Diagnóstico de. Bacterias fitopatógenas. Bacterias fitopatógenas. Bacterias fitopatógenas OBJETIVOS

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Diagn

ó

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stico de

stico de

Bacterias fitopat

Bacterias fitopat

ó

ó

genas

genas

27 de mayo de 2011

Ing. Agr. María José Montelongo

OBJETIVOS

• Recordar las características de las

bacterias fitopatógenas

• Recordar la clasificación de las

bacterias

• Reconocer síntomas y signos más

comunes de las enfermedades

bacterianas

• Conocer el proceso de diagnóstico de

una enfermedad bacteriana

Algunos

agentes

fitopatógen

os en una

célula

vegetal

– Pared celular compleja – Membrana citoplasmática – Citoplasma

– Material genético nuclear y extranuclear • Flageladas • La mayoría Gram-• Variabilidad genética – transformación, conjugación, transducción y mutación

Bacterias fitopatógenas

Bacterias fitopatógenas

•Alta tasa de multiplicación

• La mayoría tienen forma de bacilo (1-2μm x <1μm) • Hay bacterias filamentosas

Bacterias fitopatógenas

• Saprófitos facultativos: se multiplican en el huésped, pero pueden sobrevivir en restos y en el suelo. Algunas se consideran habitantes del suelo (Pseudomonas,

Agrobacterium, Streptomyces).

• Parásitos obligados: bacterias fastidiosas, limitadas al xilema o floema y Mollicutes (fitoplasmas y espiroplasmas)

Bacterias fitopatógenas

Clave de identificación de los géneros de bacterias fitopatógenas

(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)

Bacterias Gram positivas

(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)

Bacterias Gram negativas

(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)

Se aceptaba que numerosas enfermedades de plantas que producían amarillamientos eran causadas por virus:

9Sintomatología

9Transmisión por insectos

9Multiplicación en plantas e insecto vector 9El agente causal era filtrable y se transmitía por

injerto

Mollicutes Fitopatógenos

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

En 1902 se publica el primer

En 1902 se publica el primer

informe sobre la aparici

informe sobre la aparicióón de un n de un “

“amarillamientoamarillamiento””óó““YellowYellow Disease

Disease””en plantas. Hasta 1967 en plantas. Hasta 1967

se les atribuy

se les atribuyóóorigen viralorigen viral

En 1967

En 1967 DoiDoiy colaboradores y colaboradores descubren, en cortes descubren, en cortes ultrafinosultrafinosdel del floema de plantas con s floema de plantas con sííntomas, ntomas, part

partíículas similares a los culas similares a los micoplasmas animales micoplasmas animales (

(MMicoplasma icoplasma LLikeikeOOrganismrganism) y se ) y se los denomin

los denominóóMLOMLO

1902 1967

(Dr. Luis

Dominio: Bacteria Phylum: Ternicutes

Clase: Mollicutes (Mycoplasmalike organisms (MLO))

Orden I: Mycoplasmatales

Orden II: Entomoplasmatales Familia II: Spiroplasmataceae

Género: Spiroplasma Familia (s): aún no definida

Género: Candidatus Phytoplasma

Mollicutes Fitopatógenos

• Tamaño pequeño, filtrables por poros de 450nm • Genoma pequeño

• Gram (+)

• Sin de pared celular, solo membrana plasmática

• Son los procariotas más pequeños que pueden autoreplicarse • Parásitos

• Resistentes a penicilina (interfiere con la producción de la pared celular) pero sensibles a tetraciclina y cloranfenicol (interfieren con la síntesis de proteínas)

• Los fitopatógenos son transmitidos por insectos que se alimentan del floema: cicadélidos, delfácidos y psílidos.

• Los mollicutes fitopatógenos: fitoplasmas y espiroplasmas.

Clase Mollicutes

Habitan y se multiplican en insectos Frecuentes en la superficie en plantas

y flores. Habitantes del floema y diversos órganos

de insectos

Identificación por serología y PCR Identificación por PCR, amplificación del

rRNA RFLP y/o análisis secuencial del DNA

Cultivables in vitro No se han podido cultivar in vitro

Morfolología helicoidal, filamentos ramificados o no, y/o formas de cocos. Pleomórficos ESPIROPLASMAS FITOPLASMAS S. citri Organismo vivo autoreplicante más pequeño que se conoce. Vasos floemáticos donde se observan fitoplasmas (IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Filodia

Virescencia Esterilidad

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Deformación y

disminución del

tamaño foliar

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Longitud anormal de entrenudos

(IFFIVE

Proliferación de yemas axilares

(escoba de bruja)

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Amarillamientos y “dieback”

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Vinca

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Duraznero

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

(IFFIVE

(IFFIVE--INTA)INTA)

Xylella fastidiosa

• Limitada al xilema • Transmitida por cicadélidos • Más de 150 especies hospederas • En viña: Enfermedad de Pierce • En citrus: Clorosis Variegada de los

HUANGLONGBING (“Citrus greening”)

• Gram negativa • Limitada al floema • No cultivable in vitro • Transmitida por psílidos • Capaz de multiplicarse en los

vectores

Pasos a seguir:

1) Observación del problema

2) Formular una hipótesis que explique lo

observado

3) Probar la hipótesis

4) Aceptar o revisar la hipótesis

DIAGNÓSTICO

Síntomas de enfermedades

_bacterianas

• Manchas foliares

• Manchas en frutos

• Cancros

• Marchitez

• Hiperplasia

• Podredumbre

• Costras

• Necrosis

Agallas o tumores

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Lesiones en frutos

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Xanthomonas arboricola pv. pruni

