Estimación de la biomasa fúngica en un suelo del sudoeste de la provincia de Buenos Aires (Argentina) con una tinción directa con blanco de calcoflúor

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E

MICROBIOLOGÍA

ORIGINAL

Estimación

de

la

biomasa

fúngica

en

un

suelo

del

sudoeste

de

la

provincia

de

Buenos

Aires

(Argentina)

con

una

tinción

directa

con

blanco

de

calcoflúor

María

B.

Vázquez

a,

,

Martín

R.

Amodeo

b

y

María

V.

Bianchinotti

a,c

aCERZOS-CONICET,CCT-BahíaBlanca,CentrodeRecursosRenovablesdelaZonaSemiárida,CentroCientíficoTecnológico

BahíaBlanca,BahíaBlanca,BuenosAires,Argentina

bGEKKO,GrupodeEstudiosenConservaciónyManejo,UniversidadNacionaldelSur,BahíaBlanca,Argentina cUniversidadNacionaldelSur,BahíaBlanca,Argentina

Recibidoel14deenerode2016;aceptadoel31demayode2016 DisponibleenInternetel8deseptiembrede2016

PALABRASCLAVE Biomasafúngica; Regiónpampeana; Calcoflúor; Epifluorescencia

Resumen Losmicroorganismosdelsuelosonvitalesparaelcorrectofuncionamientodelos ecosistemas,principalmenteporsupapelenelcicladodenutrientes.Laintensificacióndeluso delsueloylasprácticasagrícolasalterannegativamentelaactividadmicrobiana.Labiomasa fúngicaesunodelosparámetrosmásutilizadosparaestudiarelimpactodelasactividades agrícolasenlaestructurayelfuncionamientodelsuelo.Elobjetivodelpresentetrabajofue estimarlabiomasafúngicaenunsuelodelsudoestebonaerenseconelfindeobtenervalores dereferenciaquepermitanusaresteparámetrocomounindicadordecambiosenel ecosis-temay,porotrolado,demostrarquelametodologíaempleadaessensiblealasvariacionesen lascondicionesclimáticas.Secolectaronmuestrasdesuelosdurante2a˜nosconsecutivos.Se prepararonfrotisdesueloyseti˜neronconsolucionesdedistintasconcentracionesdeblanco decalcoflúoryluegoseestimólabiomasafúngicaobservandolosfrotisconmicroscopiode epi-fluorescencia.Losvaloresdebiomasafúngicaestimadosvariaronentre2,23y26,89␮gCfúngico/g desueloyestuvierondentrodelrangoesperableparaeltipodesueloestudiado.Labiomasa fúngicamostróunarelaciónpositivaconlatemperaturaylasprecipitaciones.Lametodología empleadaresultóserconfiable,repetibleysensibleacambiosenlascondicionesclimáticas. Losresultadospodríanusarsecomovaloresdereferenciaparaestudiarlabiomasafúngicade suelosbajodistintascondiciones yemplearsecomo indicadoresdelimpactodelasdistintas prácticasagrícolassobreelecosistema.

©2016Asociaci´onArgentinadeMicrobiolog´ıa.PublicadoporElsevierEspa˜na,S.L.U.Esteesun art´ıculoOpenAccessbajolalicenciaCCBY-NC-ND( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Autorparacorrespondencia.

Correoelectrónico:mbvazquez@criba.edu.ar(M.B.Vázquez).

http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.05.006

0325-7541/©2016Asociaci´onArgentinadeMicrobiolog´ıa.PublicadoporElsevierEspa˜na,S.L.U.Esteesunart´ıculo OpenAccessbajola licenciaCCBY-NC-ND(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

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KEYWORDS Fungalbiomass; Argentineanpampas; Calcofluor;

Epifluorescence

FungalbiomassestimationinsoilsfromsouthwesternBuenosAiresprovince (Argentina)usingcalcofluorwhitestain

