Procesamiento y Análisis digital de imágenes biológicas para el reconocimiento automático de quistes de Toxoplasma gondii

Procesamiento y Análisis digital de imágenes biológicas para el

reconocimiento automático de quistes de Toxoplasma gondii

Armando A. Quiñones Quiñones

Grupo de Investigación BIOAXIS, Programa de Bioingeniería, Universidad El Bosque Bogotá, Colombia

Mario F. Jiménez Hernández

Grupo de Investigación BIOAXIS, Programa de Bioingeniería, Universidad El Bosque Bogotá, Colombia

y

Graciela Juez Castillo

Grupo de Investigación Ciencias Básicas Aplicadas, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad EAN Bogotá, Colombia

RESUMEN

La Toxoplasmosis es una parasitosis humana causada por Toxoplasma gondii, un patógeno de prevalencia en varias especies de animales de sangre caliente. Este parásito es clínicamente importante debido a las enfermedades que puede causar, entre ellas, correoretinitis, microcefalia, hidrocefalia y retardo mental. También afecta a pacientes inmunocomprometidos, aquellos con algún tipo de cáncer, trasplante de órganos y VIH. La infección crónica por T. gondii, se carateriza por la formación de quistes en la célula hospedera que permiten la sobrevivencia del parásito, de ahí la importancia de detectar y analizar las estructuras quísticas para evidenciar mecanismos de interacción entre microorganismo y huésped. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un algoritmo matemático de procesamiento digital de imagen, para el reconocimiento morfológico de varios quistes de T. gondii en un solo campo visual. Esta herramienta usó el Toolbox Image Processing del software Matlab 2014. El algoritmo desarrollado proporcionó una alta sensibilidad y especificidad para la detección automática de un solo quiste en un campo visual, sin embargo no se obtienen los mismos resultados para el caso de dos estructuras quísticas en el mismo campo visual, para ello se requiere mejorar el protocolo histoquímico que redunde en una mejor resolución de la imagen. Keywords: Toxoplasma gondii, Excentricidad, Co-ocurrenccia

1. INTRODUCCIÓN

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular

miembro del filum Apicomplexa. Es un importante patógeno de una variedad de animales incluyendo humanos. La infección en hospederos intermediarios, incluyendo la especie humana,

ocurre a través de diferentes vías, transmisión de madrea a feto, transmisión de taquizoitos en trasplante de órganos, ingestión de taquizoitos o bradizoitos presentes en carnes preparadas con mínimas condiciones de cocción [1] e ingestión de ooquistes presentes en agua destinada para el consumo humano [2].

T. gondii es un patógeno de alta significancia en

epidemiología debido a las enfermedades que causa en el feto en caso de ser transmitido durante la gestación, sus manifestaciones clínicas se asocian con encefalitis, eritroblastocis, correoretinitis, microcefalia, hidrocefalia, retardo mental, entre otras [3,6]. Además, este parásito oportunista puede generar infección crónica en pacientes inmunocomprometidos con algún tipo de cáncer [4] y con trasplante de órganos [3]; adicionalmente, las personas con VIH son extremadamente vulnerables al desarrollo de encefalitis toxoplásmica [5], se reporta que alrededor del 30 al 50% de los individuos infectados presentan esta patología. Por otra parte, la seropositividad of T. gondii ha sido asociada con la manifestación clínica de otras infecciones crónicas como hepatitis B, diabetes mellitus, neoplasma, squizofrenia y artritis [7].

T. gondii predomina fuertemente debido a su

fuerte capacidad de interconversión entre los estados taquizoito y bradizoito, la cual le permite resistir efectivamente al sistema immunológico. Este parásito tiene un complejo ciclo de vida que incluye la reproducción sexual y asexual dependiendo de su estado de desarrollo biológico. El ciclo sexual ocurre solamente en el intestino de los gatos, los cuales se consideran los huéspedes definitivos [8], mientras que el ciclo asexual se presenta en la mayoría de huéspedes intermediarios [9]. Cuando el huésped desarrolla inmunidad, la cantidad de taquizoitos libres disminuye y su multiplicación intracelular se hace lenta. Dentro de pocas semanas, el parásito se interconvierte del estado taquizoito (fase proliferative o aguda) al estado bradizoito (fase

crónica o latente), el cual forma el quiste tisular para mantenerse en el hospedero posiblemente por toda la vida. Los quistes de T. gondii crecen en algunos tejidos, especialmente en el cerebro protegiendo el parásito del sistema inmune [8].

Una de las complejas estrategias de este parásito para sobrevivir es su capacidad para afectar los huéspedes inmunocomprometidos y reactivar la infección, causando potencialmente encefalitis fatal [9]. El aumento en el interés de las consecuencias de la interconversión de T. gondii, ha conducido a diversas investigaciones en la recrudescencia de la Toxoplasmosis, por ejemplo en individuos infectados con VIH, los bradizoitos que se encuentran en los tejidos se diferencian a taquizoitos, los cuales llegar a generar abscesos cerebrales conduciendo al problemas fatales para el paciente [5]. El estado quístico de T. gondii aún no ha sido exhaustivamente caracterizado, por lo cual se considera importante la continuidad en estudios de los mecanismos que utiliza el patógeno para establecerse en la célula hospedera por meses, años e inclusive por toda la vida [10].

