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Valor diagnóstico de Ia prueba PCR-ADN para VIH-1 a partir de muestras de sangre totaI impregnadas en papel de filtro. Lima, 2013

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(1)

UNIVERSIDAD NACIONAL

DE

SAN CRISTOBAL

DE HUAMANGA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA DE FORMACION PROFESIONAL DE B|OLOGiA

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030

Valor diagnéstico de Iaprueba PCR-ADN para VIH-1

a partir de muestras de sangre'totaI impregnadas

en papel de filtro. Lima, 2013

TESIS PARA OBTENER EL

TiTULO

PROFESIONAL DE

BIOLOGA CON MENCION EN LA ESPECIALIDAD DE

MlCROBlOLOGiA

PRESENTADO POR:

Bach. cuss GUTIERREZ, Carmen Nilda

(2)

-Tesis

154:2

Cub

Ea-1

ACTA DEsusTEuTAcION QE TESIS

R.D.N° 246 0242014 024UNSCH 024F.C.B 024D

Bach. Carmen Nilda Cuse Gutiérrez

En la ciudad de Ayacucho, siendo Ias cuatro de la tarde con diez minutos, del dia '

veintidés de diciembre del a}401odos mil catorce, en el auditorio de la Facultad de

Ciencias Biolégicas de Ia Universidad Nacional de San Cristébal de Huamanga,

reunidos los profesores Dr. Homero Ango Aguilar como miembro y presidente

encargado mediante memorando N ° 754 0242014 UNSCH 024FCB, e integrado por los

profesores Blgo. Tomas Yuret Miranda Tomasevich, Mg. Aurelio Carrasco Venegas

y Mg. Gilmar Pe}401aRojas, y como secretario docente Blgo. Elbert Hermoza Valdivia,

con la }401nalidadde recepcionar en acto p}402blico,la exposicién de la tesis 034Valor

diagnéstico de la prueba PCR-ADN para V|H 0241a partirrte muestras de sangre total

impregnadas en papel de filtro. Lima 2013, presentado por la bachiller en Ciencias

Biolégicas Carmen Nilda Cuse Gutiérrez, con la que pretende optar el titulo

profesional de Bibloga con mencién en la especialidad de Microbiologia.

Inicialmente se da a conocer, mediante su lectura. el memorando754 - 2014 024

UNSCH 024FCB, de encargo de la presidencia del acto, al Dr. Homero Ango Aguilar,

asi como la documentacién presentada para la sustentatoriay estando en orden el

Sr. presidente encargado autoriza a la sustentante para que pueda dar inicio con su

exposicién, lo que es realizado inmediatamente con el agradecimiento a la

universidad, facultad, familiares, docentesy compa}401erosde estudios; Ia exposicién

debe tener una duracién méxima de cuarentaycinco minutos.

Transcurrida Ia sustentacién y concluida esta por pane de la sustentante, el Sr.

presidente encargado pide a los miembros del jurado evaluador para que puedan

realizar las preguntas y aclaraciones que crean necesarias, a las mismas que la

Srta sustentante da respuesta en forma satisfactoria.030

Una vez concluida con esta seccién de preguntas, el Sr. presidente invita a la

sustentante y p}401blicoasistente puedan hacer abandono del auditorio en forma

momenténea con la }401nalidadde realizar la cali}401cacién,previa una discusién de la

(3)

Miembro jurado evaluador Exposicldn Rsptaapreguntas Promedio

Dr. Homero Ango Aguilar 17 17 17

Blgo. Tomés Yuret Miranda Tomasevich 18 18 18

Mg. Aurelio Carrasoo Venegas 18 18 18

Mg. Gilmar Pe}401aRojas 19 17 18

Promedio 18

Concluida la calificacién Ia Sna. sustentante obtuvo Ia nota promedio de dieciocho

(18) que es Aprobatorio, e inmediatamente se invitaa la sustentante pueda ingresar

al auditorio al igual que el publico asistente, con la }401nalidadde dar a conocer el

resultado p}401blicamente,e imponerla medalla respectiva. como también efectuar el

juramentode Ley.

Concluye, e1acto de sustentacién conla}401rmade los jurados al pie del presente acta

de sustentacién en fe de conformidad, siendo |as seis de la tarde con cuarenta

minutos. /

'

/

/

,

1

) I 030/

Hom oAngo Aguilar Blgo Mira da Tomasevich I

Miembro 024Presidente Miembro

Mg.relio %rras§§ne;as Mg. G 031ErPe}401aRojas

Asesor Miembro

Blgoilbert Hermoza Valdivia

(4)

A mis padres:TeodosioyCarmen

A mis hennanos: Miguel Angel yKarina

(5)

AGRADECIMIENTO

A mi Alma Mater, la Universidad Nacional de San Cristébal de Huamanga, por

forjarme académicamente creando en mi, espiritu de superacién.

Ala Facultad de Ciencias Biolégicas por cobijarrne en sus claustros.

A la escuela de fonnacién profesional de Biologia y su plana docente por sus

sabias ense}401anzas.valores y principios inculcados durante mi fonnacién

profesional.

AI Instituto Nacional de Salud (INS) por brindarnos apoyo para desarrollar mi

proyecto de tesis.

A mis padres, por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, tanto académica,

como de la vida, por su incondicional apoyo y cari}401omantenido a través del

tiempo. Mis hermanos, por estar siempre conmigo y danne su apoyo en cada

momento de mi vida.

Al asesor externo Dra. Soledad Romero Ruiz, del Laboratorio de VTS-VIH/SIDA

del INS por su asesoramiento en el desarrollo del presente trabajo de

investigacién. Al personal del laboratorio VTS-VIH/SIDA, que colaboré en el

presente trabajo, en especial a Fany.y Susan.

Al asesor interno Mg. Aurelio Carrasco Venegas, por sus observaciones en la

elaboracién y desarrollo del presente estudio.

A todas las personas que colaboraron de alguna manera para desarrollar el

presente estudio.

(6)

INDICE GENERAL

Pégina

DEDICATORIA iii

AGRADECIMIENTO v

INDICE GENERAL vii

INDICE DE TABLAS ix

INDICE DE FIGURAS xi

INDICE DE ANEXO - xiii

RESUMEN xv

I.

INTRODUCCION

XVI

II. MARCO TEORICO 3

2.1. Antecedentes 3

2.2. Marco conceptual 4

2.3. Marco teérico 7

2.3.1.Virus de Inmunode}401cienciaHumana (VIH) 7

2.3.2. Etiologia del VIH

7

'

2.3.3.Estruc1ura y genoma 7

2.3.4.CicIo de replicacién 9

2.3.5.Variabi|idad genética 10

2.3.6.Historia natural de la infeccién 11

2.3.7.Mecanismos de transmisién 12

2.4. Marco legal 23

III. MATERIALES Y METODOS 25

, 3.1. Ubicacién de lazona de estudio 25

3.2. Poblacién 25

3.3. Muestra 25

3.4. Sistema de muestreo 26

3.5. Metodologia 26

IV. RESULTADOS 33

V. DISCUSION V 37

VI.

