INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Secretaría de Investigación y Posgrado
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Sección de Estudios de Posgrado e Investigación
Programa de Maestría en Ciencias Quimicobiológicas
D
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Tesis que como uno de los requisitos para obtener
el grado de Maestro en Ciencias Quimicobiológicas.
Presenta:
Sandra Emperatriz Quintana González
Directores de tesis:
Dra. Elba Reyes Maldonado.
Dr. Carlos Martínez Murillo
El presente trabajo se realizo en el Laboratorio de Hematopatología del Departamento de Morfología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección de la Dra. Elba Reyes Maldonado y en Laboratorio de Hematología especial del Servicio de Hematología, del Hospital General de México y en el Servicio de Hematología del Hospital General Regional No. 1 “Carlos McGregor” del IMSS, bajo la dirección del Dr. Carlos Martínez Murillo.
La sustentante fue becaria del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de enero de 2006 a diciembre de 2007 con número de registro 203964.
i
INDICE
Índice i
Abreviaturas ii
Índice de figuras iii
Índice de tablas iv Resumen v Abstract vii I. Introducción 1 La Hemostasia y su regulación 2 Justificación 28
Planteamiento del problema 29
Hipótesis 29
Objetivo 29
II. Material y métodos 31
Criterios de selección de los controles 31
Descripción general del estudio 35
Análisis estadístico 36 Aspectos éticos 37 III. Resultados 38 IV. Discusión 45 V. Conclusiones 50 VI. Referencias 51
ii
Abreviaturas
AT Antitrombina FT Factor Tisular FVIII Factor VIII
IVFT Inhibidor de la vía del factor tisular
PAI Inhibidor del Activador del Plasminógeno PAI-1 Inhibidor del Activador del Plasminógeno tipo 1 PC Proteína C
PCa Proteína C activada PS Proteína S
RPCA Resistencia a la Proteína C activada t-PA Activador del plasminógeno tisular
TAFI Inhibidor de la Fibrinólisis activado por Trombina
TAFIa Inhibidor de la Fibrinólisis activado por Trombina activado TAT Trombina-Antitrombina
TM Trombomodulina
TP Tiempo de Protrombina TR Tiempo de Reptilasa TT Tiempo de Trombina
TTPa Tiempo de Tromboplastina Parcial activada TEV Tromboembolismo Venoso
TVP Trombosis venosa profunda
iii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo celular de la Hemostasia Secundaria 4 Figura 2. Inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT) 6
Figura 3. Función de la Antitrombina 7
Figura 4. Sistema proteína Ca/PS 8
Figura 5. Equilibrio fisiológico en la formación y en la disolución del coágulo
10
Figura 6. Función de PAI-1 (Inhibidor del Activador del Plasminógeno Tisular tipo-1)
12
Figura 7. Activación de TAFI por el complejo Trombina/Trombomodulina (T/TM)
13 Figura 8. TAFI, es codificado en el cromosoma 13 en el brazo largo
en la fracción 14.11
13
Figura 9. Estructura Cristaloide de TAFI con la localización del péptido de activación y su dominio enzimático
14
Figura 10 TAFIa. 15
Figura 11. Diagrama de flujo 36
Figura 12. Concentraciones de PAI con respecto a la localización de la trombosis
43
Figura 13. Relación de los niveles de PAI-1 y sitio de la trombosis 43 Figura 14 Localización de la Trombosis por grupo de edad 44
iv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Factores de riesgo en tromboembolismo venoso 17 Tabla 2 Prevalencia de los marcadores biológicos y su riesgo
relativo en casos y controles
19
Tabla 3 Características generales de los controles sanos y en pacientes
38
Tabla 4 Pacientes que presentaron eventos trombóticos 39 Tabla 5 Distribución de los pacientes por factores o no de riesgo
y número de eventos trombóticos
39
Tabla 6 Valores de mediana y percentiles para las pruebas de hemostasia realizadas en pacientes y controles
40
Tabla 7 Resultados de las proteínas inhibitorias de la coagulación y FVIII
41
Tabla 8 Resultados de la mediana para las pruebas de fibrinólisis en los pacientes con trombosis.
41
Tabla 9 Resultados de las pruebas realizadas en este trabajo para casos y controles comparados con lo publicado.
v
Dedicatorias
A la Dra. Elba Reyes por su apoyo, dedicación, paciencia y sus grandes enseñanzas para mi formación académica
Al Dr. Carlos Martínez por todo el apoyo para la realización de este proyecto
A todos los integrantes de mi Comité Tutorial por su apoyo y enseñanzas
vi
RESUMEN
La trombosis es la primera causa de morbi/mortalidad en el mundo y en México, se encuentra dentro de las primeras causas de muerte. La trombosis se relaciona con la asociación de factores primarios (30-40% de los casos) y secundarios, sin embargo, en México no se conoce con exactitud la prevalencia de estos defectos primarios.
Objetivo. Determinar los niveles de plasminógeno, PAI-1, TAFI, de los inhibidores de la coagulación, Proteínas C y S, antitrombina, de FVIII y RPCa, en pacientes con historia de trombofilia primaria y un grupo control.
Material y Métodos. Se estudiaron a 114 pacientes con historia de trombosis arterial y/o venosa menores de 45 años de edad, procedentes del Servicio de Hematología del Hospital General de México de la SS y del HGR No. I del IMSS en la ciudad de México. Además 114 donadores de sangre como población control. Todos los pacientes y controles fueron notificados y estudiados bajo consentimiento informado. Se obtuvieron 10 mL de sangre de cada paciente y población control utilizando como anticoagulante citrato de sodio, se procedió a efectuar la separación del plasma para realizar las determinaciones hemostáticas, marcadores de fibrinólisis (plasminógeno, PAI-1 y TAFIa) y los factores de la coagulación (factor VIII), inhibidores de la coagulación (Proteína C, Proteína S y Antitrombina) y RPCa. Todas estas pruebas hemostáticas se realizaron por métodos coagulométricos y cromogénicos utilizando un equipo STA compact (STAGO- Asniéres, Francia) y por ELISA.
Resultados. De los 114 pacientes, 37 fueron hombres y 77 mujeres, el promedio de edad fue 33 años (16-44 años). Los sitios afectados fueron: trombosis venosa en 55.3% y arterial en 44.7%. El primer evento trombótico fue a los 32 años (rango: 15-44 años) y el 17.5% tuvieron antecedentes familiares de trombosis. En 61.5% no se encontraron factores de riesgo asociados. La RPCa se encontró positiva en10.2%, la deficiencia de la antitrombina en1.8%, de PC en 4.3%, de PS en 3.5% e incremento del FVIII:C en 5.6% de los enfermos. La disminución en los niveles del plasminógeno se encontró en 2.6% de los pacientes, mientras que los niveles PAI-1 se encontraron elevados en 18.4% de los pacientes y deTAFIa en 10.2%. Las concentraciones más elevadas de PAI-1 se asociaron con trombosis cerebral (p=0.023) y con mayor prevalencia en los pacientes >35 años (p=0.034), mientras que las concentraciones más altas de TAFIa se asociaron con TVP (p=0.01).
Conclusiones. Los resultados obtenidos en este estudio multicéntrico realizado en la ciudad de México, demuestran que existe alteración en los parámetros hemostáticos de los pacientes con trombofilia primaria en 48.2% de los enfermos con trombosis, pero la prevalencia de dichas alteraciones es baja comparada con población caucásica y similar en las determinaciones de marcadores fibrinolíticos como los niveles de PAI-1 y TAFIa, ambos resultaron ser marcadores para trombosis arterial cerebral y TVP, respectivamente.
vii
Abstract
Thrombosis is the first cause of morbidity and mortality in the World, and in Mexico is one of the leading causes of death. Thrombosis results of interactions between environmental and genetic risk factors (30-40% of cases are genetic factors), however in Mexico is not known with accuracy what is the prevalence in hereditary thrombosis.
Objective. To determine the levels of plasminógeno, PAI-1 TAFI, coagulation inhibitors; protein C, protein S and antihtrombin, factor VIII and APCR, in patients with history of hereditary trhombophilia and with a control group.