Abstract Soilmicroorganismsarevitalforecosystemfunctioningbecauseoftheroletheyplay insoilnutrientcycling.Agriculturalpracticesandtheintensificationoflandusehaveanegative effectonmicrobialactivitiesandfungalbiomasshasbeenwidelyusedasanindicatorofsoil health.TheaimofthisstudywastoanalyzefungalbiomassinsoilsfromsouthwesternBuenos Airesprovinceusingdirectfluorescentstainingandtocontributetoitsuseasanindicatorof environmentalchangesintheecosystemaswellastodefineitssensitivitytoweather condi-tions.Soilsampleswerecollectedduringtwoconsecutiveyears.Soilsmearswerepreparedand stainedwithtwodifferentconcentrationsofcalcofluor,andthefungalbiomasswasestimated underanepifluorescencemicroscope.Soilfungalbiomassvaried between2.23and26.89g fungalC/gsoil,beingthesevaluesintherangeexpectedforthestudiedsoiltype.Thefungal biomasswaspositivelyrelatedtotemperatureandprecipitations.Themethodologyusedwas reliable,standardizedandsensitivetoweatherconditions.Theresultsofthisstudycontribute informationtoevaluatefungalbiomassindifferentsoiltypesandsupportitsuseasanindicator ofsoilhealthforanalyzingtheimpactofdifferentagriculturalpractices.

©2016Asociaci´onArgentinadeMicrobiolog´ıa.PublishedbyElsevierEspa˜na,S.L.U.Thisisan openaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introducción

Losmicroorganismosdelsuelo(bacteriasyhongos)sonuna parte fundamental en ese ecosistema, ya que participan activamenteenelcicladodelosnutrientesyenla descom-posicióndelamateriaorgánicamuerta21,24.Másdel50%de labiomasamicrobianadelsueloestáconstituidaporhongos, loscuales,ademásdesuimportanciacomo degradadores, contribuyenalmantenimientodelaestructuraylahumedad deesemedio,conloqueseprevienesuerosión21.

Laproductividaddeunsistemaagrícolaestáfuertemente relacionadaconlaactividadmicrobiológicadelsuelo43.Asu vez,laintensificacióndelusodelsueloylasprácticas agrí-colasalteran negativamentelaactividadmicrobiana enel suelo4,31,41.Por ende,el estudiodelabiomasayla activi-dadmicrobianadelsueloesrelevanteparacomprenderel impactoquelasactividadesagrícolastienensobrela estruc-turayelfuncionamientodelecosistema4.

El estudio de los hongos provenientes de muestras medioambientalesescomplejo,enparteporquelas técni-casconvencionalesbasadasenelusodemediosdecultivo sonconsideradasinsuficientesapartirdeunanálisis exhaus-tivo de tales muestras. Muchos hongos son incapaces de crecer encondiciones de laboratorio o solo una peque˜na fracción,inferioral 1%,escultivable.Por ello,si bienlas técnicasdependientesdelcultivofueron laspreferidas en elpasado,enlaactualidadseconsideraqueporsísolasson insuficientes,yaquebrindaninformaciónsesgadasobrela diversidadybiomasafúngicadelsuelo26.Enconsecuencia, labúsquedademetodologíasquepermitanlograr estimacio-nesdebiomasaconfiables,independizándosedelcultivode losmicroorganismos,esrelevante.Algunastécnicas propo-nenlacuantificaciónindirectaestimandoparámetroscomo respiraciónyactividadenzimáticaopormediodetécnicas moleculares.Porotrolado,sehandesarrollado metodolo-gías basadas en conteo directo de losmicroorganismos a

partirdesuspensioneshomogenizadasdemuestrasdeagua ysuelo8.

Lainvestigacióndeloshongosenelsuelopresentauna dificultadadicional,debidoaquepeque˜naspartículas com-ponentesdesuelo, como arcillas o clastos, interfierenen la observación de las muestras. Además de la compleji-dad inherente al suelo, las hifas tienen una distribución heterogéneaeneseambiente,estoimplicaqueunmanejo inadecuadodelamuestraspuederesultarenestimaciones erróneas24.