CONCLUSIONES

41

VII. RECOMENDACIONES 43

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 45

ANEXOS 47

(7)

iNDlCE DE TABLAS

Tabla 1. Concentracién de componentes utilizados en PCR 29

Tabla 2. Condiciones de ciclamiento enel termociclador 29

Tabla.3. Concentracién de componentes utilizados en la segunda

ronda del PCR 30

Tabla.4. Condiciones de ciclamiento en el termociclador (segunda

ronda) 30

Tabla.5. Sensibilidad de la reaccién en cadena de la polimerasa

(PCR) - 33

Tab|a.6. Especi}401cidadde la reaccién en cadena de la polimerasa

(8)

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura del Virus de lnmunode}401cienciaHumana 8

Figura 2. Estructura genémica del VIH 9

Figura 3. Replicacién del Virus de lnmunode}401cienciaHumana 10

Figura 4. Curso clinico de la infeccién natural por el VIH-1 12

Figura 5 Etapas de la reaccién en cadena de la polimerasa (PCR) 19

Figura 6. Capacidad predictivade una prueba diagnéstica 22

Figura 7. Sensibilidad de la reaccién en cadena de la polimerasa

(PCR) a partir de muestras de sangre en papel de }401ltro 34

Figura 8. Especi}401cidadde la reaccién en cadena de la polimerasa

(PCR) a partir de muestras de sangre en papel de filtro 36

(9)

INDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Ampli}401caciénde la segunda ronda de PCR 49

Anexo 2. Consentimiento informado 50

Anexo 3. Preparacién de reactivos 55

Anexo 4. Fotogra}401ade materiales empleados para la extraccién de

ADN 56

Anexo 5. Flujograma de procesamiento de muestras 57

Anexo6. Flujograma de extraccién de ADN 58

(10)

030 RESUMEN

La infeccién por el VIH es un problema de salud publica distribuida

mundialmente; en la actualidad se conocen dos tipos vlrales: el VIH-1 con

distribucion universal y el VIH-2 concentrado en Africa Occidental. En nuestro

pais se ha descrito la circulacion del VIH-1. La serologla es la forma mas sencilla

para el diagnéstico de la infeccién por el VIH, detecta anticuerpos contra el virus.

Sin embargo presentan inconvenientes a la hora de hacer un diagnéstico

temprano de la infeccion por el VIH. La reaccién en cadena de la polimerasa

(PCR) ha mostrado buenos resultados tanto en la fase aguda como en la fase

crénica de la infeccién por el VIH-1; existen diversas pruebas de PCR

desarrollados para la deteccién del virus de la lnmunode}401cienciahumana (VIH),

siendo el mas indicado el PCR-ADN proviral que permite detectar al VIH en la

fase inicial de la infeccién, donde la prueba serologica no es util (recién nacido

de madres infectadas con VIH o con antecedentes de riesgo de infeccién durante

el embarazo y personas con periodos de ventana mas Iargos de lo habitual). Por

tanto el presente estudio tuvo como objetivo determinar el valor diagnéstico de la

prueba PCR-ADN proviral para el diagnéstico del VIH-1, evidenciada por la

sensibilidad y la especi}401cidadde un ensayo de PCR anidada utilizando muestras

de sangre impregnadas en papel de }401ltroFTA, La investigacién aplicada fue

bésico descriptivo. El estudio se desarrollo en el lnstituto Nacional de Salud

(INS), laboratorio de VTS-VIH/SIDA gracias al convenio entre la Universidad

Nacional de San Cristobal de Huamanga con la mencionada institucién. Se

trabajo con muestras de sangre positivas a VlH recepcionadas en el INS en el

periodo de febrero a marzo del 2014, y muestras negativas colectadas de

personal voluntario previa }401nnadel consentimiento informado. El papel de }401ltro

FTAtiene una matriz con una formulacion patentada, que lisa |as células de las

manchas de sangre seca (DBS) en papel de }401ltroy conserva el ADN; facilitando

la coleccién, transporte y almacenamiento de las muestras de sangre, ademas

requiere peque}401acantidad de muestra, disminuye riesgos de oontaminacién y

desarrolla un principio de extraccién de ADN répido y sencillo. Se ampli}401céla

regién Pol del VIH-1 obteniendo una sensibilidad del 95% y especi}401cidadde

100% Por tanto la PCR-ADN proviral es un método sensible y especifico

adema 031sde ser répido y sencillo para el diagnéstico temprano del VIH-1.

Palabras claves: VlH, valor diagnostico, sensibilidad y especi}401cidad

(11)

I.

INTRODUCCION

En la actualidad |os métodos de tamizaje y con}401rmaciénde la infeccién por el

VIH se basan en la deteccién de anticuerpos circulantes através de los métodos

serolégicos como Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Western Blot

(WB), lnmuno}402uorescenciaindirecta (IFI), entre otras. Las desventajas de estos

métodos radican en que no con}401erenun resultado oportuno debido al tiempo que

lleva Ia seroconversién (10 - 14 diasy aveces hasta 6 meses), ademés que ésta

varia de persona a persona. 030A pesar de su alta sensibilidad (99%), féciles y

répidos de manejar son poco especi}401cos.La inmuno}402uorescenciase utiliza

como prueba con}401rmatoriadel diagnéstico serolégico de VIH, es una técnica

~ simple de fécil ejecucién, con el inconveniente de que necesita un microscopic

de epi}402uorescenciayde un personal altamente capacitado y con experiencia en

las lecturas de las léminas.2

La PCR ha mostrado buenos resultados, tanto en la fase aguda como en la fase

crénica de _la infeccién, es altamente sensible, detecta minimas cantidades de

ADN y es altamente especi}401caque detecta secuencias especi}401casde ADN. 031

En la actualidad contamos con técnicas de PCR-ADN que utilizan sangre entera;

colectadas de 1 a 4 ml, en contraste, la PCR-ADN con DBS en papel de }401ltro

omite la necesidad de separar |as células mononucleares y la necesidad de

centrifugacién. l

Se ha desarrollado un método sencillo en base a un protocolo modi}401cado,

empleado por lngrid Beck que utiliza muestras de sangre sobre papel de }401ltro030

(tarjetas FTA) y un buffer de Iavado (kit comercial). La tarjeta tiene una matriz

impregnada con una férmula patentada que destruye Ias células y mantiene Ia

integridad del ADN. Ademés requieren peque}401acantidad de muestra, no

(12)

conllevan un menor riesgo biolégico, no necesitan refrigeracién y son féciles de

transportar. '

La PCR-ADN con DBS en papel de }401ltroconstituye una buena alternativa para

el diagnéstico oponuno del VIH-1 por ser altamente sensible y especi}401caen

caso de ni}401osde madres seropositivas. personas con situacién de riesgo,

gestantes, entre otros.

PorIo cual para el presente trabajo de investigacién se plantelaron |os siguientes

objetivos:

Objetivo general:

- Determinar el valor diagnéstico de la técnica PCR-ADN con muestras de

sangre total impregnadas en papel de }401ltropara la deteccién de la

7 infeccién por el virus de la inmunode}401cienciahumana (VIH-1)

Objetivos especi}401cas:

- Determinar Ia sensibilidad de la reaccién en cadena de la polimerasa

(PCR-ADN) con muestras de sangre total impregnadas en papel de }401ltro.I

o Determinar la especi}401cidadde la reaccién en cadena de la polimerasa

(PCR-ADN) con muestras de sangretotal impregnadas en papel de}401ltro.