Material and Methods. We studied 114 patients withhistory of arterial trombosis and/or venous trombosis under 45 years old, The study was realized in Hematology Services of the Hospital General de México OD, SSA and HGR no.1 IMSS, in Mexico city. In addition 114 blood donors as control population. All patients and controls fill and accept informed consent. We collected 10 mL of blood from each patient and control group using sodium citrate as anticoagulant, then we separated plasma to realize hemostatic parameters, fibrinolysis markers (plasminógeno, PAI1 and TAFI), and coagulation factor (Factor VIII), coagulation inhibitors (Protein C, Protein S and antithrombin), and APCR. All these tests were measured by chromogenic substrate assays, coagulometric assay and enzyme-linked immunosorbent assay with STA compact (STAG-Asnieres, France) and by ELISA
Results.114 patients were screened ; 37 were men and 77 women, average age was 33 years (16-44 years). The siites affected were: venous trombosis in 55.3% and arterial site in 44.7% , 17.5% had a family history of trombosis. We did not find acquired risk factors in 61.5% of these patients. APCR was found positive in 10.2%, antithrombin deficiency in 1.8%, Protein C deficiency in 4.3% and, Protein S deficiency in 3.5%, FVIII:C increase was present in 5.6% of the patients. Plasminogen levels were decrease in 2.6%, whereas PAI-1 levels were elevated in 18.4% and, TAFI in 10.2%. The highest concentrations of PAI-1 were associated with cerebral trombosis (p=0.023) and greater prevalence in patients more than 35 years (p=0.034), while the highest concentrations of TAFI were associated with DVT (p=0.01).This multicenter study conducted in Mexico, demonstrated that there was alterations in coagulation tests in patients with arterial and venous trombosis in 48.2% of these patients. But the prevalence of these disorders is low compared with caucasian population and in the determinations of similar fibrinolytics markers; PAI-1 and TAFIa, both were found to be markers for cerebral arterial trombosis and venous trombosis (DVT), respectively
1
I. INTRODUCCIÓN.
La trombosis es la obstrucción local del flujo sanguíneo en algún vaso ya sea arterial o venoso, que provoca que los tejidos y células irrigados por dicho vaso, sufran isquemia, es decir, falta de oxígeno, y producir una lesión que puede evolucionar a la necrosis o muerte celular. Esto es lo que se conoce como infarto, el cual puede presentarse en miocardio, pulmón, cerebro y otros sitios. La masa que impide el paso de la sangre se llama trombo, y está compuesto de una malla que tiene proporciones variables de fibrina y plaquetas, que engloban a otros elementos celulares de la sangre, como los eritrocitos y leucocitos. Aunque las arterias y las venas son los sitios más frecuentes de aparición de la trombosis, también puede ocurrir en los capilares (microcirculación) o dentro de las cavidades del corazón. Las complicaciones de la trombosis se originan por los efectos locales de la obstrucción del flujo, por el desprendimiento y embolización del material trombótico, o por el consumo de elementos hemostáticos 1,2.
El patólogo Rudolf Virchow (1821-1902) postuló una triada de factores fisiopatológicos que pueden inducir la trombosis; la estasis de la sangre, las alteraciones en los componentes de la sangre y los cambios en la pared vascular. Actualmente, esta triada sigue vigente y explica que la enfermedad tromboembólica es una enfermedad multifactorial.
La trombofilia se define como un incremento en el riesgo de desarrollar trombos y puede ser congénita o adquirida. La formación o la presencia de un coágulo que afecta la circulación sanguínea, puede estar ubicado en el lado arterial o venoso, o en ambos sitios. La causa de esta oclusión en muchas ocasiones puede ser claramente identificada, pero en muchas otras permanece sin identificarse el origen.
La introducción del término trombofilia fue realizado por Egeberg en 1975, posterior a la descripción de la tendencia mayor al desarrollo de trombosis venosa profunda en una familia Noruega a quienes más tarde, se les describió la deficiencia de antitrombina III 3.
2 La trombofilia hereditaria se define como la tendencia genéticamente determinada para producir trombosis. Las alteraciones genéticas dominantes o la combinación de varios defectos menos graves pueden desarrollar clínicamente trombos a temprana edad. Además, la recurrencia de la enfermedad es más frecuente y, adicionalmente, existe una historia familiar de trombosis 4.
Esta tendencia mayor para el desarrollo de trombosis en relación al resto de la población general, se ha denominado: síndrome de hipercoagulabilidad, estados pro-trombóticos y trombofilias5. Los individuos afectados pueden presentar eventos trombóticos al asociarse con algún factor de riesgo, además de presentar cuadros recurrentes de trombosis.
La trombosis venosa profunda y el embolismo pulmonar se consideran como una sola enfermedad clínica denominada tromboembolismo venoso (TEV), debido a que tienen el mismo mecanismo patogénico.
Aún cuando es bien conocido que todos los pacientes con TEV tienen un alto riesgo de tener episodios recurrentes, y que estos se presentan en algunas familias más frecuentemente que en otras; en la actualidad se ha demostrado que existen factores de riesgo hereditarios que ocasionan fenómenos trombóticos arteriales o venosos, o ambos. La trombofilia hereditaria puede ser encontrada en aproximadamente 70% de los pacientes que han experimentado un episodio de trombosis venosa 6.
La Hemostasia y su regulación
La presencia de la trombofilia se basa en un desequilibrio entre los mecanismos procoagulantes y anticoagulantes, adicionalmente, se suman los factores de riesgo secundarios entre los que podemos mencionar; la obesidad, la cirugía, el embarazo y otros 6,7.
3 La generación de la enzima trombina es el centro del proceso de la coagulación, la cual es esencial para la hemostasia y generar suficiente fibrina, cuyo exceso contribuye a la trombosis. La trombina es, por lo tanto, la clave para equilibrar adecuadamente la hemorragia o la trombosis.
La trombina se forma a través de la activación del sistema de la hemostasia, integrándose en tres fases; la de iniciación, la amplificación y la propagación. La fase de iniciación, comienza con el daño vascular, en la superficie de las células que expresan el factor tisular (FT), formándose el complejo FT/VIIa, que activa al FX y al FIX. El factor Xa se une al factor Va y juntos forman, el complejo protrombinasa; este complejo actúa sobre su sustrato, la protrombina (FII) y se produce la trombina (FIIa). Cuando se activa el FX, el FXa provoca la liberación del inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT) y frena la producción de más FXa y FVIIa, por lo que la cantidad que se produce por esta vía es pequeña (<5% del total de la trombina). La fase de amplificación, consiste en la producción de estas pequeñas cantidades de trombina, que son suficientes para producir la activación de los cofactores V y VIII, del FXI y de la activación de las plaquetas. La última fase, la fase de propagación, se encarga de generar grandes cantidades de trombina (>95% del total de la trombina), esta fase se lleva a cabo sobre las plaquetas activadas por la misma trombina. En la fase de propagación, el FIXa se une al FVIIIa, formando el complejo Xasa, en esta vía se forman suficientes cantidades de FXa que se unen con el FVa y se generan grandes cantidades de trombina 8-12, Fig 1.
4 Figura 1.Mecanismo celular de la Hemostasia Secundaria.La hemostasia inicia con la exposición del factor tisular (FT) por células que expresan este factor, se forma el complejo FT/VIIa quien actúa sobre dos sustratos; Factor X y Factor IX (fase de iniciación). El FXa se une en complejo con el Va (complejo protrombinasa) quien actúa sobre la protrombina y forma pequeñas cantidades de trombina. Las pequeñas cantidades de trombina (IIa) se deben a la presencia del inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT) que evita mayor producción de factor Xa. La fase de amplificación; la pequeñas cantidades de trombina que se forman son suficientes para activar al factor VIII y V, activar plaquetas y el factor XI. La fase de propagación se lleva a cabo sobre las plaquetas activadas. El factor IXa se une al factor VIIIa y se forma el complejo Xasa, quien a activa al factor X, el cual se une al factor V y se forma el complejo protrombinasa sobre plaquetas activadas y se forma una gran cantidad de trombina, para convertir el fibrinógeno en fibrina.
