Determinación de dioxinas en leche materna de mujeres expuestas a humo procedente de la quema de leña.

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(1)U NIVERSIDAD A UTÓNOMA FACULTADES. DE. DE. S AN L UIS P OTOSÍ. C IE N C I A S Q U Í M I C A S , I N G E N I E R Í A. Y. MEDICINA. PROGRAMA MULTIDISCIPLINARIO DE POSGRADO EN CIENCIAS AMBIENTALES. DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS AMBIENTALES. PRESENTA: Q.F.B. ROGELIO COSTILLA SALAZAR. DIRECTORA DE TESIS: DRA. LETICIA YÁÑEZ ESTRADA COMITÉ TUTELAR: DR. FERNANDO DÍAZ-BARRIGA MARTÍNEZ DRA. JAQUELINE CALDERÓN HERNÁNDEZ. SAN LUIS POTOSÍ, S.L.P.. ABRIL DE 2005.

(2) U NIVERSIDAD A UTÓNOMA FACULTADES. DE. DE. S AN L UÍS P OTOSÍ. C IE N C I A S Q U Í M I C A S , I N G E N I E R Í A. Y. MEDICINA. PROGRAMA MULTIDISCIPLINARIO DE POSGRADO EN CIENCIAS AMBIENTALES. DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS AMBIENTALES. PRESENTA: Q.F.B. ROGELIO COSTILLA SALAZAR DIRECTORA DE TESIS: DRA. LETICIA YÁÑEZ ESTRADA SINODALES:. DRA. LETICIA YÁÑEZ ESTRADA. _______________________________. DR. FERNANDO DÍAZ-BARRIGA MARTÍNEZ ______________________________. DRA. ANA CRISTINA CUBILLAS TEJEDA. SAN LUÍS POTOSÍ, S.L.P.. ______________________________. ABRIL DE 2005.

(3) PROYECTO REALIZADO EN:. DEPARTAMENTO DE TOXICOLÓGIA AMBIENTAL FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ. CON FINANCIAMIENTO DE:. CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT). A TRAVÉS DEL PROYECTO DENOMINADO:. “EVALUACIÓN DE RIESGO EN SALUD POR LA EXPOSICIÓN A DIOXINAS”. 39081-M. BECARIO 176771. LA MAESTRIA EN CIENCIAS AMBIENTALES RECIBE APOYO A TRAVÉS DEL PROGRAMA DE FORTALECIMIENTO AL POSGRADO NACIONAL (PIFOP- SEP)..

(4) Gracias. En especial a la Dra. Leticia Yáñez, por su tiempo, apoyo y dedicación durante todo el trabajo, además por tratar de hacer de mi una persona ordenada y dedicada ¡GRACIAS!.. A Miros, por su apoyo incondicional y por ser parte importante en la elaboración de este trabajo.. Al Dr. Fernando Díaz-Barriga, por confiar en mí y formar parte de su gran grupo de investigación.. A la Dra Jaqueline, por su tiempo y trabajo invertido.. A la Dra Ana Cristina, por regalarme un poco de su valioso tiempo.. A Iza y a Vita por su ayuda y trabajo. A mis Padres y Hermanos por ayudarme a cumplir esta realidad. A todos mis compañeros y amigos por su amistad y su apoyo.. A Diana, por ayudarme siempre y en cada momento, por estar conmigo y por que no se que haría sin ella..

(5) INDICE GENERAL. Resumen. 1. Introducción. 3. Material y Métodos. 8. Resultados. 16. Discusión. 22. Conclusiones. 29. Bibliografía. 31.

(6) INDICE DE TABLA. Tabla 1. Exactitud del método de ELISA para cuantificar dioxinas. 39. en leche materna. Tabla 2. Validación del método de extracción de dioxinas de los. 40. lípidos. Tabla 3. Efecto de matriz y porcentaje de recobro utilizando el. 41. método desarrollado en nuestro laboratorio. Tabla 4. Distribución de madres que usan leña para cocinar por. 42. Municipio. Tabla 5. Distribución de madres por tipo de combustible empleado. 43. para cocinar. Tabla 6. Características sociodemográficas de las madres, por tipo. 44. de combustible empleado para cocinar. Tabla 7. Factores que influyen en la exposición a dioxinas.. 45. Tabla 8. Distribución de las madres de la Huasteca por periodo de. 46. lactancia. Tabla 9. Distribución de las madres de la Huasteca por número de. 47. lactancia Tabla 10. Niveles de dioxinas en leche de la población de estudio.. 48. Tabla 11. Asociación entre la concentración de dioxinas en leche. 49. materna (pg/g lípido) y el uso de leña, ajustado por los meses de lactancia. Tabla 12. Asociación entre la concentración de dioxinas en leche materna (pg/g lípido) y el uso de leña, ajustado por los meses de lactancia y por la edad de la madre.. 50.

(7) INDICE DE FIGURAS. Figura 1. Estructuras químicas del antígeno, la dioxina más tóxica y. 51. subrogado empleados en la técnica de ELISA. Figura 2. Curva de inhibición de la reacción dioxina-anticuerpo.. 52. Figura 3. Niveles de dioxinas en leche materna de acuerdo al tipo de. 53. combustible empleado para cocinar. Figura 4. Correlación entre el logaritmo de la concentración de. 54. dioxinas en leche materna y el número de lactancias. Figura 5. Correlación entre el logaritmo de la concentración de. 55. dioxinas en leche materna (pg/ g lípido) y los meses de lactancia del Grupo / Leña. Figura 6.. Correlación entre el logaritmo de la concentración de. 56. dioxinas en leche materna y la edad de la madre. Figura 7. Hornillas utilizadas en la zona de muestreo.. 57.

(8) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Resumen. Las dioxinas son compuestos lipofílicos altamente tóxicos, agrupados en 75 congéneres. La 2,3,7,8 tetraclorodibenzo-p-dioxina es considerada como la más tóxica. Para evaluar la exposición a un compuesto tóxico se emplean los biomarcadores, los cuales nos permiten determinar si el compuesto tóxico se absorbió o no. Un biomarcador de exposición a dioxinas para mujeres es la cuantificación de los niveles de éstas en leche materna. El método especifico y selectivo para cuantificar a este tipo de compuestos es la cromatografía de gases de alta resolución acoplado a un detector de masas de alta resolución, pero el costo del análisis es muy alto. Debido a esto es necesario desarrollar metodologías alternas que sean accesibles y confiables. La técnica de ELISA es una alternativa. En este estudio se logró estandarizar un método para cuantificar dioxinas en leche materna por ELISA, el cual es sensible (Limite de Detección = 9 pg/ml), exacto, preciso (el porcentaje de recobro para muestras fortificadas fue del 76% ± 9 y del 104% ± 15 para el estándar de referencia) y reproducible (se obtuvo un coeficiente de variación del 16% al analizar por triplicado una muestra de concentración conocida). Una vez validado el método, se evaluó la exposición a dioxinas en madres de la Huasteca Potosina que utilizan leña para cocinar (Grupo Leña n=56) y se comparó con una población control que usa gas butano (Grupo Gas Huasteca n=11) de la misma zona y una población control de la capital de San Luís Potosí (Grupo Gas Urbano n=5), la población que utiliza leña para cocinar presentó niveles significativamente mayores (21.45 pg/g lípido ± 1.7, p<0.05) que la población control de la Huasteca (13.48 pg/g lípido ± 1.2) y que la 1.

(9) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. población control de la capital (8.32 pg/g lípido ± 1.02). El periodo de lactancia influyó sobre los niveles de dioxinas en la leche materna, ya que al aumentar éste disminuyó la concentración de las mismas. (r=-0.26, p< 0.05), sin embargo el. número de lactancias no presentó una asociación estadísticamente significativa con los niveles de dioxinas en leche. La edad de las madres primíparas del Grupo Leña presentó una asociación significativamente positiva (r=0.64, p<0.05) con los niveles de dioxinas en leche. Se realizó un análisis de regresión lineal múltiple (RLM) con las concentraciones de dioxinas en leche y las variables que resultaron significativas del análisis bivariado, el resultado indica que el uso de leña y la edad del lactante explican el 18% de los niveles de dioxinas en leche materna, cuando se ajustó por la edad de la madre este porcentaje se incrementó al 23%. Con la metodología desarrollada para cuantificar dioxinas en leche materna por la técnica de ELISA fue posible distinguir el grado de exposición a estos compuestos entre dos poblaciones distintas. Los resultados obtenidos sugieren que el uso de leña como combustible es un factor de riesgo de exposición a dioxinas en poblaciones que emplean leña para cocinar.. 2.

