NF-light (Neurofilament light) ELISA

NF-light

®

(Neurofilament light)

ELISA

instrucciones de uso

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de la proteína del

neurofilamento de cadena ligera (NF-L) humana en el líquido cefalorraquídeo.

UD51001

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For illustrative purposes only.

To perform the assay the instructions for use provided with the kit have to be used.

Distributed by:

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Versión 2016-04

Uso previsto

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de la proteína del neurofilamento de cadena ligera (NF-L) humana en el líquido cefalorraquídeo. Los anticuerpos presentan reactividad cruzada con la proteína del neurofilamento de cadena ligera de rata, bovinos y macacos, y pueden usarse con fines de investigación en las especies mencionadas.

Introducción

El ensayo NF-light® _{(proteína del neurofilamento de cadena ligera) de UmanDiagnostics es un}

inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de la proteína del NF-L en el líquido

cefalorraquídeo humano. En la prueba se utilizan dos anticuerpos monoclonales altamente específicos que no compiten (Norgren et ál., 2002).

Los neurofilamentos son los principales constituyentes del citoesqueleto de las células neuronales. Son importantes para el mantenimiento del calibre y la integridad morfológica de los axones, que afectan a la velocidad y la fidelidad de las transmisiones neuronales. Existen tres cadenas diferentes de

neurofilamentos, cuyo nombre hace referencia a su tamaño. Se trata de los neurofilamentos ligeros, medianos y pesados. Los neurofilamentos ligeros constituyen la columna vertebral a la que se ensamblan las cadenas más pesadas para formar la fibra de neurofilamentos (Lee et ál., 1993). Tras una lesión de las neuronas debida a un traumatismo directo o a procesos degenerativos lentos, el contenido de la célula se libera en el compartimento circundante, lo que posibilita las determinaciones cuantitativas de las proteínas axonales. Se han constatado aumentos de los niveles de neurofilamentos ligeros en varias enfermedades degenerativas tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple y en modelos animales tales como encefalomielitis autoinmunitaria experimental crónica (Rosengren et ál., 1996; Norgren et ál., 2003, 2004, 2005).

El inmunoensayo es un ELISA no competitivo en fase sólida de 2 anticuerpos (Ac). Un anticuerpo

monoclonal (AcM) específico reviste una superficie sólida y se une a neurofilamentos ligeros. La detección se realiza mediante el uso de otro anticuerpo monoclonal conjugado específico. Las determinaciones cuantitativas se realizan mediante el cambio enzimático de un sustrato incoloro a un producto coloreado, que se corresponde con la cantidad de neurofilamentos ligeros en la muestra.

Intervalo de medición:

Límite de detección: 32 pg/mL

Precisión:

% CV interensayo < 9 Tiempo de incubación:

Tamaño de la muestra:

Temperatura de almacenamiento: 2-8 °C. Manténgase alejado del calor o la luz solar directa Duración del producto: 18 meses desde la fecha de producción

Una vez abierta, la placa de tiras NF-light® debe utilizarse en un plazo máximo de 4 semanas. Asegúrese de cerrar la placa de tiras abierta para evitar que se humedezca.

Advertencias y precauciones

1. Solo para diagnósticos in vitro. Solo para uso profesional.

2. Antes de llevar a cabo el ensayo lea con atención las instrucciones de uso en su totalidad. Use la versión válida del prospecto proporcionado con el kit. Asegúrese de que lo entiende todo.

3. En caso de que el envase del kit presente daños graves póngase en contacto con su proveedor por escrito en un plazo máximo de una semana desde la recepción del kit. No utilice los componentes dañados. Guarde los componentes dañados por si los necesita por cuestiones relacionadas con la reclamación.

4. No mezcle reactivos de lotes diferentes. No utilice reactivos caducados.

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6. Se recomienda analizar todas las muestras, controles y patrones por duplicado. Si se produce una gran variación entre las muestras, repita el ensayo.

7. Siga las directrices de buenas prácticas de laboratorio y de seguridad. Use batas de laboratorio, guantes desechables y gafas de protección cuando sea necesario.

