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Interleukin-2 ELISA BE C. Instrucciones de Uso

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Academic year: 2021

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Interleukin-2

ELISA

Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de

Interleucina-2 humana (IL-2) en sobrenadantes de cultivo celular,

suero y plasma humanos.

BE53021

96

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com

(2)

INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO

1.

USO PROPUESTO

2

2.

RESUMEN

2

3.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

3

4.

REACTIVOS SUMINISTRADOS

4

5.

INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

4

6.

TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE

ALMACENAMIENTO

4

7.

MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO

5

8.

PRECAUCIONES DE USO

5

9.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

6

10. PROTOCOLO DE ENSAYO

8

11. CALCULO DE RESULTADOS

11

12. LIMITES

12

13. PRUEBAS FUNCIONALES

13

14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS

16

15. RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS

16

16. RESUMEN DEL PROTOCOLO

17

(3)

1.

USO PROPUESTO

El ELISA IL-2 humana es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa de la IL-2 humana.

El ELISA IL-2 humana es para el diagnóstico in vitro. No debe utilizarse en los procedimientos terapéuticos.

2.

RESUMEN

La Interleucina-2 (IL-2) juega un papel central en la activación y proliferación de los linfocitos que han sido preparados por los antígenos. La IL-2 juega un papel fundamental en la expansión de la mayoría de las células T, células natural killer (NK) y células B durante ciertas fases de su respuesta. La IL-2 es una glicoproteína de 15 kDa codificada por un solo gen situado en la región q26-28 del cromosoma humano 4. El polipéptido deducido de cDNA consta de 153 aminoácidos. La expresión génica de IL-2 está regulada a nivel transcripcional por varias vías de activación. La proliferación antígeno específico de los linfocitos T de ayuda y citotóxicos después de la estimulación es críticamente, dependiente de la expresión, secreción y de IL-2, y unión a los receptores de IL-2, inducida en una forma autocrina sobre la superficie de las células-T.

Además de su papel más importante para mediar el antígeno específico de proliferación de linfocitos T, la IL-2 modula la expresión de los antígenos interferón y de histocompatibilidad, estimula la proliferación y la diferenciación de las células B activadas, aumenta la actividad de las células NK y inhibe la formación de colonias de granulocitos y macrófagos.

Se han observado alteraciones en la capacidad de las células T de sintetizar IL-2 en los estados fisiológicos y patológicos. Debido al papel central de la IL-2 en la respuesta inmunitaria, la IL-2 resultó ser una molécula muy importante por las implicaciones diagnósticas y terapéuticas.

La IL-2 muestra efectos antitumorales, por lo tanto se utiliza en el tratamiento del cáncer. El seguimiento de los niveles de IL-2 en suero proporciona una visión más detallada en varias situaciones patológicas como el cáncer, enfermedades infecciosas, el rechazo de trasplantes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y la diabetes tipo I.

(4)

3.

PRINCIPIO DE ENSAYO

Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos anti-IL-2 humana.

Figura 1

La IL-2 presente en la muestra o el estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en las micropocillos. Se agrega un anticuerpo anti-IL-2 humana conjugado a biotina que se une a la IL-2 capturado por el primer anticuerpo.

Figura 2

Después de la incubación los anticuerpos no unidos conjugados a biotina anti-IL-2 humana son eliminados durante una etapa de lavado. Se agrega Estreptavidina-HRP y este se une a los anticuerpos conjugados a biotina anti-IL-2 humana.

Figura 3

Después de la incubación se elimina la Estreptavidina-HRP no unida mediante una etapa de lavado, y se añade la solución de substrato reactiva con HRP a los pocillos.

Figura 4

Se forma un producto de color proporcional a la cantidad de la IL-2 presente en la muestra o el estándar. La reacción es terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones estándar de IL-2 humana y se determina la concentración de IL-2 humana en la muestra. Figura 5 Anticuerpo Estándar o Muestra Conjugado de Biotina Estreptavidina-HRP - Substrato Substrato reaccionado

Micropocillos Recubiertos

Primer Incubación

Segunda Incubación

Tercer Incubación

(5)

4.