El sistema de la hemostasia es un sistema dinámico y su función primordial es mantener la sangre fluida dentro de los vasos sanguíneos. La regulación de la hemostasia esta integrada por diversos mecanismos antitrombóticos que interaccionan dinámicamente y regulan la formación del coagulo manteniendo un equilibrio. Estos mecanismos reguladores funcionan a través de proteínas que inhiben los mecanismos procoagulantes, de esta manera, hay inhibidores de los mecanismos de la hemostasia primaria y de la hemostasia secundaria.
5 El endotelio vascular cubre todos los vasos sanguíneos y sus propiedades de regulación son diferentes a lo largo del sistema vascular. En condiciones fisiológicas el endotelio vascular se encarga de mantener la sangre fluida dentro de los vasos sanguíneos, por lo tanto, su función más importante es antiagregante y anticoagulante (ej. activación de la proteína C), así como profibrinolítica (ej. liberación del activador del plasminógeno tisular; t-PA), sin embargo, cuando se rompe el equilibrio, en el caso de una lesión vascular (ej. colocación de un catéter venoso), el endotelio tiende a ser procoagulante (expresión de factor tisular) y antifibrinolítico, como la liberación del inhibidor del plasminógeno tisular tipo 1 (PAI-1) 13.
1. Inhibidores naturales; inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT), antitrombina (AT), proteína C (PC) y proteína S (PS)
Los factores activados de la coagulación son proteasas cuya actividad es modulada por los inhibidores naturales, de los cuales los más importantes son la antitrombina (AT) y el sistema de la proteína C (PC) y proteínas S (PS) 14.
El primer inhibidor que se produce, es el IVFT que como se comentó, inhibe la generación de trombina al inhibir al FVIIa y FXa (Fig. 2). Es un inhibidor tipo Kunitz que inhibe al complejo FT/FVIIa, el cual inicia la coagulación 15, por medio de dos mecanismos, inicialmente formando el complejo FXa/IVFT que subsecuentemente interactúa con FT/FVIIa, formando un complejo cuaternario e inactivando al complejo FT/FVIIa, lo que provocará que no se continúe la activación de complejo Xa y IXa 16.
6 Figura 2. Inhibidor de la vía del factor tisular (IVFT). La generación del complejo FT/VIIa produce la activación del FX, el FXa se une en complejo con el FVa que se encargan de generar trombina, pero solo en cantidades pequeñas, porque la presencia del FXa libera al IVFT que bloquea la acción del FVIIa y del FXa y evita, que se activen el FXa y FIXa. El IVFT es liberado de la célula endotelial y la heparina incrementa su liberación.
Otro sistema de inhibición, se lleva a cabo a través de la antitrombina (AT) y el sistema de las proteínas C y S.
1.1 Antitrombina (AT)
La AT normalmente circula en el plasma a una concentración mayorque el IVFT, su concentración es de 3.2 μmol/L. Tiene una vida media de 3 días y su función es neutralizar a las proteasas de serina. La información genética para su síntesis reside en el cromosoma 1, se sintetiza por el hígado y se secreta al plasma como una molécula de 432 aminoácidos. Tiene un peso de 58 kDa e inhibe a toda la superfamilia de las serpinas (17). La AT forma un complejo irreversible 1:1 con su enzima activa y el complejo es depurado en el hígado con la perdida de la función enzimática. Estudios recientes, han demostrado que la AT tiene acción antiinflamatoria independiente de su efecto anticoagulante 18-20. Pertenece a la familia de las serpinas, que incluye al cofactor II de la heparina, la α2-antiplasmina, el inhibidor del activador del plasminógeno tisular
7 tipo I (PAI-1), inhibidor de C1 y de la α1-antiplasmina.
Es un potente inhibidor de la trombina y de otras proteasas de serina como el FXIIa, FXIa, FIXa, FXa y calicreína 21-23. El mecanismo de inactivación de las proteasas de serina ocurre en dos pasos; inicialmente existe una interacción débil de la heparina o sustancias semejantes a la heparina, las cuales son secretadas en el endotelio vascular; esta interacción promueve un cambio conformacional de la AT, lo que provoca que esta pueda unirse a las proteasas de serina (Fig 3). La heparina se une a la trombina y potencializa la reacción de la AT, incrementando la capacidad de inhibición hasta mil veces más 24.
Figura 3. Función de la Antitrombina. La antitrombina circula en plasma, pero en presencia de heparina o sustancias semejantes a la heparina (dermatán sulfato, heparán sulfato), provocan un cambio conformacional. En este ejemplo la antitrombina se une y se forma el complejo TAT (Trombina/antitrombina), inactivando de esta forma la proteasa de serina. Por lo tanto, la heparina potencializa el efecto de la AT 1,000 veces más.
1.2 Sistema Proteína C/Proteína S
Las proteínas C y S son proteínas dependientes de la vitamina K (25-28). El sistema de las proteínas C y S actúa a través de la activación de la proteína C (PC) por el complejo trombina/trombomodulina (T/TM). El complejo T/TM activa a la PC (Fig. 4). La PCa se une a su cofactor la PS y juntos se encargan de la inactivación de los cofactores de la
8 coagulación el FVIIIa y FVa, controlando de esta manera, la activación de los complejos Xasa y protrombinasa, respectivamente. La PS es un componente esencial de la PC 28. La PS actúa como un cofactor en estas reacciones e incrementa la actividad anticoagulante de la PC a 20 veces más 29,30.
La proteína C es una glicoproteína de 62 kD, se sintetiza en el hígado como un zimógeno, circula a concentraciones de 4 μg/mL, la información genética para su síntesis se localiza en el cromosoma 2. La PCa a diferencia de la PS, es una enzima con propiedades antitrombóticas, sin embargo, también se han identifificado propiedades anti-inflamatorias y anti-apoptóticas 31. La proteína S existe en dos formas: una forma libre y otra unida en complejo con la proteína C4b del complemento 32.
La deficiencia de la antitrombina, PC y PS se asocia con una mayor tendencia trombótica 7,14.
Trombomodulina (TM)
Figura 4. Sistema Proteína Ca/PS.Una vez que se forma la trombina, se une al receptor de membrana; la trombomodulina (TM), el complejo trombina (IIa)/TM, en presencia de la PC, se une a su cofactor la PS y juntos inactivan a los cofactores VIIIa y Va, formando el FVIIIi y FVi.
9
2. Sistema de la Fibrinolisis
El sistema fibrinolítico incluye un amplio espectro de enzimas proteolíticas con funciones fisiológicas y fisiopatológicas en diferentes procesos que incluyen el equilibrio hemostático, remodelación de los tejidos, invasión de tumores, angiogénesis y reproducción 33,34.
Los objetivos de la fibrinolisis es restaurar la integridad del endotelio vascular y mantener la sangre liquida dentro de los vasos sanguíneos. La formación de la fibrina y su degradación son procesos fundamentales en la reparación de los tejidos en condiciones normales, por lo tanto, el proceso fibrinolítico regula el sistema de la coagulación en donde participan elementos plasmáticos y celulares.
La enzima principal que se encarga de la disolución del coágulo es la plasmina, por lo tanto, existen mecanismos plasmáticos que se encargan de generar esta enzima a partir de la activación del plasminógeno, su papel principal es degradar a la fibrina. Para formarse la plasmina, el plasminógeno debe ser activado, los activadores del plasminógeno son el activador del plasminógeno tisular (t-PA) y el activador tipo urocinasa (u-PA), a su vez estas proteínas son reguladas por los inhibidores del activador del plasminógeno (PAI) tipo 1 (PAI-1), el cual es liberado de la célula endotelial 35,36
, el tipo 2 (PAI-2) placentario 37 y el tipo 3 (PAI-3) el cual es idéntico al inhibidor de la proteína C 38. Las deficiencias del plasminógeno pueden producir trombofilia 7.
La plasmina puede ser inhibida específicamente por la 2-antiplasmina y de forma secundaria por la 2-macroglobulina. El inhibidor de la fibrinólisis activado por trombina (TAFI) es otro inhibidor del sistema fibrinolítico 39 (Fig.5).
