Legipid Legionella Fast Detection Referencias: , , , ,

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Texto completo

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Legipid

®

Legionella Fast Detection

Referencias:

311-10-00, 311-10-01, 311-10-02, 311-10-04, 311-10-06

Prospecto

Test para la detección rápida de Legionella sp en muestras de agua, basado en la

combinación de la captura inmunomagnética y el inmunoensayo enzimático

(CEIA).

(2)

2 ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN

II. LA TECNOLOGÍA DEL TEST Legipid® Legionella Fast Detection

III. REACTIVOS Y COMPONENTES DEL KIT

IV. CADUCIDAD Y ALMACENAMIENTO

V. MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO

VI. PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES

VII. PROTOCOLO

A. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

B. ANÁLISIS

C. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN DEL TEST

VIII. CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS POSITIVOS

IX. CARACTERÍSTICAS Y VALIDACIÓN DEL TEST

X. REFERENCIAS

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3

I.

INTRODUCCIÓN

Legipid® Legionella Fast Detection es un test sencillo y rápido para la detección cualitativa y presuntiva de

Legionella sp en agua potable, natural e industrial. El test combina inmunocaptura magnética y

enzimo-inmunoensayo (CEIA) con reacción colorimétrica enzimática para un ensayo rápido de 1 hora, después de pre-concentrar una muestra. El usuario potencial de este kit es personal capacitado que realiza ensayos para detectar Legionella sp en laboratorios e instalaciones de riesgo (hoteles, hospitales, spa, piscinas, jacuzzis, torres de refrigeración, etc). El test Legipid® Legionella Fast Detection sería crucial para una prevención eficiente de la legionelosis.

Los métodos bacteriológicos convencionales requieren al menos de 7 a 15 días. Además, la recuperación de células viables en muestras ambientales por aislamiento en cultivo es usualmente muy pobre por los requerimientos específicos de crecimiento, interferencia de otras bacterias, pérdida y daño de Legionella en la preparación de la muestra para eliminar o reducir el número de otras bacterias. Se ha reportado que

Legionella sp forma células viables pero no cultivables que pueden causar fracaso del cultivo de Legionella sp

viable a partir de algunos ambientes. Los biofilms colonizan las instalaciones de riesgo y pueden contribuir a la rápida fluctuación de las células libres, dificultando la definición de períodos mínimos de muestreo para mantener la instalación de riesgo bajo control.

II.

LA TECNOLOGÍA DEL TEST Legipid® Legionella Fast Detection

Legipid® Legionella Fast Detection (referencia 311-10) es un test CEIA rápido basado en la separación inmunomagnética (SIM) con partículas magnéticas inmuno-activadas con anticuerpo anti-Legionella, acoplada a una detección colorimétrica para un ensayo rápido de 1 hora. La muestra original de agua se concentra por filtración o similar, y la muestra así preparada se eluye y dispensa en una cubeta de test, para ser analizada por el método CEIA. Se añade una suspensión de partículas magnéticas que se unen a la Legionella. Si hay presentes células de Legionella en la muestra preparada, se unirán a los anticuerpos inmovilizados sobre la superficie de las partículas magnéticas para formar complejos bacteria/partícula. Como estos complejos pueden ser separados por un imán, pueden ser fácilmente lavados y resuspendidos. Luego, los complejos se incuban con un anticuerpo anti-Legionella conjugado con una enzima, para formar complejos marcados. Tras los pasos de lavado descritos, los complejos Legionella/partícula magnética se visualizan por colorimetría desarrollada cuando se añaden los substratos enzimáticos. Un control (sin la bacteria diana) puede ser ensayado en paralelo en una cubeta de control. Este test incluye las siguientes 3 principales etapas:

III. REACTIVOS Y COMPONENTES DEL KIT

311-10-00 (10 ensayos con maletín) y 311-10-01 (10 ensayos)

La referencia 311-10-00 contiene todos los reactivos y componentes necesarios para la realización de 10 ensayos y se suministra en un maletín para su transporte que contiene una placa refrigerante para mantener los reactivos a la temperatura adecuada.