(13)

ll. MARCO TEORICO

2.1. Antecedentes

El diagnéstico precozdela infeccién por el VIH-1 enlos ni}401osno se puede lograr

con las pruebas de anticuerpos convencionales, debido a la persistencia de los .

anticuerpos maternos transferidds pasivamente que persisten por hasta 18

meses después del nacimiento. 030Se deben realizar métodos directos que

detecten al virus 0 alguno de sus componentes. La deteccién del ADN por PCR

es un método establecido para determinar el estado de la infeccién en ni}401os

nacidos de madres seropositivas y, combinado con muestras de sangre seca

(DBS) en papel de }401ltroprovee una metodologia sencilla para el diagnéstico del

VIH-1 en los ni}401osyalgunos casos especiales '

Se desarrollé un ensayo de PCR 034inhouse" de una sola ronda dirigido a la regién

pol, utilizaron como muestra DBS en papel de }401ltro.Para Ia validacién utilizaron

esténdares celulares conocidos en ndmero de copias, para Iuego ser aplicado a

un grupo de ni}401oscon estado de infecciénconocido. Finalmente comparé con

los resultados de un laboratorio de referencia utilizando un método

automatizado. Encontrando un 92.8% y 98.3% de sensibilidad y especi}401cidad

respectivamente para el método "in house 035comparable con el método

automatizado.5

031 En otro estudio se evalué un ensayo con la tecnologia Amplicor PCR-DNA con

muestras de DBS y sangre total de ni}401osen Tailandia. Los resultados obtenidos

fueron de 96% a 100% de sensibilidad y 100% de especi}401cidad.Por tanto

concluyeron que DBS se puede utilizar con precisién en Iugardesangre totals.

Se evalué Ia validez diagnéstica de la PCR-ADN por Amplicor de Roche (versién

1.5) en ADN extraido de puncién de talén infantil impregnados en papel de filtro

(S&S) Encontrando un 98.68% de sensibilidad y una especi}401cidadde! 100%

(14)

Para la deteccién del VIH por nested PCR, utilizaron muestras de sangre en

papel

de filtro de ni}401os

nacidos de

madres

seropositivas. Se analizaron 109

muestras de ni}401osen los que se desconocia su estado de infeccién de los

cuales 26 (23.8%) resultaron positivos y 83 (76.2%) negativos por PCR. Este

método constituye un ensayo simple para la deteccién del VIH en muestras de

sangre coleciadas en papel }401ltroreduciendo Iargos pasos de extraccién y

031 puri}401caciéndel ADN yfacilita el transporte ymanejo de las muestras. 035

Se desarrollo una prueba de nested PCR-ADN con muestras de sangre en papel

de }401ltropara evaluar Ia sensibilidad y especi}401cidad.Las muestras fueron

tomadas en dos paises (Washington y Per}401).Amplificando Ia region pol,

obteniendo una sensibilidad y especi}401cidadde 98.4% y 98.3% respectivamente,

dos de esas muestras perlenecian a otros subtipos (A y C), y en el caso de

muestras de Pen 031:(madres e hijos seropositivos por ELISA) el ensayo tuvo una

sensibilidad de 99% y una especi}401cidaddel 100%. Asimismo realizaron el Iimite

de deteccion utilizando Ia Iinea celular 8E5 obteniendo de 5 a 10 copias/5 pl de

sangre. Concluyendo que la PCR con muestras de sangre en papel de }401ltroes

un método practice, econémico, sensible y especi}401copara el diagnéstico del

VIH-1. 030

030

Un trabajo realizado en Cuba, con el }401nde determinar Ia utilidad de papel }401ltro

con muestras de sangre seca en la deteccion de ADN proviral, se incluyeron 50

muestras donde se incluyeron ni}401osnacidos de madres seropositivas y 60

muestras procedentes de donantes voluntarios de sangre. La muestras fueron

tomadas en papel de }401ltroN°903 (scnlecher& Schuell) Ia extraccion porelusion

y la ampli}401caciéna partir del gen gag. El 92% de los seropositivos analizadas

030 resultaron positivos por PCR, no se encontré positividad en los seronegativos; el

procedimiento empleado resulto L'1ti| en el diagnéstico de VIH-1 a partir de

muestras de sangre en

papel

}401|tro.°

2.2. Marcoconceptual

- ADN. Acido Desoxirribonucleico. Es una compleja cadena de polimeros I

unidos por puentes de hidrégeno, estructuralmente esta formado por

nucleétidos En casi todos los organismos celulares el ADN esté

organizado en forma de cromosomas, situados en el nucleo de la célula.

Material genético de todos los organismos vivos encargado de la '

replicacién, el ADN se copia e si mismo cada vez que una célula se

(15)

reproduce ytransrf1'it 031ela 034a'034'descendénla infomiacién que contiene. De030cia

acuerdo a la complejidad que presenta un organismo vivo, el ADN podré

ser mas o menos complejo. En este sentido el ADN de los individuos

resulla ser mas complejo que el que presenta una bacteria?

0 Ampli}401cacién.Es el aumento en el n}402merode copias de un fragmento

de ADN particular, para ello es necesario conocer al menos parcialmente

la secuencia del fragmento a ampli}401car.Bésicamenle se trata de replicar

una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello se realiza un

experimenta in vitro tal como lo hacen las células in vivo para replicar su

ADN. 030

0 Dicotémica. Una medida nominal referida a pruebas diagnésticas que

tiene sélo dos resultados (ejemplos son el género: masculino o

femenino: la supervivencia: si 0 no); Ilamada también binaria. 035

- Desnaturalizacién. Cambio estructura! de las proteinas o a 031cidos

nucleicos donde pierden su estructura nativa, por lo general irreversible,

de esta forma pierden su éptimo funcionamiento y a veces también

cambian sus propiedades fisico-quimicas. El ADN se desnaturaliza por

altas temperaturas produciendo una separacién de la doble hélice, que

ocurre por la ruptura de los puentes de hidrégeno. En el caso de

proteinas debido a: precipitacién, hidrélisis de enlaces peptidicos, efecto

de écidos diluidos, élcalis diluidos, calentamientoo irradiacién.

0 Diagnéstico. Ana'lisis que se realiza para determinar cualquier siluacién

y sus tendencias. Esta detenninacién se realiza en base a datosyhechos

recogidos y ordenados sistematicamente que permiten juzgar mejor qtle

es lo que esta 031pasando. Conjunto de signos que sirven para fijar el

cara

031cter

peculiar de una enfennedad.

035

- E. D. T. A. Acido etilendiaminotetraacético, es una sal que tiene efecto

quelante, act}402asobre el calcio, al }401jarloimpide su activacién y por ende,

la coagulacién sanguinea.

o Electroforesis. Migracién de paniculas cargadas eléclricamente (iones),

dispersos en un medio liquido, por la accién de un campo eléctrico lo

mas homogéneo posible. La velocidad de desplazamiento es por tanto

proporcional a la intensidad de campo y a la carga iénica e

inversamenle proporcional al radio de la particula y a la viscosidad del

(16)

0 Enfermedad. Alteracién del estado de salud del cuerpo animal.

- Especi}401cidad.La especi}401cidadnos indica Ia capacidad de nuestro

estimador para dar como casos negatives |os casos realmente sanos;

proporcién de sanos correctamente identi}401cados.Es decir, la

especi}401cidades la capacidad de la prueba para detectar Ia ausencia de la

enfermedad en sujetos sanos.

030

0 Hibridacién. Es Ia unién complementaria de acidos nucleicos (ADN 0

ARN) Técnica de biologia molecular que se utiliza para detectar una

molécula diana par}401endode una sonda complementaria a ella. En Ias

técnicas de hibridacién se pane de dos poblaciones de acidos nucleicos:

un conjunto homogéneo de acidos nucleicos de secuencia conocida que

act}402acomo sonda y otro conjunto heterogéneo de écidos nucléicos de '

secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. 030

- lnfeccién. Es un término clinico que indica la contaminacién,

desencadena una respuesta inmunolégica y da}401oestructural del

hospedero, causada por microorganismos patégenos, es decir, existe

invasién con lesién tisular por esos mismos génnenes (hongos, bacterias,

protozoos, virus, etc.), sus productos

o ambos

a la vez.