10 Figura 5. Equilibrio Fisiológico en la formación y en la disolución del coágulo.La hemostasia debe mantenerse en equilibrio, cuando ocurre un daño vascular es importante que se forme un coágulo en el sitio del daño en un mecanismo fisiológico llamado hemostasia (integrado por la hemostasia primaria y secundaria). La coagulación debe ser transitoria en el tiempo, por lo que más tarde ocurren mecanismos de disolución del coágulo con la fibrinólisis. Adicionalmente, existen mecanismos de regulación natural para el sistema de hemostasia como la antitrombina, sistema de proteína C y S, proteína Z y ZPI y, para el sistema fibrinolítico los inhibidores son el PAI, la 2- antiplasmina y el TAFI.
2.1 Activadores del Plasminógeno
El Activador del Plasminógeno Tisular (t-PA), es una proteasa de serina sintetizada en la célula endotelial y liberado a la circulación sanguínea como precursor de una cadena (sc-tPA). En presencia de plasmina el sc-tPA se activa y se forma el t-PA, el cual está formado por dos cadenas. El t-PA tiene gran afinidad por la fibrina, por lo que al unirse a esta incrementa su actividad enzimática 40.
11 El activador del plasminógeno tipo Urocinasa (u-PA), es una proteasa de serina implicada principalmente en la protéolisis celular. El u-PA se une a su receptor específico sobre la membrana celular, el u-PAR, lo cual incrementa la activación del plasminógeno unido a la membrana 41.
2.2 Inhibidores de los Activadores del Plasminógeno.
El Inhibidor del Activador del Plasminógeno tipo-1 (PAI-1), es una glicoproteína de una cadena de 50 kDa con un gran espectro de inhibición proteolítica 42. Está constituida por 379 aminoácidos y no funciona únicamente como inhibidor de la fibrinólisis, sino también juega un papel importante en la transducción de señales celulares, adherencia y migración celular 42,43.
El PAI-1 es una glicoproteína que se sintetiza por una variedad de tejidos y células entre las que se encuentra la célula endotelial, los megacariocitos, el endometrio, peritoneo, macrófagos, células mesoteliales y tejido adiposo 40. Las concentraciones en plasma del PAI-1 tienen una variabilidad circadiana 44. Las variaciones díurnas de la concentración de PAI-1 se encuentran más elevadas, lo que provoca que la actividad fibrinolítica se encuentra disminuida en la mañana, tanto en sujetos sanos como en los pacientes con enfermedad arterial coronaria 44. El PA-1 pertenece a la superfamilia de las serpinas, los cuales son inhibidores de las proteasas de serina 40, forma un complejo covalente con su blanco, por lo que produce un complejo irreversible 45. La serpina esta presente en bajas concetraciones en el plasma humano. Las plaquetas contienen grandes cantidades de PA-1, y hay evidencia de que pueden sintetizar PAI-1 activo 46.
Es uno de los principales reguladores del sistema fibrinolítico in vivo40. El incremento en los niveles del PAI-1 puede producir disminución en la eliminación de la fibrina y por lo tanto, promover su depósito anormal y conducir a eventos trombóticos 47 Fig.6.
12 Figura 6. Función de PAI-1 (Inhibidor del Activador del Plasminógeno Tisular tipo-1). El principal inhibidor de la fibrinolisis es el PAI-1, el cual inhibe a los dos activadores del plasminógeno; el PA y el u-PA, de esta forma evita que se forme plasmina, la enzima principal de la fibrinolisis.
2.3 Inhibidor de la Fibrinolisis Activado por Trombina (TAFIa)
La coagulación también es controlada por una vía anticoagulante integrada por la trombina que se une a la trombomodulina en la célula endotelial en presencia de la proteína C del plasma, esta se activa y se produce la PCa (ver PC). Recientemente, se descubrió un análogo de la vía anti-fibrinolítica 39. El inhibidor es activado discretamente por la trombina, pero su activación se acelera 1,250 veces por trombomodulina 48. El complejo trombina-trombomodulina (T/TM), el cual en presencia de una proteína, conocida con el nombre de inhibidor de la fibrinolisis activado por trombina (TAFI), se forma una enzima; TAFIa (Fig. 7), inactiva a un cofactor que atenúa la fibrinolisis. TAFIa es una enzima clasificada como una metaloproteasa que exhibe una actividad semejante a la carboxipeptidasa B 39, esta proteína consta de 401 aminoácidos 49 y esta codificada en el cromosoma 13 (Fig.8). La imagen cristaloide de TAFI se representa en la Fig. 9.
13 En condiciones fisiológicas la enzima activa es relativamente inestable con una vida media de aproximadamente 10 minutos 50.
Figura 7. Activación de TAFI por el complejo Trombina/Trombomodulina (T/TM). El complejo T/TM en presencia de TAFI (Inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina), este es activado y se encarga de inhibir a la fibrinolisis. Por otro lado, en presencia de la proteína C (PC) se forma la PCa quien inhibe a los dos cofactores de la coagulación; V y VIII.
14 Figura 9. Estructura Cristaloide de TAFI con la localización del péptido de activación y su dominio enzimático.
TAFI se sintetiza en el hígado y se secreta como propéptido. El TAFI se activa por la plasmina, la trombina o en presencia del complejo trombina/trombomodulina 51.
TAFIa inhibe la fibrinolisis porque remueve los residuos de lisina en el extremo C-terminal 39, lo que resulta en disminución del plasminógeno y en inhibición de la segunda fase de la lisis del coágulo (Fig. 10). Otra probable actividad secundaria de TAFIa es la disminución en la conversión de Glu-plasminógeno a Lys-plasminógeno y en disminución en la protección de la plasmina de la inhibición de la 2-antiplasmina 50.
15 Figura. 10. TAFIa. TAFI se encuentra en el plasma en forma inactiva, la trombina, el comlejo Trombina/Trombomodulina y la plasmina lo pueden activar. TAFIa es una enzima que evita que la fibrina se degrade.
Redlitz y cols., en 1996, fueron los primeros que observaron que TAFIa estaba involucrado en la regulación de la fibrinólisis in vivo. Ellos demostraron en perros con trombosis inducida, que la actividad de TAFIa estaba incrementada durante la trombosis. Las concentraciones elevadas de TAFI en humanos correlacionan con dos veces más el riesgo de desarrollar TVP 104.
Recientemente, se ha producido la proteína TAFI recombinante y al parecer puede tener implicaciones terapéuticas relevantes. En efecto, la terapia antifibrinolítica empleando TAFIa puede ayudar a prevenir manifestaciones hemorrágicas en varias enfermedades, entre ellas la hemofilia 51, sin embargo, la estructura de TAFIa es inestable por lo que se esta intentando incrementar la vida media de su activiad enzimática por medio de glicosilación.
16
3. El Problema trombótico
La trombosis es una enfermedad que afecta a jóvenes y a viejos. La forma más común de trombosis antes de los 40 años, es la venosa, después de esta edad la incidencia de infarto agudo del miocardio (IAM) incrementa rápidamente y es la forma más común de trombosis. La incidencia de tromboembolismo venoso es de alrededor de 1 por cada 1,000 individuos/año.
Las trombosis han tenido un notable incremento como causa de morbi-mortalidad en el mundo moderno, sin embargo, a pesar de este aparente desarrollo, existen diferencias raciales, geográficas y socioculturales que influyen en cada región en particular en el mundo. Por ejemplo, se sabe que existen diferencias en la incidencia de algunas trombosis hereditarias, de acuerdo al origen de la población estudiada. La población aborigen tiene una incidencia más baja comparativamente con población mestiza o caucásica. A pesar de estas diferencias existen muchos factores de riesgo que influyen en la mayor parte de la población del mundo, así que podemos decir que se trata de un problema universal con sus particularidades 6.
4. Factores de riesgo
El proceso de trombosis involucra diversos factores que predisponen a un individuo a sufrir de una oclusión trombótica. Virchow, identificó a finales del siglo XIX, los factores que predisponen al desarrollo de la trombosis, estos factores son: lesión endotelial, estasis venosa y alteraciones en el componente sanguíneo.