Esta referencia contiene los elementos indicados en la tabla siguiente:

Referencia ID Reactivo/Componente Cantidad provista

311-10-00-MA Maletín 1 unidad

311-10-00-L0 Eluyente 1 frasco (110 mL)

311-10-00-L1 Reactivo de captura (partículas inmunomag.) 1 frasco ( 11 mL)

311-10-00-L2 Tampón de lavado 1 frasco (215 mL)

311-10-00-L3 anti-Legionella conjugado con enzima 10 viales (10 x 1mL) 311-10-00-L4 Co-substratos enzimáticos 10 viales monodosis

(10 x 2.6mg)

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4

311-10-00-L6 Reactivo de parada 1 frasco (3.5 mL)

311-MP2-RA Concentrador de partículas mag. con dos cubetas 1 unidad

311-10-CB Cubeta 8 unidades

311-10-PF Placa refrigerante 1 unidad

El concentrador de partículas magnéticas (311-MP2-SP) y las cubetas (311-10-CB) pueden suministrarse por separado.

La referencia 311-10-01 también incluye todos los reactivos necesarios para realizar 10 ensayos pero no cuenta con maleta de transporte (311-10-00-MA) ni con concentrador de partículas magnéticas (311-MP2-RA). 311-10-02 (40 ensayos)

La referencia 311-10-02 contiene todos los reactivos necesarios para la realización de 40 ensayos. Esta referencia contiene los elementos indicados en la tabla siguiente:

Referencia ID Reactivo/Componente Cantidad provista

311-10-02-L0 Eluyente 1 frasco (440 mL)

311-10-02-L1 Reactivo de captura (partículas inmunomag.) 1 frasco ( 44 mL)

311-10-02-L2 Tampón de lavado 1 frasco (840 mL)

311-10-02-L3 anti-L.egionella conjugado con enzima 1 frasco (44 mL) 311-10-02-L4 Co-substratos enzimáticos

20 viales monodosis (20 x 2.6mg) 5 frascos (5 x 12 mg)

311-10-02-L5 Tampón de reacción 1 frasco (60 mL)

311-10-02-L6 Reactivo de parada 1 frasco (4,4 mL)

311-10-CB Cubeta 40 unidades

La referencia 311-10-02-L4 presenta una combinación de dos formatos (viales monodosis y frascos) para ajustarse al número de ensayos a realizar en una misma tanda. Cada frasco permite realizar 4 ensayos mientras que cada vial permite realizar 1 ensayo.

Ejemplo: Para analizar 10 muestras en una misma tanda se requerirá realizar 11 ensayos (1 ensayo por muestra más el ensayo del control negativo por tanda). Por lo tanto podríamos utilizar 3 viales monodosis y 2 frascos de 4 ensayos cada uno.

EL concentrador de partículas magnéticas para dos cubetas (311-MP2-SP) o para cuatro cubetas (311-MP4-SP) y las cubetas (311-10-CB) pueden suministrarse por separado.

Referencia ID Componente Cantidad provista

311-MP2-SP Concentrador de partículas mag. para dos cubetas 1 unidad 311-MP4-SP Concentrador de partículas mag. para cuatro cubetas 7 unidades

311-10-CB Cubeta 20 unidades

311-MP4-P Plataforma 1 unidad

311-MP4-TC Tapete posicionador 1 unidad

El concentrador de partículas magnéticas para cuatro cubetas (311-MP4-SP), contiene los componentes indicados en la tabla siguiente y pueden ser suministrados por separado.

Referencia ID Componente Cantidad provista

311-MP4-CH Soporte insertable para cubetas 1 unidad

311-MP4-MH Soporte magnético 1 unidad

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5 311-10-04 (100 ensayos)

La referencia 311-10-04 contiene todos los reactivos necesarios para la realización de 100 ensayos. Esta referencia contiene los elementos indicados en la tabla siguiente:

Referencia ID Reactivo/Componente Cantidad provista

311-10-04-L0 Eluyente 1 frasco (1100 mL)

311-10-04-L1 Reactivo de captura (partículas inmunomag.) 1 frasco (110 mL)

311-10-04-L2 Tampón de lavado 2 frascos (2x1050 mL)

