Enzyme immunoassay for the quantitative determination of Free Testosterone in human serum or plasma

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Free Testosterone

Enzyme immunoassay for the quantitative determination of Free Testosterone in human serum or plasma Dosage immunoenzymatique pour la détermination quantitative de la testostérone libre dans le sérum ou le plasma humain

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Testosterona libre en suero o plasma humano

Only for in-vitro diagnostic use

English: Page 2 to 7

Français: Page 8 à 13

Espanol: Página 14 a 19

Bibliography / Bibliographie / Bibliografía Page / Página 22 Symbols Key / Explication des symboles / Símbolos Page / Página 23 Summary of Test Procedure/ Résumé de la procédure de test / Page / Página 24 Resumen de la técnica

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Product Number: DNOV009 (96 Determinations)

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ENGLISH

1. INTRODUCTION

Testosterone is a steroid hormone from the androgen group. Testosterone is primarily secreted in the testes of males and the ovaries of females although small amounts are secreted by the adrenal glands. It is the principal male sex hormone and an anabolic steroid. In both males and females, it plays key roles in health and well-being.

Due to its insolubility in aqueous solutions, for the most part Testosterone circulates in the blood bound to transport proteins. Only a small percentage (< 1%) of circulating testosterone exists as unbound or free testosterone. The majority, approximately 60%, is bound to SHBG with high affinity, while the remainder is loosely bound to albumin. Both the albumin-bound and free fractions may be biologically active, while SHBG effectively inhibits testosterone action.

Testosterone effects can be classified as virilising and anabolic effects. Anabolic effects include growth of muscle mass and strength, increased bone density and strength, and stimulation of linear growth and bone maturation. Virilising effects include maturation of the sex organs.

Testosterone levels decline gradually with age in men.

Measurement of the free or unbound fraction of serum testosterone has been proposed as a means of estimating the physiologically bioactive hormone. Free testosterone levels are elevated in women with hyperandrogenism associated with hirsutism in the presence or absence of polycystic ovarian disease. In addition, free testosterone measurements may be more useful than total testosterone in situations where SHBG is increased or decreased (e.g. hypothyroidism and obesity).

2. INTENDED USE

Competitive immunoenzymatic colorimetric method for quantitative determination of free Testosterone in human serum or plasma. Second generation.

3. PRINCIPLE OF THE ASSAY

In blood Testosterone is bound to SHBG (60%) and in lower quantity to other proteins (for example albumin). Only the measurement of Free Testosterone (< 1% of Total Testosterone) permits the estimating of the biologically active hormone.

Microtiter strip wells are precoated with anti-Testosterone antibodies (solid-phase). Free Testosterone in the sample competes with added horseradish peroxidase labelled Testosterone (enzyme-labelled antigen) for antibody binding. The Testosterone bound to proteins does not take part to this reaction, so it is washed away during the washing step (for total Testosterone measurement the ELISA NovaTec “Testosterone” kit is available). After incubation a bound/free separation is performed by solid-phase washing. The immune complex formed by enzyme-labelled antigen is visualized by adding Tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product. The intensity of this product is inversely proportional to the amount of Testosterone in the sample. Sulphuric acid is added to stop the reaction. This produces a yellow endpoint colour. Absorption at 450 nm is read using an ELISA microwell plate reader.

Testosterone in the blood is bound to SHBG (60 %) and in lower quantity to other protein. Only the measurement of Free Testosterone (< 1% of Total Testosterone) permits the estimating of the hormone biologically active.

4. MATERIALS

4.1. Reagents supplied

Anti-Testosterone IgG Coated Wells: 12 breakapart 8-well snap-off strips coated with anti-Testosterone, in

resealable aluminium foil.

Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml sulphuric acid, 0.15 mol/l (avoid any skin contact).

Testosterone-HRP conjugate: 1 bottle containing 15 ml of horseradish peroxidase labelled Testosterone.

TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine (H2O2-TMB 0.26g/l) (avoid any

skin contact).

Wash solution 10x conc.: 1 bottle containing 50 ml of a 10x concentrated solution of phosphate buffer 20 mM,

NaCl 160 g/l, Tween-20 10 g/l, pH 7.4

Control A: 1 bottle containing 1 ml of a lot-specific, ready to use control solution. The concentration is stated on the

label.

Control B: 1 bottle containing 1 ml of a lot-specific, ready to use control solution. The concentration is stated on the

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Testosterone Standards: 6 bottles, 1 ml each Standard 0: 0.0 pg/ml Standard 1: 0.2 pg/ml Standard 2: 1.0 pg/ml Standard 3: 4.0 pg/ml Standard 4: 20.0 pg/ml Standard 5: 100.0 pg/ml

Unit conversion: pmol/l = 3.47*pg/ml

4.2. Materials supplied

1 Strip holder

1 Cover foil 1 Test protocol

1 Distribution and identification plan

4.3. Materials and Equipment needed

ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450 nm, 620-630 nm Incubator 37°C

Manual or automatic equipment for rinsing wells Pipettes

Vortex tube mixer Distilled water Disposable tubes Timer

5. STABILITY AND STORAGE

The reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at 2...8 °C in the dark.

6. REAGENT PREPARATION

It is very important to bring all reagents, samples and standards to room temperature (22…28°C) for at least 30 minutes before starting the test run! At the end of the assay store the reagents immediately at 2-8° C; avoid long exposure to room temperature.

6.1. Coated snap-off Strips

The ready to use break apart snap-off strips are coated with anti-Testosterone antibodies. Store at 2…8 °C. Open the bag only when it is at room temperature. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed in the

aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at 2…8 °C; stability until expiry date

6.2. Testosterone-HRP Conjugate

Testosterone-HRP Conjugate is a ready to use solution.

6.3. Testosterone Standards

Before use mix 5 min. with a rotating mixer. The standards are ready to use and have the following concentration of Testosterone: Standard 0: 0.0 pg/ml Standard 1: 0.2 pg/ml Standard 2: 1.0 pg/ml Standard 3: 4.0 pg/ml Standard 4: 20.0 pg/ml Standard 5: 100.0 pg/ml

The solutions have to be stored at 2…8 °C.

After first use the standards are still stabile for another 6 months if stored at 2-8°C.

6.4. TMB Substrate Solution

The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be stored at 2...8°C in the dark. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into

blue, it may have become contaminated and should be thrown away.

6.5. Stop Solution

The bottle contains 15 ml 0.15 M sulphuric acid solution (R 36/38, S 26). This ready to use solution has to be stored at 2...8°C.

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6.6. Wash Solution

Dilute the content of the concentrated Wash Solution with distilled water to a final volume of 500 ml prior to use. For smaller volumes respect the 1:10 dilution ratio. The diluted wash solution is stable for 30 days at 2…8°C. In concentrated wash solution it is possible to observe the presence of crystals, in this case mix at room temperature until complete dissolution of crystals, for greater accuracy dilute the whole bottle of concentrated wash solution to 500ml on taking care also to transfer crystals with washing of the bottle, then mix until crystals are completely dissolved.

6.7. Controls

The bottles contain 1 ml of a lot-specific, ready to use control solution.

7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION

The determination of Free Testosterone can be performed in human serum or plasma. Store specimen at -20°C if the determination is not performed on the day of the sample collection. If samples are stored frozen, mix thawed samples well before testing. Avoid repeated freezing and thawing.

8. ASSAY PROCEDURE

8.1. Test Preparation

Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described. Prior to commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and standards should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If it lasts more than ten minutes, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve. Please allocate at least:

1 well (e.g. A1) for the substrate blank 2 wells (e.g. B1+C1) for standard 0 2 wells (e.g. D1+E1) for standard 1 2 wells (e.g. F1+G1) for standard 2 2 wells (e.g. H1+A2) for standard 3 2 wells (e.g. B2+C2) for standard 4 2 wells (e.g. D2+E2) for standard 5 2 wells (e.g. F2+G2) for control A 2 wells (e.g. H2+A3) for control B

It is recommended to determine standards and patient samples in duplicate.

Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. A clean, disposable tip should be used for dispensing each standard and each patient sample. Adjust the incubator to 37 °C.

1. Dispense 20 µl standards, controls and samples into their respective wells. Add 100 µl conjugate to each well. Leave well A1 for substrate blank.

2. Cover wells with the foil supplied in the kit. 3. Incubate for 1 hour at 37°C.

4. When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times with 300 µl diluted wash solution. Avoid overflows from the reaction wells. During each washing step, gently shake the plate for 5 seconds and remove excess solution by tapping the inverted plate on an absorbent paper towel.

Automatic washer: In case you use automatic equipment, wash the wells at least 5 times.

Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values.

5. Dispense 100 µl TMB Substrate Solution into all wells.

6. Incubate for exactly 15 min at room temperature (22 – 28°C) in the dark.

7. Dispense 100 µl Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate Solution. Shake the microplate gently.

Any blue colour developed during the incubation turns into yellow.

8. Measure the absorbance (E) of the specimen at 450 nm against a reference wavelength of 620-630 nm or against blank within 5 minutes.

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8.2. Measurement

Adjust the ELISA Microwell Plate Reader to zero using the substrate blank in well A1.

If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the substrate blank in well A1, subtract the absorbance value of well A1 from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results!

Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each standard and patient sample

in the distribution and identification plan.

Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates.

9. RESULTS

9.1. Calculation of results

Calculate the mean absorbance for each point of the standard curve and each sample. Plot the mean value of absorbance of the standards against concentration. Draw the best-fit curve through the plotted points. (Four Parameter Logistic).

Interpolate the values of the samples on the standard curve to obtain the corresponding values of the concentrations expressed in pg/ml.

9.2. Reference values

Serum concentrations of free testosterone are within the following ranges:

n° sera Median pg/ml Range pg/ml Male (age) < 12 23 0,26 ND - 4,60 12 - 18 23 6,65 0,18 - 23,08 19 - 55 67 11,56 1,00 - 28,28 > 55 35 6,46 0,70 - 21,45 Female (age) < 12 20 ND ND - 1,46 12 - 18 29 0,91 ND - 2,24 19 - 55 57 0,61 ND - 2,85 > 55 31 0,49 ND -1,56

Please pay attention to the fact that the determination of a range of expected values for a “normal” population in a given method is dependent on many factors, such as specificity and sensitivity of the method used and type of population under investigation. Therefore each laboratory should consider the range given by the manufacturer as a general indication and produce their own range of expected values based on the indigenous population where the laboratory works.

10. QUALITY CONTROL

Each laboratory should assay controls at normal, high and low levels range of free testosterone for monitoring assay performance. These controls should be treated as unknowns and values determined in every test procedure performed. Quality control charts should be maintained to follow the performance of the supplied reagents. Pertinent statistical methods should be employed to ascertain trends. The individual laboratory should set acceptable assay performance limits. Other parameters that should be monitored include the 80, 50 and 20% intercepts of the standard curve for run-to-run reproducibility. In addition, maximum absorbance should be consistent with past experience. Significant deviation from established performance can indicate unnoticed change in experimental conditions or degradation of kit reagents. Fresh reagents should be used to determine the reason for the variations.

11. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS

11.1. Precision

Intra Assay Variation

Within run variation was determined by replicate (20x) the measurement of three different serum samples in the same assay. The within assay variability is ≤ 8,9%.

Inter Assay Variation

Between run variation was determined by replicate (10x) the measurement of three different control sera in 10 different assays. The between assay variability is ≤ 12,4%.

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11.2. Specificity

The specificity was assessed by measuring the apparent response of the assay to the following potentially cross-reactive analytes and interfering substances (Anticoagulants). The cross reaction of the antibody calculated at 50% according to Abraham:

Analyte % Cross reactivity

DHT 0,08220% ANDROSTENEDIONE 0,13200% ANDROSTERONE 0,00005% DHEA-S < 0,00001% CORTISON < 0,00001% CORTISOL < 0,00001% 17β-ESTRADIOL 0,00069% ESTRONE < 0,00001% PREGNENOLONE < 0,00001% 17α-ETHINILESTRADIOL 0,00002% NORGESTREL 0,00590% DANAZOL 0,00327% ALDOSTERONE < 0,00001% ESTRIOL 0,00009% EPITESTOSTERONE 0,00001% PROGESTERONE < 0,00001% 17 OH-PROGESTERONE 0,00008% DHEA 0,00003% PREDNISONE < 0,00001% SODIUM CITRATE < 0,00001% EDTA < 0,00001% HEPARIN < 0,00001%

11.3. Analytic Sensitivity

The lowest detectable concentration of Free Testosterone that can be distinguished from standard 0 is 0.04 pg/ml.

11.4. Method comparison

The Free Testosterone ELISA was compared to the Siemens Free Testosterone RIA kit, commercially available. 51 serum samples were analysed.

The linear regression curve was calculated: Y = 1,81*X - 1,71

r2 = 0,94

12. PRECAUTIONS AND WARNINGS

In compliance with article 1 paragraph 2b European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed. The use of the testkits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. To improve the performance of the kit on ELISA automatic systems, it is recommended to increase the number of washes.

Only for in-vitro diagnostic use. Not for internal or external use in humans or animals.

All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-HIV antibodies, anti-HCV antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive. Nevertheless, all materials should still be regarded and handled as potentially infectious.

Do not interchange reagents or strips of different production lots.

No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit. Do not use reagents after expiry date stated on the label.

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Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware.

Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination.

Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination.

After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to further use.

To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense conjugate without splashing accurately to the bottom of wells.

Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products.

Some reagents contain small amounts of Proclin 300® as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa.

The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.

The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes.

Avoid the exposure of reagent TMB/H2O2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. This method allows the determination of Free Testosterone from 0.2 pg/ml to 100.0 pg/ml.

The clinical significance of Free Testosterone determination can be invalidated if the patient was treated with cortisone or natural or synthetic steroids.

The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. To improve the performance of the kit on automatic systems is recommended to increase the number of washes.

It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate

Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction.

Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera.

Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of the reagents.

Samples microbiologically contaminated, highly lipemic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells.

The NovaTec ELISA is only designed for qualified personnel who are familiar with good laboratory practice.

12.1. Disposal Considerations

Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste.

13. ORDERING INFORMATION

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FRANÇAIS

1. INTRODUCTION

La testostérone est une hormone stéroïdienne du groupe androgène. La testostérone est secrétée dans les testicules et les ovaires bien que de petites quantités soient secrétées dans les glandes adrénales. C’est l’hormone sexuelle masculine principale et un stéroïde anabolisant. Elle joue un rôle essentiel dans le bien-être et la santé chez l’homme et la femme. En raison de son insolubilité dans les solutions aqueuses, pour la plupart la Testostérone ciruclates dans le sang s'est liée pour transporter des protéines. Seul 1-2% des testostérones circulantes existent sous une forme non liée ou libre. La majorité, environ 60%, a une forte affinité avec le SHBG, alors que le reste est faiblement lié à l’albumine. L’albumine liée et les fractions libres peuvent être biologiquement actives, alors que le SHBG inhibe efficacement l’action de la testostérone.

Les effets de la testostérone peuvent être classés en tant qu’effets virilisants et anabolisants. Les effets anabolisants conduisent à l’augmentation de la masse musculaire et de la force, l’augmentation de la densité osseuse et de la résistance osseuse, l’augmentation linéaire de la stimulation et de la maturation des os. Les effets virilisants conduisent à la maturation des organes sexuels.