La microscopia de fluorescencia se ha usado con éxito para realizar estimaciones de biomasa fúngica y a menudo ha llevado a mejores resultados que otras técnicas2,8,24,28. Elprincipio pararealizar las estimaciones de biomasa fúngica en suelo utilizando microscopia de fluorescencia es muy sencillo: un volumen conocido de suspensión de suelo se monta sobre un área conocida de un portaobjetos y luego la muestra se ti˜ne con un colorante fluorescente seleccionado en función del tipo de muestra y del objetivo del estudio8. Existen distintos protocolos para realizar estimaciones de biomasa fún-gica en muestras de suelo empleando microscopia de fluorescencia acoplada a tinciones específicas8,22,30,35,40. Entre los colorantes más usados para evidenciar hifas fúngicas está el blanco de calcoflúor (5-[[4-anilino-6- [bis(2-hydroxyethyl)amino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-2- [(E)-2-[4-[[4-anilino-6-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-2-sulfophenyl]ethenyl]benzenesulfonic acid), conocido comercialmente como Calcofluor White, Fluorescent Brightener 28 o Tinopal. Este fluorocromo ti˜nelas paredes celulares,haciéndolas lucirde colorazul brillante cuando son observadas con epifluorescencia. Debido a que esta metodología es fácilmente aplicable, tienebajocostoypuedeemplearsesobremuestrasfijadas, muchos laboratorios han comenzado a utilizarla para la observaciónyel recuentode hongosa partir demuestras

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de suelo2,10,12,25. Esta metodología brinda estimaciones confiables y reproducibles que son comparables con las realizadasutilizandootrastécnicasindirectas2.

En Argentina, las primeras investigaciones relativas a los hongos del suelo fueron realizadas hace más de 30a˜nos empleandoexclusivamente técnicasdependientes de cultivo13-15,18,20. Con el advenimiento de las técnicas independientesdelcultivo, las investigacionesse comple-mentaronconel empleodealgunadeellas,porejemplo, laestimacióndebiomasaatravésdelaactividad enzimá-ticao la cuantificación del contenido deergosterol en el suelo realizadaspor Aonet al.3, Bórtoli et al.11 y Gaspar etal.19.Enlaúltimadécadasepopularizóelusoexclusivo demetodologíasindependientesdelcultivo,comola cuan-tificacióndelcontenidodeácidosgrasosdelsueloempleada porMontecchiaetal.27yVargasGiletal.37.

Hasta la fecha, el blanco de calcoflúor no había sido empleadoparacuantificarlabiomasafúngicaenelsueloen Argentina.Elobjetivo delpresentetrabajo fueestimarla biomasafúngicaenunsuelodelsudoestedelaprovinciade BuenosAiresutilizandounatinciónespecíficaconblancode calcoflúoracopladaamicroscopiadefluorescencia, conel findeobtenervaloresdereferenciaquepermitanusareste parámetrocomounindicadordecambiosenelecosistema. Asimismo,seintentódemostrarquelatécnicaempleadaes suficientemente sensible para detectarlas variaciones en labiomasa fúngicadel suelo atribuibles acambios en las condicionesclimáticas.

Materiales

y

métodos

Muestrasdesuelo

Lasmuestrasdesuelofueronrecolectadasdeunaparcelasin historiadeusoagrícolaubicadaenlaestaciónexperimental ColoniaNapostá, perteneciente a la Universidad Nacional delSur, provincia deBuenos Aires, Argentina (38◦ 29 56 S;62◦ 1736O).Elsueloestudiadofueunhaplustoltípico conbajocontenidodemateriaorgánica(<2%).Se realiza-ron4muestreospora˜no,entrelosmesesdemayoyjunio, durante2a˜nosconsecutivos(2010y2011).Encadamuestreo setomaron4muestrasdelhorizontesuperficialdelsuelo (0-10cm).Las muestrassecolocaronenbolsasdepolietileno estérilesysemantuvierona4◦C;seprocesarondentrodelas 24hposterioresalarecolección,paraevitarlosefectosdel almacenamientosobrelacomunidadmicrobiana29.Losdatos meteorológicosfueron tomados dela estación meteoroló-gicapertenecientealCERZOS,ubicadaenelCCT-CONICET BahíaBlanca,Argentina.Seanalizaronlatemperaturayla precipitacióndurantelosperíodosdemuestreoysecalculó latemperaturapromedioylas precipitacionesacumuladas durantelos7díaspreviosacadafechademuestreo.

Suspensionesdesuelo

Serealizarondiluciones seriadasdelas muestras desuelo utilizandosoluciónsalinaestéril(0,4gMgSO4[H2O]7;0,02g FeSO4[H2O]7;0,2gK2HPO4;0,2g[NH4]2SO4; 0,08gCaSO4; 1000ml H2O destilada). Las suspensiones con 50mg de suelo/ml se fijaroncon formol al 37% y se conservarona 4◦Cenoscuridad.