034

- ADN Polimerasa. Enzima que tiene la capacidad de sintetizar ADN a

partir de un oligonucleétido iniciador y una hebra de ADN molde. Es .

imponante por su caracteristica de ser una enzima termoestable y

termoactiva, soportan altas temperaturas requeridas para la

'des_naturalizacién del ADN. La primera enzima termoestable fue Ia

aislada de la bacteria Thennus aquaticus denominada comanmente Taq

ADN polimerasa.

035

- PCR. Reaccién en cadena de la polimerasa, mas conocida como PCR

por las siglas derivadas del inglés (Polymerase Chain Reaction) es una

técnica in vitro de secuencias especi}401casde acidos nucleicos de

ampli}401caciénenzimética exponencial. La reaccién ocurre en un equipo

denominado termociclador que permite cambiar diferentes temperatures

para que se lleve a cabo el proceso. 030

0 Sensibilidad. La sensibilidad nos indica, la capacidad de nuestro

estimador para dar como casos positivos los casos realmente enfermos;

proporcién de enfermos correctamente identi}401cados.Es decir, la

(17)

sensibilidad es la capacidad}402ela pruebanpara detectar la enfermedad en

sujetos enfermos. 030

2.3. Marco teérico

2.3.1. Virus de lnmunode}401cienciahumana(VIH)

El VIH fue descubierto por primera vez en 1983, numerosos trabajos ha

demostrado su relacién con el Sindrome de lnmunode}401cienciaadquirida (SIDA);

se caracteriza por diversas manifestaciones clinicas, entre ellas el da}401oal

sistema inmune manifesténdose mediante la destruccién de células CD4

0

_

células T y a largo plazo se mani}401estapor la susceptibilidad a enfermedades

oponunistas, neoplasias malignas asociadas y degeneracién del sistema

nervioso central (SNC).'°

2.3.2. Etiologia deIVlH

El VIH es un retrovirus que pertenece a la familia Retroviridae y género

Lentivirus, caracterizado por presentar un marcado poder citolitico, de infectar

células del sistema inmune y de producir infecciones |entas. 034Estosvirus tienen

una serie de caracteristicas especificas que son determinantes en la compleja

patogenia de la infeccién como la gran diversidad genética y genoma complejo,

ciclo vital con dos fases (ARN y ADN proviral), se replica mediante un

mecanismo inverso al habitual en los virus ARN; el papel fundamental lo juega

una enzima Ilamada transcriptasa reversa. Sus células huésped son los Iinfocitos

CD4+, macréfagos, células nerviosas de la microglia y células dendriticas

residentes en mucosas (células de Langerhans) 030.Existen dos tipos del VIH,

denominados VIH-1 y VIH-2. El primero fue descubierto en la década de 1980,

es el més virulento e infeccioso que el VIH-2 y es el causante de la mayoria de

infecciones por VIH en el mundo. El VIH-2 es menos contagioso, se encuentra

confinado en los paises de Africa Occidental."

031

2.3.3. Estructura y genoma

Estructura

Desde el punto de vista morfolégico el VIH es una particula esférica de 90 a 120

nm de diémetro y su envoltura externa esta formada en un 5-10% de

componentes propios del virus (g|ucoproteinas 024gp)y de un 90-95% de

componentes de la membrana de donde se originé 0302.Laestructura comprende un

core (centro) que contiene las nucleoproteinas, rodeado de una envoltura

compuesta por membrana celular donde se inserlan |as glucoproteinas de

(18)

informacién genética en dos cadenas idénticas de ARN, las proteinas

estructurales codificadas por el gen gag que constituyen Ia matriz y cépside del virus, proteinas funcionales codificadas por el gen pol (transcriptasa reversa,

integrasa y proteasa).3

FIGURA 1. Estructura del virusde la lnmunode}401cienciaHumana

env gp12O

5

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g

\_

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Estructuradelvirus dela "' " '.' \

lnmunode}401cienciaHumana ; '

Fuente: Hernandez 035.

Genoma

El genoma del VIH-1 y VIH-2 son similares, estén constituidos por una cadena

de

ARN monocatenario protegido por una envoltura

de

membrana.

035

Ambos

estén compuestos por 3 genes estructurales (gag, pol y env) y seis genes

reguladores nef, rev, vif, tat, vpu y vpr(vpx en caso de VIH-2) encargados de la

regulacién de la sintesis y replicacién viral 035El provirus, forma integrada del

genoma del VIH, mide aproximadamente 9.8 Kb Ambos extremos del provirus

tienen una secuencia nucleotidica denominada LTR (long terminal repeats) que

sirven de receptores de proteinas tanto celulares como virales, que activan Ia

transcripcién del virus. 035

(19)

FIGURA 2. Estructura genémica del VIH

(F 1 2 3 4 § 6 Z 8 9kb

5 030L1'R ' r 3 030L1 031}401

cg

E

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~53 Endanucloasa --"-

024-':,;T-pre(nl1_iIado) 3

1125 (maya}402 Proteins exlrucelular

p,5 gp12O

A PmxelnaIransmmubranal

7 p9 9 035 034

Fuente: Roses 035.

2.3.4. Ciclo de replicacién

El ciclo biolégico del VIH se divide en dos etapas bien diferenciadas: la primera

etapa del ciclo, comprende desde el reconocimiento celular hasta Ia integracién

del ADN viral al ADN huésped. El reconocimiento celular esté relacionado con la

sensibilidad a los receptores CD4 presentes en los linfocitos T4, ademés de

correceptores de quimiocinas que en los linfocitos es CXCR4 y en los

macréfagos CCR5. 0305El primer paso de este proceso es el acoplamiento de la gp

120 a los receptores CD4 auxiliado por los correceptores. Esta unién origina un

cambio conformacional en gp 120, que permite plegarse a gp 41 yesta a su vez

fusiona Ia envoltura viral con la membrana celular. Una vez dentro de la céiula el

virus pierde Ia envoltura Iiberéndose e1 ARN viral, ypor accién de la transcriptasa

reversa comienza el proceso de retrotranscripcién (transformacién de ARN viral

en ADN viral), este ADN es transportado al interior del n}401cleode la célula yuna

vez en el nucleo el ADN lineal se integra a la célula del huésped mediante Ia

integrasa viral, y se fonna el provirus. El provirus puede perrnanecer

transcripcionalmente inactive durante meses

o

a}401os.

035

La segunda etapa del ciclo comprende desde Ia biosintesis de los componentes

virales hasta Ia salida de los viriones infectantes. El inicio de la transcripcién del

provirus, depende de factores celulares y virales que interactuan con las

secuencias reguladores localizadas en la regién U3 de la LTR. Estos elementos

celulares se unen al promotor viral yaumentan Ia expresién genética del VIH-1

en respuesta a la estimulacién celular por diferentes mecanismos. El ARN

generado es procesado en el nllcleo y transportado al citoplasma con ayuda de

(20)

hasta los centros de ensamblaje para formar los nuevos viriones, Iiberados por

un proceso de gemacién a través de la membrana p|asmética. 0303Una proteina

importante en la formacién de los viriones es la proteasa viral, enzima que

provoca la ruptura de la poliproteina Gag en proteinas de la cépside y

nucleocépside (p6, p9, p17 y p24) y de la poliproteina Pol precursora de todas

enzimas virales (transcriptasa reversa, integrasa yproteasa).