(10) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Introducción. Las dioxinas (CDDs) son compuestos lipofílicos altamente tóxicos que están presentes en gran parte del ecosistema global en diferentes medios, incluyendo suelo, aire y sedimento, también se han detectado en tejidos animales y humanos.1 Existen 75 congéneres de dioxinas, de las cuales la que tiene átomos de cloro en las posiciones 2,3,7 y 8 (tetraclorodibenzo-p-dioxina o TCDD) es considerada como la mas tóxica2. Las dioxinas se generan por actividades naturales, o por la actividad humana. La producción natural se genera debido a la combustión incompleta de compuestos orgánicos, por ejemplo durante un incendio forestal o por la actividad volcánica. En la actividad humana son productos secundarios de los procesos de incineración y combustión industrial, municipal y doméstica; también se producen durante la manufactura de plaguicidas clorados, por lo que éstas son entonces liberadas al ambiente cuando los campos agrícolas son fumigados con este tipo de plaguicidas3. Para la generación de dioxinas, se requiere; 1) una temperatura entre 300 y 400 °C, 2) una fuente de carbono que podría ser madera, hidrocarburos y compuestos orgánicos principalmente, 3) una fuente de cloro, como por ejemplo plaguicidas organoclorados (pentaclorofenol, DDT, 2,4 D, entre otros), el cloruro de sodio presente de manera importante en los basureros municipales,5 4) oxígeno, cuya función es la oxidación del carbono facilitando así la formación de estructuras cíclicas y la cloración de las mismas,4 5) un catalizador como el cobre, el hierro, el plomo o el zinc. Por ejemplo, durante la quema de leña está presente el carbono, el cloro y el oxígeno. Las plantas leñosas están compuestas por 45% de carbono y contienen de 1 a 10 mg de cloro 3.

(11) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. por cada 100 g de materia seca.35 Esto explica la formación de dioxinas durante la combustión de leña.. El comportamiento ambiental de las dioxinas está relacionado con el número de átomos de cloro en la molécula. Entre mayor es el número, su presión de vapor es menor, su solubilidad en agua es más baja y su afinidad por matrices como el suelo es mayor7. Es por esto que las dioxinas como la 2,3,7,8-TCDD y la 1,2,3,7,8PeCDD se encuentran preferentemente en el aire asociadas a partículas sólidas que se depositan en la tierra por precipitación húmeda (lluvia) o seca. En los cuerpos de agua, debido a sus propiedades lipofílicas y por ende a su baja solubilidad, se concentran en el sedimento, o pueden localizarse en partículas suspendidas; además los suelos con un alto contenido de materia orgánica tienen una mayor capacidad para retener a este tipo de compuestos.7 El tiempo de vida media de degradación de las dioxinas en suelo es de aproximadamente 17 años, mientras que en el subsuelo puede ser hasta de 100 años.7. La forma como se generan y el comportamiento ambiental de las dioxinas, explica por qué éstas se encuentran en el ambiente, lo que trae como consecuencia, que un gran porcentaje de la población esté expuesta a las CDDs por vía oral, inhalatoria y/o dérmica. La absorción por vía oral se presenta principalmente al consumir alimentos contaminados, para la población en general más del 90% de la absorción diaria de CDDs, proviene de la dieta,6 y el 90% de las dioxinas que se ingieren son absorbidas. Algunos reportes en la literatura señalan que los congéneres más clorados como los hepta y los octa, presentan la menor eficiencia 4.

(12) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. de absorción.11 Los resultados obtenidos de estudios sobre estructura-actividad conducen a asumir que las dioxinas pueden también absorberse por vía inhalatoria y dérmica.28,29,30. No existen reportes en la literatura que sugieran el metabolismo de estas moléculas en el organismo humano. Su distribución en el organismo es alta; lo anterior se explica por la lipofilicidad y transporte facilitado a través de membranas biológicas. Las dioxinas se acumulan principalmente en el hígado, la piel y el tejido adiposo con una vida media de eliminación entre 7 y 9 años aproximadamente para las CDDs más tóxicas.11,31,34,35. Las CDDs se eliminan principalmente por piel y sales biliares. Durante la lactancia las dioxinas son removidas del tejido adiposo y por lo tanto son excretadas con los lípidos de la leche materna. Diversos estudios han demostrado que las CDDs presentes en la leche materna son absorbidas por el infante; por lo tanto, ésta es una fuente de exposición a dioxinas para el lactante y una vía de eliminación para la madre,10 por lo que las dioxinas presentes en la leche materna son un buen biomarcador de exposición.. La activación de genes, la generación de radicales libres, la fosforilación de proteínas y la modificación de señales hormonales,7,8,9 son algunos de los mecanismos relacionados con la toxicidad de las dioxinas. Debido a esta diversidad de mecanismos, los efectos en salud son muy variados, los más. 5.

(13) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. importantes son: cloroacné, daño hepático, alteración conductual neurológica, inmunosupresión, disrupción endocrina y cáncer.8,9. El método por excelencia para analizar dioxinas en muestras ambientales y biológicas es la cromatografía de gases con detector de masas de alta definición (HRGC – HRMS).11 Sin embargo, este método es sumamente costoso.11 Una alternativa son los inmunoensayos, para el caso de las dioxinas se ha desarrollado la técnica de ELISA.12. Las ventajas del ELISA son: es un método rápido, de menor costo, el volumen de la. muestra. para. el. análisis. es. pequeño,. es. sensible,. reproducible. y. razonablemente selectivo para realizar estudios de monitoreo en áreas contaminadas por CDDs o para realizar estudios de barrido en poblaciones expuestas a estos compuestos. Dentro de las desventajas podemos mencionar que es selectivo para la 2,3,7,8 TCDD por lo que no se pueden cuantificar otros congéneres; además, pueden obtenerse falsos positivos por reacciones cruzadas con compuestos similares.. En México se han descrito múltiples fuentes de producción de dioxinas14 y sin embargo, no hay estudios que evaluen la exposición a estos compuestos. Las principales limitantes son: la carencia de un cromatógrafo de Gases-Masas de alta resolución y el alto costo del análisis. En consecuencia el ELISA podría ser de gran utilidad para el análisis de estos compuestos. Se considera que una población de alto riesgo es aquella que emplea leña como combustible en fogatas 6.

(14) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. o chimeneas para la cocción de alimentos, pues se ha estimado que por cada kilogramo de leña se generan alrededor de 2 ng TEQ (factor internacional de concentración) de dioxinas13, 14.. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una metodología para extraer y cuantificar dioxinas en leche materna por la técnica de ELISA. Empleando esta técnica se realizó un estudio piloto para evaluar la exposición a dioxinas en mujeres de la Huasteca Potosina que utilizan leña para cocinar, comparando ésta con una población control de la misma zona pero que cocinan en estufas de gas.. 7.