La trombofilia hereditaria fue primeramente descrita en 1956, por Jordan y Nandorff por características clínicas 52. Las deficiencias hereditarias de AT, PC y PS fueron las primeras causas identificables de trombofilia 3,53,54. Años más tarde, fueron identificados dos polimorfismos genéticos como causa adicional de trombosis; el Factor V Leiden 55-58
17 protrombina 59.
Las principales causas de trombofilia hereditaria pueden ser originadas por la pérdida de la función de las proteínas inhibidoras de la coagulación, como las deficiencias de las proteínas C (PC), proteína S (PS) y antitrombina (AT), o bien, incremento de la función de algún factor de la coagulación como la mutación en el gen de la protrombina 20210 (G20210A), la disfibrinogenemia, hiperhomicisteinemia debido al daño en la vía metabólica, o la resistencia a la inhibición de la coagulación debido a la mutación del Factor V Leiden; la resistencia a la proteína C activada (RPCA).
Los factores de riesgo para el tromboembolismo venoso (TEV) están asociados con el daño tisular y la estasis por ejemplo: el trauma, obesidad, la cirugía e inmovilización, además del cáncer, ingesta de anticonceptivos orales (AO), hiperhomocistinemia, incremento de fibrinógeno y de FVIII. Las mujeres en edad reproductiva también tienen un alto riesgo de desarrollar trombosis por la ingesta de AO, el embarazo y el puerperio, lo que ha venido inquietando a la comunidad médica.
Tabla 1. Factores de riesgo en tromboembolismo venoso.
Adquirida Hereditaria Desconocida
Edad >40 años AT-III Hiperhomocistinemia
Trombosis previa Proteína C FVIII
Inmovilización >3 días Proteína S FvW
Cirugía >30 min Factor XII Fibrinógeno Cirugía ortopédica Plasminógeno
Embarazo b2 Glucoproteína 1
Anticonceptivos orales Resistencia a la Proteína C activada
Cáncer Factor V Leiden
Anticoagulante Lúpico Disfibrinogenemia Trombogénica Síndrome mieloproliferativo Protrombina 20210ª Viaje prolongado >6 hrs
Historia familiar de trombosis
18 La enfermedad TEV actualmente se considera como de origen multifactorial y resultado de las interacciones entre los genes; gen-gen y gen-microambiente (factores de riesgo adquiridos) 60.
En pacientes con presencia de trombosis venosa antes de los 18 años de edad, la prevalencia de los defectos trombofílicos se han encontrado en 54% de los casos (deficiencia de los inhibidores naturales de la coagulación en el 18.3%, FVL 31.8%, G20210A 4.2%), a diferencia de los adultos en quienes, el diagnóstico de trombofilia hereditaria se presenta en la tercera parte de ellos 61. Por tal motivo, se ha recomendado que todos los pacientes con trombosis venosa pueden ser candidatos potenciales para el estudio de trombofilia, independiente de la edad, las circunstancias de la trombosis y la severidad de las manifestaciones clínicas 62. Aún con estos datos es muy debatible a que pacientes se les deben realizar todas las pruebas de trombofilia. Un posible criterio de exclusión es la presencia de una enfermedad de alto riesgo para trombosis, como son las neoplasias.
4.1 Deficiencia de los inhibidores naturales de la coagulación.
En general, las deficiencias de los inhibidores naturales de la coagulación son raras; deficiencia de proteína C, S y AT, estas se detectan en menos del 1% de la población en general, y en menos del 10% de los pacientes con trombosis venosa (Tabla 2) 63-65.
En los individuos portadores de estas deficiencias, el riesgo de TEV es de 5-8 veces más alto que en la población en general y la incidencia anual de TEV es de 1-2% 63,66. Aproximadamente, la mitad de los eventos trombóticos ocurren en asociación con factores de riesgos circunstanciales, aunque el primer evento es más frecuente antes de los 45 años de edad.
19 Tabla 2. Prevalencia de los marcadores biológicos y su riesgo relativo en casos y controles.
Trombofilia Población general Caucásica (% portadores) Pacientes con TVE (%) Riesgo Relativo de TEV (casos y controles) Incidencia anual de TEV (%) Deficiencia AT 0.02-0.16 4.3 5 1-2 Deficiencia PC 0.2-0.4 4.8 6.5 1-2 Deficiencia PS - 4.3 1.7 1-2 Factor V Leiden 4.8 18.1 7 (heterocigotos) 40-80 (homocigotos) 0.19-0.67 PT G20210A 2.0 7.3 2-3 0.13 FVL+G20210A 0.01 2.2 20 0.57 Hiperhomocistinemia 5 10-25 2.5 - MTHFR 677 TT 13.7 13.9 1 - 4.2 Deficiencia de antitrombina.
Los pacientes con deficiencia de AT no pueden inactivar a las proteasas de serina (IIa, VIIa, IXa, XIa, XIIa) por lo que tienen mayor predisposición a desarrollar trombosis. Con 50% de reducción de AT es suficiente para perder el balance de la generación de trombina, y al perderse este equilibrio hay mayor probabilidad de que el paciente presente fenómenos trombóticos. Los individuos heterocigotos para la deficiencia de AT tienen una incidencia variable de trombosis, mientras que en los homocigotos es de 100%, por lo tanto, puede ser una enfermedad mortal a temprana edad.
Existen dos tipos de deficiencia de AT. La deficiencia de AT tipo 1 se caracteriza por la disminución en la síntesis de la proteína (antigénica y funcional) 3,24,67. La prevalencia es de 0.02%. El tipo 2 es la deficiencia funcional; la proteína está presente (prueba antigénica), pero la función esta defectuosa; esta alteración puede estar localizada en el sitio de unión a la trombina, o en unión a la heparina, o presentar un efecto pleiotrópico,
20 es decir mixto 7,65,68.
En algunos pacientes que son refractarios al tratamiento con dosis adecuadas de heparina, debemos de sospechar la presencia de deficiencia de AT, ya que la heparina es un inhibidor indirecto y requiere necesariamente de la AT para poder actuar 7.
La determinación de AT actualmente se considera como una prueba que debe realizarse cuando el paciente tiene TVP aguda, debido a que la deficiencia de esta proteína puede influir en el tratamiento. Así los niveles bajos de AT influyen en la respuesta a la heparina, por lo que los pacientes resistentes a dicho anticoagulante pueden tener niveles bajos de AT. La deficiencia de la PC y PS durante el tratamiento con la anticoagulación oral pueden presentar trombosis paradójica; así mismo, los niveles bajos de AT, PC y PS pueden interaccionar con el tratamiento a base de L-asparaginasa.
Adicionalmente, la determinación de estas proteínas se puede afectar en ciertas condiciones adquiridas: niveles bajos de AT se observan en pacientes con enfermedad hepática, síndrome nefrótico, enfermedades intestinales inflamatorias y embarazo. Niveles bajos de PC y PS se pueden presentar en pacientes con daño hepático; niveles bajos de PS se presentan en el embarazo 6.
4.3 Deficiencia de Proteína C.
La deficiencia de la proteína C (PC), fue descrita por primera vez en 1981 69, y está asociada con un incremento variable de trombosis. Es una enfermedad rara, cuya transmisión puede ocurrir en forma homocigota o heterocigota, esta deficiencia se asocia con púrpura neonatal fulminante o trombosis venosa masiva 7. En estado heterocigoto los pacientes con deficiencia de la proteína C frecuentemente se asocian con trombosis venosa profunda de miembros pélvicos, también puede presentarse en sitios poco comunes, aunque algunos pacientes son asintomáticos. La incidencia de trombosis incrementa con la edad. El síntoma más común es la presencia de TVP en miembros pélvicos, el embolismo pulmonar y el síndrome post-trombótico puede ocurrir como
21 consecuencia de una TVP. La causa de muerte frecuentemente es la embolia pulmonar70.