Preparaciónytincióndelosfrotisdesuelo

SeutilizóunamodificacióndelatécnicadeBloemyVos8. Paraprepararlosfrotisdesueloseutilizaronportaobjetos de inmunofluorescencia de 11mm de diámetrode campo (LabSud,Argentina).Secolocóunaalícuota de20␮ldela suspensión de suelo (50mg/ml) enel centro del campoy sedejósecarcompletamenteatemperaturaambiente.Las muestrassesembraronporcuadruplicado.

Lassolucionesdeblancodecalcoflúor empleadas(2,5% y5%)(FluorescentBrigthener28,Sigma-AldrichArgentina, C40H44N12O10S2) se prepararon disolviendo completamente el colorante en 5ml de NaOH al 10% (v/v) durante unos minutos.Luegosellevaronaunvolumenfinalde100mlcon etanolal50%,sefiltraronatravésdeunfiltrodemembrana de0,2␮mdiámetro(Whatman)yseconservarona4◦Cen oscuridad.

Losfrotisdesuelosecolocaronsobrepapel absorbente húmedoyapartirdeesemomentosemantuvieronen oscuri-dad.Lashifasfúngicasseti˜neroncolocando50␮ldesolución decalcoflúorsobrecadafrotisduranteunahora.Luego,se eliminóelexcesodecoloranterealizando3lavadosde5min conetanol al50%yporúltimounlavadodeunminutoen agua destilada.Luego dellavado, lospreparados se deja-ronescurrir yseconservaronenoscuridada4◦Chastaun máximode60días.

Recuentodelashifasfúngicas

Los frotisdesuelosemontaronconunagotadeaceitede inmersióndebajafluorescencia(Cicarelli,Argentina),sobre laquesecolocóelcubreobjetos.Lasobservacionesse reali-zaronconunmicroscopioNikonEclipse(objetivo20X,filtro de excitación BP 340-380nm, divisorde haz 400nm y fil-trobarreraLP430nm).

Cálculosyestimaciones

Lalongitudtotaldehifasfúngicas(H)seestimóutilizandoel métododeintersección1.Seusólafórmula:H=I×× A

2L; dondeIeselnúmerodeinterseccionesporgrilla;Aeselárea delagrilla,yLeslalongituddelaslíneasdelagrilla,para calcularlalongituddehifasenlagrilla.Luegosecalculóla longitudtotaldehifasporgramodesuelo(F)comoF=H× 10−6×A B ×1 S

dondeHeslalongitudtotaldehifasenla grilla;Aeseláreadelfrotis;Beseláreadelagrilla,ySesla cantidaddesueloenelfrotis.Elbiovolumendehifas fúngi-casporgramodesuelo(V)seestimócomoV= 4W2F− W3, dondeWeselanchopromediodelashifasfúngicas(según BloemyVos8).ApartirdeVseestimóelcontenidode car-bonofúngicoporgramodesuelocomoCfúngico/gdesuelo= V×1,3×10−13g Cfúngico/␮m3

utilizandounvalorde car-bonoespecíficotomadodelaliteratura1.

Análisisestadístico

Serealizóunaregresiónmúltipleentrelosvalorespromedio debiomasacorrespondientesacadafechademuestreocon elvalordetemperaturayprecipitación.SerealizaronQ-Q plotsyanálisisderesidualesparaverificarelcumplimiento

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Figura1 Frotisdesuelote˜nidosconsolucióndecalcoflúoral 5%.Lasflechasindicanhifasfúngicas,elcírculomarcauncristal decalcoflúor.

delossupuestosdelanálisis.Paraloscálculosygráficosse utilizaronlospaquetesstats,gridExtrayggplot2del soft-wareR17.