REACTIVOS SUMINISTRADOS

1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales anti- IL-2 humana

1 vial (70 µL) con Conjugado de Biotina (anticuerpos policlonales anti-IL-2 humana) 1 vial (150 µL) con Estreptavidina-HRP

2 viales con Estándar IL-2 humana liofilizado, 2.4 ng/mL tras la reconstitución 1 vial (5 mL) de Solución Buffer de Ensayo Concentrado 20x

(PBS con 1 % de Tween 20 y BSA al 10 %) 1 vial Control alto, liofilizado

1 vial Control bajo, liofilizado

1 frasco (12 mL) Diluyente de Muestras

1 frasco (50 mL) de Solución Buffer de Lavado Concentrada 20x (PBS con Tween 20 al 1%)

1 vial (15 mL) de Solución de Substrato (tetrametil-bencidina)

1 vial (15 mL) de Solución de Parada (Acido fosfórico 1 M)

4 Tapas para placas, Adhesivas

5.

INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO – ELISA KIT

Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C escepto los controles. Almacenar los controles liofilizados a -20°C.

Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura (2°C y 8°C), controles a -20°C, respectivamente. En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos.

Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulación.

6.

TOMA DE MUESTRAS E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina), líquido amniótico, orina, sangre, han sido examinado con este ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuados para su uso en el ensayo. Eliminar el suero o plasma del coágulo o de las células tan pronto como sea posible después de la coagulación y separación.

Prestar atención a un "Efecto Gancho" posible debido a la alta concentración de las muestras (ver capítulo 11). Las muestras que contienen un precipitado visible deben aclararse antes de su uso en el ensayo. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.

Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congeladar a -20°C para evitar la pérdida de IL-2 humana bioactiva. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2°C y 8°C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5).

Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente

(6)

7.

MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO

- Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL

- Micropipetas ajustables de un solo canal de 5 μL a 1000 μL con puntas desechables - Micropipetas multicanales ajustables de 50 μL a 300 μL con puntas desechables - Depósito para micropipetas multicanales

- Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos

- Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación - Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm

(opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio

- Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión

8.

PRECAUCIONES DE USO

- Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por tanto, recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones específicas.

- Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en procedimientos terapéuticos.

- No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No usar reactivos caducados.

- No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación. - No pipetear con la boca.

- No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos. - Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas.

- Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las muestras y reactivos.

- Evitar el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales. - Evitar salpicaduras y la generación de aerosoles.

- Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso.

- Usar recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato. - La exposición a los ácidos inactiva el conjugado.

- Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos. - La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso.

- Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado durante un mínimo de 1 hora a 121.5ºC.

- Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0% de hipoclorito sódico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico.

(7)

9.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS

La Solución de Buffer Concentrada debe de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluidas antes de iniciar el procedimiento del test. Si en el concentrado de la Solución de Buffer se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución.

9.1. Solución Buffer de Lavado (1x)

Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.

Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2°C y 25°C. La Solución Buffer de Lavado permanece estable durante 30 días.

En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado de acuerdo a la siguiente tabla:

Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) (mL) Agua Destilada (mL)

1 - 6 25 475

1 - 12 50 950

9.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)

Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio aforado de 100 mL. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada aun volumen final de 100 mL. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.

Conserve la solución a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C. La Solución Buffer de Ensayo (1x) permanece estable durante 30 días.

En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la siguiente tabla:

Número de Tiras Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL)

1 - 6 2.5 47.5

1 - 12 5.0 95.0

9.3. Preparación de Conjugado de Biotina

Utilice el Conjugado de Biotiona antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución.

Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluir en una proporción de 1:100 con Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.

En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente tabla:

Número de Tiras Conjugado de Biotiona (mL) Buffer de Ensayo (1x) (mL)

1 - 6 0.03 2.97

1 - 12 0.06 5.94

9.4. Estreptavidina-HRP

Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución.

Se debe diluir la Estreptavidina-HRP concentrada en una proporción de 1:100 con Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.

En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente tabla:

Número de Tiras Estreptavidina -HRP (mL) Buffer de Ensayo (1x) (mL)

1 - 6 0.06 5.94

(8)

9.5. Estándar IL-2 Humana

Reconstituir el Estándar IL-2 humana añadiendo agua destilada.

El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una completa y homogénea solubilización (concentración del estándar reconstituido = 2.4 ng/mL).

Permitir que el estándar reconstituido repose durante 10-30 minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones.

El estándar tiene que ser usado inmediatamente después de la reconstitución y no se puede almacenar. Las diluciones estándar pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.e) o alternativamente en tubos (véase 9.5.1).

