UNIVERSIDAD VERACRUZANA
INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA SALUD
“Función de la proteína CD38 en la activación y
proliferación de los linfocitos T reguladores”
TESIS
PRESENTA:
QFB JOCELYN CAROLINA PÉREZ LARA
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL
GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS
DIRECTOR:
D en C. JUAN CARLOS RODRÍGUEZ ALBA
CODIRECTORA:
D en C. GABRIELA LÓPEZ HERRERA
FINANCIAMIENTO
El presente trabajo se realizó en la Unidad de Citometría de Flujo del Instituto de
Ciencias de la Salud y el Laboratorio de Neurotoxicología de la Universidad
Veracruzana. En vinculación con el Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados (CINVESTAV), el Instituto Nacional de Pediatría (INP-SSA) y el
Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER). Este proyecto fue
financiado a través del donativo CONACYT 253138 y el Fondo CONACYT FC
(2015) 214 otorgado al D en C. Juan Carlos Rodríguez Alba y al Dr. Héctor
Enrirque Espinosa Arciniega. Se agradece al CONACYT por la beca número
DEDICATORIAS
La corona del anciano son sus nietos; el orgullo de los hijos son sus padres
Proverbios 17:6
Cada evento importante que sucede en mi vida se lo dedico a mis abuelos, en
especial a mis abuelitas, porque fueron ellas quienes educaron a mis padres, y sin
mi madre y mi padre , esto no hubiera sucedido.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Veracruzana por la oportunidad de prepararme como Maestra en Ciencias de la Salud, en especial, al Instituto de Ciencias de la Salud.
Quiero agradecer a las instituciones que participaron en la realización de este proyecto, al Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN), al Instituto Nacional de Pediatría (INP) y a la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).
Al Dr. Juan Carlos Rodríguez Alba, por la confianza que depositó en mí para trabajar en su línea de investigación y aceptarme como su alumna. Agradezco, sus enseñanzas, regaños y principalmente el apoyo que me brindó durante todo este proceso. No me queda más que agradecerle y reconocer la gran labor que ejerce como tutor.
A la Dra. Gabriela López Herrera y al Dr. Héctor Romero Ramírez, por brindar el apoyo técnico y académico, necesario durante el desarrollo de este proyecto. Además, quiero agradecerles la disposición de tiempo que tuvieron para viajar y asistir a los exámenes tutorales. Sin duda, son parte fundamental en mi formación académica.
Al Dr. Jaime Morales Romero por su asesoría estadística así como todas las sugerencias que fortalecieron este proyecto, pero principalmente, mi formación como Maestra en Ciencias de la Salud.
RESUMEN
El sistema inmune se encuentra conformado por un conjunto de células, tejidos y moléculas que tienen como objetivo movilizar una respuesta ante la invasión de un patógeno, toxina o alérgeno. Asimismo, éste debe evitar respuestas equívocas o excesivas que puedan dañar al organismo. Por tal motivo, existe una población de linfocitos T denominada linfocitos T reguladores (Treg) que se encarga de suprimir una respuesta inmunológica excesiva. Los linfocitos Treg se caracterizan por la expresión de las proteínas CD4, CD25 y FoxP3, así como proteínas de activación CTLA-4 y CD69. Actualmente, se ha propuesto el uso de esta población celular como inmunoterapia frente a enfermedades autoinmunes, alergias o padecimientos que conduzcan a inflamación crónica. No obstante, es importante conocer marcadores de superficie que permitan identificar a estas poblaciones celulares de manera específica y principalmente que efectúen una función supresora. En este sentido, CD38 es una proteína que se ha asociado con la regulación del sistema inmunológico, ya que su ausencia potencia el desarrollo de enfermedades autoinmunes en modelos murinos. Se ha descrito que el entrecruzamiento de CD38 induce proliferación y síntesis de proteínas de activación en linfocitos T. En el presente trabajo se evaluó la función de la proteína CD38 en la activación y proliferación de los linfocitos Treg. Los resultados obtenidos mostraron que la proteína CD38 presenta altos niveles de expresión en los linfocitos Treg y su expresión se asocia con FoxP3. Por otra parte, el ratón knockout de la proteína CD38 (Cd38 -/-) tiene bajos porcentajes de linfocitos Treg en comparación con el ratón silvestre, sugiriendo que CD38 ejerce una función en el desarrollo de esta población celular. Los linfocitos Treg CD38+ presentan mayor expresión de CTLA-4 y CD69 en comparación con los linfocitos Treg CD38-, lo cual indica que los linfocitos Treg CD38+ se asocian con un fenotipo de activación. Finalmente, el entrecruzamiento de CD38 es capaz incrementar el porcentaje de linfocitos Treg en el ratón silvestre. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo proponen a CD38 como un potencial marcador de los linfocitos Treg y se sugiere que la activación de la proteína a través de un anticuerpo agonista, ejerce una función ya sea en la proliferación o diferenciación de los linfocitos Treg.
ABSTRACT
The immune system is a network of cells, tissues and molecules that work together to defend the body against the attack of a pathogen, toxin or allergen. Also, it must avoid equivocal or excessive responses that could damage the organism. Thus, there is a population of T cells named regulatory T cells (Treg) that are responsible for suppressing an excessive immune response. Treg cells are characterized by the expression of CD4, CD25 and FoxP3, as well as CTLA-4 and CD69 activation proteins. Currently, the use of this subset has been proposed as cellular immunotherapy against autoimmune diseases, allergies or conditions that lead to chronic inflammation. However, it is essential to know the surface markers that identify these cellular subsets in a specific way and mainly with a suppressor function. Hence, CD38 is a protein that has been associated with the regulation of the immune system, since its absence enhances the development of autoimmune diseases in murine models. It has been described that the cross-linking of CD38 induces proliferation and synthesis of activation proteins in T cells. In this work, the function of the CD38 protein in the activation and proliferation of Treg cells is evaluated. The results were selected for the CD38 protein presents high levels of expression in the Treg cells and its expression is associated with FoxP3. On the other hand, the CD38 Knock-out mouse (Cd38 -/-) has low percentages of Treg cells compared with wild-type, suggesting that CD38 exerts a function in the development of this cell population. The Treg cells expressing CD38 presented an increased expression of CTLA-4 and CD69 compared to Treg cells that did not express CD38, indicating that CD38+ Treg cells are associated with an activated phenotype. Finally, the crosslinking of CD38 is able to increase the percentage of Treg cells from the wild-type. Altogether, the results obtained in this work proposed a CD38 as a potential marker of a suppressive subset of Treg cells and it is suggested that the activation of the protein through an agonist antibody exerts a function either on the proliferation or differentiation of Treg cells.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
Figura 1. Esquema general de un linfocitos Treg. 6
Figura 2. Desarrollo de los linfocitos Treg. 8
Figura 3. Mecanismos de regulación de los linfocitos T reguladores 11
Figura 4. Modelo cristalográfico de CD38. 13
Figura 5. Señalización de CD38 en linfocitos T 15
Figura 6. Mayor expresión de CD38 en los linfocitos Treg y CD25-FoxP3+. 24
Figura 7. La expresión de CD38 se asocia con la expresión de FoxP3, no
así con la expresión de CD25
26
Figura 8. Gráfica de correlación entre la expresión de CD38 y FoxP3 en los
linfocitos T CD4+.
27
Figura 9. El porcentaje de linfocitos Treg disminuye en el ratón CD38 KO en
comparación con el ratón C57BL/6.