La zoonosis en Colombia actualmente es un tema de alta importancia epidemiológica debido a las vías de transmisión y desarrollo de la patogénesis, algunos estudios reportan la presencia de cepas avirulentas de T. gondii en aislados de carne destinada al consumo humano proveniente de algunas regiones de Colombia [12]. Para profundizar en el estudio de la Toxoplasmosis es necesaria la investigación en la caracterización de los estados de desarrollo del parásito, lo cual contribuirá con el entendimiento de los eventos involucrados en el desarrollo de la patología, en este caso el presente trabajo está enfocado en la detección y análisis de estructuras quísticas de T. gondii, aisladas de tejidos de cerdos destinados al consumo humano y provenientes de una región Colombiana en la cual se conocen algunos reportes de prevalencia del parásito. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un algoritmo matemático de procesamiento digital de imagen, para el reconocimiento morfológico de varios quistes de T. gondii en un solo campo visual. Esta herramienta usó el Toolbox Image Processing del software Matlab 2014. El algoritmo desarrollado proporcionó una alta sensibilidad y especificidad para la detección automática de un solo quiste en un campo visual, sin embargo no se obtienen los mismos resultados para el caso de dos estructuras quísticas en el mismo campo visual, para ello se requiere mejorar el protocolo histoquímico que redunde en una mejor resolución de la imagen.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio experimental de los quistes de T. gondii fue realizado en cerebro de ratón infectados con cepa avirulenta JUEZ1 nativa de Colombia. Inicialmente se tomaron muestras de tejidos de corazón y lengua de cerdo destinados para consumo de la población Colombiana. Estas muestras fueron procesadas y analizadas mediante técnicas moleculares, posteriormente para mantener la viabilidad del patógeno y permitir el desarrollo del estado quístico, parte de estas muestras fueron inoculadas en ratones con ciertas especificaciones y teniendo en cuenta las normas de bioética. Posteriormente los ratones fueron sacrificados y su cerebro fue aislado para realizar procesos histoquímicos y moleculares.

El análisis histoquímico fue desarrollado con reactivos Periodic-Acid-Schiff (PAS) y Giemsa, en los laboratorios BBMP de la universidad de los Andes. Este estudio permitió la visualización de los quistes de T. gondii a diferentes escalas, usando un microscopio Carl Zeiss 37081 AX10sKop 40 y posterior captura de imágenes de microscopía óptica, mediante cámara Nikon Carl Zeiss SONY DSC-S85. Las imágenes obtenidas fueron sometidas al procesamiento digital mediante la aplicación del algoritmo matemático desarrollado. Algoritmo

Para llevar a cabo el análisis de los quistes de T.

gondii, las imágenes fueron procesadas usando

etapas específicas (Fig.1) a través de la herramienta computacional Matlab 2014, toolbox Image Processing. El algoritmo permitió segmentar las imágenes resaltando ciertas características esenciales de la imagen biológica, tales como la circularidad, cuyo parámetro morfológico se mantiene constante en todas las imágenes de los quistes de este parásito, de ahí que se utilizó para la detección el parámetro de la escentricidad como medida de circularidad, (Fig. 2a, 2b).

Finalmente, mediante una matriz de co-ocurrencia (fórmulas 1, 2) el análisis de textura fue realizado utilizando el índice de homogeneidad (fórmula 3), el cual es considerado un parámetro fundamental que proporciona información respecto a la regularidad local de la textura (Fig. 3) y detección propia del quiste (Fig. 4A, B, C).

Fig. 1. Diagrama de flujo de las etapas del procesamiento digital de la imagen del quiste de T. gondii.

Fig. 2a. Parámetro de Circularidad [11].

Fig. 2b. Índice de escentricidad. Matlab 2014. Quistes de T. gondii. Cepa JUEZ1 nativa de Colombia. Tinción Giemsa, tejido cerebral de ratón con 8 meses de infección. Quiste de 55um de diámetro, 10x (A, B). Quistes de 77um de diámetro, 10x (C). Microscopio Carl Zeiss 37081 AX10sKop 40.

Fig. 3. Parámetro de homogeneidad de la imagen del quiste de T. gondii. Matlab 2014. Matriz de Co-occurrence (1) (2) Homogeneidad

∑

∑

=

₊

₊

=

i

j

C

y

Homogeneit

)

(

1

Classification accuracy  = !"#$%&  !"  !"!#$%  !"##$!%&'  !"#$$%&%'"(_{!"#$%  !"#$%&  !"  !"!#$%} =!"_!"= 1 (4)

Sensitivity =_{!"#$  !"#$%$&'#!!"#$%  !"#$%&'"(}!"#$  !"#$%$&'# = !"

!"!!= 1 (5)

Specificity= !"#$  !"#$%&'"(  

!"#$  !"#$%&'"(!!"#$%  !"#$%$&'#= !"