(15) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Materiales y métodos. Reactivos: Hexano, acetona, dietil éter e isopropanol (Burdick & Jackson grado HPLC), H2SO4, ácido fórmico, columnas de Florisil (1000 mg/6 ml MgO 3.6 SiO2) carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de potasio monobásico, fosfato de sodio dibásico anhidro, cloruro de potasio, citrato de sodio y cámara de vacío (J. T. Baker), Sílica gel malla 0.063 – 0.2 mm, dimetilsulfoxido para biología molecular, tween 20, albúmina de suero bovino, y tetrametilbencidina (SIGMA), placas de ELISA de 96 pozos de fondo plano de poliestireno (Nunc), lector de ELISA (BIO-RAD microplate reader BENCHMARK), estándar de referencia de leche liofilizada (Community Bureau of Reference BCR 534), segundo anticuerpo (gota-anti-rabbit IgG-HRP, Pharmingen), el primer anticuerpo (policlonal), el antígeno de recubrimiento y el TMDD (subrogado utilizado para la curva de calibración) fueron donados por el Departamento de Entomología de la Universidad de Davis California.. Población de estudio: Las muestras de leche materna fueron colectadas de madres que estaban en diferentes periodos de lactancia, de los Municipios de Tampamolón Corona, Tancanhuitz de Santos y Aquismón. Las tres localidades pertenecen a la Zona Huasteca del Estado de San Luis Potosí. Se recolectaron un total de 67 muestras. A todas las participantes se les aplicó un cuestionario para registrar aspectos como: nombre y edad de la madre, domicilio, edad del lactante, número de gestas, periodo de lactancia, antecedentes ginecológicos, hábitos alimenticios, uso de medicamentos, tabaquismo, alcoholismo, ocupación laboral 8.

(16) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. de los padres, exposición a plaguicidas y frecuencia y uso o no de leña como combustible para preparar sus alimentos, entre otros. También se analizaron 5 muestras de leche materna de la capital de San Luis Potosí para utilizarlas como Grupo Control Urbano. Las participantes firmaron una hoja de consentimiento después de haber recibido una explicación de los alcances del trabajo.. Tratamiento de la muestra: El método para analizar a las dioxinas en leche se divide en tres etapas: 1. Extracción de los lípidos de la muestra biológica. 2. Extracción de las dioxinas de los lípidos. 3. Cuantificación de las dioxinas por la técnica de ELISA.. 1.- Extracción de los lípidos: Se pesaron 5 g de la muestra de leche en el TUBO A y se agregó 1 ml de ácido fórmico y 6 ml de isopropanol, se agitó en vortex por 3 min. Se añadieron 6 ml de dietiléter-hexano 1:1. Los tubos se invirtieron por 5 min y se centrifugaron a 3000 rpm durante 3 min. A un tubo de ensaye (TUBO B) se le agregaron 4 ml de KCl al 1% y se transfirió la capa superior (fase orgánica) del TUBO A al TUBO B. La capa inferior se reextrajo con 3 ml de dietiléter-hexano 1:1, transfiriendo nuevamente la fase orgánica al TUBO B, éste se invirtió durante 5 min y se centrifugó a 3000 rpm durante 3 min. Del TUBO B se removió y desechó la capa inferior. Se agregaron 4 ml de KCl al 1%, se invirtió durante 2 min y se centrifugó a 3000 rpm durante 3 min.. 9.

(17) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. A un tercer tubo (TUBO C), el cual fue previamente pesado, se transfirió la capa superior del TUBO B, la capa inferior de éste se extrajo nuevamente con 3 ml de dietiléter-hexano 1:1 y la fase orgánica se transfirió al TUBO C, las fases orgánicas colectadas en el TUBO C se evaporaron con flujo de nitrógeno a 37 °C hasta llegar a peso constante y se determinó por gravimetría el contenido de lípidos presentes.. 2.- Extracción de CDDs de los lípidos: Se probaron tres métodos para la extracción de los CDDs de los lípidos, el reportado por Yukio y Nakazawa, 2000,15 el segundo es el empleado para cuantificar compuestos organoclorados, desarrollado por Bergman y colaboradores (comunicación personal, 2001) y el tercero fue desarrollado en nuestro laboratorio al combinar los dos métodos anteriores. El método elegido fue éste último ya que los porcentajes de recobro del estándar de referencia y de las muestras fortificadas con TMDD fueron superiores a los obtenidos con los dos primeros.. Una vez obtenidos los lípidos, se disolvieron con 4 ml de hexano, se adicionaron 2 ml de H2SO4 y la muestra se mezcló por inversión durante 2 min y se centrifugó a 3000 rpm por 3 min. La fase orgánica se transfirió a un tubo cónico y se extrajo nuevamente con 3 ml de hexano, la fase orgánica se pasó al tubo cónico y se evaporó con flujo de nitrógeno a 37 °C hasta un volumen aproximado de 2 ml. El extracto se pasó por una columna de 0.1 g de sílica gel activada más 1g de Síilica gel:H2SO4 concentrado (1:2) y 0.1 g de sulfato de sodio anhidro, la cual fue previamente acondicionada con 6 ml de hexano. La muestra se eluyó con 8 ml de 10.

(18) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. hexano (2ml x 4), el eluato obtenido se evaporó con una corriente de Nitrógeno a 37°C hasta obtener un volumen aproximado de 2 ml. Esta fracción se pasó por una columna de Florisil (1000 mg/6 ml MgO 3.6 SiO2), la cual se acondicionó previamente con 10 ml de hexano (5 ml x 2), la muestra se eluyó con 9 ml de hexano (3 ml x 3). El eluato se evaporó con una corriente de Nitrógeno a 37°C hasta obtener un volúmen aproximado de 1 ml, a este volúmen se le añadieron 200 µl de Dimetil Sulfóxido (DMSO) y se continuó evaporando hasta tener solamente el DMSO en el tubo, de esta forma las dioxinas que estaban presentes en la fase orgánica (hexano) quedaban disueltas en el DMSO.. 3.- Cuantificación de las dioxinas por la Técnica de ELISA: El método para cuantificar dioxinas por ELISA fue desarrollado en el laboratorio del Dr. Bruce Hammock de la Universidad de Davis, California16.. Fundamento: la terminación carboxílica del hapteno 2, 3, 7 – Tricloro 8 – carboxi – dibenzo dioxina (antígeno de recubrimiento figura 1a), se adhiere a las paredes de los pozos de la placa de ELISA. Cuando se agrega el anticuerpo policlonal selectivo para la 2,3,7,8 TCDD en exceso y la dioxina (muestra a ser analizada Figura 1b), el anticuerpo tiene una mayor afinidad por la dioxina que por el hapteno, de tal forma que al realizar un lavado sólo quedará en el pozo de la placa los haptenos unidos a los anticuerpos que no hayan sido unidos a las dioxinas de la muestra, mientras que el complejo anticuerpo-dioxina se elimina durante el lavado. Al adicionar un segundo anticuerpo marcado con la enzima peroxidasa, éste reconoce y se une al complejo hapteno-primer anticuerpo, formando un 11.

(19) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. complejo colorido cuando se adiciona su sustrato (H2O2) y un cromógeno (tetra metil bencidina). Por lo tanto la concentración de dioxinas presentes en la muestra es inversamente proporcional a la intensidad del color obtenido.. Curva de calibración o de inhibición. A partir de un estándar de 100,000 pg/ml del subrogado TMDD (metil, 2,3,7,8 tricloro dibenzo paradioxina Figura 1c) se prepararon en DMSO al 50% en PBS las siguientes concentraciones 20,000; 4,000; 800; 267; 89; 30; 10; 2; 0.4 y 0.08 pg/ml. la curva fue generada como se describe en la siguiente sección.. Procedimiento: El antígeno de recubrimiento (hapteno figura 1a) se diluyó 1/14,000 con una solución tampon de carbonato de sodio (Na2HCO3 0.035 M, pH 9.6), se añadieron 100 µl de éste en cada pozo de una placa de ELISA y se incubó a 4°C durante 12 hrs. aproximadamente; posteriormente la placa se lavó con Tween 20 al 0.5% (solución de lavado), se adicionaron 50 µl de albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% en PBS (solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5), se incubó por 30 min a 18°C y se lavó nuevamente con la solución de lavado, se adicionaron 50 µl de cada uno de los estándares de la curva de calibración o del extracto de la muestra a analizar por triplicado (uno por pozo). Se adicionaron 50 µl de PBS y 50 µl del primer anticuerpo policlonal, (1:3000 en PBS con BSA al 2.0%). La placa se incubó a 18°C durante 90 min. y se lavó con la solución de lavado. Se adicionaron en cada pozo 100 µl del segundo anticuerpo (gota-antirabbit IgG-HRP) diluido 1:3000 en PBST (PBS al 10%, más Tween 20 al 0.05%, pH 7.5), se incubó durante 60 min a 18°C y nuevamente se lavó con solución de 12.