29
Figura 10. Los linfocitos Treg CD38+ tienen mayor expresión de CTLA-4 y
CD69 en comparación con los linfocitos Treg CD38-
30
Figura 11. La expresión de CD69 se asocia con la expresión de CD38 32
LISTA DE ABREVIATURAS
AF488: Alexa Flúor 488
APC: Aloficocianina
BCR: Receptor de células B
Breg: Linfocitos B reguladores
BV421: Violeta Brillante 421 (Brilliant Violet 421)
BV605: Violeta Brillante 605 (Brilliant Violet 605)
cADPR: Adenosin difosfato de ribosa cíclico (cyclic adenosine diphosphate
ribose)
CTLA-4: Antígeno 4 del linfocito T citotóxico (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4)
DN: Linfocitos T dobles negativos
DP: Linfocitos T dobles positivos
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EM: Esclerosis múltiple
FACS: Flourescence Activated Cell Sorting
GITR: Factor de Necrosis Tumoral Inducido por Glucocorticoides
IDO: Idolamina 2,3 dioxigenasa
IFNγ: Interferón gamma
Ig: Inmunoglobulina
IL-10: Interleucina 10
IL-2: Interleucina 2
iTreg: Linfocitos T reguladores inducidos
kDa: Kilodalton
LAT: Proteína adaptadora de linfocitos T (Linker for activation of T cells)
LES: Lupus Eritematoso Sistémico
MDSC: Células Mieloides Supresoras (Myeloid-derived suppressor cells)
MHC I: Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase I
MHC II: Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II
NAADP: Ácido nicotínico adenina dinucleótido fosfato
NAD: Nicotinamida Adenina Dinucleótido
nTreg: Linfocitos T reguladores naturales
NADP: Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
PBS: Buffer de Fosfatos Salino
PE: Ficoeritrina (Phycoerythrin)
PE-Cy7: Ficoeritrina-Cianin 7 (Phycoerythrin-Cyanyn 7)
PerCp: Peridinin Chlorophyll Protein Complex
TCR: Receptor de Linfocitos T
TGFβ: Factor de crecimiento transformante beta
Th3: Linfocitos T cooperadores tipo 3
Tr1: Linfocitos Treg CD4+ tipo 1
TRAIL-DR5: Tumour-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand–death
receptor 5
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ... 1
1.1 Sistema Inmune y tolerancia inmunológica ... 3
1.2 Linfocitos Treg ... 5
1.2.1 Clasificación de los Linfocitos Treg ... 7
1.2.2 Mecanismos de regulación de los linfocitos Treg ... 9
1.3.1 Funciones de CD38 ... 12
1.3.2 CD38 y regulación del sistema inmune ... 16
3. JUSTIFICACIÓN ... 18
4. HIPÓTESIS ... 19
5. OBJETIVOS ... 19
6. MATERIAL Y MÉTODOS ... 20
6.1 Lugar y tiempo de estudio ... 20
6.2 Diseño de estudio ... 20
6.3 Animales ... 20
6.4 Suspensiones celulares ... 20
6.5 Anticuerpos y tinción de citometría de flujo ... 21
6.6 Ensayo de proliferación ... 21
6.7 Análisis estadístico ... 22
8. RESULTADOS ... 23
8.1 Los linfocitos Treg y los linfocitos CD4+CD25-FoxP3+ presentan mayor expresión de CD38 ... 23
8.2 La expresión de CD38 se asocia con la expresión de FoxP3 ... 25
8.3 La ausencia de CD38 afecta el porcentaje de linfocitos Treg ... 27
8.4 Los linfocitos Treg CD38+ tienen mayor expresión de las proteínas CTLA-4 y CD69 ... 30
8.5 El estímulo con anti-CD38 incrementa el porcentaje de linfocitos Treg ene el ratón WT ... 33
10. CONCLUSIONES ... 39
11. CONSIDERACIONES ÉTICAS Y BIOSEGURIDAD ... 40
1
INTRODUCCIÓN
El sistema inmune se define como el conjunto de células, órganos y tejidos que tienen como objetivo erradicar la invasión de un agente extraño (1). Sin embargo, es importante que exista un sistema de regulación para evitar daños al organismo. Cuando esta regulación se daña, emergen patologías como autoinmunidad o alergias. El tratamiento de estas enfermedades se basa en la administración de fármacos inmunosupresores, que se caracterizan por ser inespecíficos y conducir al paciente a un estado de inmunosupresión. Hoy en día, se propone regular al organismo a través de la terapia celular, la cual promete evitar la administración de inmunosupresores farmacológicos, mejorar la especificidad de la terapia y prevenir los efectos adversos de los medicamentos (2,3). En este sentido, los linfocitos Treg representan una subpoblación especializada de linfocitos T CD4+ que expresan altos niveles de CD25 (cadena alfa del receptor de la IL-2) y FoxP3, siendo éste último un factor de transcripción, cuya expresión es intracelular (4). Los estudios clínicos y preclínicos indican que el uso de los linfocitos Treg como inmunoterapia reducen los signos de autoinmunidad y evitan el rechazo de transplantes (5,6). Sin embargo, debido a que los linfocitos Treg son una población de baja frecuencia,
a menudo se utiliza una expansión inicial de los linfocitos Treg in vitro antes de
su administración terapéutica. Un paso crítico para emplear a esta población celular como inmunoterapia, radica en su identificación a través de marcadores específicos que seleccionen a poblaciones con alta capacidad proliferativa y supresora.
2
CD38 se expresa de manera basal en el 10% de los linfocitos T y se ha
reportado que una población de linfocitos T CD38+ CD45RBbajo presenta
3
CAPÍTULO I
1. ANTECEDENTES
1.1 Sistema Inmune y tolerancia inmunológica
4
a) Tolerancia central
Se sugieren dos mecanismos por los cuales se mantiene la tolerancia central:
1. Deleción: Es uno de los principales mecanismos propuestos. Este se relaciona con la inducción de muerte celular por apoptosis en aquellas células que reconocen antígenos propios.
2. Anergia: Existen algunos linfocitos autorreactivos que a pesar de recibir una señal estimuladora por parte de un autoantígeno, estos son dirigidos a un estado de inactivación. Estos linfocitos continuan su desarrollo y migran a periferia; sin embargo, estos no reaccionarán a la estimulación del antígeno en periferia y por lo tanto no proliferarán ni se diferenciarán en células efectoras.
b) Tolerancia periférica
5
1.2 Linfocitos Treg
Esta población fue descrita por primera vez a mediados de la década de 1990, cuando se demostró que una población de LT CD4+ que co-expresa a CD25 (cadena α del receptor de la IL-2), presentaba características de una población reguladora en el adulto sano y además posee una gran actividad supresora en un modelo murino con autoinmunidad (15). Años más tarde, en el 2003, se delimitó el papel funcional y de desarrollo del factor de transcripción nuclear (FoxP3), como una característica clave en la biología y fenotipo de los linfocitos T CD4+CD25+ (16,17).
Actualmente existen reportes que indican que la presencia de FoxP3 es esencial en la regulación del sistema inmunológico, debido a que su expresión en otros tipos celulares, tales como los linfocitos B, los linfocitos Tγδ, infocitos NK, macrófagos y células dendríticas, les confiere un fenotipo inmunosupresor o regulador de células efectoras (18).
De esta manera, esta población celular ha sido determinada fenotípicamente como linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ (linfocitos Treg) (Figura 1), representando aproximadamente entre el 5 y el 15% de los linfocitos T CD4+ totales, tanto en humanos como en ratones sanos (15). No obstante, existen otras moléculas que participan en la función reguladora de esta población celular y que además permiten mejorar su caracterización, una de ellas es el receptor CTLA-4 (Antígeno 4 asociado al Linfocito T Citotóxico). Esta es una molécula inhibidora de la activación de los linfocitos, la cual utiliza una señal negativa a través de su dominio intracelular, o bien, antagoniza de manera competitiva la señal coestimuladora mediada por CD28.
