UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú,
Decana de América
)
ESCUELA DE POSGRADO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
UNIDAD DE POSGRADO
PRODUCCIÓN
DE
mRNA
PARA
CITOQUINAS
HEMATOPOYÉTICAS (IL-3, GM-CSF e IL-7) EN RATONES
INMUNOSUPRIMIDOS TRATADOS CON EXTRACTO ACUOSO
DE
Lepidium meyenii
WALPERS (MACA)
Tesis para optar al Grado Académico de
MAGÍSTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Bachiller Evelyn Katy Alvarez Salazar
LIMA – PERÚ
Mira que te mando que te esfuerces y seas valiente; no temas ni desmayes, porque Jehová tu Dios estará contigo en dondequiera que vayas
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por acompañarme y guiarme a lo largo de mi vida, por ser mi fortaleza
en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de aprendizajes,
experiencias y sobre todo felicidad.
A mis padres, Uldarico y Dionicia, por su ejemplo de lucha y honestidad,
porque creyeron en mí y me dieron la oportunidad de tener una profesión.
A mis hermanas Elizabeth y Rosa, por llenar mi vida de alegrías y amor
cuando más lo he necesitado.
A mi asesora Libertad Alzamora por aceptarme en su laboratorio, por haber
compartido conmigo sus conocimientos y sobre todo su amistad.
A todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron
en la realización de esta investigación, hago extensivo mi más sincero
agradecimiento.
Al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica por el
CONTENIDO
PAG
RESUMEN I
ABSTRACT II
LISTA DE TABLAS III
LISTA DE FIGURAS IV
LISTA DE ABREVIATURAS V
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES
2.1 Lepidium meyenii WALPERS (MACA) 3
2.2 HEMATOPOYESIS Y CITOQUINAS 6
2.3 CICLOFOSFAMIDA 9
2.4 EMPLEO DE PLANTAS COMO PROTECTORES FRENTE A DROGAS
CITOTÓXICAS
11
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 13
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 ELABORACIÓN DEL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA E
IDENTIFICACIÓN FITOQUÍMICA DE SUS PRINCIPALES COMPONENTES
14
4.2 INMUNOSUPRESIÓN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA 18
4.3 EVALUACIÓN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE
LA PRODUCCIÓN DE mRNA PARA IL-3, GM-SCF e IL-7 EN EL BAZO Y
LA MÉDULA ÓSEA DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
22
4.4 EVALUACIÓN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE
LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y PRODUCCIÓN DE mRNA PARA IL-3,
GM-CSF E IL-7 EN CULTIVOS DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE LA
MÉDULA ÓSEA
4.5 EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE
MACA SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS
HEMATOPOYÉTICAS DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
39
4.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 43
5. RESULTADOS
5.1 IDENTIFICACIÓN DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES PRESENTES
EN EL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA
44
5.2 INMUNOSUPRESIÓN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA Y
TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA EN RATONES
45
5.3 EFECTO DEL EAc DE MACA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE mRNA PARA
IL-3, GM-SCF e IL-7 EN CÉLULAS DEL BAZO Y LA MÉDULA ÓSEA DE
RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
48
5.4 EFECTO MODULADOR DEL EAc SOBRE LA PROLIFERACIÓN
CELULAR Y PRODUCCIÓN DE mRNA PARA IL-3, GM-CSF E IL-7 EN
CULTIVOS DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE LA MÉDULA ÓSEA
56
5.5 INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA SOBRE LA
PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS DE RATONES
INMUNOSUPRIMIDOS
58
6. DISCUSIÓN 67
7. CONCLUSIONES 78
8. RECOMENDACIONES 79
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 80
RESUMEN
Lepidium meyenni (maca) es un cultivo tradicional de los Andes Centrales
del Perú. Se han demostrado sus propiedades antitumorales e
inmunomoduladoras, que lo convierten en un excelente candidato para
investigar su actividad hematopoyética.
En el presente estudio, se trataron ratones Balb/c a dosis de 200 mg/kg de
extracto acuoso (EAc) de maca amarilla por vía oral durante 2 meses previo a
la inmunosupresión (IS) con ciclofosfamida (CF), y se evaluó la producción de
mRNA para las citoquinas hematopoyeticas: interleuquina 3 (IL-3), factor
estimulador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) e interleuquina
7 (IL-7) en el bazo y la médula ósea, tanto en los ratones tratados como en
sus controles. Se realizaron cultivos de células mononucleares de médula
ósea y se evaluó el efecto del EAc sobre la proliferación celular y producción
de mRNA para las 3 citoquinas hematopoyéticas.
La administración de EAc en ratones IS, incrementó (p<0.05) la producción
de mRNA para las tres citoquinas en el bazo y de IL-7 en la médula ósea, dos
días después de la IS; e IL-3 y GM-CSF en la médula ósea 5 días post-IS, al
compararlos con los grupos no tratados con el extracto. En cultivos de médula
ósea, el EAc en la dosis de 100 µg/ml, estimuló (p<0.05) la proliferación celular
y la producción de mRNA para IL-7. Además, los ratones IS y tratados con
EAc mostraron mayor recuento de células de médula ósea, sangre periférica,
unidades formadoras de colonias endógenas en el bazo (CFU-S) y respuesta
proliferativa a mitógenos de los linfocitos, cinco días después de la IS.
El EAc de maca estimula la producción de mRNA para las tres citoquinas
hematopoyéticas. La administración de EAc a ratones inmunocomprometidos
puede revertir los efectos supresores de la ciclofosfamida.
ABSTRACT
Lepidium meyenni (maca) is a traditional crop of the Central Andes of Peru.
Studies demonstrated their antitumor and immunomodulatory properties, which
makes it an excellent candidate to investigate its hematopoietic activity.
In the present study, Balb/c mice were orally treated with aqueous extract
(EAc) of maca at the doses of 200 mg/kg for two months prior to
immunosuppression (IS) with a single doses of cyclophosphamide (CF) (130
mg/kg) to evaluate the mRNA production of hematopoietic cytokines:
interleukin 3 (IL-3), granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF)
and interleukin-7 (IL-7) in spleen and bone marrow, both in treated and controls
mice. Murine bone marrow cells were isolated and co-incubated with aqueous
extract (EAc) of yellow maca to evaluate its effects on the cells proliferation
and mRNA production of the three hematopoietic cytokines.
The administration of EAc in immunosuppressed mice, increased mRNA
production for the three cytokines by spleen and IL-7 mRNA by bone marrow
on day 2 after immunosuppression, and IL-3 and GM-CSF mRNA production
by bone marrow on days 5 after IS, compared with the untreated group. EAc of maca at 100 μg/ml stimulated the proliferation of mononuclear cells and IL-7
mRNA production of cultured bone marrow cells. The extract also induced in
EAc-treated mice and IS, an increase in bone marrow and peripheral blood cell
counts, endogenous colony forming units-spleen (CFU-S) and the proliferative
response of lymphocytes on days 5 after IS.
The aqueous extract of maca stimulates the mRNA production for three
hematopoietic cytokines. The administration of EAc to immunocompromised
mice can reverse the suppressive effects of cyclophosphamide.
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Protocolo empleado para el tratamiento con el extracto acuoso de maca en ratones hembras balb/c.
Tabla 2. Secuencias de los primers empleados para el RT-PCR en tiempo real.
Tabla 3. Resultados del tamizaje fitoquímico del extracto acuoso de Lepidium meyenii (maca).
