide total y ciclofosfamida. A la paciente se le injertó médula ósea a la que no se le habían eliminado los linfocitos T de su padre con HLA idéntico. La paciente padeció EICH aguda grave en grado III seguida de EICH crónica extensa. El clon CTL específico para HA-2 se generó a partir de SP después del TMO de acuerdo con el protocolo que se describe anteriormente. E. Goulmy, en Transplant, Rev. J. Morris y N.L. Tilney, Editores. (Saunders Company 2, 29, 1988);
29. No se muestran datos;
30. A.L. Cox y cols., Science 264, 716 (1994);
31. Se analizaron mezclas de péptidos YSGEVXVSV y SXDFGTXQV en varias concentraciones con el clon 5H17 y el clon 5H13. Además de T2, se usó un EBV-BLCL negativo para HA-2 y positivo para HLA-A2.1 para presentar la mezcla de péptidos;
32. No se muestran datos;
33. K. Udake, T.J. Tsomides, H.N. Eisen, cell 69, 989 (1992). R.A. Henderson y cols., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 10275 (1993). O. Mandelboim y cols., Nature, 369, 67 (1994), A. Uenaka y cols., J. Exp. Med., 180, 1599 (1994);
34. 5H13 y 5H17 demostraron patrones idénticos cuando se analizaron con 100 individuos sanos positivos para HLA-A2.1 no relacionados. Se observó un patrón de reacción discriminatorio entre los clones cuando se analizó una célula diana que expresaba una molécula variante de HLA-A2 natural;
35. Y. Chen y cols., J. Immunol., 152, 2874 (1994). J. Ruppert y cols., Cell, 74, 829 (1993); 36.
37. W.M. Bement, T. Hasson, J.A. Wirth, R.E. Cheney, M.S. Mooseker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6549 (1994);
38. Se analizó el péptido YYGEVCVSV en un intervalo de concentración de 50 nM a 0,5 pM con 5H17 así como 5H13. No se encontró actividad;
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
39. M.A. Titus, Curr. Opin. Cell Biol., 5, 77 (1993). E. Coudrier, A. Durrbach, D. Louvard, FEBS, 307, 87 (1992);
40. M. Mooseker, Curr. Biol., 3, 245 (1993);
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 REIVINDICACIONES
1. Un péptido que constituye un epítopo de linfocito T que puede obtenerse a partir del antígeno de histocompati-bilidad menor HA-2 que comprende la secuencia YIGEVLVSV, YLGEVLVSV o YLGEVIVSV.
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia YIGEVLVSV.
3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia YLGEVLVSV o YLGEVIVSV. 4. Vacuna que comprende un epítopo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Una formulación farmacéutica que comprende un epítopo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. Péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para usar como medicina.
7. Uso de un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 en la preparación de un medicamento para la induc-ción de tolerancia a los transplantes para prevenir el rechazo y/o la enfermedad de injerto contra huésped.
8. Uso de un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la preparación de un medicamen-to para la eliminación de un grupo de células hemamedicamen-topoyéticas (neoplásicas) que presentan un péptido en el contexmedicamen-to de HLA clase 1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, por el que la eliminación se induce de forma directa o indirecta por el reconocimiento específico de dicho péptido en dicho contexto.
9. Procedimiento para la generación de anticuerpos, receptores de linfocitos T, linfocitos B o linfocitos T contra idiotipos, que comprende la etapa de inmunizar un mamífero no humano con un péptido de acuerdo con la reivindica-ción 1.
10. Un linfocito T aislado que reconoce específicamente la secuencia YIGEVLVSV, YLGEVLVSV o YLGE-VIVSV.
11. Un anticuerpo aislado que reconoce específicamente la secuencia YIGEVLVSV, YLGEVLVSV o YLGE-VIVSV.