6 alteración, se observan alteraciones en el crecimiento así como el desarrollo de infecciones recurrentes (4). Asimismo se han observado afecciones similares en el ratón mutante de FoxP3 o también denominado scurfy (19). De tal forma, los linfocitos Treg tienen un papel central en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica, lo cual ha sido evidenciado en diversos estudios que demuestran su capacidad para inhibir patologías inflamatorias in vivo. Además, ciertas enfermedades autoinmunes, infecciosas y alérgicas se asocian con una alteración funcional de los linfocitos Treg. Por el contrario, diversos estudios en cultivos primarios de células tumorales y otras provenientes de pacientes con infecciones indican que los linfocitos Treg no favorecen el estado del paciente y pueden poner en peligro al sistema inmunológico (20).
7
1.2.1 Clasificación de los Linfocitos Treg
Los Linfocitos Treg pueden originarse por dos vías que se describen a continuación:
• Los Linfocitos Treg naturales (nTreg). Se desarrollan en el timo durante el
desarrollo temprano fetal (semana 14 de gestación). Ésta subpoblación celular se genera a partir de la etapa de linfocitos T inmaduros dobles positivos (DP), en presencia de citocinas como IL-2 e IL-15 (Figura 2). Se caracterizan por ser linfocitos T CD4+, CD25+, FoxP3+, CTLA-4+, GITR+ y/o LAG+ (21). Se ha reportado que estas células son resistentes a la selección clonal (22). Esto último se describió mediante el reconocimiento de un TCR transgénico a un antígeno específico del timo, revelando que los linfocitos Treg son seleccionados positivamente por el MHC II de las células del epitelio cortical (23,24). De esta manera, el proceso de selección tímica, puede llevarse a cabo por tres diferentes mecanismos de acuerdo a la afinidad que presente el TCR (25):
1) Afinidad baja conduce a la selección positiva de linfocitos T convencionales
2) Afinidad intermedia conduce a la selección de linfocitos Treg
3) Afinidad alta conduce a la apoptosis de los linfocitos
• Los linfocitos Treg inducibles (iTreg). Se originan a partir de Linfocitos T
8 A su vez, los Linfocitos iTreg se pueden clasificar en dos subpoblaciones: linfocitos T reguladores 1 (Tr1) y Th3. Los linfocitos Tr1 se caracterizan por su capacidad para producir grandes cantidades de IL-10 y niveles bajos de TGF-β (31), mientras que los Linfocitos Th3 producen preferencialmente TGF-β (32).
Figura 2. Desarrollo de los linfocitos Treg. En el timo, los linfocitos T DP maduran a linfocitos T reguladores naturales (nTreg) en presencia de interleucinas como IL-2, IL-15 y TGF-β. En periferia, los linfocitos T CD4+ näive, encuentran a su antígeno y se diferencian en linfocitos Treg inducidos (iTreg) en presencia de TGF-β e IL-2.
9
1.2.2 Mecanismos de regulación de los linfocitos Treg
Un aspecto clave en la investigación actual de linfocitos Treg, es entender sus mecanismos de supresión. Hasta la fecha se han descrito al menos 4 mecanismos de supresión (33):
1) Citocinas inhibitorias. Diversos estudios in vivo e in vitro han demostrado
que IL-10 disminuye la producción de citocinas proinflamatorias así como la expresión de MHC II y de moléculas coestimulatorias, repercutiendo en la capacidad de estimular a los linfocitos T efectores (34). El TGF-β es una citocina inmunosupresora con propiedades pleiotrópicas, la cual se puede expresar en la membrana o secretar en los linfocitos Treg, así mismo puede regular la supresión de los linfocitos Treg sobre linfocitos T efectores (35).
2) Destrucción de células diana. Otro mecanismo importante de supresión
es la actividad citotóxica a través de la secreción de perforinas y granzimas A y B (36). También se ha sugerido que los linfocitos Treg inducen apoptosis de células T efectoras a través de la vía de tumour-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand–death receptor 5 (TRAIL-DR5) (37). En adición, la proteína Galectina 1, puede inducir apoptosis de linfocitos T, y se ha observado que es altamente expresada en linfocitos Treg de humanos y ratones (38).
3) Disrupción metabólica. Como ya se ha mencionado, los Linfocitos Treg se
10
4) Modulación de la maduración o función de la célula presentadora de
antígeno (APC). Un mecanismo esencial de supresión se lleva a cabo a través de
la expresión de CTLA-4 (Antígeno-4 asociado al Linfocito T Citotóxico). La interacción entre CTLA-4 y CD80/CD86 activa la producción de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) (41). IDO cataboliza al aminoácido esencial triptófano hasta quinureninas, por lo tanto, limita la disponibilidad de este factor proinflamatorio (42,43). Se ha propuesto además que el gen 3 de activación de Linfocitos (LAG-3, también conocido como CD233) en la superficie celular, se une a moléculas MHC de clase II con una gran afinidad, interviniendo en la maduración y la capacidad de las APC para activar linfocitos T efectores (Figura 3) (44).
11
Figura 3. Mecanismos de regulación de los linfocitos T reguladores. Representación de cuatro mecanismos utilizados por los linfocitos Treg para regular la respuesta inmunológica.
a) Secreción de citocinas anti-inflamatorias como IL-10 o TGF-B. b) Citólisis de linfocitos T CD4+ a través de la secreción de perforina o granzima. c) Apoptosis originada por la competencia de los linfocitos Treg y linfocitos T CD4+ por la IL-2. d) Inhbición de la sinápsis inmunológica mediado por la expresión de CTLA-4 (Adaptado de Vignali et al, 2008).
a) b)
12
1.3 CD38
Esta proteína fue descrita por primera ocasión, en 1980 en la progenie celular T (45). CD38 es una glicoproteína transmembranal tipo II de aproximadamente 42 kDa (300 aminoácidos), consta de 3 regiones claramente establecidas, una región N-terminal citoplasmática de 23 aminoácidos; otra transmembranal de 21 aminoácidos y una C-terminal extracelular de 256 aminoácidos (Figura 4) (46). Genéticamente, CD38 se encuentra en el cromosoma 4 en el humano y en el cromosoma 5 en el ratón (47).
1.3.1 Funciones de CD38
La molécula CD38, es una proteína a la que se le han atribuido o propuesto dos funciones principales, una como ectoenzima y otra como receptor (Figura 4). Dentro de la función enzimática, se han descrito tres principales actividades: (1) En ausencia de agua, CD38 es capaz de catalizar la conversión de Adenosín Difosfato de Ribosa cíclico (cADPR) a partir de nicotinamida adenina dinucléotido (NAD+). (2) De manera alternativa, en presencia de una molécula de agua, su actividad enzimática como NAD+ glicohidrolasa cataliza la formación de adenosín difosfato de ribosa (ADPR). (3) Por último, CD38 a pH bajo y en presencia de ácido nicotínico, cataliza la formación de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) a ácido nicotínico adenina dinucleótido fosfato (NAADP). En conjunto, estos metabolitos secundarios son reconocidos por su gran potencial para movilizar calcio (Ca2+) intracelular (7). La función como receptor de CD38 fue
13
15
Figura 5. Señalización de CD38 en linfocitos T. El entrecruzamiento de CD38 con un anticuerpo monoclonal induce la fosforilación Lck mediante la asociación de la cadena citoplasmática de CD38 y el dominio homólogo de Src 2 de LcK. Esto activa la fosforilación de ZAP 70 y LAT. (Adaptado de Muñoz, Pilar et al, 2003)
LCK
ZAP70
CD4
16
1.3.2 CD38 y regulación del sistema inmune
Con relación en la participación de CD38 y la regulación del sistema inmune, se ha demostrado que la ausencia de CD38 en ratones NOD, acelera el desarrollo de diabetes autoinmune tipo 1, así como el desarrollo de un fenotipo autoinmune similar a Lupus Eritematoso Sistémico (LES) en ratones de la cepa C57BL/6-lpr/lpr (53). En adición, datos de nuestro grupo muestran evidencias de que la presencia de CD38 es importante para evitar la aparición de características patológicas y fenotípicas de enfermedades autoinmunes (54). No obstante, aún no se ha descrito cuál es su mecanismo que ejerce para evitar el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Se cree que CD38 participa en la regulación del sistema inmunológico y evita el desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas mediante su participación en el establecimiento de mecanismos de tolerancia periférica.
