UNIVERSIDAD NACIONAL
DE
SAN CRISTOBAL
DE HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA DE FORMACION PROFESIONAL DE B|OLOGiA
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030
Valor diagnéstico de Iaprueba PCR-ADN para VIH-1
a partir de muestras de sangre'totaI impregnadas
en papel de filtro. Lima, 2013
TESIS PARA OBTENER EL
TiTULO
PROFESIONAL DE
BIOLOGA CON MENCION EN LA ESPECIALIDAD DE
MlCROBlOLOGiA
PRESENTADO POR:
Bach. cuss GUTIERREZ, Carmen Nilda
-Tesis
154:2
Cub
Ea-1
ACTA DEsusTEuTAcION QE TESIS
R.D.N° 246 0242014 024UNSCH 024F.C.B 024D
Bach. Carmen Nilda Cuse Gutiérrez
En la ciudad de Ayacucho, siendo Ias cuatro de la tarde con diez minutos, del dia '
veintidés de diciembre del a}401odos mil catorce, en el auditorio de la Facultad de
Ciencias Biolégicas de Ia Universidad Nacional de San Cristébal de Huamanga,
reunidos los profesores Dr. Homero Ango Aguilar como miembro y presidente
encargado mediante memorando N ° 754 0242014 UNSCH 024FCB, e integrado por los
profesores Blgo. Tomas Yuret Miranda Tomasevich, Mg. Aurelio Carrasco Venegas
y Mg. Gilmar Pe}401aRojas, y como secretario docente Blgo. Elbert Hermoza Valdivia,
con la }401nalidadde recepcionar en acto p}402blico,la exposicién de la tesis 034Valor
diagnéstico de la prueba PCR-ADN para V|H 0241a partirrte muestras de sangre total
impregnadas en papel de filtro. Lima 2013, presentado por la bachiller en Ciencias
Biolégicas Carmen Nilda Cuse Gutiérrez, con la que pretende optar el titulo
profesional de Bibloga con mencién en la especialidad de Microbiologia.
Inicialmente se da a conocer, mediante su lectura. el memorando N° 754 - 2014 024
UNSCH 024FCB, de encargo de la presidencia del acto, al Dr. Homero Ango Aguilar,
asi como la documentacién presentada para la sustentatoriay estando en orden el
Sr. presidente encargado autoriza a la sustentante para que pueda dar inicio con su
exposicién, lo que es realizado inmediatamente con el agradecimiento a la
universidad, facultad, familiares, docentesy compa}401erosde estudios; Ia exposicién
debe tener una duracién méxima de cuarentaycinco minutos.
Transcurrida Ia sustentacién y concluida esta por pane de la sustentante, el Sr.
presidente encargado pide a los miembros del jurado evaluador para que puedan
realizar las preguntas y aclaraciones que crean necesarias, a las mismas que la
Srta sustentante da respuesta en forma satisfactoria.030
Una vez concluida con esta seccién de preguntas, el Sr. presidente invita a la
sustentante y p}401blicoasistente puedan hacer abandono del auditorio en forma
momenténea con la }401nalidadde realizar la cali}401cacién,previa una discusién de la
Miembro jurado evaluador Exposicldn Rsptaapreguntas Promedio
Dr. Homero Ango Aguilar 17 17 17
Blgo. Tomés Yuret Miranda Tomasevich 18 18 18
Mg. Aurelio Carrasoo Venegas 18 18 18
Mg. Gilmar Pe}401aRojas 19 17 18
Promedio 18
Concluida la calificacién Ia Sna. sustentante obtuvo Ia nota promedio de dieciocho
(18) que es Aprobatorio, e inmediatamente se invitaa la sustentante pueda ingresar
al auditorio al igual que el publico asistente, con la }401nalidadde dar a conocer el
resultado p}401blicamente,e imponerla medalla respectiva. como también efectuar el
juramentode Ley.
Concluye, e1acto de sustentacién conla}401rmade los jurados al pie del presente acta
de sustentacién en fe de conformidad, siendo |as seis de la tarde con cuarenta
minutos. /
'
/
/
,
1
) I 030/
Hom oAngo Aguilar Blgo Mira da Tomasevich I
Miembro 024Presidente Miembro
Mg.relio %rras§§ne;as Mg. G 031ErPe}401aRojas
Asesor Miembro
Blgoilbert Hermoza Valdivia
A mis padres:TeodosioyCarmen
A mis hennanos: Miguel Angel yKarina
AGRADECIMIENTO
A mi Alma Mater, la Universidad Nacional de San Cristébal de Huamanga, por
forjarme académicamente creando en mi, espiritu de superacién.
Ala Facultad de Ciencias Biolégicas por cobijarrne en sus claustros.
A la escuela de fonnacién profesional de Biologia y su plana docente por sus
sabias ense}401anzas.valores y principios inculcados durante mi fonnacién
profesional.
AI Instituto Nacional de Salud (INS) por brindarnos apoyo para desarrollar mi
proyecto de tesis.
A mis padres, por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, tanto académica,
como de la vida, por su incondicional apoyo y cari}401omantenido a través del
tiempo. Mis hermanos, por estar siempre conmigo y danne su apoyo en cada
momento de mi vida.
Al asesor externo Dra. Soledad Romero Ruiz, del Laboratorio de VTS-VIH/SIDA
del INS por su asesoramiento en el desarrollo del presente trabajo de
investigacién. Al personal del laboratorio VTS-VIH/SIDA, que colaboré en el
presente trabajo, en especial a Fany.y Susan.
Al asesor interno Mg. Aurelio Carrasco Venegas, por sus observaciones en la
elaboracién y desarrollo del presente estudio.
A todas las personas que colaboraron de alguna manera para desarrollar el
presente estudio.
INDICE GENERAL
Pégina
DEDICATORIA iii
AGRADECIMIENTO v
INDICE GENERAL vii
INDICE DE TABLAS ix
INDICE DE FIGURAS xi
INDICE DE ANEXO - xiii
RESUMEN xv
I.
INTRODUCCION
XVI
II. MARCO TEORICO 3
2.1. Antecedentes 3
2.2. Marco conceptual 4
2.3. Marco teérico 7
2.3.1.Virus de Inmunode}401cienciaHumana (VIH) 7
2.3.2. Etiologia del VIH
7
'
2.3.3.Estruc1ura y genoma 7
2.3.4.CicIo de replicacién 9
2.3.5.Variabi|idad genética 10
2.3.6.Historia natural de la infeccién 11
2.3.7.Mecanismos de transmisién 12
2.4. Marco legal 23
III. MATERIALES Y METODOS 25
, 3.1. Ubicacién de lazona de estudio 25
3.2. Poblacién 25
3.3. Muestra 25
3.4. Sistema de muestreo 26
3.5. Metodologia 26
IV. RESULTADOS 33
V. DISCUSION V 37
VI.