!"!!= 1 (6)

Error =Falsenegatives + Falsepositives Truenegatives + Trupositives

= 0

60

= 0 ₍₇₎

Algoritmo para Detección de dos quistes de T. gonddii en el mismo campo visual

Para el reconocimiento morfológico de varios quis-tes de T. gondii en un solo campo visual, primero se ecualizaron las imágenes debido a que todas care-cían de intensidades bajas y altas de grises, esto permitió mejorar la calidad de la imagen y por ende resaltar la morfología del quiste.

Posteriormente las imágenes fueron binarizadas, erosionadas para eliminar pixeles no significativos y por último, se utilizó la circularidad como índice para la detección de los quistes, cuyo parámetro matemático se muestra en la figura 3. La identifica-ción automática de dos quistes en el mismo campo visual se puede observar en la figura 6A.

3 RESULTADOS

Detección de un quiste de T. gondii en un campo visual

Para la identificación de quistes de T. gondii (Fig. 6A, B, C) en imágenes de microscopía óptica, el algoritmo de detección automática se basó principalmente en dos parámetros: uno definido como el índice de circularidad, el cual inicialmente permitió identificar las formas circulares de los organelos presentes en la imagen biológica y la segunda determinada por el análisis de textura, cuyo parámetro fue la homogeneidad (entendido

como la regularidad local de la intensidad de pixeles distribuidos en el área del círculo detectado). De esta manera puede deducirse que el algoritmo proporcionó una alta sensibilidad y especificidad como herramienta computacional para la detección automática de quistes de T. gondii en muestras biológicas. El algoritmo usa un umbral de área, considerando que existen varias estructuras celulares con forma circular, esto con el fin de descartar estructuras celulares circulares muy pequeñas. Aplicando técnicas de procesamiento digital a las imágenes de microscopía óptica, se logró mejorar la detección de quistes de T. gondii (Figs. 6A, B, C).

Fig. 6. Procesamiento de imagen con Matlab 2014. Quistes de Toxoplasma

gondii de cepa JUEZ1 nativa de Colombia. Tinción Giemsa, tejido de cerebro de

ratón con ocho meses de infección. Quiste de 55um de diámetro, 10x (A). Quiste de 97um de diámetro, 100x (B). Quiste de 75um de diámetro, 10x (C). Microscopio Carl Zeiss 37081 AX10sKop 40.

Detección de dos quistes de T. gondii en el mismo campo visual

El algoritmo desarrollado reconoció morfológicamente dos quistes de T. gondii en el mismo campo visual (Fig 7A), sin embargo para algunas imágenes no se obtienen los mismos resultados en términos de la sensibilidad comparada con la detección de un solo quiste, debido a que la calidad de la imagen se vió afectada por los procesos histoquímicos que no resaltaron de manera óptima la estructura quística del parásito (Fig 7B).

Fig.7 A B

Detección de quistes de T. gondii en un campo visual. Procesamiento de imagen con Matlab 2014. Quistes de

Toxoplasma gondii de cepa JUEZ1 nativa de Colombia.

Tinción Giemsa, tejido de cerebro de ratón con 8 meses de infección. Detección de dos quistes en el mismo campo visual, 10x (A). Detección de un solo quiste, pero presencia de dos en el mismo campo visual, 10x (B)., 10x. Microscopio Carl Zeiss 37081 AX10sKop 40.

4.

El algoritmo aplicado a partir de imágenes microscopía óptica para la cepa avirulenta JUEZ1 de T.gondii, permitió la detección automática de quistes del patógeno con alta sensibilidad y especificidad, esto indica que la herramienta computacional desarrollado es capaz de acelerar los procesos de identifición y conteo de quistes de T.

gondii en una muestra biológica. Para mejorar las

condiciones de detección en el caso de 2 quistes en un miscmo canpo visual, es necesario mejorar la calidad de la imagen a través de la mejora del proceso histoquímico que permit resaltar el quiste con respecto al fonde de la imagen. El algoritmo fue validado con 60 imágenes biológicas, en cada una de ellas se visualizó por campo visual un quiste de T. gondii mediante el uso de microscopía óptica, estas estructuras celulares se presentaron de diferente tamaño pero todas provenientes de muestras estudiadas bajo las mismas condiciones experimentales.

Este trabajo proporciona una herramienta computacional eficiente para el estudio de la Toxoplasmosis en Colombia a través de la detección automática y precisa de los quistes de T.

gondii en muestras biológicas. En trabajos futuros

se espera continuar con el análisis de un mayor número de imágenes biológicas obtenidas de diversas cepas del patógeno, así como la detección de varios quistes en el mismo campo visual óptico, esto permitirá validar la eficiencia del algoritmo contribuyendo con la rapidez en la detección de patógenos presentes en muestras biológicas. Agradecimientos

Juan Miguel Escobar, Director del Programa de Bioingeniería de la Universidad El Bosque. Eduardo Ramírez, Director del Departamento de Ciencias Básicas de la Universidad EAN. Barbara H. Zimmermann, Directora del grupo de investigación BBMP de la Universidad de Los Andes.

5. REFERENCIAS

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