CURSO DE PRIMAVERA PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER

(1)

CURSO DE PRIMAVERA

PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER

Conceptos básicos sobre ADN y ARN

Técnicas de amplificación (PCR y variantes) Aplicaciones principales

Dr. Juan C. Cigudosa Madrid

29 y 30 de mayo, 2014 SEAP- IAP

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Material hereditario: ADN

• Nuestra información genética está codificada en una

macromolécula: el ADN (ácido dexoxirribonucléico).

• El ADN con proteínas forma los cromosomas. El material

básico de los cromosomas es la cromatina.

• 46 cromosomas que se agrupan en parejas de

cromosomas homólogos (uno heredado del padre y el otro de la madre)

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Nucleosoma: 8 Histonas+147 pb

2 metros de ADN en un núcleo de 0,005 mm diámetro

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El ADN como material genético

Características del material genético

• Capacidad de

almacenamiento

de la información

• Capacidad de

replicación

• Capacidad de

expresión

de la

información

• Capacidad de

variación

por

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El ADN como material genético

• Capacidad de almacenamiento

de la información

• Capacidad de replicación

• Capacidad de expresión de la

información

• Capacidad de variación por

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ADN

1. Acido Desoxiribonucleico: información genética.

2. Polímero formado por

subunidades: nucleótidos.

3. Nucleótido está constituído: azúcar pentosa(desoxiribosa)+base nitrogenada (A,T,C,G)+ grupo fosfato. 4. T y C pirimidinas; A y G purinas. 5. T es complementaria a A C es complementaria a G

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¿Qué es una secuencia de ADN?

• ADN: 4 caracteres

A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina).

• Las moléculas de ADN están compuestas por una secuencia de millones de estos caracteres, de la misma manera que si tuviéramos un collar en los cuales cada perla es de un color de cuatro posibles.

• El orden de las bases en la secuencia es la manera de almacenar la información: el ADN es la memoria química de los organismos vivos.

• La lectura de esta secuencia de bases es lo que denominamos secuenciación.

(8)

GENOMA/GEN

• GENOMA: todo el ADN contenido en el núcleo (no olvidar

que hay ADN en mitocondrias).

• La unidad de información en el ADN es el GEN (formado por

nucleótidos) que es una secuencia de ADN que contiene la información para la producción de proteínas, así como las instrucciones regulatorias para determinar cuándo y en qué cantidad se producirán esas proteínas.

• 20000 genes aproximadamente

• 20-30 kb tamaño medio de un gen (nº exones muy variable

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Región

codificante

EXOMA

Región no codificante

Estructura de un GEN

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El ADN como material genético

• Capacidad de almacenamiento

de la información

• Capacidad de replicación

• Capacidad de expresión de la

información

• Capacidad de variación por

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Replicación del ADN

DEFINICION: una molécula original de ADN de doble cadena es convertida en dos moléculas hijas de ADN idénticas.

(12)

El ADN como material genético

• Capacidad de almacenamiento

de la información

• Capacidad de replicación

• Capacidad de expresión de la

información

• Capacidad de variación por

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DOGMA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

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ARN

1. Acido Ribonucleico. 2. Polímero formado por

subunidades: nucleótidos.

3. Nucleótido está constituído: azúcar (ribosa)+base nitrogenada (A,U,C,G)+ grupo fosfato. 4. U y C pirimidinas; A y G purinas. 5. U es complementaria a A C es complementaria a G 6. Estructura monocatenaria

Severo Ochoa ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cómo se sintetizaba el ARN

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CODIGO GENÉTICO

20 Aa

1

er

_Aa

SIEMPRE

ATG/ Met

4

3

_{= 64}

codones

Codones

STOP

TAA/TAG/

TGA

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(18)

Los GENES se anotan en mayúscula y cursiva

P53, BCR-ABL, EGFR

, etc

Las PROTEINAS se anotan en minúscula

p53, Bcr-Abl, Egfr, etc

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El ADN como material genético

• Capacidad de almacenamiento

de la información

• Capacidad de replicación

• Capacidad de expresión de la

información

• Capacidad de variación por

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El ADN como material genético

• El material genético debe ser capaz de proporcionar una

fuente de variabilidad a través del proceso de

mutación.

• Mutación línea germinal

:

afecta a los gametos, pasará

a la descendencia.

• Mutación somática

:

Alteración o cambio en la

información genética (ADN) que ocurre después de la

concepción.

• Este cambio podrá ser beneficioso, neutral o perjudicial.

• Mutación

:

cambio que afecta

a la composición del ADN que

tendrá su reflejo final en la

proteína resultante.

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Mutaciones indel: Cambio de la secuencia de codones que debe ser leída durante la traducción, resultando en una proteína completamente diferente, que no suele ser funcional.

(22)

(23)

Tipos de mutaciones

• Mutaciones no sinónimas: sustituciones nucleotídicas que cambian un

aminoácido por otro (MISSENSE).