CONCLUSIONES
41
VII. RECOMENDACIONES 43
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 45
ANEXOS 47
iNDlCE DE TABLAS
Tabla 1. Concentracién de componentes utilizados en PCR 29
Tabla 2. Condiciones de ciclamiento enel termociclador 29
Tabla.3. Concentracién de componentes utilizados en la segunda
ronda del PCR 30
Tabla.4. Condiciones de ciclamiento en el termociclador (segunda
ronda) 30
Tabla.5. Sensibilidad de la reaccién en cadena de la polimerasa
(PCR) - 33
Tab|a.6. Especi}401cidadde la reaccién en cadena de la polimerasa
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura del Virus de lnmunode}401cienciaHumana 8
Figura 2. Estructura genémica del VIH 9
Figura 3. Replicacién del Virus de lnmunode}401cienciaHumana 10
Figura 4. Curso clinico de la infeccién natural por el VIH-1 12
Figura 5 Etapas de la reaccién en cadena de la polimerasa (PCR) 19
Figura 6. Capacidad predictivade una prueba diagnéstica 22
Figura 7. Sensibilidad de la reaccién en cadena de la polimerasa
(PCR) a partir de muestras de sangre en papel de }401ltro 34
Figura 8. Especi}401cidadde la reaccién en cadena de la polimerasa
(PCR) a partir de muestras de sangre en papel de filtro 36
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Ampli}401caciénde la segunda ronda de PCR 49
Anexo 2. Consentimiento informado 50
Anexo 3. Preparacién de reactivos 55
Anexo 4. Fotogra}401ade materiales empleados para la extraccién de
ADN 56
Anexo 5. Flujograma de procesamiento de muestras 57
Anexo6. Flujograma de extraccién de ADN 58
030 RESUMEN
La infeccién por el VIH es un problema de salud publica distribuida
mundialmente; en la actualidad se conocen dos tipos vlrales: el VIH-1 con
distribucion universal y el VIH-2 concentrado en Africa Occidental. En nuestro
pais se ha descrito la circulacion del VIH-1. La serologla es la forma mas sencilla
para el diagnéstico de la infeccién por el VIH, detecta anticuerpos contra el virus.
Sin embargo presentan inconvenientes a la hora de hacer un diagnéstico
temprano de la infeccion por el VIH. La reaccién en cadena de la polimerasa
(PCR) ha mostrado buenos resultados tanto en la fase aguda como en la fase
crénica de la infeccién por el VIH-1; existen diversas pruebas de PCR
desarrollados para la deteccién del virus de la lnmunode}401cienciahumana (VIH),
siendo el mas indicado el PCR-ADN proviral que permite detectar al VIH en la
fase inicial de la infeccién, donde la prueba serologica no es util (recién nacido
de madres infectadas con VIH o con antecedentes de riesgo de infeccién durante
el embarazo y personas con periodos de ventana mas Iargos de lo habitual). Por
tanto el presente estudio tuvo como objetivo determinar el valor diagnéstico de la
prueba PCR-ADN proviral para el diagnéstico del VIH-1, evidenciada por la
sensibilidad y la especi}401cidadde un ensayo de PCR anidada utilizando muestras
de sangre impregnadas en papel de }401ltroFTA, La investigacién aplicada fue
bésico descriptivo. El estudio se desarrollo en el lnstituto Nacional de Salud
(INS), laboratorio de VTS-VIH/SIDA gracias al convenio entre la Universidad
Nacional de San Cristobal de Huamanga con la mencionada institucién. Se
trabajo con muestras de sangre positivas a VlH recepcionadas en el INS en el
periodo de febrero a marzo del 2014, y muestras negativas colectadas de
personal voluntario previa }401nnadel consentimiento informado. El papel de }401ltro
FTAtiene una matriz con una formulacion patentada, que lisa |as células de las
manchas de sangre seca (DBS) en papel de }401ltroy conserva el ADN; facilitando
la coleccién, transporte y almacenamiento de las muestras de sangre, ademas
requiere peque}401acantidad de muestra, disminuye riesgos de oontaminacién y
desarrolla un principio de extraccién de ADN répido y sencillo. Se ampli}401céla
regién Pol del VIH-1 obteniendo una sensibilidad del 95% y especi}401cidadde
100% Por tanto la PCR-ADN proviral es un método sensible y especifico
adema 031sde ser répido y sencillo para el diagnéstico temprano del VIH-1.
Palabras claves: VlH, valor diagnostico, sensibilidad y especi}401cidad
I.
INTRODUCCION
En la actualidad |os métodos de tamizaje y con}401rmaciénde la infeccién por el
VIH se basan en la deteccién de anticuerpos circulantes através de los métodos
serolégicos como Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), Western Blot
(WB), lnmuno}402uorescenciaindirecta (IFI), entre otras. Las desventajas de estos
métodos radican en que no con}401erenun resultado oportuno debido al tiempo que
lleva Ia seroconversién (10 - 14 diasy aveces hasta 6 meses), ademés que ésta
varia de persona a persona. 030A pesar de su alta sensibilidad (99%), féciles y
répidos de manejar son poco especi}401cos.La inmuno}402uorescenciase utiliza
como prueba con}401rmatoriadel diagnéstico serolégico de VIH, es una técnica
~ simple de fécil ejecucién, con el inconveniente de que necesita un microscopic
de epi}402uorescenciayde un personal altamente capacitado y con experiencia en
las lecturas de las léminas.2
La PCR ha mostrado buenos resultados, tanto en la fase aguda como en la fase
crénica de _la infeccién, es altamente sensible, detecta minimas cantidades de
ADN y es altamente especi}401caque detecta secuencias especi}401casde ADN. 031
En la actualidad contamos con técnicas de PCR-ADN que utilizan sangre entera;
colectadas de 1 a 4 ml, en contraste, la PCR-ADN con DBS en papel de }401ltro
omite la necesidad de separar |as células mononucleares y la necesidad de
centrifugacién. l
Se ha desarrollado un método sencillo en base a un protocolo modi}401cado,
empleado por lngrid Beck que utiliza muestras de sangre sobre papel de }401ltro030
(tarjetas FTA) y un buffer de Iavado (kit comercial). La tarjeta tiene una matriz
impregnada con una férmula patentada que destruye Ias células y mantiene Ia
integridad del ADN. Ademés requieren peque}401acantidad de muestra, no
conllevan un menor riesgo biolégico, no necesitan refrigeracién y son féciles de
transportar. '
La PCR-ADN con DBS en papel de }401ltroconstituye una buena alternativa para
el diagnéstico oponuno del VIH-1 por ser altamente sensible y especi}401caen
caso de ni}401osde madres seropositivas. personas con situacién de riesgo,
gestantes, entre otros.
PorIo cual para el presente trabajo de investigacién se plantelaron |os siguientes
objetivos:
Objetivo general:
- Determinar el valor diagnéstico de la técnica PCR-ADN con muestras de
sangre total impregnadas en papel de }401ltropara la deteccién de la
7 infeccién por el virus de la inmunode}401cienciahumana (VIH-1)
Objetivos especi}401cas:
- Determinar Ia sensibilidad de la reaccién en cadena de la polimerasa
(PCR-ADN) con muestras de sangre total impregnadas en papel de }401ltro.I
o Determinar la especi}401cidadde la reaccién en cadena de la polimerasa
(PCR-ADN) con muestras de sangretotal impregnadas en papel de}401ltro.
ll. MARCO TEORICO
2.1. Antecedentes
El diagnéstico precozdela infeccién por el VIH-1 enlos ni}401osno se puede lograr
con las pruebas de anticuerpos convencionales, debido a la persistencia de los .
anticuerpos maternos transferidds pasivamente que persisten por hasta 18
meses después del nacimiento. 030Se deben realizar métodos directos que
detecten al virus 0 alguno de sus componentes. La deteccién del ADN por PCR
es un método establecido para determinar el estado de la infeccién en ni}401os
nacidos de madres seropositivas y, combinado con muestras de sangre seca
(DBS) en papel de }401ltroprovee una metodologia sencilla para el diagnéstico del
VIH-1 en los ni}401osyalgunos casos especiales '
Se desarrollé un ensayo de PCR 034inhouse" de una sola ronda dirigido a la regién
pol, utilizaron como muestra DBS en papel de }401ltro.Para Ia validacién utilizaron
esténdares celulares conocidos en ndmero de copias, para Iuego ser aplicado a
un grupo de ni}401oscon estado de infecciénconocido. Finalmente comparé con
los resultados de un laboratorio de referencia utilizando un método
automatizado. Encontrando un 92.8% y 98.3% de sensibilidad y especi}401cidad
respectivamente para el método "in house 035comparable con el método
automatizado.5
031 En otro estudio se evalué un ensayo con la tecnologia Amplicor PCR-DNA con
muestras de DBS y sangre total de ni}401osen Tailandia. Los resultados obtenidos
fueron de 96% a 100% de sensibilidad y 100% de especi}401cidad.Por tanto
concluyeron que DBS se puede utilizar con precisién en Iugardesangre totals.