8. Evite el contacto con el reactivo de parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. Se puede solicitar la ficha de datos de seguridad del material de este producto directamente a UmanDiagnostics.

9. Los productos químicos y los reactivos preparados o usados deben tratarse como desechos peligrosos de acuerdo con las directrices o normas nacionales sobre riesgo biológico y seguridad. 10. Utilice un agitador orbitario de mesa para ELISA a 800 rpm.

Contenido del kit:

Contenido Componente del kit Cantidad

Cubierta de la placa 2 uds.

Tubo de 15 mL para dilución del conjugato 2 uds.

PLATE Placa de tiras revestida con Ac anti-NF-L 12 × 8 pocillos

STOP Reactivo de parade 1 × 6 mL

TMB Sustrato con TMB 1 × 12 mL

SAMDIL Disolución amortiguadora para la muestra 1 × 40 mL CONDIL Disolución amortiguadora para el conjugado 1 × 12 mL

CONJ Concentrado de conjugado 1 × 260 µL

50×TRAC Marcador concentrado 1 × 260 µL

STAND Concentrado de NF-L bovino 2 viales

10×WASH Concentrado de disolución amortiguadora de lavado (10×) 2 × 40 mL Cromógeno y reactivos de parada

Enzima: peroxidasa de rábano picante (HRP) Sustrato: tetrametilbencidina, TMB

Reactivo de parada: H2SO4 al 8 % V/V (advertencia, corrosivo)

Equipo esencial no incluido:

Lector de placas de microtitulación de 450 nm (longitud de onda de referencia, de 620 a 650 nm) Micropipetas de 10-1000 µL

Mezclador vórtex

Agitador orbitario de mesa para ELISA (800 rpm) Agua desionizada

Frasco de lavado, sistema automático o semiautomático de lavado de placas de microtitulación Papel absorbente, puntas de pipeta y temporizador

Tubos de poliestireno o polipropileno para la dilución del patrón y de la muestra

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preparar la solución de conjugado.

Propiedades de la prueba

Tipos de muestra

La prueba ELISA NF-light® se ha desarrollado para el análisis de muestras de líquido cefalorraquídeo y no puede, en su forma actual, utilizarse para el análisis de muestras de sangre.

Dependencia de la temperatura

El ensayo se ha diseñado para ser utilizado a temperatura ambiente (20-25 °C).

Intervalo de medición

La curva de calibración cubre el intervalo de 100 a 10 000 pg/mL NF-L (véase la curva en la página 5). No se permite la extrapolación más allá de la curva; las muestras situadas fuera de la curva tienen que diluirse y medirse de nuevo.

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Preparación de los reactivos

Disolución amortiguadora de lavado

Diluya el contenido total de un frasco de concentrado de disolución amortiguadora de lavado (10xWASH) con agua desionizada hasta obtener un volumen final de 400 mL. La disolución amortiguadora de lavado diluida no utilizada se puede conservar a temperatura ambiente y debe utilizarse en un plazo máximo de dos meses. El concentrado de lavado 10× puede tener un aspecto opalescente debido a la elevada concentración de sales (sin efecto sobre el rendimiento del análisis).

Patrones

La serie de dilución del patrón debe reconstituirse y prepararse justo antes de su uso. La dilución más alta (10 000 pg/mL) del patrón se obtiene mediante la reconstitución de un vial de patrón liofilizado (STAND) con el volumen de diluyente de muestras (SAMDIL) indicado en la etiqueta del frasco. Agite brevemente y manténgala a temperatura ambiente. Etiquete 6 microtubos, uno para cada dilución del patrón (es decir, 5000 pg/mL, 2500 pg/mL, 1000 pg/mL, 500 pg/mL, 100 pg/mL y 0 pg/mL). Diluya el patrón de acuerdo con la tabla de dilución que se muestra a continuación:

Dilución del patrón:

El patrón reconstituido debe usarse inmediatamente y no puede reutilizarse.

Marcador

Diluya el marcador concentrado justo antes de su uso (50×TRAC) (AcM anti-NF-L marcados con biotina) en una proporción de 1:50 con diluyente de muestras (SAMDIL). Mezcle bien invirtiendo o agitando el tubo.