Existen suficientes reportes que asocian la expresión de CD38 con la regulación del sistema inmunológico, puesto que diversas poblaciones que se encargan de suprimir y mantener la homeostasis del sistema inmune, expresan altos niveles de CD38, tal es el caso de los linfocitos B reguladores CD1daltoCD5+ (Breg). Resultados previos de nuestro grupo, indican que los linfocitos Breg expresan niveles altos de CD38 y que la activación de la señalización de estas células a través de LPS y un agonista de CD38 incrementa el porcentaje de esta población celular, así como su habilidad para producir IL10. Esta evidencia, sugiere que la expresión de CD38 podría evitar el desarrollo de enfermedades autoinmunes a través de su expresión en los linfocitos Breg (54). No obstante, la capacidad inmunosupresora podría no estar limitada a esta población.
17 expresión de CD38 en las células MDSC identifican a una subpoblación que posee alta capacidad supresora (55).
Finalmente, la expresión de CD38 y CD45RBbajo en linfocitos T CD4+ caracteriza a una subpoblación con fenotipo inmunosupresor, capaz de inhibir la activación y proliferación celular, así como la secreción de citocinas efectoras (IFN-γ, IL-4 e IL-10) de los linfocitos T (8).
Si bien, CD38 aparentemente participa en la regulación del sistema inmunológico, en ciertos procesos cancerosos, su expresión podría ser perjudicial. Ejemplo de ello es el mieloma múltiple, ya que se ha desarrollado un nuevo anticuerpo monoclonal antagonista de CD38 para el tratamiento de estos pacientes. Se sabe que su administración induce apoptosis en las células tumorales de mieloma, sin embargo, existe evidencia que demuestra una inhibición de la función, así como de la proliferación de los linfocitos Treg (56). Esto último permite que los linfocitos T efectores proliferen y puedan erradicar a las células tumorales. No obstante, en patologías como enfermedades autoinmunes sistémicas, es relevante mantener el porcentaje y la funcionalidad de los linfocitos Treg.
18
3. JUSTIFICACIÓN
Cuando los mecanismos de tolerancia de la respuesta inmunológica fallan, se desencadenan trastornos como enfermedades autoinmunes, alergias, hipersensibilidad así como el rechazo a trasplantes alogénicos. El tratamiento para dichos padecimientos consta de fármacos inmunosupresores que inhiben de manera inespecífica la respuesta inmunológica y que además originan una gamma de efectos adversos como nefrotoxicidad, diabetes, hiperlipidemia, hipertensión, enfermedades cardiovasculares y obesidad. Por lo tanto, el punto clave para mejorar la inmunosupresión en cualquiera de los casos, es bloquear selectivamente la respuesta inmune afectada sin impedir que otras funciones protectoras del sistema inmunológico se lleven a cabo. Por tal motivo, se ha propuesto a los linfocitos Treg como una nueva estrategia terapéutica no farmacológica que sería capaz de regular a células activadas específicas que originen el daño, sin embargo, estas estrategias se han limitado debido a la falta de marcadores específicos que permitan identificar a la población de linfocitos Treg capaces de suprimir a las células problema. En este sentido, se propone que, con base en los antecedentes, la elucidación de la expresión de la proteína CD38 en esta población celular así como su asociación con otros marcadores específicos de linfocitos Treg como CTLA-4 y CD69, podría indicar que CD38 funciona como un marcador de linfocitos Treg. En este sentido, la expresión de CD38 facilitaría la identificación de esta población reguladora y potencialmente los linfocitos Treg CD38+ podrían ayudar a prevenir o controlar trastornos del sistema inmune como alergias, enfermedades autoinmunes o inflamación crónica.
19
4. HIPÓTESIS
• La proteína CD38 induce la activación y proliferación de los linfocitos T
reguladores.
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general:
• Evaluar la función de la proteína CD38 en la activación y proliferación de los
linfocitos T CD4+CD25+Foxp3+.
5.2 Objetivos particulares:
• Analizar la expresión de la proteína CD38 en linfocitos T reguladores
esplénicos de los ratones Cd38+/+ y Cd38-/-.
• Medir los niveles de expresión de CTLA-4 y CD69 en los linfocitos Treg
CD38+.
• Evaluar la proliferación de linfocitos Treg ante los estímulos anti-CD3/CD28
20
CAPÍTULO II
6. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1 Lugar y tiempo de estudio
El presente proyecto se realizó durante el periodo de agosto 2016-junio 2018 en la Unidad de Citometría de Flujo y en el laboratorio de Neurotoxicología de la Universidad Veracruzana.
6.2 Diseño de estudio
El presente trabajo corresponde a un estudio transversal, experimental
6.3 Animales
Para la realización de este trabajo se utilizaron ratones knockout para el gen CD38 (CD38-/-) y ratones silvestres (CD38+/+), los cuales se encuentran en un fondo genético C57BL/6. Los ratones fueron mantenidos en cajas de policarbonato de 47x33x19 cm y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad 12:12 (encendido de luz 11:00 PM), a una temperatura de 21±1.0 ºC. Los animales tuvieron acceso ad
libitum a agua purificada y a alimento.
6.4 Suspensiones celulares
Los ratones de cada cepa se sacrificaron por dislocación cervical, se obtuvieron los bazos y se colocaron en una caja petri con 5 ml de PBS (Solución de Fosfatos Salinos) 1x estéril. El bazo se disgregó con un émbolo de jeringa y una malla de acero inoxidable. A continuación las células se colocaron en un tubo y se centrifugaron a 1,500 rpm por 5 min. El sobrenadante se decantó y el botón celular se resuspendió en PBS 1x. Posteriormente, para eliminar a los eritrocitos se añadieron 5 ml de solución de cloruro de amonio al 0.85% (NH4Cl 150 mM, 10 mM
21 PBS 1x y se centrifugó a 1,500 rpm por 5 min. Finalmente, las células se suspendieron en 1 ml de PBS 1x.
6.5 Anticuerpos y tinción de citometría de flujo
A partir de las suspensiones celulares de bazo, 2 x 106 de células fueron teñidas superficialmente con los anticuerpos anti-CD4 APC, anti-CD25 BV421, anti-CD69 Pe-Cy7, anti-CTLA-4 BV605 y anti-CD38 PE ajustando el volumen a 100 µL con PBS 1x. Una vez realizado el marcaje de proteínas superficiales, las células fueron permeabilizadas con BD Perm para la tinción intracelular, seguido por la adición del anticuerpo anti-Foxp3 AF488. Finalmente, las células se fijaron con Formaldehído al 1%. Los datos fueron adquiridos en el Citómetro de Flujo BD LSR Fortessa y analizados con el programa FlowJo.
6.6 Ensayo de proliferación
Se extrajeron 1 x 106 de células de bazo proveniente de la cepa C57BL/6 (Cd38 +/+) y Cd38 -/-, las cuales fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con Suero Fetal Bovino descomplementado al 10%, 100 uM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 0.2 mg/mL de penicilina, 0.5 mg/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina y 0.055 mM de β-mercaptoetanol. Posteriormente, las células se cultivaron con anti-CD3 (1 µg/mL) anti-CD28 (1 µg/mL) más rhIL-2 (100 U), en presencia o ausencia de anti-CD38 (50 µg/mL). Las células se incubaron a 37 ºC durante 72 horas en una atmósfera 5% de CO2.