Se evalué Ia validez diagnéstica de la PCR-ADN por Amplicor de Roche (versién
1.5) en ADN extraido de puncién de talén infantil impregnados en papel de filtro
(S&S) Encontrando un 98.68% de sensibilidad y una especi}401cidadde! 100%
Para la deteccién del VIH por nested PCR, utilizaron muestras de sangre en
papel
de filtro de ni}401os
nacidos de
madres
seropositivas. Se analizaron 109
muestras de ni}401osen los que se desconocia su estado de infeccién de loscuales 26 (23.8%) resultaron positivos y 83 (76.2%) negativos por PCR. Este
método constituye un ensayo simple para la deteccién del VIH en muestras de
sangre coleciadas en papel }401ltroreduciendo Iargos pasos de extraccién y
031 puri}401caciéndel ADN yfacilita el transporte ymanejo de las muestras. 035
Se desarrollo una prueba de nested PCR-ADN con muestras de sangre en papel
de }401ltropara evaluar Ia sensibilidad y especi}401cidad.Las muestras fueron
tomadas en dos paises (Washington y Per}401).Amplificando Ia region pol,
obteniendo una sensibilidad y especi}401cidadde 98.4% y 98.3% respectivamente,
dos de esas muestras perlenecian a otros subtipos (A y C), y en el caso de
muestras de Pen 031:(madres e hijos seropositivos por ELISA) el ensayo tuvo una
sensibilidad de 99% y una especi}401cidaddel 100%. Asimismo realizaron el Iimite
de deteccion utilizando Ia Iinea celular 8E5 obteniendo de 5 a 10 copias/5 pl de
sangre. Concluyendo que la PCR con muestras de sangre en papel de }401ltroes
un método practice, econémico, sensible y especi}401copara el diagnéstico del
VIH-1. 030
030
Un trabajo realizado en Cuba, con el }401nde determinar Ia utilidad de papel }401ltro
con muestras de sangre seca en la deteccion de ADN proviral, se incluyeron 50
muestras donde se incluyeron ni}401osnacidos de madres seropositivas y 60
muestras procedentes de donantes voluntarios de sangre. La muestras fueron
tomadas en papel de }401ltroN°903 (scnlecher& Schuell) Ia extraccion porelusion
y la ampli}401caciéna partir del gen gag. El 92% de los seropositivos analizadas
030 resultaron positivos por PCR, no se encontré positividad en los seronegativos; el
procedimiento empleado resulto L'1ti| en el diagnéstico de VIH-1 a partir de
muestras de sangre en
papel
}401|tro.°
2.2. Marcoconceptual
- ADN. Acido Desoxirribonucleico. Es una compleja cadena de polimeros I
unidos por puentes de hidrégeno, estructuralmente esta formado por
nucleétidos En casi todos los organismos celulares el ADN esté
organizado en forma de cromosomas, situados en el nucleo de la célula.
Material genético de todos los organismos vivos encargado de la '
replicacién, el ADN se copia e si mismo cada vez que una célula se
reproduce ytransrf1'it 031ela 034a'034'descendénla infomiacién que contiene. De030cia
acuerdo a la complejidad que presenta un organismo vivo, el ADN podré
ser mas o menos complejo. En este sentido el ADN de los individuos
resulla ser mas complejo que el que presenta una bacteria?
0 Ampli}401cacién.Es el aumento en el n}402merode copias de un fragmento
de ADN particular, para ello es necesario conocer al menos parcialmente
la secuencia del fragmento a ampli}401car.Bésicamenle se trata de replicar
una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello se realiza un
experimenta in vitro tal como lo hacen las células in vivo para replicar su
ADN. 030
0 Dicotémica. Una medida nominal referida a pruebas diagnésticas que
tiene sélo dos resultados (ejemplos son el género: masculino o
femenino: la supervivencia: si 0 no); Ilamada también binaria. 035
- Desnaturalizacién. Cambio estructura! de las proteinas o a 031cidos
nucleicos donde pierden su estructura nativa, por lo general irreversible,
de esta forma pierden su éptimo funcionamiento y a veces también
cambian sus propiedades fisico-quimicas. El ADN se desnaturaliza por
altas temperaturas produciendo una separacién de la doble hélice, que
ocurre por la ruptura de los puentes de hidrégeno. En el caso de
proteinas debido a: precipitacién, hidrélisis de enlaces peptidicos, efecto
de écidos diluidos, élcalis diluidos, calentamientoo irradiacién.
0 Diagnéstico. Ana'lisis que se realiza para determinar cualquier siluacién
y sus tendencias. Esta detenninacién se realiza en base a datosyhechos
recogidos y ordenados sistematicamente que permiten juzgar mejor qtle
es lo que esta 031pasando. Conjunto de signos que sirven para fijar el
cara
031cter
peculiar de una enfennedad.
035
- E. D. T. A. Acido etilendiaminotetraacético, es una sal que tiene efecto
quelante, act}402asobre el calcio, al }401jarloimpide su activacién y por ende,
la coagulacién sanguinea.
o Electroforesis. Migracién de paniculas cargadas eléclricamente (iones),
dispersos en un medio liquido, por la accién de un campo eléctrico lo
mas homogéneo posible. La velocidad de desplazamiento es por tanto
proporcional a la intensidad de campo y a la carga iénica e
inversamenle proporcional al radio de la particula y a la viscosidad del
0 Enfermedad. Alteracién del estado de salud del cuerpo animal.
- Especi}401cidad.La especi}401cidadnos indica Ia capacidad de nuestro
estimador para dar como casos negatives |os casos realmente sanos;
proporcién de sanos correctamente identi}401cados.Es decir, la
especi}401cidades la capacidad de la prueba para detectar Ia ausencia de la
enfermedad en sujetos sanos.
030
0 Hibridacién. Es Ia unién complementaria de acidos nucleicos (ADN 0
ARN) Técnica de biologia molecular que se utiliza para detectar una
molécula diana par}401endode una sonda complementaria a ella. En Ias
técnicas de hibridacién se pane de dos poblaciones de acidos nucleicos:
un conjunto homogéneo de acidos nucleicos de secuencia conocida que
act}402acomo sonda y otro conjunto heterogéneo de écidos nucléicos de '
secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. 030
- lnfeccién. Es un término clinico que indica la contaminacién,
desencadena una respuesta inmunolégica y da}401oestructural del
hospedero, causada por microorganismos patégenos, es decir, existe
invasién con lesién tisular por esos mismos génnenes (hongos, bacterias,
protozoos, virus, etc.), sus productos
o ambos
a la vez.