Existen dos tipos de herencia; los pacientes heterocigotos a la deficiencia de la proteína C son autosómicos dominantes, mientras que en los homocigotos el patrón de herencia es autosómico recesivo. Existen dos tipos de deficiencia de la PC; el tipo 1 se caracteriza por disminución en la síntesis de la proteína y es el más común. El tipo 2 representa la alteración funcional de la molécula 6,7,71.
Los pacientes con deficiencia de la PC pueden cursar con complicaciones posteriores a la administración de antagonistas de la vitamina K, la warfarina induce necrosis cutánea por disminución de la proteína C. Para evitar la trombosis paradójica con los antagonistas de la vitamina K, se recomienda la administración de plasma fresco congelado o concentrados de proteína C 72.
4.4 Deficiencia de la Proteína S.
La deficiencia de la proteína S fue descrita en 1984 73. Existen tres tipos de deficiencia de la proteína S. La deficiencia de proteína S tipo I se caracteriza por disminución cuantitativa de proteína S. Los niveles de la PS antigénica y funcional se encuentran disminuidos 74,75,76. La deficiencia tipo 2 es la alteración cualitativa de la PS, los niveles antigénicos se encuentran normales, pero los funcionales se encuentran disminuidos. La deficiencia tipo 3 se caracteriza porque los niveles de la PS total son normales, pero la PS libre se encuentra disminuida y existe incremento de la unión de la PS a C4b.
La herencia es autosómica recesiva y el sitio de trombosis principalmente es venosa. Los sitios son TV de miembros inferiores, TEP, axilar, mesentérica, en sistema nervioso central.
No solo la disminución de los inhibidores de la coagulación producen trombofilia, existen otras alteraciones que pueden contribuir al fenómeno trombótico. Anormalidades
22 genéticas de algunos factores de la coagulación como es el caso de la mutación del FV Leiden, la resistencia a la proteína C activada (RPCa). La protrombina 20210, en donde la mutación provoca un incremento anormal de la protrombina. Otra alteración es la ausencia de dos enzimas que contribuyen al incremento anormal de la hiperhomocistinemia; la deficiencia de la metiltetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y la Cistationina Beta Sintetasa (CBS).
4.5 Resistencia a la Proteína C Activada.
La resistencia al efecto anticoagulante de la proteína C activada (PCa), o resistencia a la proteína C activada (RPCa) es la causa más frecuente de trombofilia hereditaria en muchos países. La mayoría de los casos de RPCa son causados por la mutación del factor V Leiden, pero también se han reportado otras mutaciones en el gen de este factor hemostático.
La RPCa fue primeramente descrita por Dählback en 1993, quien encontró que algunas personas con hipercoagulabilidad clínica fueron resistentes a la PCa y este fenotipo se demostró su herencia autosómica dominante (80), el defecto molecular responsable de la RPCa rápidamente fue investigado en la Universidad de Leiden en Holanda como una sola mutación puntual en el gen del factor V (81). La mutación Leiden se origina por la sustitución del aminoácido arginina a glutamina en uno de los sitios de la proteína que rompe al factor V. Esta mutación es la causa más común de trombofilia hereditaria en muchos países.
4.6 Factor V Leiden (FVL).
El FVL está presente casi exclusivamente en población caucásica, con una prevalencia de 5% en la población general con ancestro europeos, y 18% en los pacientes con TEV. El riesgo de TEV es de 2-7 veces más alto entre los heterocigotos y de 40-80 veces más en el grupo de homocigotos 82. La incidencia anual de TEV es de 0.19-0.67%. El embarazo y los AO incrementan el riesgo, al igual que los eventos menores como los viajes prolongados, cirugías menores, etc. 83. El primer evento ocurre en un número
23 considerable de pacientes después de los 45 años 84,85.
El FV Leiden es originado por el cambio de una base en el gen del FV. En caso de que un paciente presente esta mutación, la molécula del FV es resistente a la acción de la PCa, lo que promueve mayor incremento en la formación de trombos 84.
La prevalencia de FV Leiden varía ampliamente entre diferentes grupos étnicos. Alrededor de 3-5% en la raza blanca, mientras que es muy rara en nativos africanos, asiáticos 86 y en México 87.
La manifestación clínica más frecuente es la trombosis venosa profunda. La mutación se reporta en aproximadamente 20% de los pacientes no seleccionados con TVP y del 40-60% en los pacientes seleccionados, los cuales son referidos a centros especializados8890. Basados en un estudio de casos y controles el riesgo de TVP incrementó 5-10 veces más para los portadores heterocigotos de la mutación Leiden y aproximadamente 80 veces más para los homocigotos 88,89.
La trombosis antes de la edad adulta es rara, la incidencia del TEV incrementa con la edad y los factores de riesgo asociados. El embarazo y el uso de AO son causas de resistencia a la PCa funcional, que agregado a la resistencia causada por la mutación, resulta en un efecto adicional en el riesgo de trombosis 88.
4.7 Protrombina G20210A
La protrombina es la proteína precursora de la trombina, la cual activa a los factores V y VIII y convierte el fibrinógeno en fibrina, activada al factor IX y es un potente agonista de las plaquetas. En 1996 por Poort y cols., secuenciaron el gen de la protrombina de 28 familias con trombofilia inexplicable e identificaron la transición de G a A en la posición del nucléotido 20210, en la región 3‟ del gen de la protrombina, que está asociado a incremento en el riesgo de trombosis venosa 59. Los pacientes con la mutación G20210A tiene niveles significativamente más elevados de protrombina en plasma. El gen de la
24 protrombina G20210A está presente en 2% de los sujetos sanos y en el 7% de los pacientes con TEV 59,91. El riesgo de TEV es de 2-3 veces más alto entre los heterocigotos, así mismo, el riesgo de TEV espontánea incrementa con la edad, es 19 veces más alto después de los 60 años de edad 92.
4.8 Hiperhomocistinemia
La homocisteína es un aminoácido derivado de la conversión metabólica de la metionina. La hiperhomicisteinemia leve es un factor de riesgo para trombosis arterial y venosa. Los factores adquiridos (baja ingesta de piridoxina, cobalamina y folatos) pueden producir hiperhomicistinemia leve interactuando con los factores genéticos, como el polimorfismo C677T en el gen de la metiltetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Los portadores homocigotos pueden desarrollar hiperhomocisteinemia especialmente con niveles bajos de folatos 93. Entre los caucásicos la prevalencia de este genotipo es de 13.7% muy similar a los que se encuentran en los pacientes con trombosis 94.
No está claro como la homocisteína afecta el riesgo de trombosis. In vitro, la homocisteína tiene múltiples efectos trombogénicos, que incluyen el daño en el endotelio vascular y antagonismo en la síntesis y función del óxido nítrico 95.
4.9 Incremento en los niveles del Factor VIII de la Coagulación
Niveles elevados de FVIII están asociados con incremento del riesgo de TEV 4-10 veces más, cuando las concentraciones exceden de 150-200 UI/dL, respectivamente 96. Por cada 10 UI/dL que incrementan los niveles de FVIII el riesgo para un episodio de TEV incrementa un 10% y el riesgo de TVP incrementa el 24% 79,96. La base genética para el incremento en los niveles del factor VIII no se ha entendido completamente.
4.10Papel Fisiopatológico de la Fibrinolisis
Deficiencia del Plasminógeno. Los dos sistemas principales de la fibrinolisis son el plasminógeno y el t-PA. El plasminógeno se convierte en la enzima plasmina en presencia de sus activadores del plasminógeno. La deficiencia del plasminógeno o de
25 sus activadores puede reducir la capacidad para remover el coágulo y contribuir a la enfermedad tromboembólica 97.
En 1978, Aoki y cols identificaron el primer caso con anormalidades en el plasminógeno98. Posteriormente, se encontró que la deficiencia de plasminógeno ocurre entre el 0.5-2.0% de pacientes con trombosis. La trombosis se ha reportado en pacientes jóvenes con disminución del plasminógeno cuando las concentraciones en plasma se encuentran en <40% del control normal 7.