Lesiones en frutos

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Lesiones en frutos

Lesiones en frutos

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Xanthomonas campestris pv. cucurbitae

Costras

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Podredumbres blandas

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Podredumbres blandas

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Podredumbres blandas

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Afecciones vasculares

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Marchitez

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Manchas foliares

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Manchas angulares,

acuosas

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Manchas foliares

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Cribado

Defoliación

Síntomas de enfermedades

bacterianas

Cancros

Síntomas de enfermedades

bacterianas

PASOS DEL DIAGNOSTICO

Observación del problema

Aceptación o replanteo de hipótesis Planteo

de hipótesis

Prueba de hipótesis

• Observación de síntomas y signos

• Aislamiento en medios de cultivo

• Prueba de hipersensibilidad en no huésped • Pruebas de patogenicidad

• Prueba de Gram • Características culturales • Pruebas bioquímicas y fisiológicas • Pruebas serológicos (ELISA) • Técnicas moleculares

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

La bibliografía indica que podría ser una bacteria!!

Zooglea: Aspecto mucilaginoso,

constituido de masa bacteriana y

restos del vegetal.

Signo de bacterias

Microcorrida: para hojas

Técnicas para ver el signo de

bacterias

Test de flujo: para tallos

Técnicas para ver el signo de

bacterias

• Observación de síntomas y signos

• Aislamiento en medios de cultivo

• Prueba de hipersensibilidad en no huésped • Pruebas de patogenicidad

• Prueba de Gram • Características culturales • Pruebas bioquímicas y fisiológicas • Pruebas serológicos (ELISA) • Técnicas moleculares

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

Aislamiento

Aislamiento

Indirecto

Cultivo trampa

Aislamiento

_Aislamiento

• Observación de síntomas y signos • Aislamiento en medios de cultivo

• Prueba de hipersensibilidad en no huésped • Pruebas de patogenicidad

• Prueba de Gram • Características culturales • Pruebas bioquímicas y fisiológicas • Pruebas serológicos (ELISA) • Técnicas moleculares

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

1. Se realiza una inoculación masiva en el mesófilo de una hoja de una planta NO HUESPED 2. Se observa la ocurrencia (o no) de reacción de

hipersensibilidad

Hipersensibilidad en no

huésped

La aparición de una reacción de hipersensibilidad indica que la bacteria inoculada es patógena.

Hipersensibilidad en no

huésped

Prueba de patogenicidad

Inoculación mediante aspersión

Prueba de patogenicidad

Inoculación mediante infiltración

• Patógenos vasculares:

inoculación al tallo

– axila - pinchar a través

de gota

– inyección al tallo

Prueba de patogenicidad

• Observación de síntomas y signos • Aislamiento en medios de cultivo

• Prueba de hipersensibilidad en no huésped • Pruebas de patogenicidad

• Prueba de Gram • Características culturales • Pruebas bioquímicas y fisiológicas

• Pruebas serológicos (ELISA) • Técnicas moleculares

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

Taxonomía

– Morfológicas,

– Culturales (forma, bordes,

color de las colonias)

– Fisiológicas

– Bioquímicas

– Patológicas (capacidad

para atacar a

determinado huésped)

Características

taxonómicas

Morfología de colonia en

medio sólido

Forma

Elevación

Borde

Morfología de colonia en

medio sólido

Pared celular

Prueba de gram indirecta

GRAM (+) GRAM (-)

GRAM (-)

– Erwinia

– Pseudomonas

– Xanthomonas

– Xylella

– Agrobacterium

GRAM (+)

– Clavibacter

– Curtobacterium

– Streptomyces

Principales géneros de

Bacterias fitopatógenas

Coloración de la colonia

en medio YDC

Reacción de oxidación/fermentación o de Hugh & Leifson

La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen metabolismo oxidativo

Características

fisiológicas

• Metabolismo

oxidativo

– Pseudomonas

– Xanthomonas

– Xylella

– Agrobacterium

– Clavibacter

• Metabolismo

fermentativo

– Erwinia

Reacción de o/f

Producción de pigmentos fluorescentes

Pseudomonas fluorescens se caracteriza por producir pigmentos fluorescentes (izq)

Características

fisiológicas

• Observación de síntomas y signos • Aislamiento en medios de cultivo

• Prueba de hipersensibilidad en no huésped • Pruebas de patogenicidad

• Prueba de Gram • Características culturales • Pruebas bioquímicas y fisiológicas

• Pruebas serológicos (ELISA) • Técnicas moleculares

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

• Serología: ELISA

Otras Técnicas

• Técnicas moleculares

– PCR

– PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)

– Real time PCR

– Secuenciación

Técnicas moleculares

PCR

PCR-RFLP

Técnicas moleculares

Real time PCR

Técnicas moleculares

Secuenciación

Diagnóstico de enfermedades

bacterianas

• AGRIOS, G. 2005. Plant pathology. 5nd. ed. London, Elsevier Academic Press. 922 p.

• KADO, C. 2010.Plant bacteriology. Minessota, APS Press. 336 p.

• TRIGIANO, R.; WINDHAM, M.; WINDHAM, A. 2008. Plant pathology, concepts and laboratory exercises. 2nd. ed. Florida, RC Press. 558 p.