034
- ADN Polimerasa. Enzima que tiene la capacidad de sintetizar ADN a
partir de un oligonucleétido iniciador y una hebra de ADN molde. Es .
imponante por su caracteristica de ser una enzima termoestable y
termoactiva, soportan altas temperaturas requeridas para la
'des_naturalizacién del ADN. La primera enzima termoestable fue Ia
aislada de la bacteria Thennus aquaticus denominada comanmente Taq
ADN polimerasa.
035
- PCR. Reaccién en cadena de la polimerasa, mas conocida como PCR
por las siglas derivadas del inglés (Polymerase Chain Reaction) es una
técnica in vitro de secuencias especi}401casde acidos nucleicos de
ampli}401caciénenzimética exponencial. La reaccién ocurre en un equipo
denominado termociclador que permite cambiar diferentes temperatures
para que se lleve a cabo el proceso. 030
0 Sensibilidad. La sensibilidad nos indica, la capacidad de nuestro
estimador para dar como casos positivos los casos realmente enfermos;
proporcién de enfermos correctamente identi}401cados.Es decir, la
sensibilidad es la capacidad}402ela pruebanpara detectar la enfermedad en
sujetos enfermos. 030
2.3. Marco teérico
2.3.1. Virus de lnmunode}401cienciahumana(VIH)
El VIH fue descubierto por primera vez en 1983, numerosos trabajos ha
demostrado su relacién con el Sindrome de lnmunode}401cienciaadquirida (SIDA);
se caracteriza por diversas manifestaciones clinicas, entre ellas el da}401oal
sistema inmune manifesténdose mediante la destruccién de células CD4
0
_
células T y a largo plazo se mani}401estapor la susceptibilidad a enfermedades
oponunistas, neoplasias malignas asociadas y degeneracién del sistema
nervioso central (SNC).'°
2.3.2. Etiologia deIVlH
El VIH es un retrovirus que pertenece a la familia Retroviridae y género
Lentivirus, caracterizado por presentar un marcado poder citolitico, de infectar
células del sistema inmune y de producir infecciones |entas. 034Estosvirus tienen
una serie de caracteristicas especificas que son determinantes en la compleja
patogenia de la infeccién como la gran diversidad genética y genoma complejo,
ciclo vital con dos fases (ARN y ADN proviral), se replica mediante un
mecanismo inverso al habitual en los virus ARN; el papel fundamental lo juega
una enzima Ilamada transcriptasa reversa. Sus células huésped son los Iinfocitos
CD4+, macréfagos, células nerviosas de la microglia y células dendriticas
residentes en mucosas (células de Langerhans) 030.Existen dos tipos del VIH,
denominados VIH-1 y VIH-2. El primero fue descubierto en la década de 1980,
es el més virulento e infeccioso que el VIH-2 y es el causante de la mayoria de
infecciones por VIH en el mundo. El VIH-2 es menos contagioso, se encuentra
confinado en los paises de Africa Occidental."
031
2.3.3. Estructura y genoma
Estructura
Desde el punto de vista morfolégico el VIH es una particula esférica de 90 a 120
nm de diémetro y su envoltura externa esta formada en un 5-10% de
componentes propios del virus (g|ucoproteinas 024gp)y de un 90-95% de
componentes de la membrana de donde se originé 0302.Laestructura comprende un
core (centro) que contiene las nucleoproteinas, rodeado de una envoltura
compuesta por membrana celular donde se inserlan |as glucoproteinas de
informacién genética en dos cadenas idénticas de ARN, las proteinas
estructurales codificadas por el gen gag que constituyen Ia matriz y cépside del virus, proteinas funcionales codificadas por el gen pol (transcriptasa reversa,
integrasa y proteasa).3
FIGURA 1. Estructura del virusde la lnmunode}401cienciaHumana
env gp12O
5
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g
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Estructuradelvirus dela "' " '.' \
lnmunode}401cienciaHumana ; '
Fuente: Hernandez 035.
Genoma
El genoma del VIH-1 y VIH-2 son similares, estén constituidos por una cadena
de
ARN monocatenario protegido por una envoltura
de
membrana.
035
Ambos
estén compuestos por 3 genes estructurales (gag, pol y env) y seis genes
reguladores nef, rev, vif, tat, vpu y vpr(vpx en caso de VIH-2) encargados de la
regulacién de la sintesis y replicacién viral 035El provirus, forma integrada del
genoma del VIH, mide aproximadamente 9.8 Kb Ambos extremos del provirus
tienen una secuencia nucleotidica denominada LTR (long terminal repeats) que
sirven de receptores de proteinas tanto celulares como virales, que activan Ia
transcripcién del virus. 035
FIGURA 2. Estructura genémica del VIH
(F 1 2 3 4 § 6 Z 8 9kb
5 030L1'R ' r 3 030L1 031}401
cg
E
& 024 024-ae«»w 024 024 024u
:3
E
i
1
I---mv(m;_-_-Pm,
034
,
"""
035
T1
035
Fmease 9mo vtlm env naIP27
Relrotrarlscrlgtasa
031 we--=51 env precursor
~53 Endanucloasa --"-
024-':,;T-pre(nl1_iIado) 3
1125 (maya}402 Proteins exlrucelular
p,5 gp12O
A PmxelnaIransmmubranal
7 p9 9 035 034
Fuente: Roses 035.
2.3.4. Ciclo de replicacién
El ciclo biolégico del VIH se divide en dos etapas bien diferenciadas: la primera
etapa del ciclo, comprende desde el reconocimiento celular hasta Ia integracién
del ADN viral al ADN huésped. El reconocimiento celular esté relacionado con la
sensibilidad a los receptores CD4 presentes en los linfocitos T4, ademés de
correceptores de quimiocinas que en los linfocitos es CXCR4 y en los
macréfagos CCR5. 0305El primer paso de este proceso es el acoplamiento de la gp
120 a los receptores CD4 auxiliado por los correceptores. Esta unién origina un
cambio conformacional en gp 120, que permite plegarse a gp 41 yesta a su vez
fusiona Ia envoltura viral con la membrana celular. Una vez dentro de la céiula el
virus pierde Ia envoltura Iiberéndose e1 ARN viral, ypor accién de la transcriptasa
reversa comienza el proceso de retrotranscripcién (transformacién de ARN viral
en ADN viral), este ADN es transportado al interior del n}401cleode la célula yuna
vez en el nucleo el ADN lineal se integra a la célula del huésped mediante Ia
integrasa viral, y se fonna el provirus. El provirus puede perrnanecer
transcripcionalmente inactive durante meses
o
a}401os.
035
La segunda etapa del ciclo comprende desde Ia biosintesis de los componentes
virales hasta Ia salida de los viriones infectantes. El inicio de la transcripcién del
provirus, depende de factores celulares y virales que interactuan con las
secuencias reguladores localizadas en la regién U3 de la LTR. Estos elementos
celulares se unen al promotor viral yaumentan Ia expresién genética del VIH-1
en respuesta a la estimulacién celular por diferentes mecanismos. El ARN
generado es procesado en el nllcleo y transportado al citoplasma con ayuda de
hasta los centros de ensamblaje para formar los nuevos viriones, Iiberados por
un proceso de gemacién a través de la membrana p|asmética. 0303Una proteina
importante en la formacién de los viriones es la proteasa viral, enzima que
provoca la ruptura de la poliproteina Gag en proteinas de la cépside y
nucleocépside (p6, p9, p17 y p24) y de la poliproteina Pol precursora de todas
enzimas virales (transcriptasa reversa, integrasa yproteasa).