Tabla 4. Efecto del extracto acuoso de maca sobre los niveles séricos de la enzima transaminasa glutámico pirúvica en los ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Tabla 5. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresión de mRNA de IL-3, GM-SCF e IL-7 en los cultivos de células mononucleares de la médula
ósea.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Hipocótilos del Lepidium meyenii Walpers (maca), ecotipo amarillo. Figura 2. Elaboración del EAc de maca.
Figura 3. Administración del extracto acuoso de maca a los ratones. Figura 4. Electroforesis de los RNA totales de las muestras analizadas.
Figura 5. Resultado del análisis de los primers para IL-3 mediante el Software Primer-Blast.
Figura 6. Amplificación por PCR convencional con los primers específicos para los genes evaluados.
Figura 7. Programa de análisis de imagen TotalLab Quant.
Figura 8. Curva de disociación correspondiente a los fragmentos amplificados del transcrito del gen IL-7, se observa un solo pico con un Tm aproximado de
75,6°C en todas las muestras analizadas para IL-7.
Figura 9. Gráfico de la segunda derivada de la fluorescencia emitido por cada reacción, mediante el análisis del Método de Cuantificación Comparativa del
software Rotor Gene (versión 1.7).
Figura 10. Gráfico de la segunda derivada generado por el software Rotor Gene, para los fragmentos amplificados del transcrito del gen IL-7.
Figura 11. Obtención de la médula ósea de los fémures de los ratones.
Figura 12. Ensayo del MTT. El formazán formado es disuelto con solubilizantes (DMSO, alcohol isopropílico, etc.) y la intensidad de la
coloración es proporcional a la cantidad de células vivas.
Figura 13. Colonias macroscópicas formadas en la superficie del bazo de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 14. Efecto de diferentes dosis de ciclofosfamida sobre el porcentaje de células nucleadas de la médula ósea.
Figura 15. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresión de mRNA de IL-3 por esplenocitos de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 17. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresión de mRNA de IL-7 por esplenocitos de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 18. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresión de mRNA de IL-3 en la médula ósea de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida
Figura 19. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresión de mRNA de GM-CSF en la médula ósea de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 20. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresión de mRNA de IL-7 en la médula ósea de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 21. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la proliferación de las células mononucleares de la médula ósea.
Figura 22. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento de células nucleadas de médula ósea en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 23. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento de células nucleadas de sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 24. Macrocolonias en el bazo de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida y evaluadas 5 días después de la inmunosupresión.
Figura 25. Efecto del extracto de maca sobre el recuento de las unidades formadoras de colonia esplénica (CFU-S) de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 26. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la respuesta proliferativa a concanavalina A de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 27. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la respuesta proliferativa a Lipopolisacárido de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
LISTA DE ABREVIATURAS
EAc: Extracto acuoso
CF: Ciclofosfamida
IS: Inmunosuprimido
p.c.: Peso corporal
IL-3: Interleuquina 3
IL-7: Interleuquina 7
GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos
CFU-S: Unidades formadoras de colonias endógenas en el bazo
CMH: Célula madre hematopoyética
CPH: Célula progenitora hematopoyética
RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
1
1. INTRODUCCIÓN
La hematopoyesis es el proceso de formación, desarrollo y maduración de
eritrocitos, leucocitos y plaquetas a partir de un precursor celular común e
indiferenciado conocido como célula madre que en el adulto se encuentra en
la médula ósea. Estas células requieren de un microambiente específico
conocido como estroma medular y de factores de crecimiento hematopoyético
(FCH) para su normal evolución. Los FCH son un conjunto de proteínas
llamadas citoquinas que actúan sobre las poblaciones inmaduras potenciando
su maduración y proliferación. Entre las más importantes están: Factor
Estimulador de Colonias Granulocito-Macrófago (GM-CSF), Factor Estimulador
de Células Precursoras (SCF), IL-3, IL-7 y Eritropoyetina (Epo) (Abbas, 2008;
Mayani et al., 2007).
La médula ósea es un lugar de continua proliferación y renovación de
células sanguíneas, por lo tanto es el órgano más afectado durante cualquier
terapia de inmunosupresión con fármacos citotóxicos como la ciclofosfamida.
La pérdida de células madre y la incapacidad de regeneración de nuevas
células sanguíneas de la médula ósea se traducirán en anemia, leucopenia y
trombocitopenia (Anderson et al., 1995; Haubitz, 2007). Actualmente, se están
aplicando estas drogas antineoplásicas en combinación con varios agentes
detoxificantes e inmunomoduladores con el fin de reducir o eliminar sus
efectos tóxicos adversos (Jena et al., 2010).
En los últimos años se está produciendo una tendencia de rápido
crecimiento mundial hacia la revalorización de los conocimientos sobre el uso
de plantas tradicionales, por sus posibles efectos medicinales y/o
nutricionales. Muchas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional han
demostrado poseer actividades moduladoras de la médula ósea,
contrarrestando los efectos tóxicos de las radiaciones y drogas
antineoplásicas, además de mejorar los mecanismos inmunológicos
encargados de combatir las células malignas y proteger al organismo de las
2
Lepidium meyenii Walpers (maca) es una especie nativa adaptada a las
condiciones extremas existentes en los pisos ecológicos más altos de la
cordillera de los Andes Centrales del Perú. Es apreciada por su alto valor
nutritivo y energético, por lo que su importancia económica está vinculada
principalmente a sus propiedades revitalizantes, vigorizantes y estimulantes de
la reproducción (Obregón, 1998).
Es así como en los últimos años se han evaluado científicamente muchas
de sus propiedades, confirmando las mencionadas y aportando otras (Wanga
et al., 2007; Gonzales, 2012). Se comprobaron sus propiedades antitumorales
e inmunomoduladoras, al estimular tanto la respuesta inmune humoral como
celular (Alzamora, 2003; Alzamora et al., 2004). Sobre los estudios de la maca
en la hematopoyesis se reportaron que el extracto acuoso de maca ecotipo
amarillo favoreció significativamente el incremento de glóbulos blancos,
hemoglobina y recuento de células de médula ósea (Torres, 2008), en
animales inmunosuprimidos con 50 mg/kg de ciclofosfamida, señalando un
posible efecto estimulatorio en las células madre/progenitoras
hematopoyéticas, que la convierte en un recurso con potencial
quimioprotector.
Dado que estas células inmaduras responden a una serie de citoquinas
hematopoyéticas del estroma medular, importantes en la regulación de la
proliferación y diferenciación a células maduras, el estudio de estas citoquinas
es importante para dilucidar el mecanismo de acción de la maca a nivel
hematopoyético. Por lo que en este estudio se evaluará el efecto de la maca
sobre la expresión génica de tres citoquinas hematopoyéticas (IL-3, IL-7 y
GM-CSF) en un modelo de mielosupresión murina, y de esta manera se
proporcionará el soporte básico-molecular, indispensable para la explicación
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Lepidium meyenii WALPERS (MACA)
Es un cultivo tradicional de los Andes Centrales Peruanos, que crece y se
desarrolla en los ecosistemas Suni y Puna de los departamentos de Junín y
Pasco, en altitudes que oscilan entre los 3700 hasta los 4450 m.s.n.m. Es una
planta que reúne calidad alimenticia, alta productividad y adaptación a
condiciones ecológicas extremas donde otro cultivo no podría prosperar,
debido a las bajas temperaturas, heladas, granizadas y sequías; por lo que es
considerada la única especie del género Lepidium domesticada en los Andes
(Obregón, 1998). La maca fue un producto valioso para los incas, no solo por
su alto valor nutricional sino por su uso medicinal, especialmente como
revitalizante, afrodisiaco y potenciador de la fertilidad, razón por la cual esta
planta era considerada en la categoría de las plantas mágicas en los ritos que
los Incas y sus descendientes realizaban (Tello et al., 1992).