La maduracién final de los viriones y del ensamblaje de las proteinas virales se

produce al final del ciclo. Este complejo nucleocapside abandona la célula

llevéndose un fragmento membranal dando fin al proceso de ensamblaje ysalida

del virién.

035

Figura 3. Replicacién del virus de la lnmunodeficiencia Humana

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030°

Fuente: Rosas 034

2.3.5. Variabilidad genética

Como virus ARN que es, su genoma presenta muchas variantes (cuasiespecies).

En relacién con la envoltura (gen env)se conocen al menos9 genotipos con una

clara distribucién geografica: en Occidente predomina el B, en Africa

subsahariana el A y C, yen el Sur este asiatico el C, B y E. En relacién con el

gen gag se conocen 7 subtipos. Aunque existe cierla controversia. esta

distribucién geogréfica puede explicar la diferente epidemio|ogia.'5 En Africa

subsahariana ysudeste asiético, donde habitan el 90% de los afectados por el

VlH, la transmisién es heterosexual en el 90%, mientras en Occidente es

fundamentalmente homosexual y parenteral. El tropismo que mani}401estan|os

diferentes subtipos por las células de Langerhans del epitelio femenino es muy

alto, al menos para el subtipo E, y muy bajo para el subtipo B.

(21)

Los retrovirus tienen capacidad de recombinacion (forma de reproduccién

"sexual" primitiva) derivada de poseer 2 fiiamentos de ARN. Si en una céluia

huésped existen dos provirus diferentes, a la hora de la replicacion, uno de los }401lamentosde un provirus puede recombinarse con el del otro dando Iugar a una progenie heterocigota con las caracteristicas de ambos (tropismo, resistencias a

antirretroviraies).

2.3.6. Historia natural de la infeccién

Después de la infeccién primaria, la alta replicacién viral inicial conduce a una

ra 031pidadiseminacién del virus en organos linfoides y otros tejidos del paciente

infectado. Entre 2 6 3 semanas post-infeccién y asociado con el desarrollo de

una fuerte respuesta celular T citotéxica, que precede a la aparicién de

anticuerpos se produce una drastica caida en los niveles de ARN virico en

plasma y un restablecimiento dei numero de células T CD4+. Este nivel basal de

replicacién viral se denomina set point y varia de un individuo a otro

constituyendo un importante marcador virolégico de progresién de la

enfermedad. 035Después de la primoinfeccién, se inicia Ia fase clinicamente

asintomética. de duracion variable, entre la infeccién primaria y el desarrollo del

SIDA. Durante el periodo asintomatico de la infeccién, Ia repiicacién del virus es

continua. pero el individuo mantiene una fuerte respuesta inmune frente ai virus,

estabieciéndose un estado de equilibrio, en el cual Ia produccién y eliminacién

del virus alcanza valores semejantes. 035Como resultado, |os niveles de ARN

virico en piasma permanecen estables. Pero el numero de células T CD4+

disminuye Ientamente con una tasa media estimada de 25-60 células/ul/a}401oy el

virus invariablemente escapa al control inmune. La ultima etapa de la

enfermedad, en ausencia de tratamiento antirretroviral, se caracteriza por un

aumento de la replicacién del VIH-1 y coincide clinicamente con una marcada

disminucién en el numero de células T CD4+ (< 300 células/pl) y una profunda

aiteracién del estado general del paciente. caracterizada por la aparicién de

infecciones oportunistas graves, ciertas neoplasias y alteraciones neuro|c'>gicas.16

La infeccién primaria se caracteriza por la presencia de altos niveles de virus en

la sangre. que disminuyen hasta alcanzar un valor estacionario en la fase

asintomética (Fase 1). La aparicién de sintomas clinicos se ve acompa}401adade

un nuevo aumento en los niveles de viremia en sangre que permanecen

elevados durante todo el periodo terminal (Fase 2). El nivel de iinfocitos CD4+

(22)

alcanzando niveles Iigeramenle inferiores a los iniciales. Durante la Fase 1 su

nivel va disminuyendo paulatinamente, en muchos individuos el inicio de la Fase

2 se acompa}401ade un marcado descenso en el n}402merode linfocitos CD4+. El

n}402merode linfocitos CD8+ se eleva durante la infeccién primaria retornando a la

normalidad durante toda la Fase 1, solo durante la Fase 2 se produce una

disminucién clara en los niveles de linfocitos CD8+. Por altimo, el numero de

linfocitos CD8+ especlficos frente al VIH-1 que se ha mantenido constante

durante la Fase 1, comienza a disminuir con anterioridad a la aparicién de

sintomas y a partir de este momento desciende répidamente a medida que la

enfermedad progresa. 0306

Figura 4. Curso clinico de la infeccién natural por VIH-1

MIC 034

lmoeclbn o

9 Aslntomi}402gn slnlomi}401coSIDA

10 031

E Co 030 nroconvonlbn 0303

3 . 1o 5

3 E

i rev 03122

§ Ar}402cuupuam-VIM 3

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E 034V10 030 030

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3 RNA¢llVlM¢nplIsm {O3 5

10'

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0

E

030

Mnnnnu- 7 uImus 2-3tie: tnnodmnntznal

Fuente: Campos 035.

2.3.7. Mecanismos de transmisién

Los modos de transmisién del VlH de un individuo a otro son los principales

determinantes de las caracteristicas epidemiolégicas del SIDA. El virus se

transmite por tres vias principales:

o Transmisién Sexual. Es el modo mas frecuente de transmisién, ya sea

entre varones homosexuales o entre parejas heterosexuales. El virus

esté presente en el semen y accede a la pareja no infectada, a través de

la mucosa rectal traumatizada, o a través de la mucosa vaginal. También puedeocurrir Ia transmisién de mujeres infectadas a varones. 030°

o Transmisién Parenteral. La inoculacién de un receptor con sangre o

hemoderivados infectados es la segunda via ma 031sfrecuente de

(23)

transmision del VIH. Los pacientes infectados por esta via pueden

infectar a otros individuos por contacto sexual.

o Transmisién Vertical. La transmisién del VIH de madre a hijo es

responsable de la mayor parte de los casos de SIDA pediatrico. Este tipo

de transmisién ocurre con mayor frecuencia en el }402teroo durante el

parto, aunque también es posible Ia transmisién por la lactancia matema.

2.3.8. Diagnéstico

En el diagnostico de la infeccién por elVIH, paraconsiderar un resultado positivo

se recomienda el uso de tres técnicas con distinto principio, siendo obligado

{ entre una de ellas el Western Blot como prueba con}401rmatoria.Las pruebas035

serologicas de cuarta generacién acortan el periodo de ventana de 13 a 15 dias.

La deteccion del genoma del VIH (ADN proviral IARN) y la viremia plasmatica V

(carga viral), complementan al diagnéstico en situaciones complejas y se utiliza

para el seguimiento de los pacientes infectados por VIH para contribuir en la

decision de inicio de tratamiento respectivamente.