311-10-04-L3 anti-Legionella conjugado con enzima 1 frasco (110mL) 311-10-04-L4 Co-substratos enzimáticos

40 viales monodosis (40 x 2.6mg) 15 frascos (15 x 12 mg)

311-10-04-L5 Tampón de reacción 1 frasco (150 mL)

311-10-04-L6 Reactivo de parada 1 frasco (11 mL)

311-10-CB Cubeta 100 unidades

La referencia 311-10-04-L4 presenta una combinación de dos formatos (viales monodosis y frascos) para ajustarse al número de ensayos a realizar en una misma tanda. Cada frasco permite realizar 4 ensayos mientras que cada vial permite realizar 1 ensayo.

Ejemplo: Para analizar 18 muestras en una misma tanda se requerirá realizar 19 ensayos (1 ensayo por muestra más el ensayo del control negativo por tanda). Por lo tanto podríamos utilizar 3 viales monodosis y 4 frascos de 4 ensayos cada uno.

El concentrador de partículas magnéticas para dos cubetas (311-MP2-SP) o para cuatro cubetas (311-MP4-SP) y las cubetas (311-10-CB) pueden suministrarse por separado.

Referencia ID Componente Cantidad provista

311-MP2-SP Concentrador de partículas mag. para dos cubetas 1 unidad 311-MP4-SP Concentrador de partículas mag. para cuatro cubetas 7 unidades

311-10-CB Cubeta 20 unidades

311-MP4-P Plataforma 1 unidad

311-MP4-TC Tapete posicionador 1 unidad

El concentrador de partículas magnéticas para cuatro cubetas (311-MP4-SP), contiene los componentes indicados en la tabla siguiente y pueden ser suministrados por separado.

Referencia ID Componente Cantidad provista

311-MP4-CH Soporte insertable para cubetas 1 unidad

311-MP4-MH Soporte magnético 1 unidad

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6 311-10-06 (500 ensayos)

La referencia 311-10-06 contiene todos los reactivos necesarios para la realización de 500 ensayos. Esta referencia contiene los elementos indicados en la tabla siguiente:

Referencia ID Reactivo/Componente Cantidad provista

311-10-06-L0 Eluyente 4 frascos (4x1375 mL)

311-10-06-L1 Reactivo de captura (partículas inmunomag.) 5 frascos (5x110 mL)

311-10-06-L2 Tampón de lavado 4 frascos (4x2625 mL)

311-10-06-L3 anti-Legionella conjugado con enzima 1 frasco (550 mL) 311-10-06-L4 Co-substratos enzimáticos 25 frascos (25 x 12 mg)

20 frascos (20 x 60mg)

311-10-06-L5 Tampón de reacción 1 frasco (750 mL)

311-10-06-L6 Reactivo de parada 1 frasco (55 mL)

311-10-CB Cubeta 500 unidades

La referencia 311-10-06-L4 presenta una combinación de dos formatos (frascos de 12 mg (4 ensayos/frasco) y frascos de 60 mg (20 ensayos/frasco)) para ajustarse al número de ensayos a realizar en una misma tanda. El número máximo de ensayos (cubetas) por plataforma es de 20 (19 muestras y 1 control negativo).

Ejemplo: Para analizar 34 muestras se requerirá realizar 2 tandas de ensayos, una tanda de 19 muestras y 1 control negativo, y otra tanda de 15 muestras y 1 control negativo, en total 36 ensayos.

EL concentrador de partículas magnéticas para dos cubetas (311-MP2-SP) o para cuatro cubetas (311-MP4-SP) y las cubetas (311-10-CB) puede suministrarse por separado.

Referencia ID Componente Cantidad provista

311-MP2-SP Concentrador de partículas mag. para dos cubetas 1 unidad 311-MP4-SP Concentrador de partículas mag. para cuatro cubetas 7 unidades

311-10-CB Cubeta 20 unidades

311-MP4-P Plataforma 1 unidad

311-MP4-TC Tapete posicionador 1 unidad

El concentrador de partículas magnéticas para cuatro cubetas (311-MP4-SP), contiene los componentes indicados en la tabla siguiente y pueden ser suministrados por separado.