(20) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. lavado. Se añadieron 100µl del sustrato de la peroxidasa de una solución compuesta por 25 ml de solución amortiguadora de acetatos 100 mM, 0.4 ml de tetrametilbencidina al 0.6% en DMSO y 0.1 ml H2O2 al 1 %. Se incubó por 10 min. a 18°C y la reacción se detuvo al adicionar 50 µl de H2SO4 2M. Se determinó la densidad óptica en un lector de ELISA a 450-650 nm.16. Validación del Método Analítico: Todos los ensayos para la validación de la técnica de ELISA se realizaron con una muestra control o blanco, compuesta por 9 muestras de leche de madres no expuestas (estas se homogenizaron formando una sola muestra).. a.- Exactitud. Un estándar de referencia de leche liofilizada (BCR 534), se cuantificó por triplicado en tres días diferentes. La exactitud fue estimada como el porcentaje de error obtenido al comparar la concentración teórica con la experimental.. b.-. Precisión. Esta fue estimada al calcular el porcentaje del coeficiente de. variación obtenido del IC50 (parámetro de la curva de calibración que indica la concentración de TMDD con la cual se inhibe en un 50% la reacción antígenoanticuerpo), después de realizar la curva por triplicado y en tres días diferentes.. c.- Reproducibilidad y repetibilidad. Una muestra fortificada con 25 pg/ml de TMDD, se analizó por triplicado en un solo día, tres veces, durante tres días. 13.

(21) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. diferentes, los resultados de ambos se evaluaron al calcular el porcentaje del coeficiente de variación de la concentración de dioxinas obtenidas.. d.- Porcentaje de recobro. Para validar el método de extracción de las dioxinas de los lípidos, a 5g de la muestra blanco se le adicionaron 60, 120 ó 240 pg/ml de TMDD, se agitaron en vortex por un minuto y se dejaron en reposo por 2 hr. El análisis de las mismas se realizó de acuerdo a los dos procedimientos antes descritos (Yukio y Bergman). El recobro se determino comó el porcentaje de error al comparar la concentración teórica con la experimental.. e.- Efecto de matriz. Cuando se trabaja con muestras biológicas es común tener interferencias en el análisis del compuesto de interés, por la presencia de los diferentes componentes de la muestra. Este efecto puede contrarrestarse con al menos tres estrategias: diluir la muestra biológica antes de su análisis, diluir el extracto obtenido o modificar el proceso de extracción, como sería el aumentar el número de extracciones líquido-líquido, aumentar el volúmen de solvente de extracción, realizar extracciones sólido-líquido. Se optó por ésta última, para lo cual se probó el uso de una columna de Florisil y una de sílica gel en diferentes combinaciones: Sílica/Sílica, Florisil/Sílica, Florisil/Florisil y Sílica/Florisil. El efecto de matriz se evaluó al cuantificar la concentración de dioxinas en una muestra blanco y como el porcentaje de recobro de una muestra fortificada con 25 pg/ml de TMDD.. 14.

(22) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Análisis estadístico. Para obtener la curva de inhibición y la ecuación logística de cuatro parámetros utilizada para calcular la concentración de dioxinas en las muestras, se utilizó el programa SIGMA-Plot 2001 para Windows V. 7.0. Se realizó un análisis exploratorio de las variables del cuestionario aplicado, seguido de un análisis bivariado. Los resultados fueron normalizados por transformación logarítmica. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS para Windows V. 10.0.1.. 15.

(23) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Resultados. En la Figura 2, se muestra una curva de calibración o inhibición promedio del ensayo inmunoenzimático obtenida de tres repeticiones y la ecuación logística de cuatro parámetros, a partir de la cual se calcularon las concentraciones de dioxinas de las muestras, para cada ensayo de la ELISA se realizó una curva de calibración, el rango lineal fue de 11 a 600 pg/ml y un Límite de Detección de 9 pg/ml.. Para determinar la exactitud se analizó una muestra de referencia de leche liofilizada (BCR 534)19. Los resultados obtenidos después de tres repeticiones independientes se muestran en la Tabla 1. La concentración de dioxinas del estándar de referencia es de 8.2 pg/g lípido, éste es el resultado de la sumatoria de las concentraciones individuales para cada congénere de dioxinas multiplicado por la afinidad del anticuerpo utilizado en la técnica de ELISA. El método cumplió con los requisitos de exactitud ya que al comparar los resultados experimentales del estándar de referencia con los valores teóricos, se obtiene un error del 4.8%, este debe ser menor de 45%.20. La precisión se evaluó utilizando el IC50 como parámetro de referencia. El método es preciso, ya que la variación de este parámetro fue menor al 10%, cuando el límite permitido es del 15%.20 La reproducibilidad y repetibilidad del método analítico se evaluó con una muestra compuesta por 9 leches de diferentes madres de la Ciudad de San Luís Potosí no expuestas a humo de leña fortificada con 25 16.

(24) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. pg/ml de TMDD, los coeficientes de variación obtenidos fueron de 17% y 14% respectivamente. Estos valores están dentro del límite de aceptación que es hasta del 45% cuando las concentraciones que se reportan están en el orden de ppt (pg/g lípido o pg/ml).20. Para la validación del método de extracción de las dioxinas de los lípidos, se empleó una mezcla compuesta de 9 muestras de leche de madres de San Luis Potosí Capital, a la cual se le adicionó 60, 120 ó 240 pg/ml de TMDD. En la Tabla 2 se muestran los porcentajes de recobro y de error obtenidos con el método de Yukio et al. (método 1) y el de Bergman (método 2). Los porcentajes de recobro obtenidos para el método 1 fueron muy bajos (menores del 31%), mientras que los recobros para el método 2 fueron aceptables (del 60 al 81%); como el método 2 tuvo un mejor porcentaje de recobro, se analizó por este métodouna muestra de BCR 534 para corroborar los resultados. Sin embargo, el porcentaje de recobro obtenido del estándar de referencia fue sobreestimado en mas del 480%. Aunado a esto, los resultados obtenidos al evaluar el blanco de leche por los dos métodos (75 y 120 pg/ml respectivamente) nos indican que hay un efecto de matriz importante.. Para eliminar el efecto de matriz, se modificó tanto el método 1 como el método 2, surgiendo de esta manera uno tercero, el cual fue el que se utilizó para el análisis de las muestras problema. Se empleó ácido sulfúrico para la liberación de las dioxinas de los lípidos, en lugar del hidróxido de sodio utilizado en el método de Yukio. Además se probaron diferentes combinaciones entre las columnas de sílica 17.

(25) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. gel (utilizadas en el método de Bergman) y de Florisil. En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos. El efecto de matriz se evaluó como la menor concentración obtenida de TMDD en una muestra blanco y como el porcentaje de recobro al adicionar 25 pg/ml de TMDD a una muestra blanco de leche. La menor interferencia se obtuvo cuando se emplearon las combinaciones de las columnas de Florisil/Sílica gel y Sílica gel/Florisil, pues el efecto de matriz disminuyó considerablemente ya que las concentraciones de TMDD fueron las más bajas, pero la combinación de Sílica gel/Florisil fue mejor pues el porcentaje de recobro obtenido fue mayor (76%).. La población participante en este estudio pertenece a 11 comunidades de la Huasteca Potosina, de los Municipios de Aquismón, Tampamolón Corona y Tancanhuitz de Santos. En la Tabla 4 se muestra la distribución por Municipio, asi como el porcentaje de madres que utilizan leña para cocinar, en los tres Municipios éste es muy elevado.. Como no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de dioxinas en leche materna de las madres que solo usan leña y las que además de leña emplean de manera esporádica gas butano, éstas se agruparon formando así el Grupo Leña (n= 56, 83.3% de la población total). Por lo que la población de estudio quedó conformada por tres grupos: Grupo 1: Leña, Grupo 2: Gas Rural (control) y Grupo 3: Gas Urbano (control).. 18.