Chez les hommes, les niveaux de la testostérone diminuent graduellement avec l’âge.

La mesure de la fraction libre ou liée du sérum de la testostérone a été proposée comme un moyen d’estimation de l’hormone physiologique bioactive. Les niveaux de la testostérone libre sont élevés chez les femmes ayant un hyperandrogénisme associé à un hirsutisme en présence ou non de maladie des ovaires polykystiques. De plus, les mesures de la testostérone libre peuvent être plus utiles que la testostérone totale dans le cas où le SHBG est augmenté ou diminué (ex. Hypothyroïdisme et obésité).

2. INDICATION D’UTILISATION

La méthode colorimétrique immunoenzymatique compétitive est utilisée pour la détermination quantitative de la testostérone libre dans le sérum ou le plasma humain. Deuxième génération.

3. PRINCIPE DU DOSAGE

La testostérone présente dans le sang est liée à la SHBG (60%) et dans des quantités inférieures aux autres protéines (par exemple l’albumine). Seule la mesure de testostérone libre (< 1 % de testostérone totale) permet l’estimation de l’hormone biologiquement active.

Les puits de bandes de microdosage sont enduits d’anticorps anti-testostérone (phase solide). La testostérone dans l’échantillon rivalise avec la testostérone marquée à la peroxydase de raifort ajoutée (antigène marqué à l’enzyme) pour la liaison des anticorps. Après incubation, une séparation entre les produits liés et les anticorps libérés est effectuée par le rinçage de la phase solide. Le complexe immun formé par un antigène marqué à l’enzyme est observé par un ajout de substrat Tétraméthylbenzidine (TMB) qui conduit à un bleuissement du produit. L’intensité de ce produit est inversement proportionnelle à la quantité de testostérone dans l’échantillon. L’acide sulfurique est ajouté pour arrêter la réaction. Ceci produit une couleur jaune. Un lecteur de microplaques ELISA permet la lecture de l’absorption à 450 nm.

4. MATERIELS

4.1. Réactifs fournis

Puits recouverts d’IgG Anti-Testostérone : 12 bandes détachables enduites anti-testostérone de 8 puits, en

sachet d’aluminium refermable.

Solution stop : 1 flacon contenant 15 ml d’acide sulfurique, 0.15 mol/l (éviter tout contact avec la peau). Conjugué à la Testostérone-HRP : 1 flacon contenant 15 ml de Testostérone marqué à la peroxydase de raifort. Solution de TMB : 1 flacon contenant 15 ml de 3, 3´, 5, 5´-Tétraméthylbenzidine (H2O2-TMB 0.26g/l) (éviter tout

contact avec la peau).

Solution de lavage (concentrée x 10) : 1 flacon contenant 50 ml d’une solution de tampon phosphate concentrée

10 fois à 20 mM, NaCl 160 g/l, Tween-20 10 g/l, pH 7.4

ContrôleA: 1 flacon contenant 1 ml d’un lot spécifique d’une solution de contrôle prête à l’emploi. La concentration

est indiquée sur l’étiquette.

Contrôle B: 1 flacon contenant 1 ml d’un lot spécifique d’une solution de contrôle prête à l’emploi. La concentration

est indiquée sur l’étiquette.

Etalons Testostérone : 6 flacons, 1 ml chacun

Etalon 0: 0.0 pg/ml Etalon 1: 0.2 pg/ml Etalon 2: 1.0 pg/ml Etalon 3: 4.0 pg/ml Etalon 4: 20.0 pg/ml

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4.2. Matériels fournis

1 support de plaque

1 jeu de feuilles de recouvrement 1 mode d’emploi

1 schéma de distribution et d’identification

4.3. Matériels et équipements requis

Lecteur de microplaques ELISA, pour mesure l’absorbance à 450 nm, 620-630 nm Incubateur 37°C

Equipement manuel ou automatique pour le rinçage des puits Pipettes Vortex Eau distillée Tubes jetables Chronomètre

5. STABILITÉ ET CONSERVATION

Les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette s’ils sont conservés entre 2°C et 8 °C à l’obscurité.

6. PREPARATION DES REACTIFS

Il est très important que tous les réactifs, échantillons et contrôles soient portés à température ambiante (22°C – 28 °C) pour au moins 30 minutes avant de commencer le dosage ! À la fin de l'essai conservent les réactifs immédiatement à 2-8 ° C ; évitez la longue exposition à température ambiante.

6.1. Bandes détachables enduites

Les bandes détachables sont enduites d’anticorps anti-testostérone et sont prêtes à l’emploi. Conserver entre 2°C et 8°C. N’ouvrir l’emballage que si la pièce est à température ambiante. Après avoir prélevé les bandes nécessaires, refermer

immédiatement les autres dans le sachet d’aluminium avec le déshydratant fourni et les conserver entre 2°C et 8°C ; elles sont stables jusqu’à la date de péremption.

6.2. Conjugué à la Testostérone-HRP

Solution de conjugué à la Testostérone-HRP prête à l’emploi.

6.3. Etalons de Testostérone

Mélanger 5 minutes avant utilisation avec un vortex. Les étalons sont prêts à l’emploi et ont les concentrations de testostérone libre suivantes :

Etalon 0: 0.0 pg/ml Etalon 1: 0.2 pg/ml Etalon 2: 1.0 pg/ml Etalon 3: 4.0 pg/ml Etalon 4: 20.0 pg/ml Etalon 5: 100.0 pg/ml

Les solutions doivent être conservées entre 2°C et 8 °C.

Après la première utilisation les contrôles restent stables pendant encore 6 mois s’ils sont conservés à 2 – 8° C.

6.4. Solution TMB

Le flacon contient 15 ml d’un mélange de peroxyde d’hydrogène et de tétraméthylbenzidine. Le réactif est prêt à l’emploi et doit être conservé 2°C et 8°C à l’obscurité. La solution doit être incolore ou avoir une légère teinte bleue. Si le substrat

devient bleu, il a pu être contaminé et doit être remplacé.

6.5. Solution stop

Le flacon contient 15 ml d’une solution d’acide sulfurique 0.15 M (R 36/38, S 26). Cette solution est prête à l’emploi et doit être conservée entre 2°C et 8 °C.

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6.6. Solution de lavage

Diluer le contenu de la solution de lavage concentrée avec de l’eau distillée jusqu’à un volume final de 500 ml avant utilisation. Pour les petits volumes respecter la dilution au 10ème. La solution de lavage diluée est stable pendant 30 jours entre 2°C et 8 °C. Il est possible d’observer la présence de cristaux dans la solution de lavage concentrée, dans ce cas, mélanger à température ambiante jusqu’à la dissolution complète des cristaux, pour une meilleure efficacité diluer tout le flacon de solution de lavage jusqu’à 500ml en surveillant le transfert de cristaux avec le lavage de la bouteille, puis mélanger jusqu’à la dissolution complète des cristaux.

6.7. Contrôles

Les flacons contiennent 1 ml d’une solution de contrôle prête à l’emploi.

7. PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS

Les échantillons de plasma ou de sérum humain pour ces dosages doivent être prélevés sur des patients à jeun. Conserver les échantillons à -20°C si la détermination n’est pas effectuée le jour du prélèvement. Si les échantillons sont conservés congelés, bien mélanger les échantillons décongelés avant le dosage. Eviter les cycles répétés de

congélation et de décongélation.