Referencia ID Componente Cantidad provista

311-MP4-CH Soporte insertable para cubetas 1 unidad

311-MP4-MH Soporte magnético 1 unidad

311-MP4-BB Soporte de sujeción 1 unidad

IV. CADUCIDAD Y ALMACENAMIENTO

Una vez recibido el kit almacenar entre +2°C y +8°C, preferiblemente a +4°C. La caducidad de los reactivos correctamente almacenados es de 6 meses. Todos los reactivos incluyen su propio número de lote y condiciones de almacenamiento. Dichas condiciones también se reflejan en el embalaje. Además, el protocolo incluye código, número de lote y fecha de caducidad, asegurando la trazabilidad de todos los reactivos. Puede solicitar al fabricante un certificado de análisis.

V.

MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO

Frasco graduado con tapón de rosca, para la elución del filtro.

Filtro de fibra de vidrio, para uso como pre-filtro (*) en el sistema de filtración. Filtro de membrana estéril, para uso en el sistema de filtración.

Contenedor para residuo.

Pipetas de 10-100µl, 100-1000µl y 1-5ml.

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7 Agitador de movimiento orbital (incluyendo velocidades de 80-350 rpm).

Opcional: vórtex o sonicador, para soltar del filtro el material retenido (la elución puede hacerse manual).

(*)Se recomienda encarecidamente utilizar filtro de fibra de vidrio de diámetro de poro 2.7 μm como pre-filtro para muestras de agua, especialmente cuando la filtración es costosa

(**)Nota: Contacte con Biótica para información detallada sobre equipos recomendados por nuestro departamento técnico

VI. PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES

Este test debe ser realizado por personal adecuadamente capacitado.

Este test está diseñado para las siguientes matrices: agua potable, natural e industrial.

El producto es seguro en condiciones normales de uso. Evite el contacto con los ojos. Si se produjeran salpicaduras, use gafas de seguridad. Evite el contacto con la piel usando guantes. (Ver Ficha de Seguridad)

Los productos son estables, es improbable que reaccionen peligrosamente en condiciones normales de uso.

El producto puede ser dispuesto de acuerdo con la normativa vigente.

La prestación del test depende del estricto cumplimiento en las siguientes prácticas, especialmente en lo que concierne a la ejecución correcta del protocolo:

No utilizar reactivos después de la fecha de caducidad.

Utilizar un control negativo (reactivo L0) para cada tanda de de ensayos.

Dejar atemperar los reactivos (18-26 ºC) al menos durante 30 minutos antes de su uso. Agitar el reactivo L1 antes de usar, para asegurar la homogeneidad de la suspensión de

partículas inmunomagnéticas

Ejecutar cuidadosamente las etapas de lavado (reactivo L2). Las cubetas son desechables. No reutilizar.

Ref 311-10-00 / 01: Dejar atemperar todos los reactivos al menos durante 30 minutos antes de su uso. En el caso de los reactivos L3 y L4, dejar atemperar tantas monodosis como ensayos a realizar.

Ref 311-10-02 / 04/ 06: Dejar atemperar al menos durante 30 minutos las siguientes cantidades de reactivos por ensayo a realizar:

L0: 10 ml por ensayo

L1: 1.1 ml por ensayo (antes de tomar los ml pertinentes agitar el frasco original del reactivo L1 hasta obtener una suspensión completamente homogénea) L2: 20 ml por ensayo

L3: 1.1ml por ensayo

L4: tantos viales / frascos como ensayos a realizar, tener en cuenta que los viales son para monodosis, y los frascos pueden ser para 4 ensayos o para 20 ensayos, según referencia.

L5: 1.3ml por vial monodosis a utilizar, 6ml por frasco de L4 de 4 test y 30ml por frasco de L4 de 20 test.

L6: 0.11 ml por ensayo

Utilizar el tapete posicionador (Ref. 311-MP4-TC) cuando se use el concentrador MP4 para evitar interferencias por proximidad de los imanes entre sí.

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VII. PROTOCOLO

Se recomienda encarecidamente leer el protocolo completo y con detenimiento antes de iniciar el test.