La maduracién final de los viriones y del ensamblaje de las proteinas virales se
produce al final del ciclo. Este complejo nucleocapside abandona la célula
llevéndose un fragmento membranal dando fin al proceso de ensamblaje ysalida
del virién.
035
Figura 3. Replicacién del virus de la lnmunodeficiencia Humana
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Fuente: Rosas 034
2.3.5. Variabilidad genética
Como virus ARN que es, su genoma presenta muchas variantes (cuasiespecies).
En relacién con la envoltura (gen env)se conocen al menos9 genotipos con una
clara distribucién geografica: en Occidente predomina el B, en Africa
subsahariana el A y C, yen el Sur este asiatico el C, B y E. En relacién con el
gen gag se conocen 7 subtipos. Aunque existe cierla controversia. esta
distribucién geogréfica puede explicar la diferente epidemio|ogia.'5 En Africa
subsahariana ysudeste asiético, donde habitan el 90% de los afectados por el
VlH, la transmisién es heterosexual en el 90%, mientras en Occidente es
fundamentalmente homosexual y parenteral. El tropismo que mani}401estan|os
diferentes subtipos por las células de Langerhans del epitelio femenino es muy
alto, al menos para el subtipo E, y muy bajo para el subtipo B.
Los retrovirus tienen capacidad de recombinacion (forma de reproduccién
"sexual" primitiva) derivada de poseer 2 fiiamentos de ARN. Si en una céluia
huésped existen dos provirus diferentes, a la hora de la replicacion, uno de los }401lamentosde un provirus puede recombinarse con el del otro dando Iugar a una progenie heterocigota con las caracteristicas de ambos (tropismo, resistencias a
antirretroviraies).
2.3.6. Historia natural de la infeccién
Después de la infeccién primaria, la alta replicacién viral inicial conduce a una
ra 031pidadiseminacién del virus en organos linfoides y otros tejidos del paciente
infectado. Entre 2 6 3 semanas post-infeccién y asociado con el desarrollo de
una fuerte respuesta celular T citotéxica, que precede a la aparicién de
anticuerpos se produce una drastica caida en los niveles de ARN virico en
plasma y un restablecimiento dei numero de células T CD4+. Este nivel basal de
replicacién viral se denomina set point y varia de un individuo a otro
constituyendo un importante marcador virolégico de progresién de la
enfermedad. 035Después de la primoinfeccién, se inicia Ia fase clinicamente
asintomética. de duracion variable, entre la infeccién primaria y el desarrollo del
SIDA. Durante el periodo asintomatico de la infeccién, Ia repiicacién del virus es
continua. pero el individuo mantiene una fuerte respuesta inmune frente ai virus,
estabieciéndose un estado de equilibrio, en el cual Ia produccién y eliminacién
del virus alcanza valores semejantes. 035Como resultado, |os niveles de ARN
virico en piasma permanecen estables. Pero el numero de células T CD4+
disminuye Ientamente con una tasa media estimada de 25-60 células/ul/a}401oy el
virus invariablemente escapa al control inmune. La ultima etapa de la
enfermedad, en ausencia de tratamiento antirretroviral, se caracteriza por un
aumento de la replicacién del VIH-1 y coincide clinicamente con una marcada
disminucién en el numero de células T CD4+ (< 300 células/pl) y una profunda
aiteracién del estado general del paciente. caracterizada por la aparicién de
infecciones oportunistas graves, ciertas neoplasias y alteraciones neuro|c'>gicas.16
La infeccién primaria se caracteriza por la presencia de altos niveles de virus en
la sangre. que disminuyen hasta alcanzar un valor estacionario en la fase
asintomética (Fase 1). La aparicién de sintomas clinicos se ve acompa}401adade
un nuevo aumento en los niveles de viremia en sangre que permanecen
elevados durante todo el periodo terminal (Fase 2). El nivel de iinfocitos CD4+
alcanzando niveles Iigeramenle inferiores a los iniciales. Durante la Fase 1 su
nivel va disminuyendo paulatinamente, en muchos individuos el inicio de la Fase
2 se acompa}401ade un marcado descenso en el n}402merode linfocitos CD4+. El
n}402merode linfocitos CD8+ se eleva durante la infeccién primaria retornando a la
normalidad durante toda la Fase 1, solo durante la Fase 2 se produce una
disminucién clara en los niveles de linfocitos CD8+. Por altimo, el numero de
linfocitos CD8+ especlficos frente al VIH-1 que se ha mantenido constante
durante la Fase 1, comienza a disminuir con anterioridad a la aparicién de
sintomas y a partir de este momento desciende répidamente a medida que la
enfermedad progresa. 0306
Figura 4. Curso clinico de la infeccién natural por VIH-1
MIC 034
lmoeclbn o
9 Aslntomi}402gn slnlomi}401coSIDA
10 031
E Co 030 nroconvonlbn 0303
3 . 1o 5
3 E
i rev 03122
§ Ar}402cuupuam-VIM 3
S
E 034V10 030 030
s
5
g 3
3 RNA¢llVlM¢nplIsm {O3 5
10'
T
0
E
030
Mnnnnu- 7 uImus 2-3tie: tnnodmnntznal
Fuente: Campos 035.
2.3.7. Mecanismos de transmisién
Los modos de transmisién del VlH de un individuo a otro son los principales
determinantes de las caracteristicas epidemiolégicas del SIDA. El virus se
transmite por tres vias principales:
o Transmisién Sexual. Es el modo mas frecuente de transmisién, ya sea
entre varones homosexuales o entre parejas heterosexuales. El virus
esté presente en el semen y accede a la pareja no infectada, a través de
la mucosa rectal traumatizada, o a través de la mucosa vaginal. También puedeocurrir Ia transmisién de mujeres infectadas a varones. 030°
o Transmisién Parenteral. La inoculacién de un receptor con sangre o
hemoderivados infectados es la segunda via ma 031sfrecuente de
transmision del VIH. Los pacientes infectados por esta via pueden
infectar a otros individuos por contacto sexual.
o Transmisién Vertical. La transmisién del VIH de madre a hijo es
responsable de la mayor parte de los casos de SIDA pediatrico. Este tipo
de transmisién ocurre con mayor frecuencia en el }402teroo durante el
parto, aunque también es posible Ia transmisién por la lactancia matema.
2.3.8. Diagnéstico
En el diagnostico de la infeccién por elVIH, paraconsiderar un resultado positivo
se recomienda el uso de tres técnicas con distinto principio, siendo obligado
{ entre una de ellas el Western Blot como prueba con}401rmatoria.Las pruebas035
serologicas de cuarta generacién acortan el periodo de ventana de 13 a 15 dias.
La deteccion del genoma del VIH (ADN proviral IARN) y la viremia plasmatica V
(carga viral), complementan al diagnéstico en situaciones complejas y se utiliza
para el seguimiento de los pacientes infectados por VIH para contribuir en la
decision de inicio de tratamiento respectivamente.