9.5.1. Dilución Estándar Externa

Rotular 7 tubos, uno para cada curva estándar. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.

Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación: Pipetear 225 µL de diluyente de muestra a todos los tubos.

Pipetear 225 µL de estándar reconstituido (concentración del estándar = 2.4 ng/mL) en el primer tubo, etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 1.2 ng/mL).

Pipetear 225 µL de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como y mezclar completamente antes de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 6).

El Diluyente de Muestra sirve como blanco.

Figura 6

9.6. Controles

Reconstituya añadiendo 800 μL de agua destilada a los controles liofilizados (10-30 minutos). Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una completa y homogénea solubilización. Además tratar los controles como sus muestras de ensayo. Para el rango referencial consulte la certificación de análisis ó la etiqueta del frasco. Almacenar el reconstituyente de los controles en aliquotas a -20°C. Evite congelar y descongelar repetidamente. Transferir 225 µL IL-2 Humana Estándar Reconstituido S1 S2 S3 S4 - S7 Diluyente de Muestra 225 µL Descartar 225 µL

(9)

10. PROTOCOLO DE ENSAYO

a. 2 x 50 μL de muestra son necesarias para duplicar la medición. Las muestras de suero o plasma, así como los controles reconstituidos, se utilizan sin diluir.

Los niveles de sobrenadante de cultivo celular IL-2 humana, puede variar considerablemente. Debe realizarse una dilución óptima para cada muestra individual. Las muestras desconocidas de cultivo celular es conveniente analizar sin diluir, así como muestras prediluidas en paralelo (por ejemplo, 1:20 - 1:50), cubriendo así una gama más amplia en un mismo ensayo. Sobrenadantes de cultivo celular con muy altas concentraciones de IL-2 humana, requieren altas diluciones (por ejemplo, hasta 1:2000) con el fin de medir correctamente. Estas muestras deben ser prediluídas en el respectivo medio de cultivo celular. La dilución final de la muestra debe realizarse de acuerdo con el siguiente esquema:

Dilución Volumen de Muestra Diluyente de Muestra Factor de Dilución:

1 : 5 50 µL Muestra 200 µL Diluyente de Muestra 5 1:10 25 µL Muestra 225 µL Diluyente de Muestra 10 1:50 10 µL Muestra 490 µL Diluyente de Muestra 50 1:100 A: 10 µL Muestra B:25 µL predilución A 90 µL Diluyente de Muestra 225 µL Diluyente de Muestra 100 1:1000 A: 10 µL Muestra B:25 µL predilución A 990 µL Medio de Cultivo 225 µL Diluyente de Muestra 1000 1:2000 A: 10 µL Muestra B:10 µL predilución A 390 µL Medio de Cultivo 490 µL Diluyente de Muestra 2000

b. Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y además añada las tiras para blancos y estándares. Cada muestra, estándar, blancos y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8°C.

c. Prepare el Conjugado de Biotina (véase Preparación de Conjugado de Biotina 9.3).

d. Lave 2 veces las tiras con aproximadamente 400 µL de Solución Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos.

Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo 15 minutos. No deje secar los pocillos.

e. Dilución de los Estándares en la placa de microtitración

(Alternativamente, la dilución de los estándars puede ser preparada en tubos – véase 9.5.1)

Añadir 100 µL de Diluyente de Muestra en duplicado a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.5, concentración = 2400.0 pg/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Table 1). Mezclar el contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la pipeta (concentración del estándar 1, S1 = 1200.0 pg/mL), y transferir 100 µL a los pocillos B1 y B2, respectivamente. (véase Figure 7). Llevar cuidado de no rascar la superficie interior de los micropocillos con la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones estándar del human IL-2 ordenadas des de 1200.0 a 18.8 pg/mL. Descartar 100 µL de los contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados.

(10)

Figura 7

En caso de una dilución estándar externa (véase 9.5.1), pipetear 100 µL de estas diluciones estándar (S1-S7) en los pocillos correspondientes al estándar de acuerdo con la Tabla 1.