8. PROCEDE DU DOSAGE

8.1. Préparation du dosage

Lire attentivement la notice d’emploi avant de réaliser le dosage. La fiabilité des résultats dépend du suivi strict du protocole. Avant de commencer le dosage, déterminer, sur le formulaire fourni dans le kit, le plan de distribution et d’identification des échantillons et des contrôles. Sélectionner le nombre de bandes ou de puits nécessaires et les placer sur le support. Le pipetage des échantillons ne doit pas prendre plus de 10 minutes afin d’éviter toutes dérives du dosage. Si cela dure plus de 10 minutes, suivre le même ordre d’utilisation. Si plusieurs plaques sont utilisées, il est recommandé de répéter la courbe dose/réponse. Réserver au moins :

1 puits (ex. A1) Pour le blanc 2 puits (ex. B1+C1) Pour l’étalon 0 2 puits (ex. D1+E1) Pour l’étalon 1 2 puits (ex. F1+G1) Pour l’étalon 2 2 puits (ex. H1+A2) Pour l’étalon 3 2 puits (ex. B2+C2) Pour l’étalon 4 2 puits (ex. D2+E2) Pour l’étalon 5 2 puits (ex. F2+G2) Pour contrôle A 2 puits (ex. H2+A3) Pour contrôle B

Il est recommandé de déterminer les contrôles et les échantillons du patient en doublets.

Réaliser toutes les étapes du dosage dans l'ordre donné et sans interruption entre les étapes. Un cône de pipette propre et jetable doit être utilisé pour distribuer chaque contrôle et échantillon. Régler l'incubateur à 37°C.

1. Pipeter 20 µl d’étalons, de contrôles et d’échantillons dans leurs puits respectifs. Ajouter 100µl de conjugué dans chaque puits. Garder le puits A1 pour le blanc.

2. Couvrir les puits avec le couvercle fourni dans le kit. 3. Incuber pendant 1 heure à 37 °C.

4. À la fin de l’incubation, enlever le couvercle, aspirer le contenu des puits et laver chaque puits trois fois avec 300 µl de solution de lavage diluée. Eviter les débordements de puits de réaction.Pendant chaque pas de lessive, secouez doucement la plaque depuis 5 secondes et enlevez la solution d'excès en tapant la plaque inversée sur un essuie-mains en papier absorbant.

Équipement automatisé : Si vous utilisez l'équipement automatisé, lavez les puits au moins 5 fois.

Note : L’étape de lavage est très importante ! Un lavage insuffisant peut conduire à une précision faible et des valeurs d’absorbance faussement élevées.

5. Pipeter 100 µl de solution de TMB dans tous les puits.

6. Incuber pendant exactement 15 min à température ambiante (22 – 28°C) à l’obscurité.

7. Pipeter 100 µl de solution stop dans tous les puits dans le même ordre à la même vitesse que pour la solution de TMB. Secouer doucement la microplaque.

La couleur bleue développée pendant l’incubation vire au jaune.

8. Mesurer l’absorbance (E) des échantillons à 450 nm contre une longueur d'onde de référence de 620-630 nm ou contre une longueur d'onde de référence de 620-630 nm ou contre le blanc au cours de 5 minutes.

(11)

8.2. Mesure

Faire le zéro du lecteur ELISA à l’aide du blanc dans le puits A1.

Si - pour des raisons techniques - le lecteur d'ELISA ne peut pas être ajusté à zéro en utilisant le blanc dans le puits A1, soustraire la valeur d'absorbance du puits A1 de toutes les autres valeurs d’absorbance mesurées afin d'obtenir des résultats fiables !

Mesurer l'absorbance de tous les puits à 450 nm et enregistrer les valeurs d'absorbance pour chaque contrôle et

échantillon de patient dans le plan de distribution et d'identification.

Calculer les valeurs moyennes d’absorbance pour tous les doublets, si nécessaires.

9. RESULTATS

9.1. Calcul des résultats

Calculer l’absorbance moyenne pour chaque point de la courbe étalon et de chaque échantillon. Tracer la valeur d’absorbance moyenne des étalons par rapport à la concentration. Dessiner le meilleur ajustement de la courbe sur les points tracés (4 paramètres logistiques).

Interpoler les valeurs des échantillons sur la courbe étalon pour obtenir les valeurs de concentrations correspondantes en pg/ml.

9.2. Valeurs de Référence

Les concentrations des sérums de la testostérone libre sont dans le tableau suivant :

n° sera Médiane pg/ml Gamme pg/ml mâle (âge) < 12 23 0,26 ND - 4,60 12 - 18 23 6,65 0,18 - 23,08 19 - 55 67 11,56 1,00 - 28,28 > 55 35 6,46 0,70 - 21,45 femelle (âge) < 12 20 ND ND - 1,46 12 - 18 29 0,91 ND - 2,24 19 - 55 57 0,61 ND - 2,85 > 55 31 0,49 ND -1,56

Prenez garde au fait que la détermination d’une gamme de valeurs attendues pour une population “normale” d’une méthode donnée dépend de plusieurs facteurs, comme la spécificité et la sensibilité de la méthode utilisée et le genre de population étudiée. Par conséquent chaque laboratoire doit considérer que la gamme donnée comme une indication générale par le fabriquant et produit sa propre gamme de valeurs attendues basée sur la population où est situé le laboratoire.

10. CONTROLE QUALITE

Chaque laboratoire doit faire des contrôles de dosage à des niveaux de gammes normales, élevées et faibles de testostérone libre pour surveiller la performance des dosages. Ces contrôles doivent être considérés comme inconnus et les valeurs doivent être déterminées dans chaque test effectué. Les chartes de contrôles qualité doivent être maintenues pour suivre les performances des réactifs fournis. Des méthodes de statistiques pertinentes doivent être employées pour établir des tendances. Le laboratoire individuel doit établir des limites de performance de dosage acceptables. D’autres paramètres devant être surveillés impliquent les intersections à 80, 50 et 20% de la courbe étalon pour la reproductibilité. De plus, l’absorbance maximale doit être dans la même ligne que les expériences passées. Les déviations significatives provenant des performances établies peuvent indiquer un changement non remarquable dans les conditions expérimentales ou dans la dégradations des réactifs du kit. Les réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer la raison des variations.

11. PERFORMANCE DU DOSAGE

11.1. Précision

Variation Intra Dosage

La variation intra dosage a été déterminée par un réplicat (x20) sur trois sérums différents dans un dosage. La variation à l’intérieur d’un dosage est ≤ 8,9 %.

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Variation Inter Dosage

La variation entre les dosages a été déterminée par un réplicat (x10) sur trois sérums différent dans 10 dosages différentes. La variation entre les dosages est ≤ 12,4 %.

11.2. Spécificité analytique

La spécificité est évaluée en mesurant la réponse apparente du dosage des potentielles réactivités croisées des analytes suivants et des substances interférentes (Anticoagulants). La réaction croisée des anticorps, calculées à 50% selon Abraham :

Analyte % réaction croisée

DHT 0,08220% ANDROSTENEDIONE 0,13200% ANDROSTERONE 0,00005% DHEA-S < 0,00001% CORTISON < 0,00001% CORTISOL < 0,00001% 17β-ESTRADIOL 0,00069% ESTRONE < 0,00001% PREGNENOLONE < 0,00001% 17α-ETHINILESTRADIOL 0,00002% NORGESTREL 0,00590% DANAZOL 0,00327% ALDOSTERONE < 0,00001% ESTRIOL 0,00009% EPITESTOSTERONE 0,00001% PROGESTERONE < 0,00001% 17 OH-PROGESTERONE 0,00008% DHEA 0,00003% PREDNISONE < 0,00001% SODIUM CITRATE < 0,00001% EDTA < 0,00001% HEPARIN < 0,00001%

11.3. Sensibilité Analytique

La plus petite concentration détectable de la testostérone libre par l’étalon 0 est 0.04 pg/ml.

11.4. Comparaison de méthode

La méthode ELISA de la testostérone libre a été comparée aux dosage RIA de testostérone libre de Siemens. 51 échantillons de sérum ont été analysés selon les deux systèmes d’essais.