(26) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. En la Tabla 5 se observa la distribución de las madres participantes por tipo de combustible, el Grupo de Leña agrupa a las madres de la Huasteca que siempre han utilizado la leña como combustible para cocinar sus alimentos, como a las que utilizan tanto leña como esporádicamente gas butano. El 55% de las madres participantes de la Huasteca emplean únicamente leña como combustible para preparar sus alimentos, el Grupo Control Rural es de las madres de la Huasteca que siempre han utilizado gas butano para cocinar. El Grupo Control Urbano es de madres que viven en la capital de SLP y siempre han empleado como combustible gas butano,. En la Tabla 6, se muestran las características generales de la población de estudio. Las madres participantes tenían entre 16 y 40 años de edad con un promedio del tiempo de residencia entre 15 y 18 años para los dos grupos en el momento del estudio. El registrar el número de habitantes por casa, así como el de cuartos nos permitió tener una idea de las condiciones de hacinamiento y exposición al humo durante la quema de leña tanto de la madre como del lactante. Considerando que la vivienda con mayor número de habitantes y menor número de cuartos, están más expuestos.. En la Tabla 7, se muestran los factores que se consideraron como fuentes adicionales de exposición a dioxinas tales como: tabaquismo pasivo, el uso de plaguicidas dentro o cerca de la casa, el uso de leña para calentar la habitación y la quema de basura.. 19.

(27) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. El periodo y número de lactancias de la población de estudio se muestran en las Tablas 8 y 9, el 41% de la población tenían menos de 3 meses de lactancia y el 83% menos de 6 meses. En cuanto al número de lactancias el 77% de las madres estaba lactando a su cuarto hijo.. En la Tabla 10 y en la Figura 3, se reportan las concentraciones de dioxinas cuantificadas en la leche materna de las mujeres participantes, distribuidas de acuerdo al tipo de combustible para cocinar. Para normalizar los datos, éstos fueron transformados a una escala logarítmica decimal, el Grupo Leña presentó niveles significativamente mayores (p<0.05, 21.45 pg/g lípido) que el Grupo Gas Rural (13.48 pg/g lípido) y que el Grupo Gas Urbano (8.32 pg/g lípido) mientras que no se encontraron diferencias entre los Grupos Gas Rural y Gas Urbano.. No se encontró una asociación estadísticamente significativa entre los niveles de dioxinas en leche materna de los Grupos de estudio Leña y Control Rural (n=67) y el número de lactancias (p=0.76) (Figura 4). Sin embargo, para el Grupo Leña (n=56) se obtuvo una asociación estadísticamente significativa e inversa (p<0.05) al relacionar los niveles de dioxinas en la leche con los meses de lactancia (Figura 5).. Para evaluar la acumulación en el organismo de las dioxinas se realizó una correlación entre los niveles de dioxinas en leche materna y la edad de las madres primíparas. Para este análisis sólo se consideraron a las madres que tenían menos de tres meses lactando y que empleaban solo leña como combustibles 20.

(28) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. para la cocción de sus alimentos. Los resultados obtenidos (Figura 6) indican una asociación significativamente positiva (r=0.64, p<0.05, n=11).. En la Tabla 11, se presenta un modelo de regresión lineal múltiple (RLM) para evaluar la asociación entre los niveles de dioxinas en leche materna y las variables que fueron significativas en el análisis bivariado. El 18% de los niveles de dioxinas en leche materna esta explicado por el uso de leña y los meses de lactancia.. En la Tabla 12, se presenta el modelo de RLM para los niveles de dioxinas en leche materna asociado con el uso de leña, los meses de lactancia y la edad de la madre. El 22% de los niveles de dioxinas en leche es explicado por el uso de leña y los meses de lactancia ajustados por la edad de la madre.. 21.

(29) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Discusión. Las dioxinas están divididas en 75 congéneres cuya toxicidad difiere entre cada una de ellas.7 Diversas Organizaciones Internacionales como la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización del Tratado del Atlántico Norte (OTAN) le asignaron un valor relativo a cada congénere de acuerdo a su toxicidad, es por ello que a la dioxina mas tóxica, la 2,3,7,8-TCDD se le asignó el valor de la unidad (1).17 Este valor mejor conocido como Factor de Equivalencia Tóxica (TEF) ha sido calculado con base a estudios in vitro e in vivo bajo el esquema de una administración única (toxicidad aguda), por lo que para estimar el TEF después de una exposición subcrónica o crónica podría variar considerablemente.7 Las hexaclorodioxinas tienen un TEF de 0.1 y las heptaclorodioxinas de 0.01 lo que indica que son 10 y 100 veces menos tóxicas respectivamente que la 2,3,7,8TCDD.7 Los niveles de dioxinas cuantificados por HRGC-HRMS en diferentes matrices, se reportan como niveles de ppt TEQ, este valor se obtiene de la sumatoria del producto de la concentración determinada de cada congénere por su respectivo TEF. Para el caso de este estudio en el cual la concentración de dioxinas se estimó empleando el método de ELISA, el resultado se reporta en unidades de concentración (ppt, pg/ml o pg/g de lípido), pues el anticuerpo empleado es policlonal y como tal su afinidad es distinta para cada uno de los congéneres de dioxinas, siendo del 100% para la 2,3,7,8 TCDD, del 72% para la 1,2,3,7,8 PeCDD, del 43% para la 1,3,7,8 TCDD y del 6.7% para la 2,3,7 TriCDD, cabe hacer mención que estos congéneres son los más tóxicos. Para el resto, el anticuerpo tiene una afinidad de 0.1 a 0.0001%.18 22.

(30) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Para la curva de calibración o de inhibición se empleó el subrogado TMDD ya que éste es mucho menos tóxico que la 2,3,7,8 TCDD y cruza en un 100% con el anticuerpo. De la curva del ensayo inmunoenzimático se obtiene una ecuación logística de cuatro parámetros: y=(A-D) / (1+(X/C)B) + D, en donde “X” es la concentración de dioxinas presentes en la muestra. Tanto la curva de calibración como el método de extracción están dentro de los límites aceptados de exactitud y precisión (4.8% de error y 10% de coeficiente de variación respectivamente). El efecto de matriz se logró abatir considerablemente cuando se combinó el uso de las columnas de Sílica gel y Florisil. Cuando se emplearon dos columnas de Sílica gel (Sílica/Sílica), la concentración de dioxinas de la muestra blanco fue de 65 pg/ml con un recobro de 110%, mientras que la concentración de la misma muestra utilizando Sílica gel/Florisil fue de 23 pg/ml y un recobro del 76%. Se determinó utilizar la segunda combinación a pesar de que se obtuvo un porcentaje menor de recobro, debido a que tuvo un menor efecto de matriz.. En cuanto a las reacciones cruzadas que pueden presentarse durante la reacción antígeno-anticuerpo en la técnica de ELISA, éstas disminuyeron por la metodología empleada durante la extracción de las dioxinas de los lípidos y la limpieza de las mismas. El anticuerpo utilizado puede cruzar en menos de un 0.01%. con:. PCBs. (bifenilos. policlorados),. algunos. HAPs. (hidrocarburos. aromáticos policíclicos) entre otros compuestos aromáticos. Los PCBs tienen los mismos mecanismos de toxicidad que las dioxinas y se consideran dentro del grupo de éstas cuando se cuantifican en TEQs. En cuanto a los HAPs su 23.