22
6.7 Análisis estadístico
23
CAPÍTULO III
8. RESULTADOS
8.1 Los linfocitos Treg y los linfocitos CD4+CD25-FoxP3+ presentan mayor expresión de CD38
24
CD25-FoxP3- CD25+FoxP3- CD25-FoxP3+ CD25+FoxP3+ 0 500 1000 1500 2000 2500 IM F C D 3 8
p < 0.01 p < 0.001
p < 0.01 p < 0.001
p < 0.001
CD25-FoxP3- CD25+FoxP3- CD25-FoxP3+ CD25+FoxP3+ 0 20 40 60 80 100 % Cél u las CD38+
p < 0.005 p < 0.005 p < 0.0005
p < 0.0005
Figura 6. Mayor expresión de CD38 en los linfocitos Treg y CD25-FoxP3+. Linfocitos totales de bazo provenientes del ratón C57BL/6 fueron teñidos con los anticuerpos CD3, CD4, anti-CD25, anti-FoxP3, anti-CD38 y adquiridos en el citómetro de flujo. a) Los linfocitos T CD3+CD4+ fueron divididos de acuerdo con la expresión de CD25 y FoxP3. b) Expresión de CD38 en cada una de las subpoblaciones celulares FoxP3-, CD25+FoxP3-, CD25+FoxP3+ (Treg) y CD25-FoxP3+. c) Gráfica que muestra el nivel de expresión de CD38 mediante la Intensidad Media de Fluorescencia (IMF) en cada una de las poblaciones celulares. d) Gráfica que ilustra los porcentajes de células que expresan a la proteína CD38. Datos representativos de seis ratones. Los resultados se muestran como la media ± el error estándar (*) p< 0.05
CD25 Fo xP 3 CD38 CD25 F oxP 3 CD3+CD4+ CD25-FoxP3+ CD25+FoxP3+ CD25-FoxP3- CD25+FoxP3-d)
a) b)
25
8.2 La expresión de CD38 se asocia con la expresión de FoxP3
Como complemento de los resultados obtenidos en el apartado anterior y con la finalidad de determinar si la expresión de CD38 se asocia con el nivel de expresión de CD25 o de FoxP3, se realizó un análisis más detallado de estas poblaciones celulares. En esta ocasión, se dividieron a los linfocitos T CD4 en seis subpoblaciones diferentes, esto de acuerdo con el nivel expresión de la proteína CD25 y el factor de transcripción FoxP3. Las subpoblaciones celulares se determinaron como se muestra en la Tabla 1. Los resultados de este análisis indican que la subpoblación I presenta mayor expresión de la proteína CD38 y la expresión de esta desciende en cuanto se expresa la proteína CD25 (subpoblaciones II y III). No obstante, la expresión de CD38 disminuye drásticamente cuando se pierde la expresión de FoxP3 (supboblaciones IV, V y VI), incluso si CD25 se expresa en niveles altos (IV) (Fig 7 a,b).
Tabla 1. Subpoblaciones celulares determinadas por el nivel de expresión de la proteína CD25 y el factor de transcripción FoxP3
Subpoblación CD25 FoxP3
I Negativo Positivo
II Medio Positivo
III Alto Positivo
IV Alto Negativo
V Medio Negativo
26
Figura 7. La expresión de CD38 se asocia con la expresión de FoxP3, no así con la expresión de CD25. Linfocitos totales de bazo provenientes del ratón C57BL/6 fueron teñidos con los anticuerpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD25, anti-FoxP3, anti-CD38 y adquiridos en el citómetro de flujo. a) Los linfocitos T CD3+CD4+ fueron divididos en seis subpoblaciones de acuerdo con la expresión de CD25 y FoxP3. b) Expresión de CD38 en cada una de las subpoblaciones celulares. c) Gráfica que muestra el nivel de expresión de CD38 mediante la Intensidad Media de Fluorescencia (IMF) en cada una de las subpoblaciones celulares. Los resultados se muestran como la media ± el error estándar (n=6) (*) p< 0.05
CD38
I II III
IV V VI CD25 Fo xP 3 CD3+CD4+
I II III
IV V
VI
a)
b)
VI V IV I II III
0 500 1000 1500 2000 IM F C D 38
p < 0.05
27 Debido a que los resultados anteriores demuestran que existe una asociación entre la expresión de CD38 y FoxP3, se evaluó la correlación que existe entra la Intensidad Media de Fluorescencia (IMF) de CD38 y FoxP3 emitida por los linfocitos T CD4+. Los resultados mostraron una asociación lineal estadísticamente significativa, alta y directamente proporcional (rP = 0.95, p < 0.05), entre la expresión de CD38 y la expresión de FoxP3 en los linfocitos T CD4+ (Fig. 8).
Figura 8. Gráfica de correlación entre la expresión de CD38 y FoxP3 en los linfocitos T CD4+.
La gráfica compara la Intensidad Media de Fluorescencia (IMF) de CD38 y FoxP3 emitida por los linfocitos T CD4+. La correlación de la expresión de CD38 y FoxP3 es altamente significativa (rP=0.95, p < 0.05).
0
100
200
300
400
0
200
400
600
800
1000
IMF CD38
IM
F Fox
P
28
8.3 La ausencia de CD38 afecta el porcentaje de linfocitos Treg
29
CD38 +/+
CD38
-/-0
3
6
9
12
15
%
Treg
CD4+
p = 0.002
10% 6%
4%
5%
81% 86% 5%
3%
Cd38 +/+ Cd38
-/-CD25
Fo
xP
3
a)
b)
Figura 9. El porcentaje de linfocitos Treg disminuye en el ratón Cd38 -/- en comparación con el ratón Cd38 +/+.a) Gráfico representativo que muestra las poblaciones de linfocitos Treg en el ratón Cd38 +/+ y Cd38 -/-. b) Gráfica que muestra el porcentaje de los linfocitos Treg CD4+ en el ratón Cd38 +/+ y Cd38 -/-. Los resultados se reportan como la media ± el error estándar (n=6) (*)
30
8.4 Los linfocitos Treg CD38+ tienen mayor expresión de las proteínas CTLA-4 y CD69
En este trabajo se determinaron dos subpoblaciones celulares de linfocitos Treg identificadas por la expresión de CD38: los linfocitos Treg CD38- y los linfocitos Treg CD38+ (Fig 10). El siguiente objetivo que se planteó en este trabajo fue conocer si la expresión de CD38 se asocian con la de moléculas de activación características de los linfocitos Treg como CTLA-4 y CD69. Para tal efecto, se analizó la expresión de estas dos proteínas en los linfocitos Treg CD38- y Treg CD38+. Nuestros datos muestran que los linfocitos Treg CD38+ tienen mayor expresión de CTLA-4 y CD69 en comparación con los linfocitos Treg CD38- (Fig 9).
a) b)
Figura 10. Los linfocitos Treg CD38+ tienen mayor expresión de CTLA-4 y CD69 en comparación con los linfocitos Treg CD38-. a) Gráfico representativo que muestra el porcentaje de los linfocitos Treg CD38+ y Treg CD38-. b) Los histogramas muestran la expresión de CTLA-4 y CD69 en los linfocitos Treg CD38- (línea gris) y CD38+ (línea negra). Los gráficos representan 3 experimentos independientes (n=3)
CTLA-4 CD69
Treg
CD38-40% Treg CD38-60%
CD38
Fo
xP
3
Treg CD38+ 60%
Treg CD38 -Treg CD38 +
CD38
F
oxP
32
VI V IV I II III
0 100 200 300 400 IM F C D 6 9 WT KO
p < 0.0001
p < 0.0001
p < 0.001
Figura 11. La expresión de CD69 se asocia con la expresión de CD38. a) Los linfocitos T CD3+CD4+ fueron divididos en seis subpoblaciones de acuerdo con la expresión de CD25 y FoxP3. b) Expresión de CD69 en cada una de las subpoblaciones celulares. c) Gráfica que muestra el nivel de expresión de CD69 mediante la Intensidad Media de Fluorescencia (IMF) en cada una de las subpoblaciones celulares. Los resultados se muestran como la media ± el error
estándar (n=6) (*) p< 0.05
CD69
I II III
IV V VI CD25 F oxP 3 CD3+CD4+
I II III
IV V
VI
a)
33
8.5 El estímulo con anti-CD38 incrementa el porcentaje de linfocitos Treg en el ratón WT
34 * WT KO 0 50 100 Po rc e n ta je T re g % anti-CD3/CD28/IL-2 anti-CD3/CD28/IL2/CD38
Sin estímulo anti-CD38
n.s.