La régression linéaire a été calculée : Y = 1,81*X - 1,71

r2 = 0,94

12. PRECAUTIONS ET AVERTISSEMENTS

En accord avec l’article 1 paragraphe 2b de la directive européenne 98/79/EC, l’utilisation des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro est destinée par le fabricant à garantir la pertinence, les performances et la sécurité du produit. Par conséquent, la procédure de dosage, l’information, les précautions et mises en garde de la notice d’emploi, doivent être suivies de façon stricte. L’utilisation de ces kits avec des automates ou dispositifs similaires doit être validée. Aucun changement de la conception, composition et procédure de dosage, ainsi que l’utilisation avec d’autres produits non approuvés par le fabricant, ne sont autorisés ; seul l’utilisateur est responsable de tels changements. Le fabricant n’est pas responsable des faux résultats et des incidents dus à ces modifications. Le fabricant n’est pas responsable des résultats fournis par analyse visuelle des échantillons des patients.

Uniquement pour diagnostic in vitro.

Si vous utilisez l'équipement automatisé, l'utilisateur a la responsabilité de s'assurer que le kit a été convenablement évalué. Pour améliorer la performance du kit sur les systèmes automatiques ELISA, on recommande d'augmenter le nombre de se lave.

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Tous les composants d'origine humaine utilisés pour la fabrication de ces réactifs ont été analysés et ont été testés non réactifs aux antigènes HBs, en anticorps anti-VHI et en anticorps anti-VHC. Néanmoins, tous les produits doivent être considérés et traités comme étant potentiellement infectieux.

Ne pas utiliser de réactifs provenant d'autres fabricants avec les réactifs de ce kit. Ne pas utiliser les réactifs après la date de péremption indiquée sur l'étiquette.

Utiliser seulement des cônes de pipette, des distributeurs et du matériel de laboratoire propres. Ne pas échanger les bouchons des flacons, pour éviter la contamination croisée

Fermer les flacons de réactifs immédiatement après l’utilisation pour éviter l’évaporation et la contamination microbienne.

Avant une nouvelle utilisation, vérifier les flacons de conjugué et de contrôle, déjà utilisés, pour exclure une contamination microbienne.

Pour éviter la contamination croisée et des résultats faussement élevés, introduire les échantillons de patients et le conjugué exactement au fond des puits sans éclabousser.

Utiliser les Equipements de Protection Individuels (EPI) appropriés dans de l’utilisation des réactifs fournis. Suivre les Bonnes Pratiques de Laboratoires (BPL) pour la manipulation de produits sanguins.

Certains réactifs contiennent de petites quantités de Proclin 300® comme conservateur. Eviter le contact avec la

peau ou les muqueuses.

Le TMB est un réactif irritant qui peut être nocif s’il est inhale, ingéré ou absorbé par la peau. Eviter toute ingestion, inhalation, contact avec la peau ou les yeux.

La solution stop est une solution diluée d’acide sulfurique. L’acide sulfurique est un poison, corrosif et peut être toxique s’il est ingéré. Eviter tout contact avec la peau et les yeux pour éviter une brûlure chimique.

Eviter l’exposition du réactif TMB/ H2O2 à la lumière du soleil, aux métaux et oxydants. Ne pas congeler la solution. Cette méthode permet la détermination de la testostérone libre entre 0.2 pg/ml et 100.0 pg/ml.

La signification clinique de la détermination de la testostérone libre peut ne pas être établie si le patient suit un traitement à la cortisone ou au stéroïdes naturels ou synthétiques.

Si le liquide n’est pas complètement extrait des puits, cela peut influence la précision du dosage et/ou augmenter le bruit de fond. Pour améliorer la performance du kit sur les systèmes automatiques ELISA, on recommande d'augmenter le nombre de se lave.

Il est important que le temps de réaction dans chaque puits soit constant pour la reproductibilité. Le pipetage des échantillons ne doit pas prendre plus de 10 minutes afin d’éviter toutes dérives du dosage. Si cela dure plus de 10 minutes, suivre le même ordre d’utilisation. Si plusieurs plaques sont utilisées, il est recommandé de répéter la courbe dose/réponse dans chaque plaque.

L’ajout de TMB initie la réaction cinétique qui se termine par l’ajout de solution stop. Par conséquent, l’addition de solution de substrat et de solution stop doit être ajouté dans la manipulation pour éliminer toutes erreurs pendant la réaction.

Suivre le mode d’emploi pour effectuer le contrôle qualité dans les laboratoires médicaux en dosant les contrôles et les sérums.

Une grande précision est nécessaire pour la reconstitution et le dépôt des réactifs.

Les échantillons contaminés microbiologiquement, hautement lipémiques ou hémolysés ne doivent pas être utilisés dans le dosage.

Les lecteurs de microplaques mesurent verticalement. Ne pas toucher le fond des puits.

Le kit ELISA de NovaTec est uniquement destiné à être utilisé par un personnel qualifié familiarisé avec les BPL.

12.1. Elimination des déchets

Les résidus des produits chimiques et des préparations sont considérés en général comme des déchets dangereux. L’élimination de ce type de déchet est réglementée par des lois et réglementations nationales et régionales. Contacter les autorités compétentes ou les sociétés de gestion des déchets pour obtenir des renseignements sur l’élimination des déchets dangereux.

13. INFORMATION POUR LES COMMANDES

(14)

ESPANOL

1. INTRODUCCIÓN

La Testosterona es una hormona esteroida del grupo de andrógenos. La Testosterona es secretada por los testícuolos en los hombres y por los ovarios en las mujers, aunque pequenas cantidades son secretadas por las glándulas suprarrenales. Es la principal hormona sexual masculina y un esteroide anabólico. Desempena funciones clave para la salud y el bienestar de hombres y mujeres.

La testosterona circula en la sangre en su mayor parte consolidados para el transporte de proteínas a causa de su insolubilidad en soluciones acuosas. Solo una pequena parte (< 1 %) de la testosterona circulante existe como testosterona no unida o libre. Alrededordel 60% está unida a SHBG con alta afinidad, mientras que el resto se une a la albúmina y libre, pueden ser biológicamente activas, mientras que el enlace a SHBG inhibe la acción de la testosterona. Los efectos de la testosteronapueden clasificarse como virilizantes y anabólicos. Entre los efectos anabólicos se incluyen el desarrollo de la masa muscular y la resistencia, el aumento de la densidad y de la resistencia ósea, y la estimulación del desarrollo linel del hueso. Entro los efectos virilizantes se incluye la maduración de los órganos sexuales. Los niveles de testosterona disminuyen gradualmente con la edad en los hombres.

La medición de la fracción libre o no unida de testosterona en suero es un método para evaluar la hormona

fisiológicamente bioactiva. Los niveles de testosterona libre son elevados en mujeers con hiperandrogenismo asociado con hirtutismo en presencia o ausencia de ovarios poliqúisticos. Además, le medición de la testostereona libre resulta más útil que la medición de la testosterona total en situaciones en las que la SHBG aumenta o disminuye (por ejemplo, hipotiroidismo y obesidad).

2. USO

Método inmunoenzimático competitivo y colorimétrico para la determinación cuantitativa de la concentración de testosterona libre en suero o plasma humano. Segunda generación.

3. FUNDAMENTO DE LA PRUEBA

La testosterona en la sangre se une a las SHBG (60%) y, en menor cantidad, a otras proteínas (por ejemplo albúmina). Solo la medición de la testosterona libre (<1% del total) permite la estimación de la hormona biológicamente activa. La testosterona “libre” (antígeno) presente en la muestra compite con la testosterona marcada con peroxidasa de rabano (HRP, conjugado) por la union al anticuerpo anit-testosterona absorbido en la microplaca (fase sólida). La testosterona unida a las proteínas no participa en esta reacción y es eliminada durante la fase de lavado (para la medición de la testosterona total está disponible el kit ELISA NovaTec “Testosterone”).