2.3.8.1. Diagnéstico del VIH por métodos serolégicos
Enzimoinmunoanélisis (EIA)
La deteccién de anticuerpos especi}401casfrente al VIH-1 es el primer paso que
debe realizarse para establecer si una persona esta infectada o no por este
retrovirus. El método mas usado es el Enzimoinmunoanalisis (EIA), su principio
se basa en la utilizacién de proteinas viricas, parcialmente puri}401cados,obtenidas
de Iisado de células (EIA de primera generacién), o por medio de proteinas
recombinantes o péptidos sintéticos (EIA de segunda y tercera generacién) y
pmebas de cuarta generacion basadas en la deteccion simultanea de
anticuerpos y complejos inmunes antigeno p24/ anticuerpo y tienen una alta
sensibilidad y especi}401cidad
superior al 95.5%.
035
Con |as pruebas de tercera y cuarta generacion el 50% de los infectados puede
detectarse en las tres primeras semanas de infeccién; Ia muestra que se utiliza
es suero, plasma, hisopado gingival, orina, secreciones. 035
Western Blot (WB)
Es Ia técnica mas ampliamente utilizada, basicamente consiste en la separacién
de proteinas (antigenos) por electroforesis y transferidas a un papel de
nitrocelulosa. Estas proteinas }401jadasson expuestas al suero del paciente, en el
cual |os anticuerpos especi}401casse unen a las proteinas presentes dando un
laboratorio.
035
La positividad en el WB para VIH-1 requiere la presencia de al menos 2 bandas
de la envoltura, Ia negatividad resulta de la ausencia de bandas y los restantes
patrones se consideran indeterrninados. Una de las Iimitaciones del
WB
es el
diferente valor predictivo diagnéstico que tiene cada una de las bandas. (OMS)
Las bandas del core p17 y p24 pueden ser fmto de reactividad inespeci}401ca,
detecténdose hasta en el 15-20% de los donantes de sangre no infectados. La
presencia de anticuerpos frente a las proteinas de la envoltura es mucho mas
especi}401ca,aunque también se han descrito falsos positivos. Sin embargo, la
sensibilidad del WB es mayor para detectar anticuerpos frente a proteinas del
core que de la envo|tura.
0309
Actualmente existen WB que incorporan, junto al Iisado viral, proteinas
recombinantes o péptidos sintéticos correspondientes a proteinas de la
envoltura, en un intento por salvaguardar la sensibilidad frente a estos antigenos_
que son los més especi}401cas.
lnmuno}402uorescenciaindirecta (IFI) .
Esta técnica se ha usado amp|iamente como prueba confirmatoria para la
in'fecci6n por el VIH- 1. Su desempe}401oes bueno pero requiere de personal
debidamente entrenado para su Iectura yde microscopic de }402uorescencia.2°
En esta técnica se utilizan linfocitos infectados por el VIH, }401jadoscon acetona,
sobre los que se deposita el suero problema. Cuando se a}401adea esta .
preparacién una lgG humana marcada con }402uoresceinase reconoce la reaccién
antigeno-anticuerpo.
Los estudios comparativos efectuados indican que esta prueba tiene una
sensibilidad y especi}401cidadsimilar al WB, aunque su interpretacién puede
mostrar una gran subjetividad y su realizacién es mas compleja.
2.3.8.2. Diagnéstico del VIH por métodos moleculares
Otra técnica muy utilizada actualmente en el diagnéstico del VIH es la reaccién
en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica permite la ampli}401caciénde
minimas cantidades de ADN
o
ARN.
Es
035
una técnica de gran utilidad
tanto
en
la
fase aguda como en la fase crénica de la infeccién. Estos métodos generalmente
se utilizan en el diagnéstico de ni}401osmenores de 18 meses, en algunos casos
de resultados indetenninados por otros métodos y, principalmente en el
seguimiento de la infeccién yterapia. 035
El ADN utilizado en esta técnica puede ser extraida a_ partir de sangre total con
anticoagulante 0 plasma; 'en'étgUnds estudios sé ha visto la utilizacién de sangre
impregnada en papel dando buenos resultados debido a que emplean peque}401as
cantidades de sangre y son estables a temperatura ambiente durante periodos
prolongados, no requieren cadena de frio parasu transporte y ademés conllevan
un
menor riesgo bio|6gico.2 030
Reaccién en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica altamente sensible y especi}401coque permite detectar peque}401as
cantidades de ADN. La reaccién en cadena de la polimerasa, es una técnica035
que permite la sintesis enzimético 034invitro de secuencias especi}401cas035 de ADN
por accién de una polimerasa. Esta técnica fue desarrollada por Mullis en 1985,
toma como modelo e| proceso natural de replicacién del ADN y consiste en la
ejecucién de varios ciclos consecutivos siguiendo para cada ciclo tres pasos,
cada una con distintas condiciones establecidas de temperatura y tiempo." El
producto que se obtiene at }401nalizarIa reaccién es una gran cantidad de un
fragmento génico con alto grado de pureza que favorece la tarea de los
investigadores empe}401adosen ampliar nuestros conocimientos sobre estructura y
funcién de los genes.
034
Tipos de reaccién en cadena de la polimerasa
- PCR Anidada o nested PCR. Es una técnica muy sensible en la que el
producto de una ampli}401caciénes utilizada como molde para una segunda
amplificacién con cebadores que se hallan dentro de la primera
secuencia amp|i}401cada.Esta035PCR tiene la ventaja de brindar alta
sensibilidad y especi}401cidad.Pero tiene la desventaja de que no permite
cuanti}401carla muestra.
- PCR in situ. Consiste en una reaccién de PCR en secciones histolégicas
o celular, donde |os productos generados pueden visualizarse en el sitio
de ampli}401cacién(preparaciones }401jasen un portaobjetos). Esta técnica
realiza una primera amplificacién de ADN blanco y luego Ia deteccién
mediante hibridacién in situ convencional con sondas de ADN/ARN
(detectan cantidades peque}401isimasde genoma) Es L'1ti| para ampli}401car
especi}401camentepoblaciones de secuencias de menor representacién 034.
0 PCR m}401ltiple.Esta técnica permite amplificar simulténeamente mas de
una secuencia, para ello se combina dos 0 mas pares de cebadores en
un mismo tubo de ampli}401caciénjunto con los demas reactivos para
utilizacién de esta técnica radica en la informacién sobre varios locus en
una sola reaccién, menor cantidad de ADN molde para el analisis. uso de
menor cantidad de reactivos. 034
- - PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). Es una variante de la PCR
en la que usamosARN como molde inicial en Iugar de ADN, emplea una
transcriptasa inversa (como Tth) para realizar Ia sintesis de un ADN
complementaria al ARN (ADNc).2" De esta forma el desarrollo de una
RT-PCR tendria como primer paso, la retrotranscripcién a partir de ARN,
seguido de la ampli}401caciéna partir de la primera hebra de ADNc y
}401nalmenteel desarrollo del PCR esténdar.
- PCR en tiempo real 0 PCR cuantitativo (qPCR). Es una ampli}401cacion
en la que los productos de la PCR se detectan de fonna directa durante
|os ciclos de amplificacién utilizando sondas marcadas con fluorescencia.