Conjugado

Diluya el concentrado de conjugado (CONJ) (concentrado de conjugado de estreptavidina-HRP) en el tubo Sarstedts de15 mL suministrado con diluyente de conjugados (CONDIL) de acuerdo con la etiqueta del vial. Mezcle bien invirtiendo o agitando el tubo.

Tubo n.º Diluyente de muestras Patrón del tubo n.º Concentración pg/mL Vial

Reconstituya con el diluyente de muestras (SAMDIL) de acuerdo con la etiqueta del vial patrón

10 000 1 300 µL 300 µL (vial) 5000 2 300 µL 300 µL (1) 2500 3 360 µL 240 µL (2) 1000 4 300 µL 300 µL (3) 500 5 240 µL 60 µL (4) 100 6 300 µL 0 µL 0

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Instrucciones para llevar a cabo el inmunoensayo

Todos los reactivos del inmunoensayo deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Después de cada ciclo de lavado deberá secarse la placa golpeándola suavemente contra un papel absorbente.

Es MUY IMPORTANTE que la placa se agite a 800 rpm.

1. Diluya las muestras de LCR con igual cantidad (1 + 1) de diluyente de muestras (SAMDIL) hasta un volumen mínimo total de 210 µL. Los patrones reconstituidos y diluidos de acuerdo con la tabla de dilución estándar están listos para su uso (es decir, no deben diluirse más).

2. Lave los pocillos que va a utilizar con disolución amortiguadora de lavado (3 × 300 µL). La

disolución amortiguadora añadida podrá aspirarse, o bien eliminarse golpeando la placa contra un material absorbente inmediatamente antes del próximo ciclo de lavado.

3. Añada 100 µL de cada patrón y muestra por duplicado. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente (20-25 C) con agitación (800 rpm).

4. Lave los pocillos con disolución amortiguadora de lavado (3 × 300 µL); véase el punto 2. 5. Añada 100 µL de anticuerpos marcadores recientemente diluidos a cada pocillo. Incube durante

45 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) con agitación (800 rpm).

6. Lave los pocillos con disolución amortiguadora de lavado (3 × 300 µL); véase el punto 2. 7. Añada 100 µL de conjugado recientemente diluido a cada pocillo. Incube durante 30 minutos a

temperatura ambiente (20-25 C) con agitación (800 rpm).

8. Lave los pocillos con disolución amortiguadora de lavado (3 × 300 µL); véase el punto 2. 9. Añada 100 µL de TMB a cada pocillo. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente

(20-25 C) con agitación (800 rpm).

10. Añada 50 µL de reactivo de parada (STOP) a cada pocillo y lea la absorbancia a 450 nm (longitud de onda de referencia, 620-650 nm).

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Cambios en el funcionamiento o las características del inmunoensayo

Cualquier posible cambio en el funcionamiento o las características del ensayo se describe en las instrucciones de uso específico de cada kit.

Muestras

El LCR no debe estar contaminado con sangre. Las muestras de todos los pacientes deben considerarse potencialmente contagiosas. Tras la punción lumbar las muestras deben conservarse a −80 C en tubos de polipropileno. Debe evitarse congelar/descongelar las muestras repetidamente.

Estabilidad de la muestra

Se evaluó la estabilidad de la muestra en 5 muestras clínicas diferentes. Se comparó la reactividad de la muestra tras distintos tratamientos con la de la misma muestra almacenada a −80 °C.

% promedio del control a −80 °C Intervalo % promedio Congelación-descongelación  4 ciclos 98 96-101 Almacenamiento 5-8 °C  1 semana 99,7 95-108 24 h a temp. amb. (22 °C) 100 91-106 −20°C 1 mes 95,8 89-109

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Resultados

Los resultados se pueden calcular de forma automática mediante un paquete de software para inmunoensayos. La transformación con el método de Marquardt de 4 parámetros proporciona el mejor ajuste de la curva (véase a continuación una curva de calibración típica). Si no se dispone de tal software para inmunoensayos, la concentración de NF-L se calcula a partir de la curva de la DO media (a 450 menos 620) y las concentraciones estándar conocidas.