Después de la incubación, la separación libre-unido se obtiene mediante un simple lavado de la fase sólida. Por ultimo la enzima HRP presente en el conjugado que se unió a la fase solida cataliza la reacción entre el substrato (H2O2) y el

substrato TMB (TMB), desarrollando una coloración azul que cambia a amarillo tras la adición de la solución de parada (H2SO4).

La intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentración de antígeno marcado y, por lo tanto, inversamente proporcional a la concentración de testosterona “libre” presente en la muestra.

4. MATERIALES

4.1. Reactivos suministrados

Pozos recubiertos con IgG anti-Testosterona: 12 tiras de 8 pozos separables. Los pozos están recubiertas con

anti-Testosterona y vienen empacados en una bolsa de papel de aluminio resellable.

Solución de parada: 1 vial que contiene 15 ml de ácido sulfúrico 0,15 mol/l (evitar cualquier contacto con la piel). Conjugado Testosterona: 1 vial que contiene 12 ml de Testosterona marcada con peroxidasa de rábano. Solución de sustrato TMB: 1 vial que contiene 15 ml de 3, 3 ', 5, 5'-tetrametilbenzidina (H2O2-TMB 0,26 g/l) (evitar

cualquier contacto con la piel).

Solución de lavado concentrada 10x: 1 vial de 50 ml tampón fosfato 20 mM, NaCl 160 g/l, Tween-20 10 g/l,

pH 7.4

Control A: 1 vial que contiene 1ml de un lote específica de solución de control. La concentración se indica en la

etiqueta de la botella.

Control B: 1 vial que contiene 1ml de un lote específica de solución de control. La concentración se indica en la

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Estándares de Testosterona: 5 botellas, 1 ml cada una Estándar 0: 0.0 pg/ml Estándar 1: 0.2 pg/ml Estándar 2: 1.0 pg/ml Estándar 3: 4.0 pg/ml Estándar 4: 20.0 pg/ml Estándar 5: 100.0 pg/ml

conversión de la unidad: pmol/l = 3.47*pg/ml

4.2. Materiales suministrados

1 Soporte para tiras 1 Lámina sellante

1 Protocolo de procesamiento 1 Plan de distribución e identificación

4.3. Materiales y equipos necesarios

Lector de de ELISA equipado para medir absorbancia a 450 nm, 620-630 nm Incubador a 37°C

Equipo manual o automático para el lavado de los pozos Pipetas

Mezclador de rotación Agua destilada Temporizador

5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO

Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacenan a 2...8 °C en oscuridad.

6. PREPARACION DE LOS REACTIVOS

¡Es muy importante que tenga todos los reactivos, muestras y patrones a temperatura ambiente (22…28 °C) antes de iniciar la ejecución de la prueba! Al final del ensayo inmediatamente poner todos los reactivos a 2-8°C para evitar largos periodos a temperatura ambieten.

6.1. Tiras recubiertas rompibles

Las tiras vienen listas para ser usadas y se rompen para separar los pozos. Están recubiertas con anticuerpos anti- Testosterona. Se deben conservar a oscuras a una temperatura de entre 2...8 °C. Inmediatamente después de retirar las

tiras que va a utilizar, asegúrese de guardar las tiras que no van a ser usados dentro de la bolsa de aluminio resellable junto con el desecante suministrado y almacenarla a una temperatura entre 2...8 °C; las tiras son estables hasta la fecha de caducidad.

6.2. Conjugado Testosterona-HRP

Listo para usar.

6.3. Estándares de Testosterona

Mezcle suavemente por 5 minutos con un mezclador vortex.

Los estándares están listos para ser usados y tienen las siguientes concentraciones de Testosterona: Estándar 0: 0.0 pg/ml Estándar 1: 0.2 pg/ml Estándar 2: 1.0 pg/ml Estándar 3: 4.0 pg/ml Estándar 4: 20.0 pg/ml Estándar 5: 100.0 pg/ml

La solución debe ser almacenada a 2…8°C. Después del primer uso del conjugado sigue siendo estable por otros 6

meses si se almacenan a 2 ... 8 ° C

6.4. Solución de sustrato TMB

El frasco contiene 15 ml de un sistema de tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno. El reactivo está listo para ser usado y debe ser almacenado a 2...8 °C en oscuridad. La solución debe estar incolora o puede tener un ligero tinte azul.

Si el sustrato se torna azul, esto indica que puede haberse contaminado y por lo tanto debe desecharse. Después del primer uso de la solución de sustrato TMB sigue siendo estable por otros 6 meses si se almacenan a 2 ... 8 ° C.

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6.5. Solución de parada

El frasco contiene 15 ml de solución de ácido sulfúrico 0.15 M (R 36/38, S 26). Esta solución está lista para ser usada y debe ser almacenada a 2...8 °C. Después del primer uso, permanece estable hasta la fecha de caducidad.

6.6. Solución de lavado

Antes del uso, diluir el contenido del frasco de la “Solución de lavado conc. 10X” con agua destilada hasta un volumen de 500 ml. Para preparar volúmenes menores, respetar la relación de dilución de 1:10. La solución de lavado diluida se mantiene estable a 2÷8 °C durante al menos 30 días. En la solución de lavado concentrada es posible observar la presencia de cristales. En ese caso, agitar a temperatura ambiente hasta que los cristales se disuelvan por completo. Para una mayor precisión, diluir todo el frasco de la solución de lavado concentrada en 500 ml teniendo cuidado para transferir también los cristales y, a continuación, agitar hasta que se disuelvan por completo.

6.7. Controles de Testosterona libre

Listo para usar. Las botellas contienen 1 ml de una solución de control específica para el lote.

7. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Use suero o plasma para la determinación de Testosterona libre.. Si la muestra(s) no puede ser analizada el mismo día de la recolección de la muestra, la muestra debe ser almacenada en alícuotas y congelada ( -20 °C). Si las muestras se almacenan congeladas mezcle bien cada muestra antes de realizar la prueba. Evite congelar y descongelar

repetidamente.

8. PROCEDIMIENTO

8.1. Preparación para la prueba

Por favor, lea detenidamente el protocolo de la prueba antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados depende del seguimiento estricto del protocolo de la prueba tal cual se describe en el inserto. Antes de comenzar el ensayo, se debe establecer cuidadosamente la distribución e identificación de las muestras y los estándares en la hoja de resultados suministrada con el kit. Seleccione el número necesario de tiras de microtitulación o pozos e insértelos en el soporte. El pipeteo de muestras no debe tomar más de diez minutos para evitar la deriva del análisis. Si utiliza más de una placa, se recomienda repetir la curva dosis-respuesta. Por favor, destinar al menos:

1 pozo (por ejemplo, A1) para el blanco sustrato 2 pozos (por ejemplo, B1+C1) para el estándar 0 2 pozos (por ejemplo, D1+E1) para el estándar 1 2 pozos (por ejemplo, F1+G1) para el estándar 2 2 pozos (por ejemplo, H1+A2) para el estándar 3 2 pozos (por ejemplo, B2+C2) para el estándar 4 2 pozos (por ejemplo, D2+E2) para el estándar 5 2 pozos (por ejemplo, F2+G2) para el control A 2 pozos (por ejemplo, H2+A3) para el control B

Se recomienda determinar los estándares y muestras de pacientes por duplicado.