p < 0.05 p < 0.05
p < 0.05
Figura 12. El estímulo con anti-CD38 incrementa el porcentaje de linfocitos Treg. a) Linfocitos totales de bazo provenientes de la cepa WT y CD38 KO fueron estimulados con anti-CD3/CD28 +rhIL-2, anti-CD38 y con anti-CD3/CD28+anti-CD38/rhIL-2 por 72 horas b) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de linfocitos Treg sin estímulo y con los estímulos anti-CD3/CD28 +rhIL-2, anti-CD38 y con anti-CD3/CD28+anti-CD38/rhIL-2. Los resultados se muestran como la media ± el
error estándar (n=3) (*) p< 0.05
Sin estímulo anti-CD3/CD28 + rhIL-2 anti-CD38 + anti-CD38, rhIL-2anti-CD3/CD28
WT CD38 KO CD25 Fo xP 3
22.2% 90.8% 30.1% 92.2%
14.5% 90.2% 12% 90.4%
35
9. DISCUSIÓN
Los linfocitos T reguladores poseen un papel fundamental en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica, el estudio de estas células ha abierto la posibilidad de un mejor entendimiento de la homeostasis del sistema inmune y su potencial para la intervención terapéutica. Para identificar fenotípicamente a los Linfocitos Treg se ha propuesto el inmunomarcaje de diversas proteínas de superficie como lo son CD45RO, la proteína citotóxica asociada a Linfocitos T (CTLA4) (18), el marcador de activación HLA-DR o el factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR) (57), CD45RB, CD62L (58), neuropilina 1 (NRP1), CD103, CD195 y ICOS (59). Sin embargo, todos estos receptores carecen de especificidad celular debido a que ninguno es expresado exclusivamente en los Linfocitos Treg lo que impediría que fueran marcadores confiables para identificar esta población celular. De tal forma, es la expresión de la proteína CD25 y el factor de transcripción FoxP3 los que han permitido elucidar el fenotipo de los linfocitos Treg y estos “marcadores moleculares” han sido aceptados de manera general por la comunidad científica. En este sentido, se ha descrito que los Linfocitos T reguladores constituyen entre el 5% y 15% del total de los linfocitos T CD4+(15). En este trabajo se encontró que los linfocitos Treg obtenidos de los ratones de la cepa C57BL/6 representan un 10% de la población total de linfocitos T CD4+ (Fig. 9), ubicándose dentro de los valores normales establecidos por la literatura.
Como se ha mencionado anteriormente, es importante estudiar otras proteínas expresadas por los linfocitos Treg, con el objetivo de brindar mayor información acerca de su desarrollo y función e incluso su participación en el control de trastornos del sistema inmunológico, incluyendo la autoinmunidad, alergias, reacciones adversas en transplantes, entre otras.
36 expresan a la proteína CD38 han sido asociados con la regulación del sistema inmunológico; se ha propuesto que los linfocitos T CD4+ que expresan a CD45RBlow y a CD38 de manera elevada, presentan la capacidad de inhibir la secreción de citocinas y la proliferación de Linfocitos T efectores (8). Por otro lado, datos clínicos acerca de la investigación realizada en muestras de seres humanos, proponen a CD38 como una proteína inmunorreguladora debido a que se han reportado elevadas concentraciones de autoanticuerpos anti-CD38 en enfermedades autoinmunes como diabetes Tipo I y la enfermedad de Graves (61,62). En conjunto, los antecedentes mencionados, evidencian la importancia que implica el estudio de la proteína CD38, por tal motivo, en este trabajo se analizó si CD38 tiene la capacidad de regular a la respuesta inmune por medio de su expresión en los linfocitos Treg. De manera interesante, los resultados muestran que CD38 se encuentra altamente expresado por una subpoblación de Linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+, la cual constituye alrededor del 60 %. Un análisis detallado de las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ divididas de acuerdo con la expresión de CD25 y FoxP3 muestra que las subpoblaciones I, II y III expresan más proteína CD38 con respecto al resto de las subpoblaciones. Sin embargo, es evidente que la subpoblación I presenta mayor expresión de CD38, esta subpoblación corresponde a linfocitos CD4+CD25-FoxP3+. Existe evidencia que sugiere que esta población celular puede ser una población de linfocitos T que ha perdido la expresión de CD25 en periferia, debido probablemente a una pobre señal antigénica, sin embargo, se sugiere que cuando esta subpoblación se reencuentra con el antígeno, volverá a ser una población CD4+CD25+FoxP3+, es decir, linfocitos Treg, enriqueciendo de esta manera a la población reguladora. Además, esta subpoblación efectúa funciones supresoras cuando son activadas a través del TCR (63). Creemos que la expresión de la proteína CD38 podría tener un papel importante, ya sea como enzima o como receptor, en la transición de estas poblaciones celulares a linfocitos Treg, sin embargo, esta idea debe ser evaluada en estudios posteriores.
37 trabajo, debido a que existe un menor porcentaje de los linfocitos Treg provenientes del raton CD38-/-. Se sabe que los linfocitos Treg, desde un enfoque metabólico, realizan más fosforilación oxidativa que glucólisis, lo que origina el incremento de las concentraciones de NAD+ intracelular(64). En este sentido, CD38 es la principal molécula responsable de la hidrólisis de NAD+ para la producción de cADPR (movilidador de Ca+ intracelular) por lo que la ausencia de CD38, incrementaría las concentraciones de NAD+ intracelular. El aumento de NAD+ podría ser utilizado por una enzima análoga a CD38, denominada mono-ADP-ribosiltransferasa (ART2), ésta tiene como función ribosilar al receptor ionotrópico P2X7 y activar una señal de muerte apoptótica (65). De este modo, el porcentaje de los linfocitos Treg podría afectarse ante la ausencia de CD38, desde el punto de vista de su actividad enzimática, no obstante, es importante evaluar cuál es su función como receptor en el desarrollo de esta población celular.
Para llevar a cabo su función, los linfocitos Treg expresan proteínas relacionadas con actividades supresoras como CTLA-4 o CD69. La molécula CTLA-4 se encuentra implicada en la regulación negativa de la activación de los linfocitos y se expresa en la superficie de los linfocitos T CD4+CD25+ de manera constitutiva. Ésta se encarga de inhibir la respuesta inmune mediante la transmisión de una señal negativa a través de su región intracelular, mientras que el segundo es un antagonista competitivo del correceptor CD28. En este trabajo se evaluó si existe una asociación entre la expresión de CD38 y CTLA-4 en los linfocitos Treg, obteniendo como resultado mayor expresión de la proteína CTLA-4 en los linfocitos Treg CD38+ en comparación con los linfocitos Treg CD38-. No hay datos que demuestren cuál es la asociación entre CD38 y CTLA-4, sin embargo, se sabe que CTLA-4 es una molécula expresada en linfocitos T activados al igual que la proteína CD38.