• Mutación sin sentido: mutación por la cual un codón que especifica un

aminoácido es cambiado a un codón de terminación, dando lugar a una proteína truncada (NONSENSE).

• Mutación sinónima: mutación que altera la base situada en la tercera

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Polimorfismos

La mayor contribución a la variación genética son los SNP (85%) Cada 1000 b un SNP

Definición: variación en la secuencia de un lugar determinado del DNA entre los individuos de una población. Debe aparecer por lo menos en el 1% de la población.

(25)

SNPs

• Alrededor de 8 millones de SNPs en todo el genoma.

• Algunos pueden producir cambios en proteína:

- susceptibilidad a padecer enfermedades

- resistencia a tratamientos específico

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PREPARACION DE MUESTRAS,

EXTRACCION ACIDOS

NUCLEICOS Y CONSERVACION

DE MUESTRAS

(27)

Muestras Biológicas

1.- Tejido – Biopsa en fresco - Biopsia enparafina 2.- Fluidos: - Médula ósea - Sangre Periférica - Saliva - Líquido Cefalorraquídeo - Líquido Pleural - Líquido Pericárdico - Líquido Ascítico - Líquido Sinovial Citrato Sódico EDTA Heparina

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1) Citogenética Convencional

CARIOTIPO

2) Citogenética Molecular

FISH

3) BIOLOGIA MOLECULAR

Mínimo 5 ml MO/SP

Para RQ-PCRm, 10 ml

de SP

EDTA

3 ml de MO/SP

HEPARINA

Muestras Biológicas

Corte OCT o

Parafina

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OBTENCIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

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1) Extracción con Tiocianato de Guanidinio-Fenol-Cloroformo 2) Trizol: reactivo comercial

3) Columnas de silicagel (Rneasy Mini Kit-Qiagen)

4) Purificación por afinidad con Oligo-dT (para mRNA)

Métodos automatizados

METODOS DE EXTRACCION DE ARN

1) Extracción con Fenol-Cloroformo-Isoamílico

2) Columnas de silicagel (DNAmp Mini Kit- Qiagen) Métodos Extracción de ADN

AC. NUCLEICO [AC. NUCLEICO] (mg/ml) PUREZA (Valor óptimo) ADN A₂₆₀ x 50 x dilución A₂₆₀/A₂₈₀ (1,80) ARN A₂₆₀ x 40 x dilución A₂₆₀/A₂₈₀ (2,00)

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Extracción ADN, ARN y proteína

LISAR Y HOMOGENEIZAR ELUIR LAVAR PRECIPITAR ELUIR LAVAR PRECIPITAR DISOLVER

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CURSO DE PRIMAVERA

PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER

Conceptos básicos sobre ADN y ARN

Técnicas de amplificación (PCR y variantes) Aplicaciones principales

Dr. Juan C. Cigudosa Madrid

29 y 30 de mayo, 2014 SEAP- IAP

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PCR Sencilla: RFLP

PCR Anidada (Nested): Amplificación de una secuencia dentro de

otra previamente amplificada

RT-PCR

PCR Múltiple: Varios targets diferentes en forma simultánea Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa

PCR MSP: metilación PCR Digital (2011)

Variantes de PCR: secuenciación y pirosecuenciación

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Primers externos para amplificación de una secuencia

Tipos de PCR: PCR sencilla

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SEGUNDA PCR

Reacción 1

Primers externos

para amplificación

de una secuencia

extensa

Reacción 2

Primers internos

para amplificación

de una región

especifica

Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers

Tipos de PCR: PCR anidada

Aumentar ESPECIFICIDAD

(36)

mRNA

cDNA

PCR

Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA

Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa

Enzima Taq polimerasa

(37)

• Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en

un único tubo diferentes secuencias diana.

• Aplicación.

1) Multiplex-PCR control calidad de una muestra: amplificación de 4 genes constitutivos distintos.

2) Multiplex-PCR LAL-B infantil: amplificación de una de las 4 posibles translocaciones que estudiamos.

3) ARMS-PCR: Amplificación por PCR de Alelos Específicos.

(38)

Amplificación 4 genes simultáneamente

BCR (377 pb) b₂MG (287 pb) ABL (193 pb) PBGD (128 pb)

Tipos de PCR: PCR Múltiple

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Amplificación 4 translocaciones simultáneamente LAL-B infantil

t(4;11) MLL-AF4 t(1;19) E2A-PBX1 t(12;21) TEL-AML1 t(9;22) BCR-ABL

Controles Positivos

ADNc individuo con la

t(9;22) e1a2

POSITIVO

Tipos de PCR: PCR Múltiple

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- CUANTIFICACIÓN de la expresión de genes o reordenamientos.

- Más rápida y menos laboriosa.

(41)

Medida de señal de fluorescencia en la fase exponencial del proceso de PCR a tiempo real

Fundamento

1.Detección y cuantificación de la señal, emitida por un

reporter fluorescente, que aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR

2.Termociclador con sistema de detección capaz de cuantificar la señal emitida por el reporter

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CUANTIFICACION RELATIVA

Expresión de un gen en una muestra problema

en relación a la expresión de dicho gen en controles

normales.