Los cultivares de maca que existen en la actualidad se diferencian
principalmente por el color externo del hipocótilo (ecotipos), que es la porción
comestible y pueden ser blancos, amarillos, negros, rojos y morados, siendo
los amarillos los más consumidos y de mayor producción. La diversidad de
esta coloración se debe principalmente a la presencia de antocianinas y
probablemente a xantofilas (Yllescas, 1994; Obregón, 1998). La población
nativa peruana de los Andes Centrales consume los hipocótilos de la maca
después de hacerlas secar naturalmente y en cantidades de 20 - 50 g/diario.
Los hipocótilos secos son consumidos preferentemente hervidos en agua o
leche, en forma de jugos o cocteles (Vílchez, 2001).
El nombre científico Lepidium meyenii Walpers fue designado por el doctor
Gerhard Walpers en 1843, en base a la observación de un espécimen silvestre
de la planicie de Pisacoma en Puno; sin embargo en 1989 la doctora Gloria
Chacón señaló que no había correspondencia entre los caracteres botánicos
4
las características de Lepidium meyenii Walpers, razón por la cual planteó la
necesidad del cambio del nombre a Lepidium peruvianum Chacón (Chacón,
1990), por lo que el nombre científico de la maca fue cuestionado a partir de
ese momento. Sin embargo en el 2011, el Doctor Destéfano y colaboradores,
determinaron mediante el análisis de código de barras de DNA del cloroplasto,
que ambos "especímenes" cultivado y silvestre, eran prácticamente lo mismo,
por lo que señalaron que no habría necesidad de cambiar el nombre
designado por el doctor Walpers (Destéfano, 2011).
Los análisis bromatológicos realizados a la maca comprobaron su alto valor
nutricional por su alto contenido de macro y micronutrientes, por lo que es
utilizada como suplemento alimenticio. Se concluye que su valor nutricional es
comparable al de cereales como maíz, arroz y trigo, superando en contenido
calórico, proteínas y carbohidratos a otros vegetales, además presenta un
contenido proteico superior a otros hipocótilos y tubérculos, y altos valores de
calcio y hierro. Entre otros nutrientes encontrados están los lípidos, fibras,
vitaminas y aminoácidos esenciales (Fairlie et al., 1999; Canales et al., 2000,
Bianchi, 2003).
En 1961 se reportó por primera vez la presencia de alcaloides, glucósidos,
taninos y saponinas (Castaño, 2008). Las investigaciones fitoquímicas
mencionan principalmente:
Alcaloides, hasta 4 fracciones macaína 1, 2 3 y 4 (Dini et al., 1994)
actualmente identificados como: (1R,3S)-1
methyltetrahidro-b-carboline-3-oic-acid, un derivado de la dihidropiridina (macaridina) y dos de tipo
imidazólico (lepidilina A y lepidilina B) y (Cui et al., 2003; Muhammad et
al., 2002).
Glucosinolatos: Benzylglucosinolato (Glucotropaeolin) y m-methoxybenzylglucosinolato (Dini et al., 2002). Otros investigadores
afirman la presencia de 8 glucosinolatos (Valentová y Ulrichová, 2003).
Isotiocianatos, producto de la hidrólisis de los glucosinolatos, por acción
de la mirosinasa. Son responsables del fuerte olor y sabor picante de la
5
Macaeno y Macamidas (alkamidas benziladas), son ácidos grasos poli-insaturados (Zhao et al., 2005).
Además de esteroles (Gutiérrez et al., 2009), antocianinas, flavonoides
(Sandoval et al; 2002), taninos y saponinas (Yllescas, 1994).
Algunas de las propiedades atribuidas a la maca han sido comprobadas
científicamente en base a experimentos con animales y humanos, la mayoría
realizados con maca ecotipo amarillo, por ser el más abundante en las
cosechas (Gonzales, 2012): En ratas se demostró que la maca revierte
parcialmente el efecto deletéreo de acetato de plomo y de la altura sobre la
espermatogénesis (Rubio et al., 2006; Gonzales et al., 2004). En humanos, se
reportó que la maca gelatinizada mejora el recuento, movilidad de
espermatozoides y el deseo sexual en varones adultos, pero los efectos
reproductivos son independientes de cambios hormonales, puesto que estos
no se modifican (Gonzales et al., 2003), en mujeres se reportó que reduce los
síntomas psicológicos y la disfunción sexual de la post-menopausia, pero
independiente de la actividad estrogénica y androgénica (Brooks et al., 2008).
También se reportó que la maca favorece la tasa de crecimiento y
supervivencia de peces juveniles (Lee et al., 2004) y que presenta un efecto
favorable para el tratamiento de la osteoporosis, al mejorar la densidad ósea y
restaurar la red trabecular en un modelo de ratas ovariectomizadas tratadas
con extracto etanólico de maca (Zhang et al., 2006). Otros estudios
demostraron el potencial antioxidante del extracto acuoso de maca, por su
capacidad de atrapar los radicales libres y proteger a las células contra el
estrés oxidativo (Sandoval et al., 2002), no inducir hemólisis de eritrocitos
(Rosas y Pino, 2005), no ejercer efectos citotóxicos en cultivos de hepatocitos
con dosis crecientes de maca (Valentová et al., 2006) y revertir los parámetros
lipídicos, de glucosa y el nivel de enzimas anti-oxidantes en ratas con
hipertrigliceridemia hereditaria, alimentadas con maca como suplemento
dietario (Vecera et al., 2007). Además, que el extracto acuoso favorece la
respuesta del organismo en una situación estresante y físicamente extenuante
6
antioxidantes del cerebro en ratas recién destetadas, proponiendo a la maca
como un adaptógeno (Oré et al., 2011).
Esta planta también ha demostrado poseer actividades
inmunomoduladoras, estimulando tanto la respuesta inmune humoral y celular.
Se ha demostrado que la administración oral del extracto clorofórmico de
maca ecotipo amarillo en ratones Balb/c, conduce a un incremento del título de
anticuerpos y de la capacidad fagocítica, favorece la recuperación de la
respuesta celular natural en animales inmunosuprimidos con metilprednisona y
estimula la producción de óxido nítrico en cultivos de macrófagos peritoneales.
Resultados similares se obtuvieron con el extracto acuoso (Alzamora, 2003;
Alzamora et al., 2004; 2007).
2.2 HEMATOPOYESIS Y CITOQUINAS
Es el proceso a través del cual se generan las células de la sangre y ocurre
bajo condiciones muy específicas en la llamada médula ósea, donde las
células hematopoyéticas se desarrollan en un ambiente específico
denominado microambiente hematopoyético, que consiste en una estructura
tridimensional altamente organizada de células del estroma (macrófagos,
fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, células endoteliales, entre otras), células
accesorias (linfocitos) y sus productos (matriz extracelular, citoquinas,
quimiocinas entre otras) que regulan la sobrevida, autorenovación,
proliferación, maduración y migración de las células hematopoyéticas y resulta
en una progresión ordenada del sistema hematopoyético. Dicho
microambiente es crucial para la regulación de la hematopoyesis y la
alteración de algunos de sus componentes puede contribuir al desarrollo de
enfermedades hematológicas (Mayani et al., 2007; Ruiz, 2009).
El sistema hematopoyético está formado por diferentes tipos celulares
organizados jerárquicamente, y se pueden agrupar en:
7
multipotencialidad. Solo una pequeña parte de su población se
encuentra en ciclo celular (1 al 25%) en consonancia con las
necesidades hematopoyéticas del momento, el resto se encuentra en
estado de quiescencia.