Realice todos los pasos del ensayo en el orden indicado y sin retrasos apreciables entre los pasos. Debe usar una punta desechable limpia para la dosificación de cada estándar y cada muestra. Ajuste el incubador a 37°C±1

1. Agregue 25 µl de estándares, controles y muestras en sus respectivos pozos. Agregue 100ul de conjugado a cada pocillo. Deje el pozo A1 libre para el blanco del substrato.

2. Cubra los pozos con la hoja incluida en el paquete. 3. Incube por 1 hora a 37°C

4. Cuando se complete el tiempo de incubación, retire la lámina sellante, aspire el contenido de los pozos y los pozos 3 veces con 0,3 ml de solución de lavado diluida. Agite suavemente la placa durante 5 segundos en cada paso del lavado. Después del último lavado asegúrese haber eliminado completamente la solución de lavado de los pozos, invierta la placa y golpéela repetidas veces contra una servilleta de papel absorbente.

Lavado automático: si está utilizando una lavadora automática, hacer 5 lavados.

Nota: ¡El lavado es crítico! Un lavado insuficiente resulta en una mala precisión y valores de absorbancia falsamente elevados.

5. Agregue 100 µl de solución de sustrato TMB en todos los pozos.

6. Incube durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente (22...28 °C) en oscuridad.

7. Agregue 100 µl de solución de parada en todos los pozos en el mismo orden y a la misma velocidad que agregó la solución de sustrato TMB. Agite la microplaca.

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8. Leer la absorbancia a 450 nm frente una segunda lectura de referencia a 620-630 nm o frente al blanco entre 5 minutos.

8.2. Lectura

Ajuste el lector de placas de micropozos de ELISA a cero usando el substrato blanco en el pozo A1

Si - por razones técnicas - el lector de ELISA no se puede ajustar a cero con el blanco del substrato en el pozo A1, restar el valor de absorbancia del pocillo A1 de todos los valores de absorbancia otras medidas con el fin de obtener resultados fiables!.

Mida la absorbancia de todos los pozos a 450 nm y registre los valores de absorbancia para cada estándar y muestra

de paciente indicado en el plan de distribución e identificación.

Cuando sea necesario, calcule el valor media de la absorbancia de los duplicados.

9. RESULTADOS

9.1. Cálculo de los resultados

Calcule la absorbancia media para cada punto de la curva estándar y cada muestra. Grafique el valor medio de absorbancia de los estándares versus la concentración. Dibuje la curva que mejor se ajuste a los puntos trazados (Ej.: Logística de cuatro parámetros). Interpole los valores de las muestras en la curva estándar para obtener los valores correspondientes para las concentraciones expresadas en ng/l.

9.2. Valores de referencia

Los valores de testosterona libre en suero o plasma de referencia son los siguientes:

Es importante señalar que la determinación de un rango de valores esperados en un método dado para una población "normal" depende de muchos factores, tales como la especificidad y sensibilidad del método en uso, y la población en estudio. Por lo tanto, cada laboratorio debe considerar el intervalo especificado por el fabricante como una guía general y producir su propio rango de valores calculados en base al estadístico obtenido por el laboratorio, donde reside la población local.

10. CONTROL DE CALIDAD

Cada laboratorio deberá probar controles en los niveles normales, altos y bajos niveles de testosterona parasupervisar funcionamiento del análisis. Estos controles deben ser tratados como muestras desconocidas y se debe determinar sus valores cada vez que se realice el ensayo. Se deben llevar gráficas de éstos controles de calidad para hacerle seguimiento al desempeño de los reactivos. Se deben emplear los métodos estadísticos pertinentes para verificar las tendencias. Cada laboratorio debe establecer los límites aceptables de desempeño para el ensayo. Otros parámetros que se deben controlar son los interceptos al 80, 50 y 20% de la curva estándar para evaluar la reproducibilidad intercorrida. Además, la absorción máxima debe ser consistente con la experiencia del laboratorio. Una desviación significativa del desempeño establecido puede indicar un cambio en las condiciones experimentales o la degradación de los reactivos. Deben usarse reactivos frescos para determinar la razón de las variaciones.

11. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPEÑO

11.1. Precisión

Variación intraensayo

La variación intracorrida fue determinada por mediciones repetidas (20x) de tres sueros control diferentes en un mismo ensayo. La variación intracorrida del ensayo es ≤ 8,9 %.

n° sera Media pg/ml Rango pg/ml Masculino (edad) < 12 23 0,26 ND - 4,60 12 - 18 23 6,65 0,18 - 23,08 19 - 55 67 11,56 1,00 - 28,28 > 55 35 6,46 0,70 - 21,45 Femenino (edad) < 12 20 ND ND - 1,46 12 - 18 29 0,91 ND - 2,24 19 - 55 57 0,61 ND - 2,85 > 55 31 0,49 ND -1,56

(18)

Variación interensayo

La variación intercorrida fue determinada por mediciones repetidas (10x) de tres sueros control diferentes con 10 lotes distintos.

La variabilidad interensayo es ≤ 12,4 %.

11.2. Especificidad

La reacción cruzada del anticuerpo calcula en el 50% de acuerdo con Abraham es la siguiente:

11.3. Sensibilidad

La concentración detectable más baja de Testosterona libre que se puede distinguir del estándar 0 es 0.04 pg/ml.

11.5. Correlación con RIA

El ensayo Testosterona libre ELISA de NovaTec fue comparado con el ensayo de Testosterona libre (RIA) de Siemens. Se han comprobado 51 muestras séricas. Se calculó la curva de regresión lineal:

Y = 1,81*X - 1,71 r2 = 0,94

12. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS

En cumplimiento con el Artículo 1, Párrafo 2b de la Directiva 98/79/CE del Parlamento Europea sobre el uso de dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, es responsabilidad del fabricante asegurar la idoneidad, desempeño y seguridad del producto. Por lo tanto, el procedimiento de prueba, la información, precauciones y advertencias contenidas en las instrucciones de uso deben ser seguidas estrictamente. El uso de los kits con analizadores y equipos similares debe ser validado. No esta autorizado realizar ningún cambio en el diseño, composición y procedimiento del ensayo, así como ningún uso en combinación con otros productos no aprobados por el fabricante; el usuario es responsable de tales cambios. El fabricante no se hace responsable por resultados falsos o por cualquier incidente causado por esta razón. El fabricante no se responsabiliza por los resultados obtenidos mediante el análisis visual de las muestras de los pacientes.

Sólo para uso en diagnóstico in vitro por personal experto. No es para uso interno o externo en humanos o animales.

Todos los componentes de origen humano utilizados para la producción de estos reactivos han sido examinado para determinar la presencia de anticuerpos anti-VIH, anticuerpos anti-HCV y anticuerpos anti-HBsAg y se ha

% réaction croisée DHT 0,08220% ANDROSTENEDIONE 0,13200% ANDROSTERONE 0,00005% DHEA-S < 0,00001% CORTISON < 0,00001% CORTISOL < 0,00001% 17β-ESTRADIOL 0,00069% ESTRONE < 0,00001% PREGNENOLONE < 0,00001% 17α-ETHINILESTRADIOL 0,00002% NORGESTREL 0,00590% DANAZOL 0,00327% ALDOSTERONE < 0,00001% ESTRIOL 0,00009% EPITESTOSTERONE 0,00001% PROGESTERONE < 0,00001% 17 OH-PROGESTERONE 0,00008% DHEA 0,00003% PREDNISONE < 0,00001% SODIUM CITRATE < 0,00001% EDTA < 0,00001% HEPARIN < 0,00001%

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determinado que no son reactivos. Sin embargo, todo el material debe ser considerado y tratado como potencialmente infeccioso.

No intercambiar reactivos o tiras de diferentes lotes de producción.

No se deben utilizar reactivos de otros fabricantes en combinación con los reactivos de este kit. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

Use sólo puntas para micropipeta, dispensadores y material de laboratorio limpio. No intercambie las tapas de los viales. Esto evita la contaminación cruzada.