CUANTIFICACION ABSOLUTA

Detección del Nº Copias “exacto” de un gen o

de un gen de fusión mediante la comparación con

estándares de concentración conocida.

(43)

• Química de la Reacción.

Bufer, MgCl₂, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o

primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.

• Ciclos Térmicos.

– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN

molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).

– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers

con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-Polimerasa (60ºC).

(44)

• Química de la Reacción.

• Ciclos Térmicos.

con su secuencia complementariay actividad de la Taq-Polimerasa (60ºC).

(45)

REACTIVOS

FLUORESCENTES

Ag. Intercalantes (SYBR Green)

Sondas de Hidrólisis (TaqMan)

Sondas de Hibridación

Sondas de Horquilla (Molecular Beacons)

Fundamento QUIMICO

(46)

SYBR Green

Fase annealing

Fase extensión (II)

Fase extensión (I)

Fin del ciclo de PCR

(47)

Ventajas

- simple y económico - fácil de usar

- sensible (10-6₎

- versátil (no se necesitan sondas específicas) Desventajas

- sobrestimación de la cantidad de molde por la unión del SYBR Green a dímeros de primer y a otros productos inespecíficos - necesario hacer una curva de melting

SYBR Green

(48)

Fase extensión (I) Fase annealing

Fin del ciclo de PCR Fase extensión (II)

Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan)

Tipos de PCR: RQ-PCR

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Ventajas

-especificidad

-librerías de cebadores y sondas en las casas

comerciales

Desventaja

- diseño de cebadores y sonda para genes que

no se han estudiado (Primer Express)

Tipos de PCR: RQ-PCR

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• Química de la Reacción.

• Ciclos Térmicos.

con su secuencia complementaria y actividad de la Taq-Polimerasa (60ºC).

(51)

(52)

Producto de amplificación

Fase de plateau o saturación

Fase exponencial

Ciclo umbral (C_T) Ruido de fondo

C_T(ciclo umbral):ciclo en el que la intensidad de emisión del fluorocromo aumenta significativamente con respecto al ruido de fondo

(53)

INTERPRETACION RESULTADOS RQ-PCR (I)

C_T muestra

Log dilución

Tipos de PCR: RQ-PCR

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-Amplificación robusta y fiable -Alta especificidad y sensibilidad -Alta precisión y exactitud

-Cuantifica producto de PCR en cada ciclo

-Capacidad de realizar mayor número de reacciones al día -No requiere análisis posterior a la PCR (electroforesis) -Mayor control de contaminación

-Amplio rango de aplicación: reordenamientos IgH o TCR fusión de genes a nivel DNA fusión de genes a nivel cDNA genotipado

expresión génica

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PCR Cualitativa

1ª

2ª

3ª

Real-time PCR Cuantificación relativa Droplet Digital PCR Cuantificación absoluta

Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)

Droplet Digital PCR (ddPCR™) – 3ª

Generación

Hacer gotas PCR gotas Leer gotas Cuantificación

“X” target copies

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Ventajas

 Aumento de señal / ruido. DNA de alto número de copias y background

se diluyen, enriqueciendo los DNA escasos y permite un ± 10 % de

precisión

 Eliminación de los sesgos de la PCR. Las tasas de error se reducen

mediante la eliminación de la dependencia de amplificación de la eficiencia, permitiendo detección de pequeñas diferencias (1,2 X)

 Simplificación de la cuantificación. Con ddPCR no necesitamos

estándares para la cuantificación absoluta ó relativa.

 Reducción del coste del reactivo. reacción son picolitros-nanolitros en

volumen, reduciendo muestra reactivo y entrada

Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)

Desventajas

 Precio de la plataforma

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• ¿Qué es la secuenciación?

• Metodología

 Terminadores/Sanger  Pirosecuenciación

 Nueva generación de secuenciadores

• Análisis de secuencias

• Ejemplos de secuenciación

Secuenciación (PCR modificada)

Sanger F et al. J Mol Biol. 1975 (3):441–448 Maxam AM, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 ;74(2):560-4 M Ronaghi et al. Analytical Biochemistry. 1996;242:84-85 Shenduret et al. Nat Biotecnology. 2008: 26

(58)

1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger

(marcaje fluorescente de las moléculas de ADN

amplificadas por PCR)

2) Separación de moléculas marcadas:

- electroforesis en gel de acrilamida

desnaturalizante

- electroforesis capilar

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La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN, corresponde a la emisión de fluorescencia del nucleótido incorporado en 3´

(60)

1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger

(marcaje fluorescente de las moléculas de ADN

amplificadas por PCR)

2) Separación de moléculas marcadas:

- electroforesis en gel de acrilamida

desnaturalizante

- electroforesis capilar

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Cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El

ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con los picos de colores y su correspondiente base.