Células progenitoras hematopoyéticas (CPH) (0.5%), han perdido su
capacidad de autorenovación pero conservan su potencial proliferativo,
pueden ser multi, bi o mono-potenciales. La mayoría de ellas (55 al
75%) están en ciclo celular, por lo tanto son las más afectadas por las
drogas citotóxicas.
Células precursoras (>90%) son inmaduras, tienen escasa actividad proliferativa, pueden ser identificadas en los frotis de médula ósea
Células maduras, son diferenciadas, tienen una identidad y función
definitiva.
Las células progenitoras son las que proliferan a gran escala, proveyendo
billones de células sanguíneas por día que son necesarias para mantener la
homeostasis en el individuo; pero cuando el número de estas células
disminuyen, por ejemplo a causa de una terapia mieloablativa, las células
madre hematopoyéticas son liberadas de su inhibición y comienzan a dividirse
y diferenciarse según los requerimientos del organismo (Mera et al., 2007;
Welsch, 2010).
La hematopoyesis no solo puede ocurrir en la médula ósea sino también en
órganos fuera de ella, siempre que el lugar contenga células estromales donde
se puedan acomodar las CMH/CPH y una producción local de citoquinas
hematopoyéticos que mantengan e induzcan la diferenciación de CMH/CPH, a
esto se lo conoce como hematopoyesis extramedular y en el humano puede
ocurrir en condiciones patológicas. A diferencia del humano, la hematopoyesis
extramedular persiste en la vida adulta del ratón y el bazo constituye el
principal sitio de hematopoyesis extramedular, donde las CMH/CPH presentes
en la pulpa roja, no solo circulan sino también residen, aunque su número es
inferior a los de la médula ósea, ellas contribuyen a la hematopoyesis en
condiciones de estrés, formando colonias macroscópicas que son visibles
8
reacción compensatoria a la mielosupresión inducida por drogas citotóxicas,
ya que la médula ósea se vuelve inadecuada para mantener la hematopoyesis
normal (Oziemlak, 2005; Herbert et al., 2008; Massberg y Von Adrian 2009;
Kim, 2010).
Las citoquinas son piezas claves en la regulación de la hematopoyesis,
porque son capaces de inducir la sobrevivencia y proliferación de células
progenitoras, conduciéndolas hacia linajes específicos; además de ser
responsables de las acciones fisiológicas de las células maduras de la sangre.
Son glicoproteínas, en general de bajo peso molecular, liberadas por las
células del estroma y las células accesorias y actúan como mediadores
celulares, a través de receptores específicos que se encuentran en la
superficie de la célula diana hematopoyética. La unión de la citoquina a su
receptor inicia una cascada de fosforilación con la activación de varias vías de
señalización como las JAK/STAT cinasa y RAS/MAP cinasa. Mientras algunas
de ellas tienen un amplio rango de acción sobre muchas progenitoras
primitivas conduciéndolas a un aumento de todas las líneas celulares y a su
diferenciación; otras actúan de una manera más restringida, en líneas
celulares específicas comprometidas o diferenciadas (Soto et al., 1999; Roitt et
al., 2008; Abbas et al., 2008).
La Interleuquina 3 (IL-3) también conocida como factor estimulador de colonias de multi-linajes, es producida principalmente por los linfocitos T
activados y actúa sobre las células progenitoras muy primitivas, expandiendo y
preparando esta población para la exposición posterior al GM-CSF y otros
factores de crecimiento, estimulando su diferenciación hacia la línea mieloide
(Córdova, 2003). Además, participa en la supervivencia de las células
hematopoyéticas y regulación de las funciones efectoras de las células
mieloides diferenciadas en su estado terminal. En el ratón, el gen de la IL-3
esta codificada en el cromosoma 11, tiene un tamaño de 2.2 Kb y posee 5
exones. Su mRNA tiene un tamaño de 849 bp, su cadena polipeptídica
contiene 166 residuos de aminoácidos (Nimer y Uchida, 1995; Hara y
9
El Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) induce la diferenciación y proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas de granulocitos/macrófagos. Además, regula la
supervivencia y función de varias líneas celulares maduras (granulocitos,
neutrófilos y células dendríticas) y funciona como un mediador inflamatorio,
actuando sobre un número de diferentes tipos celulares y modulando su
función celular como presentadora de antígeno. Un amplio rango de tipos
celulares puede producir GM-CSF, pero a menudo requieren de estímulos.
Células T, macrófagos, células endoteliales, fibroblastos y mastocitos son
ejemplos de células que secretan GM-CSF luego de una estimulación. En el
ratón, el gen para GM-CSF está ubicado en el cromosoma 11, con 4 exones y
su mRNA posee un tamaño de 1,033 bp. Pertenece a la misma familia de la
IL-3 (Guthridge et al., 1998; Shi et al., 2006; Hercus et al., 2009).
La Interleuquina 7 (IL-7) es una glicoproteína de 20-28 KD, producida por las células estromales del timo, medula ósea, y los órganos linfoides
secundarios. Es una citoquina pleitrópica pero no redundante, es decir
absolutamente necesario para el desarrollo de los linfocitos T y B en el ratón, y
T en el humano. Además, regula la homeostasis periférica de las células T
vírgenes y de memoria. El gen de la IL-7 murino consiste aproximadamente de
42 kb y está localizado en el cromosoma 3, posee 5 exones y su mRNA tiene
un tamaño de 2,475 bp (Fry y Mackall, 2005; Huang y Luther, 2012; Ceredig y
Rolink, 2012).
2.3 CICLOFOSFAMIDA
La ciclofosfamida (CF) es una de las drogas alquilantes más utilizada en
los protocolos quimioterapeúticos debido a su amplio espectro antitumoral, en
la prevención de rechazo de injertos y el tratamiento de algunas enfermedades
autoinmunes; y puede ser empleada sola o en combinación con otros
productos. Debe ser metabolizada por las enzimas microsomales del hígado
para ejercer sus efectos citostáticos, a través de sus dos metabolitos
alquilantes: Fosforamida y Acroleína. Gran parte de sus efectos se debe a la
10
células cancerosas sino también a otras células con proliferación activa como
los del sistema hematopoyético (CMH/CPH), gastrointestinal, epitelial, folículos
pilosos y las glándulas genitales. Por lo que la quimioterapia conlleva a varios
efectos tóxicos e implicaciones clínicamente significantes como la leucopenia,
anemia y daño intestinal, causales de la discontinuación del tratamiento
(Anderson et al., 1995; Liberman et al., 2008; Llopis, 2009).
La supresión de las funciones de la médula ósea o mielosupresión es uno
de los efectos adversos más frecuentes y limitantes de la administración de
ciclofosfamida, aunque es reversible implica la interrupción del tratamiento
hasta que los valores leucocitarios estén dentro del rango normal permitido
para la aplicación de otra dosis. La supresión de la médula ósea se produce
debido a la constante renovación de las células hematopoyéticas, que las hace
muy vulnerables a los citostáticos, y se refleja en anemia, leucopenia y
trombocitopenia en los recuentos de sangre periférica, que pueden llevar a
una inadecuada función inmunológica, infecciones severas e incluso la muerte
(Haubitz, 2007).
Salem et al. (2012) reportaron que la administración de 4 mg ciclofosfamida
(aproximadamente 150 mg/kg p.c.) a ratones C57BL/6, en dosis única, induce
una profunda leucopenia en la periferia entre los días 3 a 15, y en bazo y
médula ósea entre los días 3 a 6 (al 9no día hay un rebote, al 12avo día se
evidencia completa recuperación). En la fase de recuperación, el retorno a los
valores normales conlleva primero a un incremento significativo de células
mieloides en el bazo y médula ósea en el 9no día (efecto rebote), retornando a
los valores normales el 12avo día, los linfocitos B demoran 3 semanas en
recuperarse, de ahí la efectividad de la CF en el tratamiento enfermedades
autoinmunes.