PAI-1. Inhibe al t-PA. El incremento en los niveles de PAI-1 y el polimorfismo del PAI-1 4G/5G pueden asociarse con un incremento en el riesgo de trombosis arterial debido a la inhibición de la fibrinolisis 7. Hamsten y cols 99 encontraron que el incremento en la expresión del PAI-1 se considera como un factor de riesgo independiente para la enfermedad arterial coronaria. En 1996, Schulman y Wiman 100 estudiaron más de 900 pacientes en un periodo mayor de 6 meses después de su primer evento trombótico y encontraron que los niveles elevados de PAI-1 correlacionaron con el riesgo de recurrencia.
Se ha informado en un estudio donde documentan una mayor incidencia de muertes por infarto agudo del miocardio en las mañanas, lo que parece depender de la influencia circadiana del PAI-1. Este estudio documentó mayor concentración por las mañanas y parece depender de un factor transcripcional llamado CLIF (cycle like factor). En la región promotora del gen del PAI-1, las secuencias de (CACGTG) son responsables de la activación de PAI-1 por CLIF; localizados uno de ellos - 677 a – 672 pb, esto se traslapa con la región promotora del polimorfismo 4G/5G. Los homocigotos para el polimorfismo 4G/4G tuvieron las concentraciones más altas entre los individuos estudiados 101.
Se ha investigado que los niveles elevados de PAI-1 representan un marcador en pacientes con síndrome metabólico y se considera un componente dentro de este síndrome, por lo que es un blanco muy atractivo para el desarrollo de nuevos fármacos40. El daño observado en los pacientes con síndrome metabólico principalmente es relacionado con obesidad y resistencia a la insulina 102.
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TAFIa. El acrónimo TAFI implica que su papel fisiológico es en la regulación de la fibrinolisis. Redlitz y cols en 1996 103 fueron los primeros que observaron que TAFIa estaba involucrado en la regulación de la fibrinólisis in vivo. Ellos demostraron en perros con trombosis inducida, la actividad de TAFIa estaba incrementada durante la trombosis. Las concentraciones elevadas de TAFI en humanos correlacionan con dos veces más el riesgo de desarrollar TVP 104.
Las variaciones en los niveles de TAFI se han asociado también con factores de riesgo cardiovascular105. Por lo tanto, es importante establecer posibles interacciones entre el estilo de vida y los niveles de TAFI y con el riesgo de desarrollar trombosis arterial 105. Los niveles de TAFI están regulados genéticamente 106. Estudios en pacientes con enfermedad arterial coronaria han informado hipofibrinolisis e incremento en los niveles en la actividad de TAFI, especialmente en pacientes con diabetes mellitus, obesidad y resistencia a la insulina 107.
Informes contradictorios se han reportado en relación a los niveles del antígeno de TAFI y enfermedad arterial coronaria, niveles elevados se ha relacionado como un factor de riesgo 108 y un factor de protección para otros 109. Parece que esta controversia puede ser debida por los polimorfismos en el gen de TAFI. En un estudio en donde se demostró que los niveles elevados de PAI-1 y de TAFIa se asocian con un mayor riesgo de infarto al miocardio en personas jóvenes ocasionado por hipofibrinolisis 106. Recientemente, Tregouet DA y cols 110 demostraron que los niveles de TAFIa están asociados con el riesgo de muerte cardiovascular en pacientes con enfermedad arterial coronaria en el estudio Atherogene.
Asi mismo, los niveles elevados del inhibidor de la fibrinolisis activado por trombina (TAFI) se ha reportado que tiene un riesgo de 1.7 para desarrollar trombosis venosa 111.
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4.11 Defectos combinados
El riesgo de un primer evento trombótico incrementa en presencia de defectos combinados. De acuerdo a la frecuencia en la población general, la prevalencia esperada de un doble heterocigoto para FVL y G20210A es de 1:1,000. En un análisis de dobles heterocigotos se observó en 2.2% de 2,310 casos con ETV, un riesgo 20 veces mayor112. La incidencia de TEV en pacientes dobles heterocigotos es de 0.57%. La combinación de hiperhomocistinemia leve con FVL o gen de la protrombina G20210A incrementa 20 a 50 veces más el riesgo de TEV, sin embargo, depende de la población estudiada 94. La presencia del haplotipo HR2 del factor V está presente en 8% de los sujetos sanos y es una causa adicional de resistencia a la proteína C activada 113.
Los niveles elevados del fibrinógeno, lipoproteína a (lpa), FVIII, FIX o FXI incrementan el riesgo de TEV 2-4 veces más 114-117. Recientemente, los niveles elevados del inhibidor de la fibrinolisis activado por trombina (TAFI) se ha reportado que tiene un riesgo de 1.7 para desarrollar trombosis venosa 104. Por otro lado, la presencia de la RPCa está relacionada al riesgo de TEV independientemente de la presencia del FVL.
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JUSTIFICACIÓN
A nivel mundial la trombosis es la primera causa de morbi-mortalidad, por lo que es un problema de salud pública a cualquier edad. La tendencia para presentar trombosis se conoce como estados hipercoagulables, y es el resultado de diferentes defectos moleculares hereditarios o adquiridos, o bien, la combinación de ambos. Las manifestaciones de hipercoagulabilidad pueden ser devastadoras y mortales. Actualmente, estas enfermedades pueden ser correctamente diagnosticadas, y en alrededor del 30-40% de los pacientes se han encontrado alteraciones biológicas. El encontrar el defecto genético de las alteraciones de la coagulación en pacientes, familiares, y la población general, es un objetivo importante para la comunidad médica, debido a que se ha propuesto el abordaje diagnóstico de acuerdo con la prevalencia de estas patologías.
Es bien sabido, que la trombosis es el resultado de la participación de más de un factor de riesgo. De igual forma, los defectos genéticos múltiples predisponen más al desarrollo de trombosis que uno solo. Algunos de ellos son conocidos como predictores más poderosos que otros, por lo que los factores predisponentes del huésped pueden o no expresarse como trombosis, dependiendo de los factores de riesgo asociados.
La importancia de conocer las concentraciones séricas de las proteínas que intervienen en la fibrinolisis como el plasminógeno, el PAI-1 y TAFI, en la regulación trombótica así como la determinación de la AT, PC y PS y el incremento de algunos factores de la coagulación, como el factor VIII en la población mexicana, radica en la posibilidad de asociarlos con el riesgo trombótico en pacientes con criterios de trombofilia primaria.
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los niveles elevados del PAI-1 se han considerado como un factor independiente de trombosis arterial en individuos menores de 45 años. Los niveles elevados de TAFI se han asociado con trombosis venosa y arterial. Así mismo, es bien conocido que la disminución de los inhibidores de la coagulación; AT, PC y PS y la elevación del FVIII se han asociado principalmente con trombosis venosa.
HIPÓTESIS
La frecuencia de las alteraciones de plasminógeno, PAI-1 y TAFI, de los inhibidores de la coagulación y del FVIII en pacientes con trombosis arterial y venosa, es más alta en los pacientes con trombofilia que en los controles.
HIPOTESIS NULA. Los niveles de plasminógeno, PAI-1, los inhibidores de la coagulación y del factor VIII son similares en los pacientes con trombosis y el grupo control
HIPOTESIS ALTERNA. Los niveles de plasminógeno, PAI-1, los inhibidores de la coagulación y del factor VIII son diferentes en los pacientes con trombosis y el grupo control.
OBJETIVO GENERAL
Determinar los niveles de PAI-1, TAFI, de los inhibidores de la coagulación, Antitrombina, Proteínas C y S y del FVIII en pacientes con trombofilia primaria y en un grupo control.
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Objetivos específicos
1. Determinar si los niveles de PAI-1, TAFI, de los inhibidores de la coagulación AT, PC, PS, se encuentran aumentados en pacientes con trombosis.
2. Determinar si hay asociación de entre los niveles de PAI-1, TAFI, FVIII:C, RPCa, PCa, PS, AT en los pacientes con el sitio de la trombosis.
3. Determinar sí los niveles de estas proteínas de la coagulación, inhibidores y proteínas que participan en la fibrinolisis y la asociación con otros factores son un factor de riesgo para trombosis.
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II.