Permite cuanti}401carla cantidad de ADN o ARN presente en la muestra
original. Tiene varias ventajas sobre los métodos clésicos de la PCR
simple 0 anidada. Solo se utiliza un par de primers, aportando una
sensibilidad préxima o igual a la PCR anidada tradicional, pero con un
riesgo de contaminacién mucho mas bajo. 035 »
Extracciénypuri}401caciéndel ADN
La extraccién y purificacién de écidos nucleicos constituye la primera etapa de la
mayoria de los estudios de bio|ogia molecular; los métodos de extraccién nos
permiten obtener écidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para
después realizar anélisis especi}401coscomo la reaccion en cadena de la
polimerasa. La calidad y pureza de los acidos nucleicos son dos de los
elementos mas importantes en ese tipo de anélisis, para obtener acidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es
preciso aplicar métodos de extraccion adecuados tomando en cuenta algunos
criterios.
034
'
-
Acido nucleico diana
o Organismo fuente
- Material inicial (sangre, plasma, hisopado, etc.)
- Uso posterior (PCR, clonacién, RT-PCR, etc.)
Para extraer los écidos nucleicos del material biolégico es preciso provocar una
Iisis celular, inactivar |as nucleasas celularesyseparar el écido nucleico del resto
de las células. El procedimiento de Iisis debe tener un equilibrio entre ser Io
su}401cientementefuerte como para lisar laycelulaay a la vez ser su}401cientemente
suave para preservar el écido nucleico.
035
Uno de los métodos de extraccion amp|iamente utllizada, es el fenol-cloroformo;
que en la actualidad ha sido desplazada por diversos métodos de extraccién
comercial patentado.
Extraccién delADN por el método Fenol ICloroforrnoIAlcohol isoamilico
Este método comprende tres etapas principales:
- Lisis de la membrana celular. Esta etapa comprende la rotura de la
membrana celular y nuclear utilizando el tampén de extraccién que
contiene tris HCI, EDTA y SDS (tratamiento qulmico) y proteina K
(digestion enzimética). Todas las membranas biolégicas presentan la
misma estructura general integrada por moléculas de Iipidos y proteinas
unidas por interaccion no covalenle, a este nivel act}402anla proteinasa K y
el detergenle sos rompiendo Ia membrana
034.
El SDS del tampon de
extraccién captura los Iipidos que conforman Ia membrana. El EDTA, es
un componente quelante que se une al magnesio, un cofactor de la
desoxirribonucleasa; al unirse el magnesio al EDTA, la accion de la
desoxirribonucleasa disminuye. El lris HCI confiere a la solucién la
capacidad amorliguadora del pH.
0 Extraccién. La combinacién de fenol, cloroformo y alcohol isoamilico se
utiliza con el objetivo de desnaturalizar y eliminar |as proteinas, ademés
el cloroformo facilita la separacién de las fases acuosa y orgénica, si el
pH de la solucién acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 024
030 8,0), los écldos nucleicos tenderan a repartirse en la fase organica. La
= adicién de la mezcla cloroformo y alcohol isoamilico se realiza para
eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa y ademas para
eliminar |os residuos de fenol que pueden inhibir Ia PCR.
- Precilpitacion. Para concentrar el ADN suele realizarse Ia precipitaclén
utilizando alcohol absoluto y acetato de sodio, en estas condiciones el
detergente que es mas soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse,
' mientras que los écidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con
alcohol al 70% permite una mayor puri}401caciéno elucién de los écidos
Etapas de la reaccién encadena de la polimerasa
El proceso de PCR por lo general consiste
en
una serie de 20 a 35 cambios
repetidos de temperatura denominados ciclos, cada ciclo suele consistir de
2
a
3
pasos a diferentes temperatures.
034
La temperatura y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de la enzima,
concentracién de iones divalente. dNTPS, temperatura de unién de cebadores y
Iongitud de ADN que se desea ampli}401car.
035
Desnaturalizacién inicial: El tubo con la mezcla de reaccién de PCR es
sometido a altas temperaturas de 90 a 95°C durante un tiempo a }401nde
desnaturalizar todo el ADN e inactivar proteasas y DNasas.
- Desnaturalizacién. La doble cadena del DNA se desnaturaliza
separéndose en una sola hebra, esto se consigue aplicando
temperatures de 90 a 95°C que produce la ruptura de los puentes de
hidrégeno intercatenarios y por lo tanto la separacién de ambas cadenas
para que los oligonucleétidos iniciadores puedan unirse a sus secuencias
del DNA complementario. Si el DNA se desnaturaliza parcialmente este .
tender:-'1 a renaturalizarce répidamente, evitando asi una e}401ciente
hibridacién de los primers y una posterior extensién
0 Hibridacién. Llamada también fase de annealing, una vez que el DNA
esta desnaturalizado se disminuye hasta Ia temperatura comprendido
entre los 40 y60°C para que se pueda producir la unién de los primers a
las secuencias flanqueantes del fragmento que se quiera ampli}401car.
- Extensién o polimerizacién. En esta etapa la temperatura se eleva,
para una éptima actividad enzimética de la Taq polimerasa que reconoce
un segmento del DNA bicatenario Iibre. La taq polimerasa sintetiza
exclusivamente en la direccién 5 030a 3 030,por lo que los nucleétidos Iibres
solo son a}401adidosen el extremo 3 030delos primers que han hibridado con
el DNA diana en el paso anterior y comienza la sintesis de la cadena
complementaria. El tiempo de extensién depende del tama}401odel
fragmento que sedesea amplificar.
0 Extensién }401nal.Después del Llltimo ciclo de PCR se da Iugar a esta
etapa }401nal,que permite que los productos de amplificacién parciales
tenninen
de completarse.
034
_
.-: 030r'_v \ ":~:/.. I-"=2.
Figura
5. Etapas de
la
reaccién en cadena de la polimerasa (PCR)
5' V. V031 -j 024?:- 024_024-024024030j
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* 030
. 1 .
Arnpnflcacldn exponencial del producto
Esqucrna gcncrzl dc la PCR.
Fuente: Rodriguez 034
Componentes de la reaccién en cadena de la polimerasa
Como Ia }401nalidaddel PCR es obtener muchas copias de ADN, se requiere un
ADN molde, primers y otros componentes para Ilevara cabo Ia reaccién:
o Muestra de ADN (écido desoxiribonucleico): La muestra biolégica
usada puede ser obtenida a partir de sangre, suero, orina y de otros
fluidos biolégicos. Es importante que el ADN esté Iibre de impurezas a }401n
de que la sensibilidad del ensayo no se vea disminuida. 034
o lniciadores 0 Primers. Son oligonucleétidos peque}401os(15 a 20
nucleétidos) de cadena simple que se dise}401ande tal manera que sean
complementarios a ios extremos 5' de las hebras del segmento de ADN
que se desea amplificar. La especi}401cidaddel PCR depende del dise}401o
de los iniciadores."
0 Taq polimerasa. Son enzimas que sintetizan ADN a partir de un
oligonucleétido iniciador y una hebra de ADN molde. son enzimas
cuales la hibridacién de los iniciadores al ADN a ampli}401carocurre con alta
rigurosidad. La primera enzima termoestable que fue utilizada para
propésitos de ampli}401caciénfue aislada del Thermus aquaticus que es
denominada Taq DNA polimerasa. La actividad de esta enzima, asi como
la }401delidadde la misma depende de la concentracién de iones Mg Iibre035
de los desoxiribonucleétidosydel pH del bufferde reaccién.
- lén Magnesio. Es importante porque afecta Ia union entre los
oligonucleétidos iniciadores y el molde de ADN. Es necesario, ademés
considerar que los nucleétidos secuestran iones Mg del medio, por lo035
que la concentracién milimolar de este ion debe ser superior a la
concentracién de los nucleétidos. Act}402acomo cofactor de la Taq
polimerasa yen la temperatura de hibridacién.