Resultados

Laintensidaddela fluorescenciaenlosfrotisse mantuvo sinalteraciones hasta 60días luegode latinción. Si bien seobservótinciónenlosfrotiste˜nidosconambas concen-traciones de colorante (2,5% y5%), con la solución al 5% decalcoflúor seobtuvounaelevadatincióndefondoyse observarongrandescristalesdecolorante,quedificultaron laidentificación delas hifasfúngicas (figura1). Los frotis te˜nidosconlasoluciónal2,5%decalcoflúorpresentaronuna tincióndefondomuybaja,conpeque˜noscristalesdel colo-rante.Lashifaspresentabanuncolorazulbrillante,ysibien diversaspartículasdesueloseti˜neronjuntoconlashifas,al habermenortincióndefondolasestructurasfúngicasfueron fácilmentedistinguibles(figura2).

La biomasa fúngica estimada tuvo un mínimo de 2,23␮gCfúngico/gdesueloyunmáximode26,89␮gCfúngico/g desuelo,ambosvaloresregistradosduranteela˜no2011.La biomasafúngicapromedioestimadadela˜no2010varióentre 4,35y7,92␮gCfúngico/gdesueloyladela˜no2011,entre4,75 y20,8␮gCfúngico/gdesuelo.

Elanálisisdelasvariablesclimáticasdelosperíodosde estudiorevelóquelosvaloresdetemperaturaregistradosla

Figura2 Frotis desuelo te˜nidoscon solución calcoflúor al 2,5%.a)Detalledeunfrotisconnumerosaspartículasdesuelo. b)Hifafúngicate˜nidacorrectamente.c)Peque˜nosfragmentos dehifas.Lasflechasindicanlashifasfúngicas.

semanapreviaalosmuestreosfueronmayoresenla tem-porada2011(F[1,6]=12,8,p<0,05).Paraelcasodelas pre-cipitacionesacumuladaslasemanapreviaacadamuestreo, nosehallarondiferenciassignificativas(F[1,6]=0,02,p>0,8). Sinembargo,seregistróenlatemporada2011unvalorde precipitaciónextremoantesdeltercermuestreodela˜no.El análisisderegresiónmostróqueelvalordebiomasafúngica estimadapresentaunarelaciónpositivasignificativaconlas 2variablesambientalesanalizadas,temperaturay precipi-taciones(F[3,4]=13,07,p=0,015,R2=0,907),yqueexistea

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Figura3 Relaciónentrelabiomasafúngicadelsuelo,la tem-peraturaylasprecipitacionesacumuladas.R2=0,907. suvezunainteracciónsignificativaentrelasvariables pre-dictivas(F[1:4]=4,73,p<0,1)(figura3).

Discusión

Existendistintosmétodosparaestimarlabiomasafúngica, pero la aplicación de ninguno de ellos ha mostrado ser eficiente bajo una amplia gama de suelos y condiciones climáticas38. Las técnicas moleculares se pueden aplicar enla mayoría de lossuelos y son ampliamente utilizadas paraestimar ladiversidadfúngicadelsuelo,perono brin-dan información sobre la biomasa microbiana2. Por otro lado, las estimaciones de biomasa microbiana del suelo empleando observacionesmicroscópicas implican procedi-mientosmáslaboriososquelastécnicasindirectas,comola cuantificacióndelarespiración29,peropermitendiferenciar ycuantificarlabiomasafúngicaindependientementedela bacteriana.

EsteeselprimertrabajodeArgentinaqueutilizala tin-ción con blanco de calcoflúor acoplada a la microscopia deepifluorescencia paraestimar labiomasafúngicaenun suelo.Losvaloresdebiomasafúngicaestimadosenelsuelo estudiado estuvieron dentro del rango de los observados endiversossuelosagrícolas,con uncontenidodemateria orgánicasimilaroaunmayor2,16,24,32,36.

Alserunametodologíabastantereciente,todavíanoha sidoempleadaendistintostiposdesuelos;porelloaúnno son suficienteslos trabajos existentes como para realizar comparacionesvisavisdelosresultadosobtenidosensuelos concaracterísticassimilares.Apesardeesto,losresultados estuvierondentrodelrangodelospublicadosenlaliteratura utilizandotécnicascomparables2,12.

Elblancodecalcoflúor,porsualtaespecificidad,esuno delosfluorocromosmásusadosenestudiosdemorfologíay desarrollodehongos23.El calcoflúorti˜nedecolor azullas paredes celulares con quitina,celulosa yotros polisacári-dosconunionesß1,4.Suusoparaestimarbiomasafúngica enmuestrasdesuelo fuepropuestopor BloemyVos8; sin

embargo,aúnnohabíasidoempleadocondichopropósito enArgentina.