2.3.8.1. Diagnéstico del VIH por métodos serolégicos

Enzimoinmunoanélisis (EIA)

La deteccién de anticuerpos especi}401casfrente al VIH-1 es el primer paso que

debe realizarse para establecer si una persona esta infectada o no por este

retrovirus. El método mas usado es el Enzimoinmunoanalisis (EIA), su principio

se basa en la utilizacién de proteinas viricas, parcialmente puri}401cados,obtenidas

de Iisado de células (EIA de primera generacién), o por medio de proteinas

recombinantes o péptidos sintéticos (EIA de segunda y tercera generacién) y

pmebas de cuarta generacion basadas en la deteccion simultanea de

anticuerpos y complejos inmunes antigeno p24/ anticuerpo y tienen una alta

sensibilidad y especi}401cidad

superior al 95.5%.

035

Con |as pruebas de tercera y cuarta generacion el 50% de los infectados puede

detectarse en las tres primeras semanas de infeccién; Ia muestra que se utiliza

es suero, plasma, hisopado gingival, orina, secreciones. 035

Western Blot (WB)

Es Ia técnica mas ampliamente utilizada, basicamente consiste en la separacién

de proteinas (antigenos) por electroforesis y transferidas a un papel de

nitrocelulosa. Estas proteinas }401jadasson expuestas al suero del paciente, en el

cual |os anticuerpos especi}401casse unen a las proteinas presentes dando un

(24)

laboratorio.

035

La positividad en el WB para VIH-1 requiere la presencia de al menos 2 bandas

de la envoltura, Ia negatividad resulta de la ausencia de bandas y los restantes

patrones se consideran indeterrninados. Una de las Iimitaciones del

WB

es el

diferente valor predictivo diagnéstico que tiene cada una de las bandas. (OMS)

Las bandas del core p17 y p24 pueden ser fmto de reactividad inespeci}401ca,

detecténdose hasta en el 15-20% de los donantes de sangre no infectados. La

presencia de anticuerpos frente a las proteinas de la envoltura es mucho mas

especi}401ca,aunque también se han descrito falsos positivos. Sin embargo, la

sensibilidad del WB es mayor para detectar anticuerpos frente a proteinas del

core que de la envo|tura.

0309

Actualmente existen WB que incorporan, junto al Iisado viral, proteinas

recombinantes o péptidos sintéticos correspondientes a proteinas de la

envoltura, en un intento por salvaguardar la sensibilidad frente a estos antigenos_

que son los més especi}401cas.

lnmuno}402uorescenciaindirecta (IFI) .

Esta técnica se ha usado amp|iamente como prueba confirmatoria para la

in'fecci6n por el VIH- 1. Su desempe}401oes bueno pero requiere de personal

debidamente entrenado para su Iectura yde microscopic de }402uorescencia.2°

En esta técnica se utilizan linfocitos infectados por el VIH, }401jadoscon acetona,

sobre los que se deposita el suero problema. Cuando se a}401adea esta .

preparacién una lgG humana marcada con }402uoresceinase reconoce la reaccién

antigeno-anticuerpo.

Los estudios comparativos efectuados indican que esta prueba tiene una

sensibilidad y especi}401cidadsimilar al WB, aunque su interpretacién puede

mostrar una gran subjetividad y su realizacién es mas compleja.

2.3.8.2. Diagnéstico del VIH por métodos moleculares

Otra técnica muy utilizada actualmente en el diagnéstico del VIH es la reaccién

en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica permite la ampli}401caciénde

minimas cantidades de ADN

o

ARN.

Es

035

una técnica de gran utilidad

tanto

en

la

fase aguda como en la fase crénica de la infeccién. Estos métodos generalmente

se utilizan en el diagnéstico de ni}401osmenores de 18 meses, en algunos casos

de resultados indetenninados por otros métodos y, principalmente en el

seguimiento de la infeccién yterapia. 035

El ADN utilizado en esta técnica puede ser extraida a_ partir de sangre total con

(25)

anticoagulante 0 plasma; 'en'étgUnds estudios sé ha visto la utilizacién de sangre

impregnada en papel dando buenos resultados debido a que emplean peque}401as

cantidades de sangre y son estables a temperatura ambiente durante periodos

prolongados, no requieren cadena de frio parasu transporte y ademés conllevan

un

menor riesgo bio|6gico.2 030

Reaccién en cadena de la polimerasa (PCR)

Es una técnica altamente sensible y especi}401coque permite detectar peque}401as

cantidades de ADN. La reaccién en cadena de la polimerasa, es una técnica035

que permite la sintesis enzimético 034invitro de secuencias especi}401cas035 de ADN

por accién de una polimerasa. Esta técnica fue desarrollada por Mullis en 1985,

toma como modelo e| proceso natural de replicacién del ADN y consiste en la

ejecucién de varios ciclos consecutivos siguiendo para cada ciclo tres pasos,

cada una con distintas condiciones establecidas de temperatura y tiempo." El

producto que se obtiene at }401nalizarIa reaccién es una gran cantidad de un

fragmento génico con alto grado de pureza que favorece la tarea de los

investigadores empe}401adosen ampliar nuestros conocimientos sobre estructura y

funcién de los genes.

034

Tipos de reaccién en cadena de la polimerasa

- PCR Anidada o nested PCR. Es una técnica muy sensible en la que el

producto de una ampli}401caciénes utilizada como molde para una segunda

amplificacién con cebadores que se hallan dentro de la primera

secuencia amp|i}401cada.Esta035PCR tiene la ventaja de brindar alta

sensibilidad y especi}401cidad.Pero tiene la desventaja de que no permite

cuanti}401carla muestra.

- PCR in situ. Consiste en una reaccién de PCR en secciones histolégicas

o celular, donde |os productos generados pueden visualizarse en el sitio

de ampli}401cacién(preparaciones }401jasen un portaobjetos). Esta técnica

realiza una primera amplificacién de ADN blanco y luego Ia deteccién

mediante hibridacién in situ convencional con sondas de ADN/ARN

(detectan cantidades peque}401isimasde genoma) Es L'1ti| para ampli}401car

especi}401camentepoblaciones de secuencias de menor representacién 034.

0 PCR m}401ltiple.Esta técnica permite amplificar simulténeamente mas de

una secuencia, para ello se combina dos 0 mas pares de cebadores en

un mismo tubo de ampli}401caciénjunto con los demas reactivos para

(26)

utilizacién de esta técnica radica en la informacién sobre varios locus en

una sola reaccién, menor cantidad de ADN molde para el analisis. uso de

menor cantidad de reactivos. 034

- - PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). Es una variante de la PCR

en la que usamosARN como molde inicial en Iugar de ADN, emplea una

transcriptasa inversa (como Tth) para realizar Ia sintesis de un ADN

complementaria al ARN (ADNc).2" De esta forma el desarrollo de una

RT-PCR tendria como primer paso, la retrotranscripcién a partir de ARN,

seguido de la ampli}401caciéna partir de la primera hebra de ADNc y

}401nalmenteel desarrollo del PCR esténdar.

- PCR en tiempo real 0 PCR cuantitativo (qPCR). Es una ampli}401cacion

en la que los productos de la PCR se detectan de fonna directa durante

|os ciclos de amplificacién utilizando sondas marcadas con fluorescencia.

Permite cuanti}401carla cantidad de ADN o ARN presente en la muestra

original. Tiene varias ventajas sobre los métodos clésicos de la PCR

simple 0 anidada. Solo se utiliza un par de primers, aportando una

sensibilidad préxima o igual a la PCR anidada tradicional, pero con un

riesgo de contaminacién mucho mas bajo. 035 »

Extracciénypuri}401caciéndel ADN

La extraccién y purificacién de écidos nucleicos constituye la primera etapa de la

mayoria de los estudios de bio|ogia molecular; los métodos de extraccién nos

permiten obtener écidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para

después realizar anélisis especi}401coscomo la reaccion en cadena de la

polimerasa. La calidad y pureza de los acidos nucleicos son dos de los

elementos mas importantes en ese tipo de anélisis, para obtener acidos

nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es

preciso aplicar métodos de extraccion adecuados tomando en cuenta algunos

criterios.