0 Desoxiribonucleétidos trifosfatos (dNTPs). La concentracién de cada
uno de ellosen la mezcla de reaccién debe ser equimolar para minimizar
|os errores de una falsa incorporacién de nucleotides. Para el PCR debe
estar en el rango de 20 024200 pM a fin de tener especificidad yfidelidad
optima a altas velocidades de incorporacién.
0 Buffer de reaccién. Los componentes del buffer de reaccién incluyen
Tris 024HCI, gelatina o alb}401minasérica bovina (100pg/mL) y detergentes
no iénicos como el Tween 20. Estos componentes pueden ser utilizados
a fin deestabilizar Ia actividad de la Taq ADN polimerasa.
- Agua. Unfactor muy importante en el PCRes la calidad de agua a utilizar
en la reaccién. se sugierede alta pureza, tridestilada, desionizada,Iibre
de
DNA contaminante o DNasasZ5.
Electroforesis .
La electroforesis es un método en el que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar biomoléculas segL'm su tama}401oy carga
eléctrica a través de un soporte, que en este caso puede ser Ia agarosa. un
polisacérido cuyas diluciones se trabajan de 0,5 a 2%; tienen la propiedad de
permanecer Iiquidas por encima de los 50°C aproximadamente y, formar un gel
semisélido al enfriarse. 035Este gel esté constituida por una matriz tridimensional
de }401braspoliméricas, embebidas en gran cantidad de medio liquido, que retarda
el paso de las moléculas de écido nucleico en mayor medida cuanto més
grandes sean estas.25Para determinar Ia concentracién del DNA se utiliza como
patron un marcadorde peso molecular, el cualse corre paralelo al DNA muestra.
Existen factores que in}402uyenen la migracién electroforética de a'cidos nucleicos
en geles deagarosa:
o Tama}401odelporo.
- Electroendosmosis. V
- Losécidos nucleicos (fonnasytama}401o).
- Buffer de electroforesis.
o Buffer de la muestra de écido nucleicos.
o Intensidad de corriente.
Corrida electroforética: Puesto que la carga eléctrica de un écido nucleico es
proporcional a su Iongitud en nucleétidos, la electroforesis separa |os fragmentos
de écido nucleico seg}402nsu tama}401oo Iongitud, expresado en nucleétidos (si son
de hebra sencilla) 0 en paresde bases (si son de doble hebra, caso com}402ndel
DNA).
031°
Visualizacién de los productos de ampli}401cacién
030 La deteccién de los productos de ampli}401caciénse realiza directamente por la
observacién de las bandas fluorescentes de ADN sobre un gel de agarosa
después de la tincién con bromuro de etidio (se intercala entre las bases y
presenta }402uorescenciacuando inciden radiaciones ultravioleta), en un
transiluminador de luz ultravioleta; yla evaluacién de la Iongitud de la banda de
ADN por comparacién con un marcador de peso molecular con}401rmala presencia
de ADN
diana
de
la
muestra.
034
Ventajas del uso de la reaccién en cadena de la polimerasa (PCR)
La utilizacién de esta nueva tecnologia proporciona ventajas entre las que
destacan:
- Ampli}401casolamente el fragmento de ADN de interés, requiere de una
sola molécula de ADN para generar millones de copias (altamente
sensible) y es selectivo en presencia de grandes cantidades de ADN
(altamente especifico)
0 El estado de conservacién de la muestra es hasta cierto grado '
indiferente, siempre que se conserve Ia secuencia diana.
Aplicaciones de la reaccién encadena de la polimerasa(PCR)
La PCR se aplicé inicialmente como una técnica en laboratories de investigacién,
debido a su robustez y rapidez; pero su gran especi}401cidady sensibilidad ha
permitido el desarrollo de técnicas de diagnéstico para determinadas
medicina c|inica. 031°Asi, se ha convenido en una herramienta fundamental en
campos tan diversos como la investigacién (clonacién de genes, deteccién de
clones recombinantes, estudio de ADN de fésiles), paleontologia, antropologia,
medicina forense y criminalistica (estudios }401logenéticoso etnogré}401cos,filiacién,
identi}401caciénde individuos y de sospechosos, asi como en el anélisis de la
evidencia en casos de asesinato, violacién, etc.), sanidad animal y mejora
genética (deteccién de enfennedades genéticas e infecciosas, pureza de razas,
etc.) y medicina (diagnéstico de enfermedades ). Dentro de la microbiologia e
infectologia, se ha utilizado para identi}401carel DNA de parésitos, virus y
bacterias, incluyendo estudios de resistencia a antibiéticos. 035
Sensibilidad y especi}401cidad
I En 1947, Yerushalmy introduce |os térrninos desensibilidad y especi}401cidadcomo
indicadores estadisticos que eval}402anel gradodee}401caciainherente a una prueba
diagnéstica.
2 034
034
Figura 6. Capacidad predictivade una prueba diagnéstica
prueba
1
WP)
(PP)
E
Fuente: Molinero 035
Sensibilidad .
La sensibilidad en epidemiologia es la probabilidad declasi}401carcorrectamentea
un individub enfermo, esdecir, Ia probabilidad de que para un sujeto enfermo se
obtenga en una prueba diagnéstica un resultado positivo. Que es lo mismo que
decir, Io contrario, Ia probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un
resultado negativo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad de la prueba
complementaria para detectar la enfermedad.
Sensibilidad = S =L VP + FN
Especi}401cidad ' -' 030' 031 " ' 030030"
La especi}401cidadindica la capacidad que tiene Ia prueba de identi}401carcomo
sanos (no enfermos) a los que efectivamente lo son, es decir, Ia especi}401cidades
la probabilidad de que la prueba identi}401quecomo rro enfermo a aquél que
efectivamente no lo esté.
VN
Espet:ificida.d = E = j .
I/N+FP
2.4. Marco legal
Aspectos éticos y legales
Toda investigacién que involucra Ia participacién de seres humanos se realiza
dentro de tres principios éticos: respeto por las personas, bene}401cenciay justicia;
estos principioé se encargan de velar la preparacién responsable de protocolos
de investigacién
035.
2.4.1. Participacién de voluntarios
La parlicipacién de seres humanos sera' para la obtencién de sangre total,
quienes deberén ser voluntarios mayores de 18 a}401osprevio conocimiento yfirma
de consentimiento informado |as mismas que sera'n utilizadas como muestras
negativas en la evaluacién de la técnicaen estudio.
2.4.2. consecuencias de la participacién en el estudio
Con respecto a la bene}401cencia,la validacién de esta técnica de diagnéstico
cumple con el propésito de contar con una técnica que desplace |as di}401cultades
en cuanto a la extraccién, transporte y conservacién de las muestras, debido a
que no requiere cadena de frio para el transporte oconservacién. Ademés de ser
aplicado en el diagnéstico confirmatorio para ni}401ospeque}401os.en quienes es
traumética Ia extraccién por puncién venosa."
2.4.3. Con}401dencialidadde la informacién
La informacién sobre datos del paciente, resultados, factores de riesgo, datos
epidemiolégicos y otros se almacenar:-in en una base del laboratorio protegidas
con clave de acceso y solo estaré disponible para los investigadores y el comité
de ética en el caso que lo solicitara. No se publicaré ninguna infonnacién que
pudiera identi}401caral paciente del cual proviene la muestra de sangre, sera