Sefc et al. (2003) en un trabajo realizado con ratones C57B1/10SnPh
inoculados con 135 mg/kg de CF, dosis única, reportaron que la celularidad de
la médula ósea retornó a los valores normales absolutos después de 6 a 7
días, aunque la composición celular se mantuvo alterada hasta el día 14. El
11
eliminados, y el incremento de celularidad del bazo 5 días post-CF se debe
principalmente a la expansión de las células mieloides, que está relacionada
con el incremento significativo de las células progenitoras en el bazo (que
pasa del 4% al 69%), acompañado con una reducción de ellas en la médula.
Actualmente, se están aplicando estas drogas antineoplásicas en
combinación con varios agentes detoxificantes e inmunomoduladores, como
son los factores de crecimiento hematopoyético sintéticos (G-CSF, GM-CSF,
eritropoyetina, etc) y los agentes citoprotectores (Amifostina) con el fin de
acelerar la recuperación hematopoyética y/o evitar daños citotóxicos, y así
permitir un tratamiento más drástico y por ende más eficaz (Krawczenko et al.,
2005; Meenu, 2008; Jena et al., 2010).
2.4 EMPLEO DE PLANTAS COMO PROTECTORES FRENTE A DROGAS CITOTÓXICAS
Muchas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional poseen efecto
protector demostrado frente a la toxicidad de las radiaciones y drogas,
sugiriendo sus potenciales usos como suplemento alimenticio en pacientes
cuyo sistema hematopoyético se ve alterado por la quimio/radioterapia
(Bhushan y Manish, 2007).
La administración de los constituyentes de 4 plantas chinas (Fórmula
Si-Wu-Tang) en ratones irradiados, resultó en un incremento del recuento
leucocitario y de todos los progenitores hematopoyéticos de la médula ósea,
que son afectados por la irradiación (Liang et al., 2006). Por otro lado, se
demostró la eficacia de Myelophil que es una mezcla de extractos de Astragali
radix y Salviae radix, en incrementar los parámetros hematológicos, el
recuento de progenitores hematopoyéticos en ensayos clonogénicos y
sobre-regular la expresión de IL-3 en el bazo de ratones inmunosuprimidos con una
dosis de 0.3 g/kg de 5-Fluorouracilo (Shin et al., 2008).
Patra et al. (2012) reportaron que la administración previa de los
12
inmunosuprimidos con 50 mg/kg de CF redujo la hipocelularidad inducida por
CF en el bazo, médula ósea y sangre periférica, lo que se correlaciona con la
reducción de células hiploides e incremento de los niveles de enzimas
anti-oxidantes, reduciendo el estrés oxidativo hepático y medular producto del
metabolismo de la CF. Otro estudio señaló que el extracto acuoso de Polygoni
multiflori rico en polisacáridos, es capaz de incrementar significativamente los
niveles de IL-2, parámetros hematológicos, perfil anti-oxidante y promover la
hematopoyesis esplénica mediante la sobreexpresión del receptor de la
eritropoyetina y el factor de transcripción GATA-1 en animales
inmunosuprimidos por aplicación de 40 mg/kg/día de CF durante 5 días
consecutivos (Chen et al., 2012).
Con respecto Lepidium meyenii, se reportó que el extracto acuoso de maca
ecotipo amarillo en una dosis de 300 mg/kg p.c., favorece significativamente el
incremento de glóbulos blancos, hemoglobina y recuento de células de médula
ósea) en animales inmunosuprimidos con 50 mg/kg de ciclofosfamida (Torres,
2008), los mismos resultados se observaron con el extracto metanólico de
maca ecotipo morado, señalando por primera vez un posible efecto
estimulador de la maca sobre la hematopoyesis (Alvarez, 2008).
Aunque la administración de dosis subletales de CF conlleva a una
profunda supresión de la respuesta humoral, celular y de la médula ósea; el
tiempo y duración de la mielosupresión depende no sólo de la dosis empleada,
sino también del organismo (edad, estado nutricional, funcionamiento de la
médula), una recuperación rápida implica una menor probabilidad de contraer
infecciones severas y continuar con otro ciclo de inmunosupresión.
13
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1 Hipótesis
El extracto acuoso de Lepidium meyenii (maca) estimula la producción de
mRNA para tres citoquinas hematopoyéticas: Interleuquina 3, Factor
estimulador de colonias de granulocitos / macrófagos e Interleuquina 7 en
ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
3.2 Objetivo General
Determinar la producción de mRNA para citoquinas hematopoyéticas (IL-3,
GM-CSF e IL-7) en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida y
tratados con extracto acuoso de Lepidium meyenii Walpers (maca).
3.3 Objetivos específicos
3.3.1 Elaborar el extracto acuoso de maca y realizar la identificación fitoquímica de sus principales componentes.
3.3.2 Determinar la dosis óptima de inmunosupresión con ciclofosfamida en ratones.
3.3.3 Demostrar el efecto del extracto acuoso sobre la producción de mRNA para las tres citoquinas hematopoyéticas en el bazo y la médula ósea
de ratones inmunosuprimidos.
3.3.4 Demostrar el efecto modulador del extracto acuoso sobre la proliferación celular y producción de mRNA para las tres citoquinas
hematopoyéticas en cultivos de células mononucleares de la médula
ósea.
3.3.5 Determinar la influencia del tratamiento con el extracto sobre la proliferación de las células hematopoyéticas de ratones
14
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 ELABORACIÓN DEL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA E
IDENTIFICACIÓN FITOQUÍMICA DE SUS PRINCIPALES
COMPONENTES
4.1.1 Elaboración del extracto acuoso de maca
Se trabajó con hipocótilos de maca, ecotipo amarillo, procedentes del Valle
de Junín, Departamento de Junín. Los hipocótilos de maca fueron
seleccionados según su estado de conservación y luego se procedió a
limpiarlos, cortarlos en pequeños trozos, secarlos a 45°C por 48 horas y
pulverizarlos con la ayuda de un molino (Figura 1). La harina de maca
obtenida se mezcló con agua destilada (1:10 P/V respectivamente) y se
sometió a hervido durante 15 minutos. Luego de enfriar, la mezcla se
centrifugó a 2000 rpm x 10 minutos y se recolectó el sobrenadante en placas
petri de plástico, en total esterilidad, que fueron puestas dentro de un
deshidratador hasta total evaporación del agua. El residuo seco, que es el
extracto acuoso deshidratado, se recolectó mediante raspado en un frasco y
se almacenó a 4°C (Figura 2).
Figura 1. Hipocótilos del Lepidium meyenii Walpers (maca), ecotipo amarillo. Los hipocótilos fueron cortados en pequeños trozos empleando un
15 Figura 2. Elaboración del EAc de maca.
A. Sobrenadante proveniente del hervido de la harina de maca. B. Residuo seco de maca, después de la evaporación total del agua.
4.1.2 Identificación fitoquímica de los principales componentes del EAc
Para la identificación de algunos de los componentes del EAc de maca, se
preparó una solución de trabajo, para ello se disolvió el extracto acuoso en agua destilada a la dosis de 30 mg/ml, que corresponde a la dosis de 200
mg/kg de peso corporal promedio de un ratón. Se utilizaron los procedimientos
descritos en algunos libros de investigación fitoquímica (Lock, 1994; Sharapin,
2000; Marcano y Hasegawa, 2002).