034

'

-

Acido nucleico diana

o Organismo fuente

- Material inicial (sangre, plasma, hisopado, etc.)

- Uso posterior (PCR, clonacién, RT-PCR, etc.)

Para extraer los écidos nucleicos del material biolégico es preciso provocar una

Iisis celular, inactivar |as nucleasas celularesyseparar el écido nucleico del resto

de las células. El procedimiento de Iisis debe tener un equilibrio entre ser Io

(27)

su}401cientementefuerte como para lisar laycelulaay a la vez ser su}401cientemente

suave para preservar el écido nucleico.

035

Uno de los métodos de extraccion amp|iamente utllizada, es el fenol-cloroformo;

que en la actualidad ha sido desplazada por diversos métodos de extraccién

comercial patentado.

Extraccién delADN por el método Fenol ICloroforrnoIAlcohol isoamilico

Este método comprende tres etapas principales:

- Lisis de la membrana celular. Esta etapa comprende la rotura de la

membrana celular y nuclear utilizando el tampén de extraccién que

contiene tris HCI, EDTA y SDS (tratamiento qulmico) y proteina K

(digestion enzimética). Todas las membranas biolégicas presentan la

misma estructura general integrada por moléculas de Iipidos y proteinas

unidas por interaccion no covalenle, a este nivel act}402anla proteinasa K y

el detergenle sos rompiendo Ia membrana

034.

El SDS del tampon de

extraccién captura los Iipidos que conforman Ia membrana. El EDTA, es

un componente quelante que se une al magnesio, un cofactor de la

desoxirribonucleasa; al unirse el magnesio al EDTA, la accion de la

desoxirribonucleasa disminuye. El lris HCI confiere a la solucién la

capacidad amorliguadora del pH.

0 Extraccién. La combinacién de fenol, cloroformo y alcohol isoamilico se

utiliza con el objetivo de desnaturalizar y eliminar |as proteinas, ademés

el cloroformo facilita la separacién de las fases acuosa y orgénica, si el

pH de la solucién acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 024

030 8,0), los écldos nucleicos tenderan a repartirse en la fase organica. La

= adicién de la mezcla cloroformo y alcohol isoamilico se realiza para

eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa y ademas para

eliminar |os residuos de fenol que pueden inhibir Ia PCR.

- Precilpitacion. Para concentrar el ADN suele realizarse Ia precipitaclén

utilizando alcohol absoluto y acetato de sodio, en estas condiciones el

detergente que es mas soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse,

' mientras que los écidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con

alcohol al 70% permite una mayor puri}401caciéno elucién de los écidos

(28)

Etapas de la reaccién encadena de la polimerasa

El proceso de PCR por lo general consiste

en

una serie de 20 a 35 cambios

repetidos de temperatura denominados ciclos, cada ciclo suele consistir de

2

a

3

pasos a diferentes temperatures.

034

La temperatura y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de la enzima,

concentracién de iones divalente. dNTPS, temperatura de unién de cebadores y

Iongitud de ADN que se desea ampli}401car.

035

Desnaturalizacién inicial: El tubo con la mezcla de reaccién de PCR es

sometido a altas temperaturas de 90 a 95°C durante un tiempo a }401nde

desnaturalizar todo el ADN e inactivar proteasas y DNasas.

- Desnaturalizacién. La doble cadena del DNA se desnaturaliza

separéndose en una sola hebra, esto se consigue aplicando

temperatures de 90 a 95°C que produce la ruptura de los puentes de

hidrégeno intercatenarios y por lo tanto la separacién de ambas cadenas

para que los oligonucleétidos iniciadores puedan unirse a sus secuencias

del DNA complementario. Si el DNA se desnaturaliza parcialmente este .

tender:-'1 a renaturalizarce répidamente, evitando asi una e}401ciente

hibridacién de los primers y una posterior extensién

0 Hibridacién. Llamada también fase de annealing, una vez que el DNA

esta desnaturalizado se disminuye hasta Ia temperatura comprendido

entre los 40 y60°C para que se pueda producir la unién de los primers a

las secuencias flanqueantes del fragmento que se quiera ampli}401car.

- Extensién o polimerizacién. En esta etapa la temperatura se eleva,

para una éptima actividad enzimética de la Taq polimerasa que reconoce

un segmento del DNA bicatenario Iibre. La taq polimerasa sintetiza

exclusivamente en la direccién 5 030a 3 030,por lo que los nucleétidos Iibres

solo son a}401adidosen el extremo 3 030delos primers que han hibridado con

el DNA diana en el paso anterior y comienza la sintesis de la cadena

complementaria. El tiempo de extensién depende del tama}401odel

fragmento que sedesea amplificar.

0 Extensién }401nal.Después del Llltimo ciclo de PCR se da Iugar a esta

etapa }401nal,que permite que los productos de amplificacién parciales

tenninen

de completarse.

034

_

(29)

.-: 030r'_v \ ":~:/.. I-"=2.

Figura

5. Etapas de

la

reaccién en cadena de la polimerasa (PCR)

5' V. V031 -j 024?:- 024_024-024024030j

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3- + 2 030

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* 030

. 1 .

Arnpnflcacldn exponencial del producto

Esqucrna gcncrzl dc la PCR.

Fuente: Rodriguez 034

Componentes de la reaccién en cadena de la polimerasa

Como Ia }401nalidaddel PCR es obtener muchas copias de ADN, se requiere un

ADN molde, primers y otros componentes para Ilevara cabo Ia reaccién:

o Muestra de ADN (écido desoxiribonucleico): La muestra biolégica

usada puede ser obtenida a partir de sangre, suero, orina y de otros

fluidos biolégicos. Es importante que el ADN esté Iibre de impurezas a }401n

de que la sensibilidad del ensayo no se vea disminuida. 034

o lniciadores 0 Primers. Son oligonucleétidos peque}401os(15 a 20

nucleétidos) de cadena simple que se dise}401ande tal manera que sean

complementarios a ios extremos 5' de las hebras del segmento de ADN

que se desea amplificar. La especi}401cidaddel PCR depende del dise}401o

de los iniciadores."

0 Taq polimerasa. Son enzimas que sintetizan ADN a partir de un

oligonucleétido iniciador y una hebra de ADN molde. son enzimas

(30)

cuales la hibridacién de los iniciadores al ADN a ampli}401carocurre con alta

rigurosidad. La primera enzima termoestable que fue utilizada para

propésitos de ampli}401caciénfue aislada del Thermus aquaticus que es

denominada Taq DNA polimerasa. La actividad de esta enzima, asi como

la }401delidadde la misma depende de la concentracién de iones Mg Iibre035

de los desoxiribonucleétidosydel pH del bufferde reaccién.

- lén Magnesio. Es importante porque afecta Ia union entre los

oligonucleétidos iniciadores y el molde de ADN. Es necesario, ademés

considerar que los nucleétidos secuestran iones Mg del medio, por lo035

que la concentracién milimolar de este ion debe ser superior a la

concentracién de los nucleétidos. Act}402acomo cofactor de la Taq

polimerasa yen la temperatura de hibridacién.