A. Preparación de la muestra

1.

Recoja el volumen de muestra del agua original que desea concentrar (por ejemplo por filtración).

2.

Añada entre 5 y 10mL, preferiblemente 10ml, del eluyente en un frasco. Use como eluyente L0 o disolución Ringer 1/40.

3.

Proceda a la filtración del volumen recogido utilizando un pre-filtro de fibra de vidrio de 2,7 µm de diámetro de poro situado sobre un filtro de membrana (por ejemplo, nitrocelulosa de 0,45 µm, policarbonato de 0,40 µm).

4.

Separe el pre-filtro de fibra de vidrio y deséchelo. Entonces cuidadosamente separe el filtro de membrana del sistema de filtración y deposítelo dentro del frasco con el eluyente antes preparado. Opcionalmente puede cortar el filtro en varias piezas con unas tijeras.

5.

Eluya el filtro por agitación. Tal agitación puede ser: a. Manual (2 minutos)

b. Vórtex (2 minutos)

c. Baño ultrasonidos (5 minutos)

Nota:

Por cada tanda de muestras, se realizará un control negativo (C) con el reactivo eluyente utilizado.

Protocolo basado en los contenidos de la norma estándar ISO 11731 para la detección y enumeración de Legionella

pneumophila en agua.

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B. Análisis con el kit Legipid® Legionella Fast Detection

B.1 Usuario de CONCENTRADOR DE PARTÍCULA MAGNÉTICA PARA 2 CUBETAS (MP2)

Antes de comenzar el test:

Asegúrese de que los reactivos que va a utilizar se han atemperado a temperatura ambiente al menos durante 30 minutos.

Inserte las cubetas en el concentrador MP2.

B.1.1) ETAPA DE CAPTURA

1. Separe el imán de las cubetas. Agite L1 hasta obtener una suspensión completamente homogénea y añádalo a la cubeta hasta la línea 1 (1ml).

2. Añada la muestra preparada hasta la línea 3, sin dejar trozos del filtro en la cubeta.

Control (C) Test (T)

3. Agite suavemente, con el tapón puesto, una vez cada 3 minutos, durante 15 minutos.

4. Acerque el imán hasta hacer tope con la cubeta y espere 5 minutos para retener las partículas.

5. Vacíe la cubeta con cuidado, sin arrastrar las partículas antes retenidas.

6. Separe el imán de la cubeta y añada el reactivo L2 hasta la línea 2 (4.5 ml).

7. Agite suavemente SIN tapones hasta resuspender de nuevo las partículas.

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9. Vacíe la cubeta con cuidado, sin arrastrar las partículas antes retenidas.

B.1.2) ETAPA DE MARCADO

1. Separe el imán, añada todo el contenido de un vial de L3 (1 ml) en cada cubeta y agite.

2. Agite suavemente SIN tapones cada 3 minutos durante 10 minutos.

3. Acerque el imán hasta hacer tope con la cubeta y espere 3 minutos para retener las partículas.

4. Vacíe la cubeta con cuidado, sin arrastrar las partículas antes retenidas.

5. Separe el imán de la cubeta y añada reactivo L2 hasta la línea 2 (4.5 ml).

6. Agite suavemente SIN tapones hasta resuspender de nuevo las partículas.

7. Acerque el imán hasta hacer tope con la cubeta y espere 3 minutos para retener las partículas.

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B.1.3) ETAPA DE DETECCIÓN

1. Prepare la mezcla de L5 con L4 en función del formato de L4: 1.3 ml de L5 por vial monodosis de L4 ó

6 ml de L5 por frasco de L4 de 4 test ó 30 ml de L5 por frasco de L4 de 20 test.

Agite enérgicamente, y reserve la mezcla disuelta.

2. Vacíe la cubeta con cuidado, sin arrastrar las partículas antes retenidas.

3. Separe el imán y añada en cada cubeta 1.3 ml de la mezcla preparada en el punto 1 (L4+L5).

4. Agite suavemente SIN tapones hasta resuspender de nuevo las partículas. Ahora espere 2 minutos, agitando suavemente mientras tanto.