La proteína CD69 es una molécula de activación temprana leucocitaria y se expresa en todas los leucocitos después de la activación. Sin embargo, en los últimos años se ha sugerido que esta participa como una molécula reguladora implicada en la modulación de TGF-β y se sugiere que esta proteína participa en
38 reportan una asociación entre la expresión de CD38 y CD69 en los linfocitos Treg, y la ausencia de la proteína CD38 disminuye la expresión de CD69. Lo que se sabe acerca de la relación entre CD38 y CD69 es que la activación de la proteína CD38 induce la expresión de CD69 en las células T Jurkat (66), hecho que debe ser determinado en los linfocitos Treg.
39
10. CONCLUSIONES
La proteína CD38 se expresa en gran medida en las poblaciones reguladoras con fenotipo FoxP3+, aún ante la baja o nula expresión de la proteína CD25. Por otra parte, los linfocitos Treg CD38+ representan un gran porcentaje de los linfocitos Treg totales y la ausencia de la proteína CD38 en un modelo murino afecta el porcentaje de los linfocitos Treg.
Los linfocitos Treg CD38+ se asocian con un fenotipo de activación de los linfocitos Treg y el ratón deficiente de CD38 presenta linfocitos Treg con menor activación.
40
11. CONSIDERACIONES ÉTICAS Y BIOSEGURIDAD
41
12. BIBLIOGRAFÍA
1. Abbas AK, Lichtman AH. Inmunología celular y molecular. 2004. 563 p. 2. Arellano B, Graber DJ, Sentman CL. Regulatory T cell-based therapies for
autoimmunity. Discov Med. 2016;22(119):73–80.
3. Radbruch A, Thiel A. Cell therapy for autoimmune diseases: does it have a future? Ann Rheum Dis. 2004 Nov;63 Suppl 2(Suppl 2):ii96-ii101.
4. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol. 2005 Apr;6(4):345–52.
5. Bluestone JA, Buckner JH, Fitch M, Gitelman SE, Gupta S, Hellerstein MK, et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Sci Transl Med. 2015 Nov 25;7(315):315ra189-315ra189.
6. Scalapino KJ, Tang Q, Bluestone JA, Bonyhadi ML, Daikh DI. Suppression of disease in New Zealand Black/New Zealand White lupus-prone mice by adoptive transfer of ex vivo expanded regulatory T cells. J Immunol. 2006 Aug 1;177(3):1451–9.
7. Wei W, Graeff R, Yue J. Roles and mechanisms of the CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose/Ca(2+) signaling pathway. World J Biol Chem. 2014 Feb 26;5(1):58–67.
8. Read S, Mauze S, Asseman C, Bean A, Coffman R, Powrie F. CD38+ CD45RBlow CD4+ T cells: a population of T cells with immune regulatory activitiesin vitro. Eur J Immunol. 1998 Nov;28(11):3435–47.
9. Patton DT, Wilson MD, Rowan WC, Soond DR, Okkenhaug K. The PI3K p110?? regulates expression of CD38 on regulatory T cells. PLoS One. 2011;6(3):1–8.
10. Ausiello CM, Urbani F, la Sala A, Funaro A, Malavasi F. CD38 ligation induces discrete cytokine mRNA expression in human cultured lymphocytes. Eur J Immunol. 1995 May;25(5):1477–80.
42 12. Mitchison NA. The carrier effect in the secondary response to hapten-protein
conjugates. II. Cellular cooperation. Eur J Immunol. 1971 Jan;1(1):18–27. 13. Fowell D, Mason D. Evidence that the T cell repertoire of normal rats
contains cells with the potential to cause diabetes. Characterization of the CD4+ T cell subset that inhibits this autoimmune potential. J Exp Med. 1993 Mar 1;177(3):627–36.
14. Sakaguchi S, Yamaguchi T, Nomura T, Ono M. Regulatory T Cells and Immune Tolerance. Cell. 2008 May 30;133(5):775–87.
15. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995 Aug 1;155(3):1151–64. 16. Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of Regulatory T Cell Development
by the Transcription Factor Foxp3. Science (80- ). 2003 Feb 14;299(5609):1057–61.
17. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol. 2003 Apr 3;4(4):330–6.
18. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol. 2009 Oct;70(4):326–36.
19. Franzke A, Hunger JK, Dittmar KEJ, Ganser A, Buer J. Regulatory T-cells in the control of immunological diseases. Ann Hematol. 2006 Nov 27;85(11):747–58.
20. Taams LS, Palmer DB, Akbar AN, Robinson DS, Brown Z, Hawrylowicz CM. Regulatory T cells in human disease and their potential for therapeutic manipulation. Immunology. 2006 May;118(1):1–9.
21. Cupedo T, Nagasawa M, Weijer K, Blom B, Spits H. Development and activation of regulatory T?cells in the human fetus. Eur J Immunol. 2005 Feb;35(2):383–90.
43 Jul 15;177(2):840–51.
23. Suto A, Nakajima H, Ikeda K, Kubo S, Nakayama T, Taniguchi M, et al. CD4(+)CD25(+) T-cell development is regulated by at least 2 distinct mechanisms. Blood. 2002 Jan 15;99(2):555–60.
24. Pacholczyk R, Kraj P, Ignatowicz L. Peptide Specificity of Thymic Selection of CD4+CD25+ T Cells. J Immunol. 2002 Jan 15;168(2):613–20.
25. Jordan MS, Boesteanu A, Reed AJ, Petrone AL, Holenbeck AE, Lerman MA, et al. Thymic selection of CD4+CD25+ regulatory T cells induced by an agonist self-peptide. Nat Immunol. 2001 Apr 1;2(4):301–6.
26. Coombes JL, Siddiqui KRR, Arancibia-Cárcamo C V., Hall J, Sun C-M, Belkaid Y, et al. A functionally specialized population of mucosal CD103 + DCs induces Foxp3 + regulatory T cells via a TGF-β– and retinoic acid–
dependent mechanism. J Exp Med. 2007 Aug 6;204(8):1757–64.
27. Curotto de Lafaille MA, Kutchukhidze N, Shen S, Ding Y, Yee H, Lafaille JJ. Adaptive Foxp3+ Regulatory T Cell-Dependent and -Independent Control of Allergic Inflammation. Immunity. 2008 Jul 18;29(1):114–26.
28. Liu VC, Wong LY, Jang T, Shah AH, Park I, Yang X, et al. Tumor evasion of the immune system by converting CD4+CD25- T cells into CD4+CD25+ T regulatory cells: role of tumor-derived TGF-beta. J Immunol. 2007 Mar 1;178(5):2883–92.
29. Cobbold SP, Castejon R, Adams E, Zelenika D, Graca L, Humm S, et al. Induction of foxP3+ Regulatory T Cells in the Periphery of T Cell Receptor Transgenic Mice Tolerized to Transplants. J Immunol. 2004;172(10).
30. Chen W, Jin W, Hardegen N, Lei K-J, Li L, Marinos N, et al. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med. 2003 Dec 15;198(12):1875–86.
31. Roncarolo MG, Bacchetta R, Bordignon C, Narula S, Levings MK. Type 1 T regulatory cells. Immunol Rev. 2001 Aug;182:68–79.
44 33. Vignali DAA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat
Rev Immunol. 2008 Jul;8(7):523–32.
34. Taylor A, Verhagen J, Blaser K, Akdis M, Akdis CA. Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-beta: the role of T regulatory cells. Immunology. 2006 Apr;117(4):433–42.
35. Guzmán-Flores M, Portales-Pérez DP. Mecanismos de supresión de las células T reguladoras (Treg). 2013;149.
36. Grossman WJ, Verbsky JW, Tollefsen BL, Kemper C, Atkinson JP, Ley TJ. Differential expression of granzymes A and B in human cytotoxic lymphocyte subsets and T regulatory cells. Blood. 2004 Nov 1;104(9):2840–8.