0 Desoxiribonucleétidos trifosfatos (dNTPs). La concentracién de cada

uno de ellosen la mezcla de reaccién debe ser equimolar para minimizar

|os errores de una falsa incorporacién de nucleotides. Para el PCR debe

estar en el rango de 20 024200 pM a fin de tener especificidad yfidelidad

optima a altas velocidades de incorporacién.

0 Buffer de reaccién. Los componentes del buffer de reaccién incluyen

Tris 024HCI, gelatina o alb}401minasérica bovina (100pg/mL) y detergentes

no iénicos como el Tween 20. Estos componentes pueden ser utilizados

a fin deestabilizar Ia actividad de la Taq ADN polimerasa.

- Agua. Unfactor muy importante en el PCRes la calidad de agua a utilizar

en la reaccién. se sugierede alta pureza, tridestilada, desionizada,Iibre

de

DNA contaminante o DNasasZ5.

Electroforesis .

La electroforesis es un método en el que se utiliza una corriente eléctrica

controlada con la finalidad de separar biomoléculas segL'm su tama}401oy carga

eléctrica a través de un soporte, que en este caso puede ser Ia agarosa. un

polisacérido cuyas diluciones se trabajan de 0,5 a 2%; tienen la propiedad de

permanecer Iiquidas por encima de los 50°C aproximadamente y, formar un gel

semisélido al enfriarse. 035Este gel esté constituida por una matriz tridimensional

de }401braspoliméricas, embebidas en gran cantidad de medio liquido, que retarda

el paso de las moléculas de écido nucleico en mayor medida cuanto més

grandes sean estas.25Para determinar Ia concentracién del DNA se utiliza como

patron un marcadorde peso molecular, el cualse corre paralelo al DNA muestra.

(31)

Existen factores que in}402uyenen la migracién electroforética de a'cidos nucleicos

en geles deagarosa:

o Tama}401odelporo.

- Electroendosmosis. V

- Losécidos nucleicos (fonnasytama}401o).

- Buffer de electroforesis.

o Buffer de la muestra de écido nucleicos.

o Intensidad de corriente.

Corrida electroforética: Puesto que la carga eléctrica de un écido nucleico es

proporcional a su Iongitud en nucleétidos, la electroforesis separa |os fragmentos

de écido nucleico seg}402nsu tama}401oo Iongitud, expresado en nucleétidos (si son

de hebra sencilla) 0 en paresde bases (si son de doble hebra, caso com}402ndel

DNA).

031°

Visualizacién de los productos de ampli}401cacién

030 La deteccién de los productos de ampli}401caciénse realiza directamente por la

observacién de las bandas fluorescentes de ADN sobre un gel de agarosa

después de la tincién con bromuro de etidio (se intercala entre las bases y

presenta }402uorescenciacuando inciden radiaciones ultravioleta), en un

transiluminador de luz ultravioleta; yla evaluacién de la Iongitud de la banda de

ADN por comparacién con un marcador de peso molecular con}401rmala presencia

de ADN

diana

de

la

muestra.

034

Ventajas del uso de la reaccién en cadena de la polimerasa (PCR)

La utilizacién de esta nueva tecnologia proporciona ventajas entre las que

destacan:

- Ampli}401casolamente el fragmento de ADN de interés, requiere de una

sola molécula de ADN para generar millones de copias (altamente

sensible) y es selectivo en presencia de grandes cantidades de ADN

(altamente especifico)

0 El estado de conservacién de la muestra es hasta cierto grado '

indiferente, siempre que se conserve Ia secuencia diana.

Aplicaciones de la reaccién encadena de la polimerasa(PCR)

La PCR se aplicé inicialmente como una técnica en laboratories de investigacién,

debido a su robustez y rapidez; pero su gran especi}401cidady sensibilidad ha

permitido el desarrollo de técnicas de diagnéstico para determinadas

(32)

medicina c|inica. 031°Asi, se ha convenido en una herramienta fundamental en

campos tan diversos como la investigacién (clonacién de genes, deteccién de

clones recombinantes, estudio de ADN de fésiles), paleontologia, antropologia,

medicina forense y criminalistica (estudios }401logenéticoso etnogré}401cos,filiacién,

identi}401caciénde individuos y de sospechosos, asi como en el anélisis de la

evidencia en casos de asesinato, violacién, etc.), sanidad animal y mejora

genética (deteccién de enfennedades genéticas e infecciosas, pureza de razas,

etc.) y medicina (diagnéstico de enfermedades ). Dentro de la microbiologia e

infectologia, se ha utilizado para identi}401carel DNA de parésitos, virus y

bacterias, incluyendo estudios de resistencia a antibiéticos. 035

Sensibilidad y especi}401cidad

I En 1947, Yerushalmy introduce |os térrninos desensibilidad y especi}401cidadcomo

indicadores estadisticos que eval}402anel gradodee}401caciainherente a una prueba

diagnéstica.

2 034

034

Figura 6. Capacidad predictivade una prueba diagnéstica

prueba

1

WP)

(PP)

E

Fuente: Molinero 035

Sensibilidad .

La sensibilidad en epidemiologia es la probabilidad declasi}401carcorrectamentea

un individub enfermo, esdecir, Ia probabilidad de que para un sujeto enfermo se

obtenga en una prueba diagnéstica un resultado positivo. Que es lo mismo que

decir, Io contrario, Ia probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un

resultado negativo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad de la prueba

complementaria para detectar la enfermedad.

Sensibilidad = S =L VP + FN

(33)

Especi}401cidad ' -' 030' 031 " ' 030030"

La especi}401cidadindica la capacidad que tiene Ia prueba de identi}401carcomo

sanos (no enfermos) a los que efectivamente lo son, es decir, Ia especi}401cidades

la probabilidad de que la prueba identi}401quecomo rro enfermo a aquél que

efectivamente no lo esté.

VN

Espet:ificida.d = E = j .

I/N+FP

2.4. Marco legal

Aspectos éticos y legales

Toda investigacién que involucra Ia participacién de seres humanos se realiza

dentro de tres principios éticos: respeto por las personas, bene}401cenciay justicia;

estos principioé se encargan de velar la preparacién responsable de protocolos

de investigacién

035.

2.4.1. Participacién de voluntarios

La parlicipacién de seres humanos sera' para la obtencién de sangre total,

quienes deberén ser voluntarios mayores de 18 a}401osprevio conocimiento yfirma

de consentimiento informado |as mismas que sera'n utilizadas como muestras

negativas en la evaluacién de la técnicaen estudio.

2.4.2. consecuencias de la participacién en el estudio

Con respecto a la bene}401cencia,la validacién de esta técnica de diagnéstico

cumple con el propésito de contar con una técnica que desplace |as di}401cultades

en cuanto a la extraccién, transporte y conservacién de las muestras, debido a

que no requiere cadena de frio para el transporte oconservacién. Ademés de ser

aplicado en el diagnéstico confirmatorio para ni}401ospeque}401os.en quienes es

traumética Ia extraccién por puncién venosa."

2.4.3. Con}401dencialidadde la informacién

La informacién sobre datos del paciente, resultados, factores de riesgo, datos

epidemiolégicos y otros se almacenar:-in en una base del laboratorio protegidas

con clave de acceso y solo estaré disponible para los investigadores y el comité

de ética en el caso que lo solicitara. No se publicaré ninguna infonnacién que

pudiera identi}401caral paciente del cual proviene la muestra de sangre, sera

Referencias

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