5. Después de los 2 minutos, si hay una diferencia de color entre el test (T) y el control (C), entonces vaya al siguiente paso; si no, entonces deje que el color se desarrolle durante 10 minutos(es decir, 8 minutos más) antes del siguiente paso.

6. Añada 3 gotas de L6 (100µl) y agite suavemente sin tapones. Espere 1 minuto.

7. Acerque el imán hasta hacer tope con la cubeta y espere 5 minutos.

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B.2 Usuario de CONCENTRADOR DE PARTÍCULA MAGNÉTICA PARA 4 CUBETAS (MP4)

Antes de comenzar el test:

Asegúrese de que los reactivos que va a utilizar se han atemperado a temperatura ambiente al menos durante 30 minutos.

Inserte las cubetas (CB) en su soporte (CH), tantas como ensayos vaya a realizar. Coloque la plataforma (P) sobre el agitador orbital

B.2.1) ETAPA DE CAPTURA

1. Añada cada muestra preparada (9 ml) en su correspondiente cubeta. Si es necesario complete el volumen con Ringer 1/40 o L0 hasta los 9 ml.

2. Agite L1 hasta obtener una suspensión completamente homogénea. Resuspenda mediante pipetting suave y repetido y entonces añada 1 mL en cada cubeta. Coloque un tapón en cada cubeta.

3. Inserte el modulo soporte de cubetas (CH) en la plataforma (P) de modo que las cubetas queden en posición horizontal. Entonces agite a 80 rpm durante 15 minutos en el agitador orbital.

4. Separe cada soporte de cubetas (CH) de la plataforma (P) y quite el tapón de cada cubeta (en posición vertical). Inserte cada soporte de cubetas (CH) en un soporte magnético (MH). Encaje el conjunto en un soporte de sujeción (BB) (presione ligeramente por delante y encájelo hacia abajo).Coloque los módulos en su posición del tapete posicionador (TC) y espere 5 minutos para retener las partículas magnéticas.

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5.Deseche el sobrenadante vaciando las cubetas, rotando para ello el conjunto, con cuidado de no arrastrar las partículas antes retenidas.

6. Desencaje el soporte de sujeción (BB) y entonces separe el soporte de cubetas (CH) del soporte magnético (MH) e inserte el soporte de cubetas (CH) en posición vertical sobre la plataforma (P) en el agitador orbital. Entonces añada 4.5ml del reactivo L2 en cada cubeta.

7. Agite a 350 rpm SIN tapones durante 10 segundos, hasta resuspender de nuevo las partículas.

8. Separe cada soporte de cubetas (CH) de la plataforma (P), insértelo de nuevo en un soporte magnético (MH) y luego en un soporte de sujeción (BB) (presione ligeramente por delante y encájelo hacia abajo). Coloque los módulos en su posición del tapete posicionador (TC) y espere tres minutos para retener las partículas magnéticas.

9. Deseche el sobrenadante vaciando las cubetas, rotando el conjunto, con cuidado de no arrastrar las partículas retenidas.

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B.2.2) ETAPA DE MARCADO

1. Desencaje el soporte de sujeción (BB), separe el soporte de cubetas (CH) del soporte magnético (MH) e inserte el soporte de cubetas (CH) en posición vertical sobre la plataforma (P) en el agitador orbital. Añada 1 ml de reactivo L3 en cada cubeta.

2. Agite a 250 rpm durante 10 segundos SIN tapones y entonces agite a 80 rpm durante 10 minutos SIN tapones.

3. Separe cada soporte de cubetas (CH) de la plataforma (P), inserte de nuevo en un soporte magnético (MH) y el conjunto en un soporte de sujeción (BB). Espere tres minutos para retener las partículas magnéticas.

4. Deseche el sobrenadante, con cuidado de no arrastrar las partículas retenidas.

5. Desencaje el soporte de sujeción (BB), separe el soporte de cubetas (CH) del soporte magnético (MH) e inserte el soporte de cubetas (CH) en posición vertical sobre la plataforma (P) en el agitador orbital.

Entonces añada 4.5ml del reactivo L2 en cada cubeta.