MATERIAL Y METODOS
Tipo de estudio
Estudio de casos y controles.
Universo de Trabajo
Para calcular el tamaño de la muestra se usó una fórmula estadística; se incluyeron 114 pacientes mexicanos con el diagnóstico confirmado de trombosis venosa o arterial que acudieron a los servicios de hematología de los hospitales: Hospital General Regional No. 1 “Carlos McGregor”, IMSS y Hospital General de México, OD, SSA. También se incluyeron a 114 sujetos sanos como controles del Banco Central de Sangre del Centro Médico Nacional SXXI, IMSS.
Grupo de Estudio
Pacientes con trombosis venosa o arterial (Casos) Sujetos sanos sin la presencia de trombosis (Controles)
CRITERIOS DE SELECCIÓN
a) DE INCLUSIÓN
Pacientes menores de 45 años Cualquier género
Diagnóstico de trombofilia (de acuerdo al comité de estandarización de la ISTH)
b) DE EXCLUSIÓN
Mayores de 45 años Embarazo
Diagnóstico de Lupus Eritematoso Sistémico Síndrome de Anticuerpos Antifosfolípidos Cáncer
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CRITERIOS DE SELECCIÓN DE LOS CONTROLES
DE INCLUSION
Individuos sanos disponentes de sangre que cumplieron todos los requisitos de la NOM-1993 para la utilización de sangre y sus derivados
DE NO INCLUSION
Individuos que no cumplieron los requisitos de la NOM para la utilización de sangre y sus derivados en su apartado selección del donador
DE ELIMINACION
Acceso venoso inadecuado Muestra insuficiente
Procedimiento
A partir de cada uno de los pacientes y donadores de sangre se obtuvo muestra sanguínea en un tubo con anticoagulante citrato de sodio al 3.8% en proporción 1:9 para las pruebas de hemostasia y otro con EDTA, para la separación de células mononucleares y obtención del DNA para la genotipificación en otro estudio. El plasma obtenido y las células mononucleares se conservaron a -70oC hasta su estudio. Los tubos se rotularon debidamente con los datos del paciente los cuales se acompañaron de una hoja de recolección de datos, previamente llenada.
Determinación de las pruebas coagulométricas.
El plasma citratado se descongeló a temperatura ambiente. Se procesaron muestras de pacientes, testigos y controles del Kit comercial para la validación de las pruebas. Para
33 la determinación de cada una de las pruebas se utilizó el equipo STA compact de la casa comercial Roche. El fundamento de las pruebas se basó en el método coagulométrico para la PC, PS y la RPCa, y por el método cromogénico para la ATIII y Plg.
RPCa. Esta prueba se realizó utilizando el Kit comercial Resistencia a la proteína C activada STAR-StaclotR APCR (Roche diagnostic). En el sistema STPA SATCLOT APC-R, la coagulación de la muestra diluida se lleva a cabo en presencia de veneno de
Crotalus viridis helleri y de plasma deficiente en Factor V. Este veneno actúa como activador del FX, pone en marcha la coagulación y elimina la interacción de los factores situados con anterioridad. Consiste en diluir el plasma 1:45 con plasma deficiente de Factor V, se agregan 50μL de reactivo Crotalus viridis helleri, se mezclan e incuban a 37oC pL de reactivo PCa en medio calcificado, la prueba termina cuando se forma el coagulo. La prueba se considera positiva cuando el TTPa en presencia de la PC activada es menor a 120 segundos.
Antitrombina (AT). La prueba funcional para determinar la ATIII se realizó mediante el Kit comercial STAR-StachromR ATIII (Roche Diagnostic). Consiste en que el plasma a estudiar se incuba con un exceso conocido como trombina (120/μL trombina bovina) en presencia de heparina. La trombina residual se cuantifica por su acción amidolitica sobre el sustrato sintético cromogénico CB5 61.50 (la PNA liberada se mide a 405 nm). La cantidad de trombina que se neutraliza desde el primer paso de la reacción es proporcional a los niveles de ATIII presentes en el plasma probado.La prueba se considera deficiente cuando el resultado es menor a 80% de actividad. El rango normal va de 80-120%.
Plasminógeno. La prueba funcional para la determinación del Plg se realizó mediante el Kit comercial STAR StachromR Plasminogen (Roche diagnostic). El procedimiento consiste en dos pasos: se adiciona un exceso de estreptocinasa-plasminógeno, el cual tiene una actividad parecida a la de la plasmina. La cantidad de estreptocinasa-palsminógeno, formado se valora pos su acción sobre el sustrato sintético CBS 30.40. La medición se logra por la liberación de p-nitroanilida medida a 405 nm.
34 La prueba se considera deficiente cuando el resultado es menor a 80% de activada, El rango normal es de 80-120 %.
Proteína C. La prueba funcional para la determinación de la PC se realizó mediante el Kit comercial STAR-StaclotR protein C (Roche diagnostics). La PC se activa por un activador especifico extraído del veneno de AgKistradon C. Contortri, la PC activada resultante inhibe los factores V y VIII de la coagulación, prolongando el TTPa, de esta forma en un sistema en el cual todos los factores están presentes, constantes y en cantidades adecuadas, excepto la PC, que es obtenida de la muestra que se esta evaluando.
La prueba se considera deficiente cuando el resultado es menor a 70% de actividad. El rango normal es de 70-140%.
Proteína S. La prueba funcional para la determinación de la PS se realizó mediante el Kit comercial STARStaclotR protein S (Roche diagnostics). El principio de ensayo está basado en la actividad de la PS como cofactor que aumenta la actividad anticoagulante de la PC activada (PCa). Este aumento se refleja por la prolongación del tiempo de coagulación de un sistema enriquecido con FVa que es el substrato fisiológico de la PCa.Valores de referencia de PS son de 70-140%.
Determinación de PAI-1. La determinación del PAI-1 se emplearon las microplacas cubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-PAI-1, las cuales fueron incubadas con soluciones estandarizadas de PAI-1. Las muestras fueron incubadas y se procedió al lavado, en el siguiente paso se empleo se agrego a las microcubetas un anticuerpo monoclonal anti- PAI-1 marcado. Posteriormente se realizó otro lavado de las microcubetas. Finalmente, el sustrato enzimático se agregó. La acción de la unión enzimática sobre el sustrato tornó la solución de color azul en color amarillo después de suspender la reacción al agregar ácido. Se realizó la curva de estandarización y posterior a la determinación en donadores sanos se determinó la absorbancia promedio de cada muestra para determinar las concentraciones de PAI-1 en UI/mL. La prueba se considero deficiente cuando el resultado fue >7.5 UI/mL. Rango normal <7.5 UI/mL.
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Determinación del antígeno TAFI (ELISA). En muestras de plasma diluido, el calibrador de TAFI fue agregado a microcubetas con un anticuerpo monoclonal específico murino para TAFI humano. El anticuerpo captura el antígeno TAFI que se encuentre presente en la solución durante el periodo de incubación. Posteriormente, se realizó el procedimiento de lavado, un anticuerpo monoclonal de cabra anti- TAFI humano se integró con una peroxidasa, la cual es agregada a las microcubetas y la unión al antígeno de TAFI capturado. Posteriormente, se realizó otro lavado, el sustrato peroxidada tetrametilbencidina (TMB) en presencia de peróxido de hidrógeno es agregó a las cubetas y subsecuentemente la reacción se tornó de color azul. La adición de ácido sulfúrico detiene la reacción y la solución se torna de color amarillo. La absorbencia de la solución fue medida a 450 nm. Se realizaron los estudios de los controles y los pacientes a una dilución de 1:50. La prueba se consideró deficiente cuando el resultado es menor a 65% de actividad. El rango normal es de 65-140%.
Descripción General del Estudio
Se seleccionaron los casos de pacientes con trombosis arterial y venosa menores a 45 años en los servicios de hematología del Hospital General de México y del Hospital General Regional No. 1 del IMSS. Previo consentimiento informado, se procedió a realizar la historia clínica completa y la toma de muestra. Se utilizaron como control donadores de sangre sanos y pareados por edad con el grupo de estudio.