(31) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. excreción por leche es muy pobre, pero si estos estuvieran en la muestra a analizar, éstos quedarían retenidos en la columna de Sílica gel:H2SO4 al igual que otros compuestos aromáticos no halogenados.24. Las dioxinas almacenadas en tejido adiposo son removidas durante el periodo de lactancia y eliminadas por la leche materna. Existen estudios que demuestran que las CDDs presentes en la leche materna son absorbidos por el lactante, el porcentaje de las dosis absorbida fue de entre 90% y 95%.21 Sin embargo la exposición del individuo a dioxinas comienza desde la gestación ya que se ha demostrado que éstas son capaces de atravesar la barrera placentaria.22 En comparación con los adultos, los lactantes presentan una exposición cinco veces mayor.23 Esto es grave, si tomamos en cuenta que entre los principales congéneres de CDDs presentes en la leche humana, se encuentran los mas tóxicos (el 2,3,7,8-TCDD y el 1,2,3,7,8-PeCDD) y que gran cantidad de la dioxina ingerida por el lactante es absorbida.11,32 Por lo tanto la leche materna debe considerarse como una ruta de exposición para el lactante.. Es por ello que en este estudio se eligió la concentración de dioxinas en leche materna como un biomarcador de exposición para mujeres que están lactando. Las concentraciones de dioxinas encontradas en las madres de la Huasteca Potosina del Grupo Leña (Tabla 10) fueron estadísticamente superiores a las registradas en los Grupos controles (Gas Rural y Gas Urbano). El Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática (INEGI) reportó que un porcentaje importante de la población de la Huasteca Potosina, utilizan leña como 24.

(32) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. combustible para cocinar (el 85% de Tampamolón Corona, el 90% en Aquismón y el 80% de Tancanhuitz de Santos),33 además, mas del 50% de la población encuestada aceptó que quema basura y la hojarasca acumulada en el solar. Esto explica por qué las madres que viven en esta zona tuvieron niveles de dioxinas mayores con respecto a la población de la Capital. Aunado a esto, las hornillas de leña utilizadas por la mayoría de las madres de las comunidades muestreadas no tienen chimenea, como se observa en la Figura 7. Tampoco cuentan con una cámara de combustión adecuada para que las personas que cocinen estén menos expuestas al humo de la leña. Por lo tanto, las dioxinas producidas por la combustión de la madera se quedan depositadas en el hollín, en las cenizas, en las paredes y en el suelo del lugar. En el Departamento de Toxicología Ambiental de la Facultad de Medicina de la UASLP, se analizaron muestras ambientales de lugares en donde se cocina con leña, para determinar los niveles de dioxinas por medio de la técnica de ELISA, obteniéndose valores de 250 a 5500 pg/g en hollín y de hasta 200 pg/g en cenizas.24 Estos resultados apoyan nuestra hipótesis de que el uso de leña para la cocción de alimentos es una fuente importante de emisión de dioxinas.. Del análisis estadístico bivariado que se realizó con todas las variables obtenidas del cuestionario aplicado (edad de la madre, tiempo de residencia, número de gestas, periodo de lactancia, antecedentes ginecológicos, algunos problemas de salud, hábitos alimenticios, empleo de medicamentos, ocupación laboral de los padres, exposición a plaguicidas y el uso de leña como combustible, entre otros), se concluye que, el grupo según el tipo de combustible para cocinar, los meses de 25.

(33) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. lactancia y la edad de las madres primíparas, influyen en las concentraciones de dioxinas encontradas en la leche materna. Existen reportes en la literatura donde se ha demostrado que los niveles de las CDDs disminuyen al aumentar el periodo y el número de lactancias.32 Durante el primer trimestre de lactancia se excretan los niveles más altos de dioxinas, mientras que en la tercer lactancia las madres pueden llegar a eliminar hasta un 45% de estos compuestos.32 Por lo tanto la leche derivada del primer embarazo tiene una mayor concentración de dioxinas que la generada en los embarazos subsecuentes, por lo que, el nivel de exposición de los hijos primerizos es mayor que el registrado en sus hermanos.25. En nuestro estudio no se encontró esta asociación entre el número de lactancias y el logaritmo decimal de la concentración de dioxinas en leche. El resultado obtenido puede explicarse por la distribución del número de lactancias de las mujeres estudiadas, ya que el 77% tenía menos de cuatro lactancias y el rango del número de hijos fue más amplio, de 1 a 10. Además para ver este tipo de asociación es importante conocer la edad del hermano anterior del lactante, dato que nosotros desconocemos. Otra explicación y quizá la más importante, es que los resultados obtenidos sugieren que la población seleccionada está expuesta no solo continuamente sino a concentraciones altas de dioxinas y es por ello que es difícil apreciar la disminución de los niveles de éstas en leche al aumentar el número de lactancias, mientras que la asociación encontrada en otros estudios se debe a una exposición pasada32 o única como es el caso de algunas mujeres que estuvieron expuestas durante un accidente industrial.27 Asimismo, diversos autores reportan que la leche del primer trimestre contiene una mayor concentración de 26.

(34) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. dioxinas que la del segundo o tercer trimestre.26 En nuestro estudio encontramos una correlación negativa entre los meses de lactancia y los niveles de dioxinas (r=-0.26, p<0.05), lo que concuerda con la literatura, es decir al aumentar el periodo de lactancia, las concentraciones de dioxinas en leche disminuyeron (Figura 5).. La asociación positiva y estadísticamente significativa encontrada con el Grupo de Leña entre los niveles de dioxinas en leche y la edad de las madres primíparas (11 muestras) que además estaban en su primer trimestres de lactancia, nos indica la magnitud de acumulación de dioxinas en el organismo de la madre, pues las más jóvenes presentaron concentraciones menores de dioxinas en leche comparadas con las de mayor edad (Figura 6). Nuestros resultados concuerdan con los reportados en la literatura, los cuales indican que las madres primíparas que se encuentran en su primer trimestre de lactancia y estén expuestas a dioxinas continuamente, presentan una asociación positiva con relación a la edad de la madre y negativa con respecto a los meses de lactancia.32. Existen reportes en la literatura que indican que los niveles de dioxinas en leche materna son menores a los niveles de dioxinas en sangre o tejido adiposo de la misma persona.37 En el presente estudio, se encontraron niveles altos de dioxinas en leche, por lo que puede esperarse que los niveles en sangre y/o tejido adiposo serán aún mayores, esto implica que el riesgo para la salud de la madre es importante y que ésta es una fuente de exposición para el lactante.. 27.

(35) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Se obtuvo un modelo de regresión lineal múltiple (Tabla 11) para evaluar la asociación entre los niveles de dioxinas en leche materna (log pg/g lípido) y el uso de leña ajustado por los meses de lactancia, encontrando que el 18% de los niveles de dioxinas en leche materna son influidos por el uso de leña. El uso de leña aumentó la concentración de dioxinas en leche (Β=0.085, p<0.05), mientras que entre más fueron los meses de lactancia menor fue la concentración de dioxinas en leche (Β=-0.026, p<0.05). Al incluir a este modelo la edad de la madre, estas variables explicaron el 22% de los niveles de dioxinas en la leche materna (Tabla 12).. 28.

(36) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Conclusiones. La técnica de ELISA se emplea para identificar poblaciones en riesgo, no así para la cuantificación del mismo. Lo más relevante de nuestro estudio es que con el método desarrollado de extracción de dioxinas, así como la validación de la técnica de ELISA para cuantificar a estos compuestos en leche materna, fue posible distinguir el grado de exposición entre dos grupos con diferentes fuentes de exposición (uso o no de leña como combustible para preparar los alimentos). Los niveles de dioxinas encontrados en el Grupo de Leña (de 3 hasta 61 pg/g de lípido) nos indican que la exposición a dioxinas en esta población es importante y justifica la realización de estudios de biomonitoreo para evaluar el riesgo a la salud que permita estructurar estrategias de prevención y/o intervención. Para ello es importante tomar en cuenta que las dioxinas no son las únicas sustancias tóxicas emitidas durante la combustión de la leña, sino que también se generan hidrocarburos aromáticos policíclicos, bióxido y monóxido de carbono y partículas menores a 10 µm entre otros.38 Además se incrementa el riesgo a la salud pues las hornillas empleadas no tienen chimenea por lo que la población esta más expuesta a los diferentes contaminantes. El uso de leña para la cocción de alimentos en la población de estudio fue un factor determinante en la exposición a dioxinas, ya que de acuerdo con los resultados obtenidos, ninguno de los otros factores que se consideraron como probables fuentes de exposición a dioxinas (quema de basura, uso de plaguicidas, tabaquismo pasivo), tuvo diferencias estadísticamente significativas, ni cuando el análisis se realizó considerando a toda la población (n=67) ni cuando solo se tomo en cuenta al Grupo Leña (n=56). 29.