37. Ren X, Ye F, Jiang Z, Chu Y, Xiong S, Wang Y. Involvement of cellular death in TRAIL/DR5-dependent suppression induced by CD4+CD25+ regulatory T cells. Cell Death Differ. 2007 Dec 31;14(12):2076–84.
38. Garin MI, Chu C-C, Golshayan D, Cernuda-Morollon E, Wait R, Lechler RI. Galectin-1: a key effector of regulation mediated by CD4+CD25+ T cells. Blood. 2007 Mar 1;109(5):2058–65.
39. de la Rosa M, Rutz S, Dorninger H, Scheffold A. Interleukin-2 is essential for CD4+CD25+ regulatory T cell function. Eur J Immunol. 2004 Sep;34(9):2480–8.
40. Pandiyan P, Zheng L, Ishihara S, Reed J, Lenardo MJ. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells induce cytokine deprivation–mediated apoptosis of effector CD4+ T cells. Nat Immunol. 2007 Dec 4;8(12):1353–62.
41. Grohmann U, Orabona C, Fallarino F, Vacca C, Calcinaro F, Falorni A, et al. CTLA-4–Ig regulates tryptophan catabolism in vivo. Nat Immunol. 2002 Nov 30;3(11):1097–101.
42. Munn DH, Shafizadeh E, Attwood JT, Bondarev I, Pashine A, Mellor AL. Inhibition of T cell proliferation by macrophage tryptophan catabolism. J Exp Med. 1999 May 3;189(9):1363–72.
45 44. Huang C-T, Workman CJ, Flies D, Pan X, Marson AL, Zhou G, et al. Role of
LAG-3 in Regulatory T Cells. Immunity. 2004 Oct;21(4):503–13.
45. Reinherz EL, Kung PC, Goldstein G, Levey RH, Schlossman SF. Discrete stages of human intrathymic differentiation: analysis of normal thymocytes and leukemic lymphoblasts of T-cell lineage. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Mar;77(3):1588–92.
46. Jackson DG, Bell JI. Isolation of a cDNA encoding the human CD38 (T10) molecule, a cell surface glycoprotein with an unusual discontinuous pattern of expression during lymphocyte differentiation. J Immunol. 1990 Apr 1;144(7):2811–5.
47. Nakagawara K, Mori M, Takasawa S, Nata K, Takamura T, Berlova A, et al. Assignment of CD38, the gene encoding human leukocyte antigen CD38 (ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase), to chromosome 4p15. Cytogenet Cell Genet. 1995;69(1–2):38–9.
48. Funaro A, Spagnoli GC, Ausiello CM, Alessio M, Roggero S, Delia D, et al. Involvement of the multilineage CD38 molecule in a unique pathway of cell activation and proliferation. J Immunol. 1990 Oct 15;145(8):2390–6.
49. Malavasi F, Deaglio S, Funaro A, Ferrero E, Horenstein AL, Ortolan E, et al. Evolution and Function of the ADP Ribosyl Cyclase/CD38 Gene Family in Physiology and Pathology. Physiol Rev. 2008 Jul 1;88(3):841–86.
50. Rodriguez-Alba JC, Moreno-Garcia ME, Sandoval-Montes C, Rosales-Garcia VH, Santos-Argumedo L. CD38 induces differentiation of immature transitional 2 B lymphocytes in the spleen. Blood. 2008 Apr 1;111(7):3644– 52.
51. Vences-Catalán F, Santos-Argumedo L. CD38 through the life of a murine B lymphocyte. IUBMB Life. 2011 Oct;63(10):840–6.
52. Sandoval-Montes C, Santos-Argumedo L. CD38 is expressed selectively during the activation of a subset of mature T cells with reduced proliferation but improved potential to produce cytokines. J Leukoc Biol. 2005 Dec 23;77(April):513–21.
46 CD38 accelerates development of a lupus-like disease in lpr mice. Rheumatology. 2011 Sep 1;50(9):1569–77.
54. Domínguez-Pantoja M, López-Herrera G, Romero-Ramírez H, Santos-Argumedo L, Chávez-Rueda AK, Hernández-Cueto Á, et al. CD38 protein deficiency induces autoimmune characteristics and its activation enhances IL-10 production by regulatory B cells. Scand J Immunol. 2018 Apr 23;e12664.
55. Karakasheva TA, Waldron TJ, Eruslanov E, Kim S-B, Lee J-S, O’Brien S, et al. CD38-Expressing Myeloid-Derived Suppressor Cells Promote Tumor Growth in a Murine Model of Esophageal Cancer. Cancer Res. 2015 Oct 1;75(19):4074–85.
56. Krejcik J, Casneuf T, Nijhof IS, Verbist B, Bald J, Plesner T, et al. Daratumumab depletes CD38+ immune regulatory cells, promotes T-cell expansion, and skews T-cell repertoire in multiple myeloma. Blood. 2016;128(3):384–94.
57. Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM, Hafler DA. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system. Nat Rev Immunol. 2010 Jul 18;10(7):490–500.
58. Fazekas de St Groth B, Landay AL. Regulatory T cells in HIV infection: pathogenic or protective participants in the immune response? AIDS. 2008 Mar 30;22(6):671–83.
59. Schulze zur Wiesch J, Thomssen A, Hartjen P, Toth I, Lehmann C, Meyer-Olson D, et al. Comprehensive Analysis of Frequency and Phenotype of T Regulatory Cells in HIV Infection: CD39 Expression of FoxP3+ T Regulatory Cells Correlates with Progressive Disease. J Virol. 2011 Feb 1;85(3):1287– 97.
60. Chen J, Chen Y-G, Reifsnyder PC, Schott WH, Lee C-H, Osborne M, et al. Targeted Disruption of CD38 Accelerates Autoimmune Diabetes in NOD/Lt Mice by Enhancing Autoimmunity in an ADP-Ribosyltransferase 2-Dependent Fashion. J Immunol. 2006;176(8).
47 anti-CD38 autoantibodies raise intracellular calcium and stimulate insulin release in human pancreatic islets. Diabetes. 2001 May;50(5):985–91.
62. Pupilli C, Antonelli A, Iughetti L, D’Annunzio G, Cotellessa M, Vanelli M, et al. Anti-CD38 autoimmunity in children with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus. J Pediatr Endocrinol Metab. 2005 Dec;18(12):1417–23.
63. Zelenay S, Lopes-Carvalho T, Caramalho I, Moraes-Fontes MF, Rebelo M, Demengeot J. Foxp3+ CD25- CD4 T cells constitute a reservoir of committed regulatory cells that regain CD25 expression upon homeostatic expansion. Proc Natl Acad Sci. 2005;102(11):4091–6.
64. Angelin A, Gil-de-Gómez L, Dahiya S, Jiao J, Guo L, Levine MH, et al. Foxp3 Reprograms T Cell Metabolism to Function in Low-Glucose, High-Lactate Environments. Cell Metab. 2017;25(6):1282–1293.e7.
65. Aswad F, Dennert G. P2X7 receptor expression levels determine lethal effects of a purine based danger signal in T lymphocytes. Cell Immunol. 2006 Sep;243(1):58–65.
66. Zubiaur M, Izquierdo M, Terhorst C, Malavasi F, Sancho J. CD38 Ligation Results in Activation of the Raf-1/ Mitogen-Activated Protein Kinase and the CD3-ζ/ζ-Associated Protein-70 Signaling Pathways in Jurkat T Lymphocytes. J Immunol. 1997;159(1):193–205.
67. Muñoz P, Navarro M-C, Pavón EJ, Salmerón J, Malavasi F, Sancho J, et al. CD38 signaling in T cells is initiated within a subset of membrane rafts containing Lck and the CD3-zeta subunit of the T cell antigen receptor. J Biol Chem. 2003 Dec 12;278(50):50791–802.