6. Agite a 350 rpm durante 10 segundos SIN tapones, hasta resuspender las partículas de nuevo.

7. Separe cada soporte de cubetas (CH) de la plataforma (P), inserte de nuevo en un soporte magnético (MH) y el conjunto en el soporte de sujeción (BB). Espere tres minutos para retener las partículas magnéticas.

8.Repita los pasos 4, 5, 6 y 7 (de esta sección B) ETAPA DE MARCAJE dos veces más.

B.2.3) ETAPA DE DETECCIÓN

1. Prepare la mezcla de L5 con L4 en función del formato de L4: 1.3 ml de L5 por vial monodosis de L4 ó

6 ml de L5 por frasco de L4 de 4 test ó 30 ml de L5 por frasco de L4 de 20 test.

Agite enérgicamente, y reserve la mezcla disuelta.

2. Deseche los sobrenadantes de las cubetas teniendo cuidado de no arrastrar las partículas capturadas.

3.

Desencaje el soporte de sujeción (BB), separe el soporte de cubetas (CH) del soporte magnético (MH) e inserte el soporte de cubetas (CH) en posición vertical sobre la plataforma (P) en el agitador orbital. Homogeneice bien la mezcla L4+L5 y añada 1.3 ml en cada cubeta.

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4.

Agite a 250 rpm durante 10 segundos SIN tapones y entonces agite a 80 rpm durante 2 minutos SIN tapones.

5.

Después de 2 minutos, compare el color del test (T) con el color del control (C); si hay una diferencia de color entre el test (T) y el control (C), entonces vaya al paso siguiente; si no, entonces deje que el color se desarrolle hasta los 10 minutos(es decir, 8 minutos más) y entonces vaya al paso 9.

6. Sin detener la agitación, traslade las cubetas cuyo color es diferente del control (C) desde la plataforma (P)

a los soportes de cubetas (CH) auxiliares. Añada con pipeta 100µl de reactivo L6 sólo sobre estas muestras para parar la reacción. Espere 1 minuto.

RECUERDE: No pare el control (C)

7. Inserte cada soporte de cubetas (CH) auxiliar en un soporte magnético (MH) y el conjunto en el soporte de sujeción (BB). Espere 5 minutos para retener las partículas magnéticas.

8.Compare el color del test (T) con la carta de color (ver APÉNDICE A (página 18)).

9.Para las muestras cuyo color de test (T) no se diferenció del color del control (C) en el paso 5, después de 10 minutos de reacción colorimétrica, añada con pipeta 100µl de reactivo L6, para parar la reacción, tanto sobre estas muestras como sobre el control (C), y agite a 80 rpm durante 1 min SIN tapones.

10. Separe cada soporte de cubetas (CH) de la plataforma (P), insértelo de nuevo en un soporte magnético (MH) y el conjunto en el soporte de sujeción (BB). Espere 5 minutos para retener las partículas magnéticas.

11.Compare el color de test (T) con el color del control (C).

Nota: Consideraciones sobre la eliminación. El producto debe eliminarse de acuerdo con las normas locales. Deseche los envases vacíos a través del proceso de reciclado o eliminación de residuos.

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C. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN DEL TEST

El resultado del test se considera positivo si:

1.

El

test (T) presenta mayor color que el control (C) a los 2 minutos desde el inicio de la reacción colorimétrica. Entonces pare la reacción según las instrucciones de este protocolo. La estimación general del nivel de Legionella sp en la muestra se puede obtener comparando el color del test (T) con la carta de color (Apéndice A).

2.

Si no hay diferencia de color a los 2 minutos, deje que la reacción transcurra hasta los 10 minutos y entonces pare la reacción. Un test (T) positivo para Legionella sp debe presentar mayor color que el color del control (C)a los 10 minutos desde el inicio de la reacción colorimétrica. El nivel estimado de Legionella sp es bajo, hasta dos órdenes de magnitud (102 UFC/porción testada).

El resultado del test se considera negativo si:

3.

El

test (T) no presenta diferencia de color con el control (C) transcurridos los 10 minutos. La interpretación de los resultados del test se resumen en el diagrama siguiente:

VIII. CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS POSITIVOS

En el contexto de la certificación de AOAC-RI, un resultado positive por Legipid® Legionella Fast Detection es considerado un positivo presuntivo y se recomienda que sea confirmado de acuerdo con métodos de cultivo estandarizados (ejemplo ISO 11731:1998).