Todas las concentraciones del análisis se obtienen directamente mediante el paquete de software para inmunoensayos o de la curva trazada manualmente. Las muestras que presentan concentraciones por encima de la dilución más alta del patrón tienen que diluirse y analizarse de nuevo. Al analizar una muestra cuyos niveles se espera que estén por encima de la curva de calibración, esta deberá primero diluirse con una cantidad igual de diluyente de muestras según el punto 1 de las instrucciones del ensayo. A

continuación se realizará una segunda dilución apropiada para que la concentración alcance niveles incluidos en la curva de calibración. La concentración leída en la curva deberá multiplicarse por el factor de dilución aplicado en el segundo paso. Por lo general, los mejores resultados se obtienen cuando se omiten las mediciones de los extremos alto y bajo del intervalo de calibración.

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nivel de NF-L.

Valores esperados

Se analizó el LCR de 50 sujetos aparentemente sanos sin signos conocidos de enfermedad neurológica. Los valores normales medidos oscilaron entre 112 y 821 pg/mL. Los sujetos sanos se dividieron en tres grupos de edad y los niveles de referencia se definieron como el nivel medio de NF-L + 2 DE.

Los resultados solo son válidos si el análisis se realiza de acuerdo con las instrucciones de uso y deben correlacionarse con las observaciones clínicas y las pruebas de diagnóstico. El usuario debe seguir estrictamente las reglas de las BPL (buenas prácticas de laboratorio) u otras normas/leyes pertinentes. Se

100 1000 10000 0 1 2 3 NF-L [pg/mL]

Transformacion Marquardt de 4-parámetros

D O m e d ia

Curva de calibración

Edad Nivel de referencia

< 30 años < 290 pg/mL (n = 17) 30-39 años < 380 pg/mL (n = 15) 40-59 años < 830 pg/mL (n = 18)

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recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de valores normales y que use muestras con niveles conocidos de neurofilamentos ligeros como controles internos.

Funcionamiento

Sensibilidad analítica

(límite de detección) 32 pg/mL LB + 1,645 × DE (100 pg/mL estándar)

Precisión Intraensayo Interensayo Baja (250 pg/mL) 4,8 % CV 9,1 % CV Alta (5000 pg/mL) 3 % CV 3 % CV Precisión media 4 % CV 6 % CV Recuperación (después del enriquecimiento) 250 pg 88,4 % 500 pg 91 % 2500 pg 98,7 % Media de recuperación 93 % Linealidad Intervalo 33-14 740 pg/mL Dilución seriada 1:128 Intervalo 93,4-109 % Media de recuperación 99,8 %

Garantía

Los datos de rendimiento aquí presentados se obtuvieron siguiendo el procedimiento indicado. Cualquier cambio o modificación en el procedimiento no recomendado por UmanDiagnostics AB puede afectar a los resultados, en cuyo caso UmanDiagnostics AB no se hace responsable de ninguna garantía, expresa, implícita o estatutaria, incluida la garantía implícita de comerciabilidad y adecuación para su uso.

UmanDiagnostics AB y sus distribuidores autorizados, en tal caso, no serán responsables de ningún daño, ya sea directo, indirecto o consecuente.

Bibliografía:

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Norgren N, Sundstrom P, Svenningsson A, Rosengren L, Stigbrand T, Gunnarsson M. Neurofilament and glial fibrillary acidic protein in multiple sclerosis. Neurology. 9 de nov. de 2004;63(9):1586-90. Norgren N, Edelstam A, Stigbrand T. Cerebrospinal fluid levels of neurofilament light in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res Bull. 30 de oct. de 2005;67(4):264-8. Rosengren LE, Karlsson JE, Karlsson JO, Persson LI, Wikkelso C. Patients with amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases have increased levels of neurofilament protein in CSF. J Neurochem. Nov. de 1996;67(5):2013-8.

Symbols Version 4.5 / 2015-12-07

REF

Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:

LOT

Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:

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LYO

Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD

In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In

Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In

Vitro. /

Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos

para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /

Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni

prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /

Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la

luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να

φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση

στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:

Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

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