Tabla 1

Tabla que describe un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en los micropocillos de las tiras:

1 2 3 4 A Estándar 1 (1200.0 pg/mL) Estándar 1 (1200.0 pg/mL) Muestra 1 Muestra 1 B Estándar 2 (600.0 pg/mL) Estándar 2 (600.0 pg/mL) Muestra 2 Muestra 2 C Estándar 3 (300.0 pg/mL) Estándar 3 (300.0 pg/mL) Muestra 3 Muestra 3 D Estándar 4 (150.0 pg/mL) Estándar 4 (150.0 pg/mL) Muestra 4 Muestra 4 E Estándar 5 (75.0 pg/mL) Estándar 5 (75.0 pg/mL) Muestra 5 Muestra 5 F Estándar 6 (37.5 pg/mL) Estándar 6 (37.5 pg/mL) Muestra 6 Muestra 6 G Estándar 7 (18.8 pg/mL) Estándar 7 (18.8 pg/mL) Muestra 7 Muestra 7

H Blanco Blanco Muestra 8 Muestra 8 Transferir 100 µL IL-2 Humana Estándar Reconstituido S1 S2 S3 S4 - S7 Diluyente de Muestra 100 µL Descartar 100 µL

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f. Añadir 100 µL de Diluyente de Muestra en duplicado en los pocillos en blanco. g. Añadir 50 µL de cada Diluyente de Muestra a los pocillos con la muestra. h Añadir 50 µL de cada muestra en duplicado a los pocillos designados. i. Añada 50 µL el Conjugado de Biotina a todos los pocillos.

j. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.

k. Prepare Estreptavidina-HRP (véase la preparación de estreptavidina-HRP 9.4).

l. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 6 veces de acuerdo al punto d del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.

m. Añada 100 µL de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos.

n. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.

o. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 6 veces de acuerdo al punto d del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.

p. Pipetee 100 μL de Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos.

q. Incube las tiras a temperatura ambiente (18-25°C) durante aproximadamente 30 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa.

Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato (véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar correctamente los pocillos positivos.

La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de forma individual para cada ensayo.

Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcanze una DO entre 0.9 y 0.95.

r. Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µL de la Solución de Parada en cada pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente después de añadir la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8°C en un lugar oscuro.

s. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizando los pocillos de blanco, haga el blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la absorbancia de las muestras y de los estándares.

Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados más abajo. De todas formas los resultados siguen siendo válidos.

(12)

11. CALCULO DE RESULTADOS

- Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio

- Construir una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada estándar frente a la concentración de IL-2 humana con el valor de absorbancia en el eje y y la concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics.

- Para determinar la concentración de la IL-2 humana circulante para cada muestra, primero encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva estándar. En el punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la concentración la IL-2 humana.

- Suero, plasma y las muestras de control se han diluido 1:2 (50 µL de muestra + 50 µL Diluyente de Muestra (1x)), La concentración leída a partir de la curva estándar se debe multiplicar por el factor de dilución (x 2).

- Si se han medido sobrenadantes de cultivo de células de la concentración leída de la curva estándar debe multiplicarse por el factor de dilución previa individuo (y) y el factor de dilución (2) del ensayo (x 2a).

- Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a concentraciones incorrectas, bajas en IL-2 humana (Efecto Gancho). Estas muestras requieren más predilución externa según los valores esperados de IL-2 humana con el Diluyente de Muestras para cuantificar con precisión la concentración real de IL-2 humana.

- Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de IL-2 humana y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no válidos.

- En la figura 8 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo de tiras ensayadas.

Figura 8

Representativa curva estándar para el ELISA IL-2 humana. Se diluyó IL-2 humana en serie de 2 etapas en el Diluyente de Muestras. No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas.

Interleukin-2 ELISA 0.0 0.1 1.0 10.0 10 100 1000 10000 (pg/m L) D O ( 450 n m )

(13)

Tabla 2

Datos típicos utilisando el ELISA IL-2 humana Longitud de onda: 450 nm

Longitud de onda de referencia: 620 nm

Estándar Concentración Human IL-2 (pg/mL) D.O. (450 nm) D.O. Media (450 nm) C.V. (%) 1 1200.0 2.996 3.020 3.008 0.4 % 2 600.0 1.683 1.706 1.694 0.7 % 3 300.0 0.836 0.795 0.815 2.6 % 4 150.0 0.444 0.430 0.437 1.5 % 5 75.0 0.243 0.241 0.242 0.3 % 6 37.5 0.150 0.144 0.147 2.0 % 7 18.8 0.098 0.095 0.096 1.3 % Blanco 0 0.053 0.055 0.054

Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo válidas.

12. LIMITES

- Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estándar para cada prueba.