Cierre los viales de los reactivos con fuerza inmediatamente después de usarlos para evitar la evaporación y contaminación microbiana.

Después de abrir el kit por primera vez y almacenarlo, verifique que los viales del conjugado y los estándares no presenten contaminación microbiana antes continuar usándolo.

Para prevenir la contaminación cruzada y la obtención de resultados falsamente elevados, pipetee las muestras de los pacientes y dispense el conjugado con precisión hacia el fondo de los pozos evitando que se produzcan salpicaduras.

Si utiliza un equipo automático , es responsibilidad del usario asegurar que la metodología aplicada haya sido debidamente validada.Para mejorar el rendimiento del kit en los sistemas automatizados de ELISA, se recomienda aumentar el número de lavados.

Evitar la exposición del substrato TMB a la luz solar directa, metal, u oxidantes. No congelar la solución. Observar la máxima precisión en la reconstitución y dispensación de los reactivos.

El tratamiento del paciente con cortisona, esteroides naturales o sintéticos pueden afectar la determinación de la testosterona libre.

Este método permite la determinación de testosterona libre de 0.2 pg/ml hasta 100 pg/ml.

El cromógeno TMB contiene un irritante que puede ser dañino si se inhala, se ingiere o se absorbe a través de la piel. Para prevenir lesiones, evitar la inhalación, la ingestión o el contacto con la piel y con los ojos.

La solución de interrupción está formada por una solución de ácido sulfúrico diluido. El ácido sulfúrico es venenoso y corrosivo, y puede ser tóxico si se ingiere. Para prevenir posibles quemaduras químicas, evitar el contacto con la piel y con los ojos.

Al añadir el sustrato TMB inicia una reacción cinética que termina al agregar la solución de interrupción. Tanto el sustrato como la solución de interrupción deben agregarse en la misma secuencia para evitar diferentes tiempos de reacción.

Observar las directrices para la ejecución del control de calidad en los laboratorios clínicos al comprobar controles y/o pool de sueros.

No use muestras con contaminación microbiana, altamente lipémicas o hemolizadas.

Los lectores de microplacas leen las DO verticalmente, por tanto no debe tocarse el fondo de los pocillos.

Para la reproducibilidad de los resultados, es importante que el tiempo de reacción sea igual para cada pocillo. El tiempo de dispensación de los pocillos no debe superar los 10 minutos; si se prolongara más allá de los 10 minutos, respétese el orden de dispensación. si utiliza más de una placa, se recomienda repetir la curva de calibración en cada plato.

Un lavado incompleto o impreciso y la aspiración insuficiente del líquido de los micropozos ELISA pueden causar una precisión pobre y/o un elevado fondo. Para mejorar el rendimiento del kit en los sistemas automatizados de ELISA, se recomienda aumentar el número de lavados.

Algunos reactivos contienen pequeñas cantidades de Proclin 300® como conservante. Evite el contacto con la piel y las mucosas.

El NovaTec ELISA está pensado exclusivamente para su uso por personal especializado que domine perfectamente las técnicas de trabajo.

12.1. Consideraciones para El Descarte

Los residuos de productos y preparaciones químicos generalmente son considerados como residuos peligrosos. La eliminación de éste tipo de residuos está regulada por leyes y regulaciones nacionales y regionales. Póngase en contacto con las autoridades locales o empresas de manejo de residuos para que lo asesoren sobre cómo eliminar los residuos peligrosos.

13. INFORMACIÓN PARA PEDIDOS

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BIBLIOGRAPHY / BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAFÍA

McCann D., Kirkish L. (1985) J. Clin. Immunoassay 8, 234 - 6. Ekins RP. (1984) J. Clin. Immunoassay 7(2), 163 – 80. Paulson JD et al. (1977) Am. J Obst. Gynecol 128, 851 – 7. Odlind V. et al. (1982) Clin. Endocrinology 16, 243 – 49. Green PJ. (1982) Clin Chem 28, 1237.

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Symbols Key/ Symbolschlüssel/ Explication des symboles / Legenda / Símbolos/ Tabela de símbolos Manufactured by / Hergestellt von/ Fabriqué par/ Prodotto da/ Fabricado por / Fabricado por In Vitro Diagnostic Medical Device/ In Vitro Diagnosticum/ Dispositif médical de diagnostic in

vitro/ Diagnostico in vitro/ Producto para diagnóstico In vitro /

Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro

Lot Number/ Chargenbezeichnung/ Numéro de lot/ Lotto/ Número de lote / Número de lote

Expiration Date/ Verfallsdatum/ Date de péremption/ Scadenza/ Fecha de caducidad / Data de Validade

Storage Temperature/ Lagertemperatur/ Température de conservation/ Temperatura di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de Armazenamento

Keep away from sunlight / Vor direkter Sonneneinstrahlung schützen / Protéger de rayonnement solaire / Mantener alejado de la luz solar CE Mark/ CE-Zeichen/ Marquage CE / Marchio CE/ Marca CE / Marca CE Catalogue Number/ Katalog Nummer/ Référence du catalogue/ Numero di codice/

Número de Catálogo / Número de Catálogo

Consult Instructions for Use/ Gebrauchsanweisung beachten/ Consulter la notice d’utilisation/ Consultare le istruzioni/ Consulte las Instrucciones de Uso /

Consultar as Instruções de Utilização

Microplate/ Mikrotiterplatte/ Microplaque/ Micropiastra/ Microplaca / Microplaca Conjugate/ Konjugat/ Conjugué/ Coniugato/ Conjugado / Conjugado

Control/ Kontrolle/ contrôle / controllo / control / controle/ controlo CALl Calibrator resp. Standard/ Kalibrator bzw. Standard/ Callibrateur resp Etalon /

Calibratore ossia Standard / Calibrador o bien Estándar

Stop solution/ Stopplösung/ Solution stop/ Soluzione bloccante / Solução de paragem TMB Substrate solution/ TMB-Substratlösung/ Substrat TMB/ soluzione substrato TMB/

solución substrato TMB / Solução substrato TMB

Washing solution 10x concentrated/ Waschlösung 10x konzentriert/ Solution de lavage concentré 10 x/ soluzione di lavaggio concentrazione x10/ solución de lavado concentrado

x10 / Solução de lavagem concentrada 10x

Contains sufficient for “n” tests/ Ausreichend für “n” Tests/ Contenu suffisant pour “n” tests/ Contenuto sufficiente per “n” saggi/ Contenido suficiente para ”n” tests /

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SCHEME OF THE ASSAY

Free Testosterone

Test Preparation

Prepare reagents and samples as described.

Establish the distribution and identification plan for all specimens and controls on the result sheet supplied in the kit.

Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder.

Assay Procedure

Substrate blank Standard 0 - 5 Controls Sample

Standard 0 - 5 - 20 µl - -

Controls - - 20 µl -

Sample - - - 20 µl

Conjugate - 100 µl 100 µl 100 µl

Cover wells with foil supplied in the kit

Incubate for 1 h at 37 °C

Wash each well three times with 300 µl diluted wash solution (if you use automated equipment wash the wells at least 5 times)

TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Incubate for exactly 15 min at room temperature in the dark

Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Shake the microplate gently.

Photometric measurement at 450 nm against a reference wavelength of 620-630 nm or against blank within 5 minutes.

NovaTec Immundiagnostica GmbH

Technologie & Waldpark

Waldstr. 23 A6 D-63128 Dietzenbach, Germany Tel.: +49 (0) 6074-48760 Fax: +49 (0) 6074-487629 Email : info@NovaTec-ID.com Internet: www.NovaTec-ID.com DNOV009-engl,fr,es-24062015-CS

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