(37) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. El no haber encontrado una asociación entre los niveles de dioxinas en leche materna y el número de lactancias, se puede deber a que las madres que usan leña para cocinar, están expuestas no solo continuamente, sino a concentraciones altas de dioxinas, pues no se logró ver una disminución en las concentraciones de dioxinas en leche al aumentar el número de lactancias. La acumulación observada en las madres primíparas del Grupo de Leña indica que la exposición a dioxinas es alta, pues conforme aumentó la edad de la madre la concentración de dioxinas en leche fue mayor. Las concentraciones de dioxinas en leche que se cuantificaron en el Grupo Leña sugieren que la madre es una fuente importante de exposición para el lactante, y el riesgo para la salud de ambos es crítico.. 30.

(38) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Bibliografía. 1.- Hong H., Chang Y., Nam I., Fortnagel P., Schmidt S. (2002). Biotransformation of 2,7-Dichloro- and 1,2,3,4-Tetrachlorodibenzo-p-Dioxin by Sphingomonas wittichii. Applied and Environmental Microbiology 68(5):2584–2588.. 2.- OMS. (2001). Biomarkers In Risk Assessment: Validity And Validation. World Health Organization, Environmental Health Criteria 222.. 3.- Harjanto S., Kasai E., Terui T., Nakamura T. (2002). Formation and transport of CDD/Fs in the packed bed of soil containing organic chloride during a thermal remediation process. Chemosphere 49(2):217-24.. 4.- Minghui Z., Pengyan L., (1999). Aspects of formation and degradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans. Chinese Science Bulletin 44(14):1249.. 5.- Noriaki I., Yoshinobu Y., Kazuie N., Shigenobu O. (2002). The effects of organic and inorganic-chloride in municipal solid waste on dioxin formation and emission. http://www.comb.ritsumei.ac.jp/combust/Paper_DXN/DXN2000_exp.pdf. Última. fecha de consulta: 20 de Abril del 2005.. 6.- Schoeters G., Goyvaerts MP., Ooms D., Van Cleuvenbergen R. (2004). The evaluation of dioxin and dioxin-like contaminants in selected food samples 31.

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(41) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. 17.- Van den Berg M., Birnbaum L., Bosveld A.T., Brunstrom B., Cook P., Feeley M., Giesy J.P., Hanberg A., Hasegawa R., Kennedy S.W., Kubiak T., Larsen J.C., Van Leeuwen F.X., Liem A.K., Nolt C., Peterson R.E., Poellinger L., Safe S., Schrenk D., Tillitt D., Tysklind M., Younes M., Waern F., Zacharewski T. (1998). Toxic equivalency factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for humans and wildlife. Environ Health Perspect 106(12):775-92.. 18.- Shan G., Leeman W. R., Gee S.J., Sanborn J. R., Jones A. D., Chang D. P. Y., Hammock B. D. (2001). Highly sensitive dioxin immunoassay and its application to soil land biota samples. Analytica Chimica Acta 444(1):169-178.. 19.- Maier E. A., Van Cleuvenbergen R., Kramer G.N., Tuinstra L.G.M.Th., Pauwels J. (1995). BCR (non-certified) reference materials for dioxins and furans in milk powder. Fresenius journal of analytical chemistry 352:179-183.. 20.- Horwitz W. (1981). Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs. Presented at the 95th annual meeting of association of official chemists, Washington, D.C.. 21.- Pluim H.J., Wever J., Koppe J.G., Van der Slikke J.W. Olie K. (1993). Intake and faecal excretion of chlorinated dioxins and dibenzofurans in breast-fed infants at different ages. Chemosphere 26:1947–1952.. 34.

(42) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. 22.- Pluim H.J., Van der Goot M., Olie K., Van der Slikke J.W., Koppe J. G. (1996). Missing effects of background dioxin exposure on development of breast-fed infants during the first half year of life. Chemosphere 33(7):1307-1315.. 23.- Djien A.K., Furst P., Rapper C. (2000). Exposure of populations to Dioxins and related compounds. Food Add contam. 17:241-259.. 24.- García E. (2005). Dioxinas en suelo y exposición en mujeres lactando. Tesis para obtener el grado de doctorado en Ciencias Biomédicas Básicas, Facultad de Medicina Universidad Autónoma de San Luís Potosí.. 25.- Hooper K., Chuvakova T., Kazbekova G., Hayward D., Tulenova A., Petreas M.X., Wade T.J., Benedict K., Cheng Y., Grassman J. (1998). Analysis of Breast Milk to Assess Exposure to Chlorinated Contaminants in Kazakhstan: Sources of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) Exposures in an Agricultural Region of Southern Kazakhstan. Environmental health perspectives 107(6):447-457.. 26.- OMS. (1989). Levels of PCBs. PCDDs and PCDFs in breast milk: results of WHO-coordinated Interlaboratory Quality Control Studies and Analytical field Studies. World Health Organization. Environmental Health Series Rpt 34.. 35.

(43) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. 27.- Garmon L. (1983). Times Beach: The Long Road to Recovery. Science News 123(17):270.. 28.-. Rozman. K.K.. (1999).. Delayed. acute. toxicity. of. 1,2,3,4,6,7,8-. heptachlorodibenzo-p-dioxin (HpCDD), after oral administration, Obeys Haber's rule of inhalation toxicology. Toxicological Sciences 49:102-109.. 29.- Diliberto J.J., Jackson J.A., Birnbaum L.S. (1996). Comparison of 2,3,7,8Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) Disposition Following Pulmonary, Oral, Dermal, and Parenteral Exposures to Rats. Toxicology and Applied Pharmacology 138 (1):158-168.. 30.- Qiao G., Riviere J.E. (2000). Dermal absorption and tissue disposition of 3,3',4, 4'-tetrachlorobiphenyl (TCB) in an ex-vivo pig model: assessing the impact of dermal exposure variables. Int. J. Occup. Environ Health 6(2):127-37.. 31.- Seidel S.D., Li V., Winter G.M., Regers W.J., Martinez E.l., Denison M.S. (2000). AH receptor-based chemical screening bioassay: application and limitations for the detection of AH receptor agonist. Toxicological Sciences 55:10715.. 32.- Hans B. (1994). PCDD and PCDF Exposure and Levels in Humans in Germany. Environmental Health Perspectives 102(1):173-185.. 36.

(44) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. 33.- INEGI. (2000). XII Censo general de población y vivienda 2000, Viviendas particulares habitadas por municipio, Combustible utilizado para cocinar y número de cuartos, su distribución según disponibilidad y uso de la cocina. Instituto Nacional de Estadística Geografía e Informática.. 34.- Pollit F. (2002). Polychlorinated Dibenzodioxins and Polychlorinated Dibenzofurans. Regulatory Toxicology and Pharmacology 30:S63–S68. 35.- Maruyama W., Yoshida K., Tanaka T., Nakanishi J. (2002). Possible range of dioxin concentration in human tissues: simulation with a physiologically based model. Journal of Toxicology and Environmental Health 65:2053–2073.. 36.- Hernández R. (2003). Botanical book. Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales. Universidad de Los Andes-Mérida– Venezuela. http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/nutricionmineral/ Última visita al sitio: 20 de Abril del 2005.. 37.- Schecter A., Furst P.,Furst C., Papke O., Ball M., Ryan J.J., Hoang D.C., Le C.D., Hoang T.Q., Cuong H.Q. (1994). Chlorinated Dioxins and Dibenzofurans in Human Tissue from General Populations: A Selective Review. Environmental health perspectives 102 suppl 1:159-171.. 37.