Carbohidratos. A 2ml de la solución de trabajo se le adicionó 2 gotas del reactivo de Molish (alfa-naftol al 1% en etanol 95%), y por las paredes del tubo
se depositó cuidadosamente 2 ml de H2SO4 concentrado, la prueba es positiva
para carbohidratos totales si se forma un anillo violeta en la interface. La
identificación de almidones, se realizó adicionando 2 gotas del reactivo de
Lugol (KI al 0,06% e I al 0,04% en H20dd) a 2 ml de la solución, la aparición de
color violeta indica reacción positiva. Se procedió a determinar la
16
mediante el método colorimétrico fenol/H2SO4. Para ello se diluyó 10 µl de la
solución de trabajo con 990 µl de H2Odd, a la dilución se le adicionó 500 µl del
reactivo fenol (fenol al 5% en H20dd) y 2,5 ml de H2SO4, después de mezclar se
dejó reposar por 10 minutos en oscuridad, para luego llevar los tubos a baño
maría por 30 minutos a 30°C. Cumplido el tiempo se realizó la lectura a 492
nm. La concentración de carbohidratos en mg/ml se determinó usando como
estándar una curva de glucosa.
Proteínas. Se mezclaron 250 µl de la solución de trabajo con 2,5 ml del
reactivo Bradford, se dejó reposar por 2 minutos y se realizó la lectura a 595
nm en espectrofotómetro. Se determinó la concentración de proteínas en
mg/ml mediante una curva estándar para seroalbúmina bovina.
Flavonoides. A 2ml de la solución de trabajo se le adicionó 0,5 ml de NaOH al 30%, el cambio de color de la solución a amarillo intenso es indicativo de la
presencia de flavonoides. Luego se determinó la concentración de flavonoides
(flavonoles y antocianinas) mediante el método de Lees y Francis (1972): A
0,5 gramos del extracto acuoso deshidratado, se le adicionó 9,5 ml de alcohol
acidificado (HCl 1,5 N en etanol 95%, en proporción 85:15 v/v). Se
homogenizó bien y se dejó macerar en refrigeración durante toda una noche.
Al cabo del tiempo, se filtró el macerado con papel Whatman N°1 y se
completó el volumen a 100 ml. Después de incubar la muestra en oscuridad
por 2 horas, se midió la absorbancia del filtrado a 374 nm (flavonoles) y 535
nm (antocianinas) en un espectrofotómeto. Se utilizaron las siguientes
fórmulas:
Flavonoles (mg/g extracto) = (A x V) / (98,2 x W)
Antocianinas (mg/g extracto) = (A x V) / (76,5 x W)
Donde:
A = Absorbancia
V = Volumen total del extracto en ml
17
Alcaloides. Se disolvieron 0,5 gramos del extracto acuoso deshidratado en 10
ml de HCl 10% y se calentó la mezcla por 10 minutos a 60 °C. Después de
dejar enfriar, se filtró la mezcla con papel Whatman N°1 y se procedió a lavar
el papel filtro con 10 ml de HCl 10%. El filtrado resultante se utilizó para las
pruebas de alcaloides, en donde a cada 2 ml del filtrado se añadió 3 gotas del
reactivo de Hager (ácido pícrico saturado) o Mayer (MgCl2 al 1.4% y KI al 5%
en H2Odd). Se consideran como positivas, las pruebas en las que aparece una
turbidez definida (Mayer) o precipitado blanquecino (Hager y Mayer).
Triterpenos / esteroles. Se disolvieron 0,5 gramos del extracto en 3 ml de H2SO4 y se dejó macerar durante 10 minutos. Se tomó 1 ml de la suspensión y
se mezcló con 1ml de anhidrido acético, se formaron 2 fases. La presencia de
un anillo guinda en la interfase es indicativo de triterpenos y de una fase
superior verdosa es indicativo de esteroles (López-Casamayor, 2007).
Taninos. A 1 ml de la solución de trabajo se le adicionó 250 µl de solución
FeCl3 (FeCl3 al 5% en HCl 0,5N), el viraje de color a azul-negruzco o
pardo-verdoso es indicativo de la presencia de taninos.
Saponinas. Se tomaron 10 ml de la solución de trabajo, se agitó vigorosamente por 5 minutos. La prueba se considera positiva si aparece
espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persiste por
más de 2 minutos.
Todas las lecturas de absorbancia se hicieron empleando el espectrofotómetro
18
4.2 INMUNOSUPRESIÓN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA
4.2.1 Animales de experimentación
Se utilizaron ratones hembras Balb/c, de 4 semanas de edad, con pesos
promedios de 25 gramos, procedentes del Instituto Nacional de Salud y se
observaron durante una semana para confirmar su buen estado de salud.
Todos los ratones fueron mantenidos en condiciones estándar de temperatura,
humedad y luz y recibieron ad libitum agua y alimento balanceado para
roedores (UNALM). El manejo de los animales se hizo en base al código de
ética sobre experimentación animal y en los principios éticos internacionales
que guían la investigación biomédica con animales.
4.2.2 Determinación de la dosis óptima de inmunosupresión con ciclofosfamida
El inmunosupresor empleado fue la ciclofosfamida en polvo estéril
(NEOPHOS 200). Se trata de una droga antineoplásica sintética, del tipo de
las mostazas nitrogenadas; se presenta como un polvo blanco cristalino,
soluble en agua, solución fisiológica y etanol. Su nombre químico es 2-[bis
(2-cloroetil) amino] tetrahidro-2H-13,2-oxazafosforina 2-oxido monohidrato; su
fórmula molecular es C7H5C12N2O2PH2O y su peso molecular es 279,1. Este
profármaco requiere su bioactivación en los microsomas hepáticos para
ejercer su mecanismo de acción, que se basa en la alquilación de las bases
nitrogenadas del DNA. La alquilación provoca la pérdida de la configuración
espacial de las cadenas de DNA e imposibilita su síntesis durante la mitosis y
de esta forma ocasiona la muerte celular.
Con la finalidad de escoger la dosis adecuada para inducir supresión de la
función de la médula ósea sin poner en riesgo la vida del animal, y evaluar los
resultados en la fase inicial de recuperación post-inmunosupresión con
ciclofosfamida (post-IS), se realizó un estudio piloto con tres ratones cada
grupo, probando tres dosis diferentes de ciclofosfamida: 65, 130 y 200 mg/kg
19
evaluación se realizó a los 2, 5 y 7 días después de la inmunosupresión, se
obtuvieron suspensiones celulares de la médula ósea de los fémures de cada
ratón y se realizó el recuento al microscopio, utilizando una cámara de
Neubauer de las suspensiones medulares diluidas en solución de TURK, que
hemolisa a los eritrocitos. Se eligió la dosis de 130 mg/ kg pc de ciclofosfamida
y realizar la evaluación a los 2 y 5 días después de la inmunosupresión.
4.2.3 Tratamiento con el extracto acuoso de maca
Se formaron 6 grupos de 12 ratones cada uno, de acuerdo a la siguiente
relación:
Grupo IS2d – EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 2 días
después de la inmunosupresión, recibieron tratamiento con EAc de maca Grupo IS2d – Sin EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 2 días
después de la inmunosupresión, no recibieron tratamiento con EAc de
maca
Grupo IS5d – EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 5 días
después de la inmunosupresión, recibieron tratamiento con EAc de maca Grupo IS5d – Sin EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 5 días
después de la inmunosupresión, no recibieron tratamiento con EAc de
maca
Grupo EAc : No inmunosuprimidos, recibieron tratamiento con EAc de maca
Grupo Sin EAc : No inmunosuprimidos, no recibieron tratamiento con EAc de maca
Se preparó una dilución del extracto acuoso (EAc) deshidratado, en agua
bidestilada estéril a una dosis de 200 mg/kg de peso corporal (p.c). La dosis
de EAc contenida en un volumen de 0,2 ml, se aplicó diariamente por vía oral,
en una solo dosis, a los ratones de los grupos IS2d-EAc, IS5d-EAc y EAc
durante todo el experimento, que tuvo una duración de 2 meses (Figura 3).