- La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada entre los reactivos puede dar resultados erróneos.

- Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser eliminados por un enjuague minucioso.

- Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo o que se secan.

- Por la aplicación de radioinmunoterapia, el número de pacientes con los anticuerpos humanos IgG antiratón (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden todavía ser ensayadas en ensayos de este tipo si se añaden inmunoglobulinas murinas (suero, líquido ascítico o anticuerpos monoclonales no específicos) a la muestra.

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13. PRUEBAS FUNCIONALES

13.1. Sensibilidad

El límite de detección de IL-2 humana definido como la concentración del analito resultando en una absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar), se determinó de ser 9.1 pg/mL (media de 6 ensayos independientes).

13.2. Recuperación

13.2.1. Intra-ensayo

La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 4 muestras de suero y 4 muestras de sobrenadantes de cultivos célulares que contienen diferentes concentraciones de IL-2 humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IL-2 humana y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3).

El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 7.0%. Tabla 3

La concentración media de IL-2 humana y el coeficiente de variación para cada muestra.

Muestra Expérience Concentración media de human IL-2 (pg/mL) Coeficiente de Variación (%) 1 1 2 3 2065.2 2062.9 2239.6 3.3 % 3.7 % 3.9 % 2 1 2 3 1616.5 1476.6 1491.1 5.0 % 6.8 % 3.1 % 3 1 2 3 1036.9 1065.8 1082.5 7.6 % 7.6 % 5.5 % 4 1 2 3 595.9 638.7 696.8 6.1 % 4.0 % 10.0 % 5 1 2 3 426.5 419.5 406.1 4.0 % 9.5 % 12.0 6 1 2 3 210.8 195.8 207.1 11.6 % 7.4 % 8.8 % 7 1 2 3 88.4 103.6 104.3 14.8 % 5.5 % 6.6 %

(15)

13.2.2. Inter-ensayo

La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de sobrenadantes de cultivos celulares que contienen diferentes concentraciones de IL-2 humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de la IL-2 humana y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 4). El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 5.0%.

Tabla 4

La concentración media de IL-2 humana y el coeficiente de variación para cada muestra:

Muestra Concentración media de IL-2 humana (pg/mL) Coeficiente de Variación (%) 1 2122.6 4.8 % 2 1528.1 5.0 % 3 1061.7 2.2 % 4 643.8 7.9 % 5 417.4 2.5 % 6 204.6 3.8 % 7 98.8 9.1 %

13.3. Recuperación después del enriquecimiento

La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo tres niveles de IL-2 humana en muestras combinadas de suero humano normal y muestras de plasma citrato. Las recuperaciones se determinaron en dos experimentos independientes con 4 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido sirvó como blanco en estos experimentos.

Tabla 5

Matriz de Muestra

Enriquecimento alto Enriquecimento medio Enriquecimento bajo Media (%) Rango (%) Media (%) Rango (%) Media (%) Rango (%) Suero 94 80-111 102 95-114 105 91-118 Plasma (EDTA) 103 93-110 94 86-106 97 73-111 Plasma (Citrato 117 114-118 101 95-110 98 82-115 Plasma (Heparina) 115 110-119 102 91-113 93 73-105 Sobrenadante de cultivo celular 110 106-116 109 98-120 108 95-121

(16)

13.4. Dilución en paralelo

Muestras de suero, plasma (EDTA, citrato, heparina) y sobrenadantes de cultura celular con diferentes concentraciones de IL-2 humana fueron analizadas mediante 2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno.

Ver Tabla 6 por los datos.

Tabla 6

Matriz de Muestra

Recuperación de Val. Esp.

Dilución Media (%) Rango (%) Suero 1:4 1:8 1:16 89 84 80 82-95 80-90 73-85 Plasma (EDTA) 1:4 1:8 1:16 97 92 98 92-102 82-104 97-122 Plasma (Citrato 1:4 1:8 1:16 93 89 91 87-98 83-99 83-103 Plasma (Heparina) 1:4 1:8 1:16 92 90 94 89-96 81-95 82-109 Sobrenadante de cultivo celular 1:4 1:8 1:16 96 86 86 94-99 81-90 82-90

13.5. Estabilidad de Muestras

13.5.1. Estabilidad Congelación - Descongelación

Alícuotas de las muestras de suero y de sobrenadantes de cultivos celulares (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20°C y posteriormente 5 veces descongeladas, y se determinó las concentraciones de la IL-2 humana. No hubo pérdidas significativas de la inmunoreactividad de IL-2 humana detectada por hasta 3 ciclos de congelación y descongelación. Una pérdida significativa de la inmunoreactividad de la IL-2 (20%) fue detectado a más ciclos de congelación y descongelación.