(45) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. 38.- McDonald J. D., Zielinska B., Fujita E. M., Sagebiel J. C., Chow J., Watson J. G. (2000). Fine Particle and Gaseous Emission Rates from Residential Word Combustion. Environmental Science Technology 34: 2080-2091.. 38.

(46) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 1.-. Exactitud del método de ELISA para cuantificar dioxinas en leche materna.. Concentración experimental pg/g lípido Concentración Día. Media. % % CV. teórica (pg/g lípido) a. 1. 2. 3. (pg/g lípido). Error. 10. 7. 9. 8.6. 4.8. BCR 8.2. 16. 534*. *BCR 534 = Estándar de referencia de leche liofilizada (8.2 pg/g de lípido se obtuvo de la sumatoria de las concentraciones individuales para cada congénere de dioxinas multiplicado por la afinidad del anticuerpo). La exactitud se estimó como el porcentaje de error entre el valor teórico y el experimental.. 39.

(47) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 2.- Validación del método de extracción de dioxinas de los lípidos.. Método. Concentración (pg/ml). % Recobro. % Error. 60. 31 + 8. 69 + 8. 120. 14 + 11. 86 + 11. 240. 18 + 8. 82 + 8. 60. 81 + 13. 19 + 13. 120. 60 + 9. 40 + 9. 240. 60 + 16. 40 + 16. Adición TMDD* Yukio 15. Blanco. 75. Adición TMDD*. Bergman**. Blanco. 120. BCR 534*** (8.2 pg/g lípido). 40 (pg/g lípido). 487. n= 3. * TMDD = Subrogado de dioxina; 2 metil, 3,7,8, tricloro dibenzo dioxina ** Comunicación personal *** BCR 534 = Estándar de referencia de leche liofilizada, analizada por método de Bergman Blanco= Blanco de leche materna sin adición de TMDD. 40.

(48) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 3.- Efecto de matriz y porcentaje de recobro utilizando el método desarrollado en nuestro laboratorio.. Columnas de. Concentración. extracción en. Media + DE (pg/ml). % Recobro. fase sólida. Blanco. Sílica/Sílica. 65 + 13. Florisil/Florisil. 45 + 19. Florisil/Sílica. 20 + 6. Sílica/Florisil. 23 + 6. Sílica/Sílica. 94 + 28. 116. Florisil/Florisil. 42 + 21. -. Florisil/Sílica. 31 + 13. 44. Sílica/Florisil. 42 + 5. 76. (n=3). Adición de 25 pg/ml de TMDD* (n=3). * TMDD= Subrogado de dioxina; 2 metil, 3,7,8, tricloro dibenzo dioxina Blanco= leche materna sin adición de TMDD El efecto de matriz se evaluó con las concentraciones obtenidas de TMDD en una muestra blanco a la cual no se le adicionó TMDD. El porcentaje de recobro se estimó de muestras fortificadas con 25 pg/ml de TMDD.. 41.

(49) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 4.- Distribución de madres que usan leña para cocinar por Municipio.. % que usan leña. Número. usan leña. Aquismón. 9. 6. Tampamolón. 39. 36. 92. Tancanhuitz. 19. 14. 74. 67. 42.

(50) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 5.- Distribución de madres por tipo de combustible empleado para cocinar.. Grupo. N. (%). Huasteca. Leña1. 56. 83.6. Gas (control rural)2. 11. 16.4. Total. 67. 100. Capital Potosina. Gas (control urbano)3. 1.. 5. 100. El Grupo de Leña esta compuesto por las madres que siempre han utilizado la leña como combustible para cocinar sus alimentos y las madres que utilizan tanto leña como gas butano (licuado), éste de manera esporádica.. 2.. El Grupo Gas (Control Rural) son madres de la Huasteca que siempre han utilizado gas butano para cocinar.. 3.. El Grupo Gas (Control Urbano) son madres que viven en la capital de S.L.P. y que siempre han empleado como combustible el gas.. 43.

(51) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 6.- Características sociodemográficas de las madres, por tipo de combustible empleado para cocinar.. Edad de la madre (años). Tiempo de residencia (años). Grupo Leña. Grupo Gas Rural. Media ± DE. Media ± DE. 26.6 ± 6.7. 27 ± 7. (16 – 40). (18 – 40). 15.5 ± 12. 18.5 ± 6.7. (0.1 – 39). (5 – 26). 6 ± 1.9. 5 ± 2.2. (3 – 11). (3 – 11). 3 ± 1.5. 3 ± 2.1. (1 – 8). (1 -7). VIVIENDA. Número de habitantes. Número de cuartos. Horas/Día frente a la. 3 ± 1.4. hornilla. (1 – 6). -. Grupo Leña (n=55); Grupo Gas Rural (n=11) Entre paréntesis se muestra el intervalo. 44.

(52) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 7.- Factores que influyen en la exposición a dioxinas.. Grupo Leña. Grupo Gas Rural. n=56. n=11. Sí. No. Sí. No. (%). (%). (%). (%). Fumadoras pasivas. 7. 93. 36. 64. Uso de plaguicidas dentro de la casa. 38. 62. 27. 73. Uso de plaguicidas cerca de la casa. 62. 38. 64. 36. Uso de leña para calentar la vivienda. 20. 80. 0. 100. Quema de basura cerca de la casa. 40. 60. 73. 27. Los grupos se dividieron por el tipo de combustible empleado para cocinar.. 45.

(53) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 8.- Distribución de las madres de la Huasteca por periodo de lactancia.. Periodo de lactancia (meses). Número. Porcentaje (%). Porcentaje acumulado (%). 1. 13. 19.4. 19.4. 2a3. 15. 22.4. 41.8. 4a5. 12. 17.9. 59.7. 6. 16. 23.9. 83.6. >7. 11. 16.4. 100.0. 46.

(54) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 9.- Distribución de las madres de la Huasteca por número de lactancia.. lactancias. Número. Porcentaje (%). Porcentaje acumulado. 1a2. 32. 48.5. 48.5. 3a4. 20. 28.8. 77.3. >a5. 15. 22.7. 100. 47.

(55) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 10.- Niveles de dioxinas en leche de la población de estudio.. Grupo. n. Media pg/g lípidoa. Error Estándar. Intervalo (pg/g lípido) Mínimo. Máximo. Leña. 56. 21.5. 1.7. 7. 61. Gas Rural. 11. 13.5*. 1.2. 6. 25. 5. 8.3*. 1.02. ND. 17. Gas Urbano. Los grupos se dividen por el tipo de combustible empleado para cocinar. a. Media geométrica. *p<0.05 con respecto al Grupo Leña. 48.

(56) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 11.- Asociación entre la concentración de dioxinas en leche materna (pg/g lípido) y el uso de leña, ajustado por los meses de lactancia.. beta. Uso de leña. Intervalo de confianza 95%. 0.085. 0.064. 0.088. -0.026. -0.144. -0.001. R2. 0.185. Meses de lactancia. El modelo fue estadísticamente significativo p<0.05.. 49.

(57) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Tabla 12.- Asociación entre la concentración de dioxinas en leche materna (pg/g lípido) y el uso de leña, ajustado por los meses de lactancia y por la edad de la madre.. beta. Intervalo de confianza 95%. Uso de leña. 0.08. 0.04. 0.098. Meses de lactancia. -0.03. -0.04. -0.002. 0.001. -0.01. 0.02. R2. 0.22. Edad de la madre (años). El modelo fue estadísticamente significativo p<0.05.. 50.

(58) DETERMINACIÓN DE DIOXINAS EN LECHE MATERNA DE MUJERES EXPUESTAS A HUMO PROCEDENTE DE LA QUEMA DE LEÑA. Figura 1.- Estructuras químicas del antígeno, la dioxina más tóxica y subrogado empleados en la técnica de ELISA.. Cl. COOH. Cl. Cl a) Antígeno de recubrimiento (hapteno). Cl. Cl. Cl. Cl. b) 2,3,7,8 TCDD (dioxina). Cl. CH3. Cl. Cl c) TMDD 2 metil, 3,7,8, tricloro dibenzo dioxina (subrogado). 51.