Los otros 3 grupos (IS2d-Sin EAc, IS5d-Sin EAc, Sin EAc) sólo recibieron
20
grupos IS2d-EAc, IS2d-Sin EAc, IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc recibieron una
dosis de 130 mg/kg de peso corporal de ciclofosfamida (NEOPHOS 200)
contenida en 0,2 ml, por vía intraperitoneal. Los ratones de los grupos
IS2d-EAc e IS2d-Sin IS2d-EAc fueron sacrificados por dislocación cervical, 2 días
después de la inmunosupresión. A diferencia de los ratones de los grupos
IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc, que fueron sacrificados 5 días después de la
inmunosupresión. El protocolo de tratamiento con el extracto acuoso para los
ratones inmunosuprimidos y no inmunosuprimidos se presenta en la Tabla 1.
21
MES SEMANA Dosis Extracto
(200 mg/kg p.c.)
1
1 Si
2 Si
3 Si
4 Si
2
5 Si
6 Si
7 Si
8 DÍA
1 Si
2 Si / Inmunosupresión con CF (130 mg/kg pc)
3 Si
4 IS2d – EAc e IS2d – Sin EAc Si / Evaluación de grupos
5 Si
6 Si
7 IS5d – EAc e IS5d – Sin EAc Si / Evaluación de grupos
Tabla 1. Protocolo empleado para el tratamiento con el extracto acuoso de maca en ratones hembras balb/c. La inmunosupresión con CF se realizó en la
última semana del experimento.
4.2.4 Determinación del daño hepatocelular producido por CF en los animales de experimentación
Puesto que el hígado es un lugar primario de biotransformación de
compuestos extraños, también es particularmente vulnerable a ellos. Con el
objetivo de comprobar que el consumo del extracto acuoso de maca
preparado en este experimento no resultó tóxico para los ratones y evaluar si
tiene algún efecto protector frente al daño hepático producido por la
ciclofosfamida, se midieron los niveles séricos de la transaminasa glutámico
22
Las transaminasas son enzimas que catalizan la transferencia reversible de
un grupo amino entre un aminoácido y un cetoácido. La transaminasa
glutámico pirúvica (TGP) es una enzima citosólica que se encuentra en altas
concentraciones en el hígado. La lesión hepatocelular desencadena la
liberación de esta enzima en la circulación, por lo que constituye un excelente
marcador de la lesión hepatocelular (Alvarez, 2005).
Al finalizar el experimento, se tomaron muestras de sangre por punción
cardiaca en tubos sin anticoagulante de cada animal. Los tubos se
centrifugaron a 3500 rpm por 10 minutos para la obtención del suero. Los
niveles séricos de la TGP se determinaron según el procedimiento señalado
en el inserto del Kit diagnóstico Transaminasas color (Valtek diagnostic). El
fundamento del método es el siguiente: Las transaminasas del suero
reaccionan con el substrato, formando el producto piruvato que reacciona con
2,4 dinitrofenilhidrazina, generando en medio alcalino una hidrazona coloreada
que se lee a 505 nm. La cantidad de transaminasas en el suero se determinó
por interpolación de las absorbancias en la curva de calibración del reactivo
estándar. Se descartaron las muestras con hemolisis visible, ya que se pueden
obtener valores falsamente elevados.
4.3 EVALUACIÓN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE mRNA PARA IL-3, GM-SCF e IL-7 EN EL BAZO Y LA MÉDULA ÓSEA DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
4.3.1 Análisis semicuantitativo de la expresión de mRNA de las citoquinas IL-3, GM-SCF e IL-7 del bazo
Las suspensiones del bazo fueron obtenidos por presión del órgano con
ayuda de un émbolo para disgregar el tejido y liberar las células, dentro de una
placa petri con 5 ml de medio RPMI. Se juntaron las suspensiones celulares
de 3 ratones por grupo (se tomaron 500 µl de suspensión del bazo de cada
23
electroforesis, su pureza y concentración por espectrofotometría y realizar la
transcripción reversa para la síntesis de DNA complementario.
4.3.1.1 Extracción de RNA
La extracción de RNA se realizó mediante el método de fenol-cloroformo
usando el reactivo Trizol (InvitrogenTM, Life Technologies) según el protocolo
establecido por Invitrogen. Todos los materiales de plástico utilizado en la
extracción, eran libres de RNasas, tratados con NaOH 0,5 M y autoclavados,
para evitar la degradación del RNA. Las centrifugaciones se realizaron a 4°C
en un microcentrífuga refrigerada.
Al finalizar el experimento, se obtuvieron suspensiones celulares del bazo
que fueron recolectadas en crioviales estériles que se centrifugaron a 1500
rpm por 3 minutos. Después se eliminó el sobrenadante y se adicionó 500 µl
de Trizol, luego de 5 minutos de incubación se añadió 100 µl de cloroformo y
se centrifugaron los crioviales por 15 minutos a 15000 rpm, obteniéndose tres
fases. La fase superior acuosa que contiene el RNA se retiró a otro criovial,
sobre el cual se adicionó 250 µl de alcohol isopropílico para precipitar el RNA,
formándose un pellet. El RNA precipitado se lavó dos veces con etanol al 70%,
y se dejó secar por 10 minutos, luego de resupenderlo en 50 µl de agua para
PCR, se separaron en alicuotas y almacenaron a -20°C.
4.3.1.2 Determinación de la integridad, pureza y concentración del RNA extraído
La integridad de las muestras del RNA extraído fue verificada a través de
electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %. Se mezclaron 6 µl de RNA con 4 µl
de formamida y 2 µl de buffer de carga (0,25 % de azul de bromofenol, 50% de
glicerol, EDTA 1 mM) dentro de crioviales, que se incubaron en baño maría a
60°C por 3 minutos y se pasó rápidamente al hielo. Se tomó 10 µl de cada
mezcla para cargar los pocillos del gel de agarosa en buffer TAE 1X (40 mM
tris, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA, ph 7,7). La electroforesis se llevó a
24
bromuro de etidio (0,5 µg/ml) por 5 minutos. El RNA se observó en un
transiluminador con radiación UV (Biometra TI 1). Debido a que el mRNA
comprende el 1-3% del RNA total, es difícil detectarlo incluso con los métodos
más sensible; por otra parte, el RNA ribosomal comprende más del 80% y la
mayoría son las subunidades 18s y 28s, con un peso molecular aproximado de
2 kb y 5 kb respectivamente. La presencia de dos bandas definidas (18s y 28s
de los RNA ribosomales) es indicativa de la integridad del RNA (Figura 4).
Figura 4. Electroforesis de los RNA totales de las muestras analizadas. Las fechas señalan la presencia de dos bandas de RNA ribosomales, en los carriles 3, 4, 6 y 7. El primer carril corresponde al marcador de 1kb – 10
kb.