En el presente trabajo se propusieron modificaciones al protocolooriginal,que vuelven a latécnica fácilmente aplicable y aptapara trabajar con grandesvolúmenes de muestras yconlosinsumosdisponiblesennuestropaís.El colorantecalcoflúorcomercializadoenlaArgentinaesuna formulaciónsinsodio distintadela indicadaenla técnica originalporBloemyVos8.Lavariaciónenlaformulación quí-micadelcolorantefuecompensadaconlaadicióndeNaOHy loscristalesdecolorantesedisolvieroncompletamente,con loqueselogróunatinciónparejaenlosfrotisdesuelo.Asu vez,la concentracióndelcoloranteutilizado pararealizar las tincionesfuemenor quelarecomendadapreviamente. Los resultadosdeestetrabajo mostraronqueenlosfrotis desuelote˜nidosconsolucionesdecalcoflúoral2,5%la tin-ción fue más pareja y se obtuvo menor tinción de fondo ymenorcantidaddecristalesdecalcoflúorsindisolver. El empleodealtasconcentracionesdecolorantefluorescente puedeocasionarunaelevadatincióndefondo,quedificulta laobservacióndelospreparados42ygeneraunsesgoenlas estimaciones39.

Losfrotisdesuelo te˜nidosseconservaronsinmontary aunconestamodificaciónlaintensidaddelafluorescencia ylatincióndefondosemantuvieronsinvariacionesluego de60díasdealmacenamiento.Enconcordanciacon nues-tros resultados,estosparámetrostambiénsemantuvieron constantesporunperíodosimilarenotrostrabajosya publi-cados,peroconlospreparadosmontadosysellados8.Esta variaciónvuelvealatécnicamáságilyalavezdisminuye eltiempodemanipulacióndelospreparados,locualevita suexposiciónylaposibledisminuciónenlaintensidaddela fluorescenciaporcontactoconlaluz.

Lamagnificaciónutilizadaparalaobservacióndelos pre-paradosfuemenorquelapropuestaenlatécnicaoriginal. La biomasa fúngicadel suelo está estrechamente relacio-nada con las condiciones ambientales yla abundancia de recursos,enespecialmateriaorgánica24;porello,ensuelos deregionessemiáridas,comolosaquíestudiados,la densi-daddehifasesgeneralmentebaja.BloemyVos8mencionan quealobservarlospreparadosconunamagnificaciónmuy elevada,existe laprobabilidad desubestimarla biomasa, yaque muchos deloscampos observadosestaríanvacíos. Enelpresenteestudioseusóunamagnificaciónmenorque larecomendada,precisamenteparadisminuireseriesgode subestimación.

Labiomasafúngicamostróunarelaciónpositivacon la temperaturaylasprecipitaciones.Seobservaronresultados similaresenotrasinvestigaciones,enlasquesedestacala marcada influencia delas condiciones climáticas sobre la actividadfúngica5-7,9,33,34.Elsueloesunsistemamuy com-plejo enelque losprocesos físicos, químicosybiológicos estáninterrelacionadosysonfuertementeinfluenciadospor factoresambientales.

Enconclusión,losresultadosdelpresenteestudio mos-traronquelametodologíaempleadaresultóserunatécnica confiable,reproducibleysensible acambiosenlas condi-cionesclimáticas. Las estimacionesde labiomasa fúngica total registradas en el suelo estudiado son compara-bles con las obtenidas aplicando otras técnicas de mayor complejidad.

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Responsabilidades

éticas

Proteccióndepersonasy animales.Losautoresdeclaran queparaestainvestigaciónnosehanrealizado experimen-tosensereshumanosnienanimales.

Confidencialidaddelosdatos.Losautoresdeclaranqueen esteartículonoaparecendatosdepacientes.

Derechoalaprivacidadyconsentimientoinformado.Los autoresdeclaranqueenesteartículonoaparecendatosde pacientes.

Financiación

Este trabajo fue parcialmente financiado a través del proyecto PICT-FONCYT(PICT-07/00380).Los autores María BelénVázquez yMartín Raúl Amodeo tienenunabeca de investigaciónotorgadaporCONICET.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclarannotenerningúnconflictodeintereses.

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