Es posible reservar un volumen de 0.1-0.5 ml de la muestra preparada antes de llevar a cabo las confirmaciones. En el caso de resultados que no se corresponden, entre Legipid® Legionella Fast Detection y el método de confirmación, el usuario debería seguir los pasos necesarios para asegurar la validez de sus resultados. La desviación positive puede asociarse con una pobre recuperación de la bacteria diana por cultivo (células viables pero no cultivables-VBNC-), microbiota que inhibe el crecimiento de Legionella, etc), o cumplimiento insuficiente de los lavados protocolizados en la etapa de marcaje.

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IX. CARACTERÍSTICAS Y VALIDACIÓN DEL TEST

El kit Legipid® Legionella Fast Detection kit es un test rápido y sencillo para la detección de Legionella sp en muestras de agua. Este kit tiene un nivel de detección relativa de 93 UFC/volumen examinado (LOD50).

El kit Legipid® Legionella Fast Detection está validado por AOAC-Research Institute en el programa Performance Tested Method para agua potable, natural e industrial. Certificado número 111101

X. REFERENCIAS

1. International Organization for Standardization. 1998ISO 11731:1998. Water quality - Detection and enumeration of

Legionella.

2. International Organization for Standardization. 2004. ISO 11731-2:2004. Water quality - Detection and enumeration of

Legionella -- Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. International Organization for

Standardization, Geneva, Switzerland.

3. Ragull S, Garcia-Nuñez M, Pedro-Botet ML, Sopena N, Esteve M, Montenegro R, et al Legionella pneumophila in

Cooling Towers: Fluctuations in Counts, Determination of Genetic Variability by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), and Persistence of PFGE Patterns. Applied and Environmental Microbiology, 2007; 73: 5382–5384

4. Alleron L, Frère J, Merlet N, Legube B. Monochloramine treatment induces a viable but non culturable state into biofilm

and planktonic Legionella pneumophila populations,. In N. P. Cianciotto, Y. Abu Kwaik, P.H. Edelstein, B.S. Fields, D.F. Geary, T.G. Harrison, C. Joseph, R.M. Ratcliff, J.E: Stout, and M.S. Swanson (eds.), Legionella: state of the Art 30 years after its recognition, ed. ASM Press, Washington, DC. 2006. p. 533-537

5. Steinert M, Emody L, Amann R, Hacker J. Resuscitation of viable but nonculturable Legionella pneumophila

Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellanii. Applied and Environmental Microbiology, 1997; 63: 2047-2053.

6. Garcia, M. T., Jones, S., Pelaz, C., Millar, R. D. & Abu Kwaik, Y. (2007). Acanthamoeba polyphaga resuscitates viable

non-culturable Legionella pneumophila after disinfection. Environ. Microbiol. 9, 1267-1277.

7. Pilar Delgado-Viscogliosi et al. 2005. Rapid Method for Enumeration of viable Legionella pneumophila and Other

Legionella spp in Water. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 71, No 7, p.4086-4096.

Advertencia al comprador: Utilice este producto sólo para análisis medioambiental

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Para asistencia técnica por favor contacte: Biótica, Bioquímica Analítica, S.L. Parque Científico y Tecnológico, Universidad

Jaume I

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APÉNDICE A – Carta de Color

Para estimar el nivel de Legionella sp en una muestra positiva a los 2 min desde el inicio de la reacción de color, sitúe la cubeta del test (T) junto a la siguiente carta de color.

Resultado en ufc / volumen examinado

Por debajo del primer color de la carta, el nivel estimado de Legionella sp es de hasta dos órdenes de magnitud (102 UFC/volumen examinado). Por debajo del segundo color de la carta, el nivel estimado de Legionella sp es de hasta tres órdenes de magnitud (103 UFC/volumen examinado). A partir del segundo color el nivel estimado de Legionella sp es igual o mayor que cuatro órdenes de magnitud (104 UFC/volumen examinado).

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