La pureza y concentración del RNA extraído fue determinado mediante
espectrofotometría UV (UNICO modelo 2100 UV). Se preparó una dilución
1:200 en buffer TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, ph 7,5) estéril y se midió la
absorbancia en el espectrofotómetro a 260 nm y 280 nm. Con los valores de
absorbancia se calcularon la pureza y concentración de RNA, a partir de las
25
Pureza de RNA = A260 / A280
Valores entre 1,8 - 2 considera que el RNA extraído está libre de
contaminantes (proteína, sales)
Concentración RNA (µg/µl) = (A260 x 40 x Factor de dilución) / 1000
Dado que 1 unidad de Absorbancia (A) a 260 nm corresponde a 40 µg/ml
de RNA
Se consideraron las muestras de RNA que alcanzaron buenos estándares
de integridad, calidad y cantidad (Rapley y Manning, 1998).
4.3.1.3 Síntesis de DNA complementario (cDNA)
El RNA extraído fue sometido a una transcripción reversa para la síntesis
de cDNA, para lo cual se empleó el Kit High capacity RNA-to-cDNA (Applied
Biosystems), siguiendo las instrucciones del protocolo. Este Kit permite la
síntesis de DNA en solo dos pasos, ya que entre sus componentes se tiene al
Buffer mix RT 2X (contiene los dNTPs, random primers) y la Enzima mix RT 20X (contiene la enzima transcriptasa reversa Multiscribe™MuLV, proteína
inhibidora de RNAsas). Brevemente, a 40 µl de la mezcla RT (25 µl de Buffer
mix RT 2X, 2,5 ul Enzima mix RT 20X y 12,5 µl de H20) se le añadió 10 µl de
RNA (0,2 µg/µl) de manera que la concentración final de RNA sea 0,04 µg/µl.
Esta mezcla se sometió a un ciclo de síntesis de cDNA a 37°C por 60 minutos
y a un ciclo final de desnaturalización de la enzima a 95°C por 5 minutos en el
termociclador (Bioer). Una vez que terminaron los ciclos, el cDNA se almacenó
a - 20°C.
4.3.1.4 Elección de los Primers
Después de hacer una selección exhaustiva considerando el tipo de tejido
analizado y la metodología empleada, se escogieron aquellos primers que se
ajusten a los parámetros sugeridos para el diseño de primers (Apéndice IV del
protocolo Power SYBR® Green Cells-to-CT™ Kit). Se realizó un búsqueda
26
transcritos de los genes murinos de IL-3, IL-7, GM-CSF y Gliceraldehído 3
fosfato deshidrogenasa (GAPDH), donde el último fue considerado como
control de expresión constitutiva (housekeeping) para normalizar los
resultados del PCR en tiempo real (Ullmannovi y Haakovec, 2003; Willems et
al., 2006).
Las eficiencias de los primers se probaron virtualmente mediante Primer
BLAST disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast., el cual
emplea el software Primer 3 para diseñar los oligonocleótidos y después los
analiza en BLAST para evitar la formación de dímeros así como hibridaciones
inespecíficas (Figura 5) (Ye et al., 2012). Alternativamente, los primers fueron
analizados mediante la herramienta bioinformática Oligoanalyzer 3,1 para
verificar el contenido de G-C, formación de hetero - y homo - dímeros,
formación de horquillas y la determinación de su Tm, con el fin de obtener
unos primers óptimos (Cano et al., 2010). Finalmente, los primers se enviaron
a sintetizar a la casa comercial Invitrogen Life Technologies ®. La secuencia
de los primers, el tamaño esperado de los productos amplificados para cada
27
Figura 5. Resultado del análisis de los primers para IL-3 mediante el Software Primer-Blast.
Nombre
del Gen Secuencias de los primers (5´ - 3´)
Tamaño del amplicón esperado
(pares de bases)
N° de acceso Gen Bank
IL-3 FW: TACATCTGCGAATGACTCTGC
RV: GGCTGAGGTGGTCTAGAGGTT 132
NM_010556.4
GM-CSF FW: ACCACCTATGCGGATTTCAT
RW: TCATTACGCAGGCACAAAAG 146
NM_009969-4
IL-7 FW: GTGCTGCTCGCAAGTTGAAG
RW: AGTTCACCAGTGTTTGTGTGC 102
NM_008371.4
GAPDH FW: TGCACCACCAACTGCTTAGC
RV: GGCATGGACTGTGGTCATGAG 258 NM_008084
28
Con el fin de evaluar la especificidad de los primers sintetizados, se
realizaron amplificaciones por PCR convencional de los genes evaluados, esto
además permitió corroborar la calidad de los RNA totales obtenidos, así como
analizar la eficiencia de la transcripción reversa. Las amplificaciones
obtenidas se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa 2%, teñido
con bromuro de etidio. Las condiciones de amplificación por PCR convencional
se explican más adelante.
Por comparación con el marcador de peso molecular incluido en el gel, se
pudo establecer que los productos amplificados correspondieron al tamaño
esperado en todas las reacciones. El tamaño de las bandas fueron
determinadas con el Programa de análisis de imagen TotalLab Quant (Figura
6).
29
4.3.1.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El cDNA sintetizado fue posteriormente amplificado mediante PCR
convencional. La reacción del PCR se preparó en un volumen final de 25 µl, en
una mezcla de reacción que contenía: 1 µl de cDNA, 2,5 µl de Buffer PCR 10X
(Appied Biosystems), 0,5 µl de MIX dNTP 10 mM, 1,5 µl de MgCl 15 mM
(Applied Biosystems), 1 µl de cada uno de los primers (forward y reverse, 10
µl), 0,25 µl de Taq-polimerasa (5U/µl) (Invitrogen TM Lifes Technologies) y
17,25 µl de H20 para PCR.
Las amplificación del cDNA se realizó en un termociclador (Bioer) y las
condiciones fueron: un paso de 94°C por 5 minutos (desnaturalización inicial) y
35 ciclos de 94°C por 30 s (desnaturalización), 55°C por 30 s (alineamiento) y
72°C por 45 s (extensión). De los 25 µl del volumen total de reacción de PCR
se tomaron 4 µl y se mezclaron con 1 µl de buffer de carga (0,25 % de azul de
bromofenol, 50% de glicerol, EDTA 1 mM).
Los productos obtenidos se separaron en geles de agarosa horizontal al
2% por electroforesis en buffer TAE 1X (40 mM Tris, 20 mM ácido acético, 1
mM EDTA, ph 7,7) a 100 voltios durante 50 minutos. Después de la corrida,
los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y las bandas
resultantes se visualizaron en un transiluminador de luz UV (Biometra TI 1)
que fueron fotografiadas con una cámara digital. Las imágenes digitales
obtenidas en color real fueron seleccionadas y transformadas en una imagen
en escala de grises, para estimar la intensidad de las bandas por
densitometría de una manera indirecta, midiendo el nivel de gris medio de las
bandas (Arrebola, 1999). Todo esto se realizó mediante el Programa de
análisis de imagen TotalLab Quant (www.totallab.com/products/totallabquant/)
(Figura 7). Todos los valores, expresados en niveles de gris, fueron
30
Nivel de gris Gen de estudio
% cambio en la expresión = x 100
Nivel de gris Gen de referencia
Figura 7. Programa de análisis de imagen TotalLab Quant. Las bandas corresponden al amplificado del transcrito del gen GM-CSF
4.3.2 Análisis cuantitativo de la expresión de mRNA de las citoquinas IL-3, GM-SCF e IL-7 de la médula ósea
Las suspensiones de médula ósea (5 ml/ratón) se obtuvieron de los
fémures de los ratones evaluados. Se juntaron las suspensiones celulares de
3 ratones por grupo (500 µl por suspensión), para proceder a extraer el RNA
con Trizol, determinar su integridad por electroforesis, su pureza y
concentración por espectrofotometría y realizar la transcripción reversa para la
síntesis de DNA complementario, utilizando la metodología anteriormente