13.5.2. Estabilidad de Almacenamiento

Alícuotas de las muestras de suero y de sobrenadantes de cultivos celulares (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20°C, 2-8°C, temperatura ambiente (TA) y a 37°C, y la concentración de la IL-2 humana determinada después de 24 h. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad de la IL-2 humana durante el almacenamiento a -20°C, 2-8°C y TA. Se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad de IL-2 humana (20%) durante el almacenamiento a 37°C después de 24 h.

13.6. Especificidad

La reactividad cruzada y la interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de IL-2 humana. No se detectó reactividad cruzada o interferencias.

13.7. Valores Esperados

No se encontró concentraciones detectables de IL-2 humana en los donantes sanos. Concentraciones elevados de IL-2 humana dependen del tipo de trastorno inmunológico.

(17)

14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS

Para los pedidos pongáse en contacto con:

Véase última página.

Para preguntas técnicas comuniquese con:

e-mail: IBL@IBL-International.com www.IBL-International.com

15. RESUMEN: PREPARACION DE REACTIVOS

15.1. Solución Buffer de Lavado (1x)

Añadir 50 mL de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada. Número

de tiras

Solución Buffer der Lavado Concentrado (mL)

Agua Destilada (mL)

1-6 25 475

1-12 50 950

15.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)

Añadir 5 mL de la Solución Buffer de Ensayo Concentrado (20x) a 90 mL de agua destilada. Número

de tiras

Solución Buffer der Ensayo Concentrado (mL) Agua Destilada (mL) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0

15.3.

Conjugado de Biotina

Hacer una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en Buffer de Ensayo (1x): Número de tiras Conjugado de Biotina (mL) Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.03 2.97 1-12 0.06 5.94

15.4.

Estreptavidina-HRP

Hacer una 1:100 dilución de Estreptavidina-HRP en Buffer de Ensayo (1x): Número de tiras Estreptavidina-HRP (mL) Buffer de Ensayo (1x) (mL) 1-6 0.06 5.94 1-12 0.12 11.88

15.5. Estándar IL-2 Humana

Reconstituir el estándar liofilizado de IL-2 humana con agua destilada.

(El volumen de reconstitución es indicado en la etiqueta del frasco de estándar)

(18)

16. RESUMEN PROTOCOLO DE ENSAYO

1. Prediluir los sobrenadantes de cultivos celulares con Diluyente de Muestras. 2. Determinar el número requirido de tiras de la placa de microtitulación

3. Preparar el Conjugado de Biotina.

4. Lavar las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado. 5. Dilución estándar en la placa de microtitración: Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras,

por duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado en los primeros pocillos y crear diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µL de pocillo a pocillo.

Deseche 100 µL de los últimos pocillos.

Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.5.1): Pipetear 100 µL de estas diluciones estándares en las tiras de los micropocillos.

6. Añadir 100 μL de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos. 7. Añadir 50 μL de Diluyente de Muestras a los pocillos de muestra.

8. Añadir 50 μL de muestra por duplicado a los pocillos respectivos. 9. Añadir 50 μL de Conjugado de Biotina a todos los pocillos.

10. Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25°C). 11. Preparar la Estreptavidina-HRP.

12. Vaciar y lavar los pocillos 6 veces con Solución Buffer de Lavado. 13. Añadir 100 μL de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos. 14. Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25°C). 15. Vaciar y lavar los pocillos 6 veces con Solución Buffer de Lavado. 16. Añadir 100 μL de Solución Substrato TMB a todos los pocillos.

17. Incubar las tiras para approximadamente 30 minutos a temperatura ambiante (18-25°C). 18. Añadir 100 μL de Solución de Parada a todos los pocillos.

19. Ajustar el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm.

Nota: Las muestras de suero, plasma y control se han diluido 1:02 (50 µL de muestra + 50 µL diluyente de muestra (1x), la concentración leída de la curva estándar debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2).

Si se han medido sobrenadantes de cultivo de células de la concentración leída de la curva estándar debe multiplicarse por el factor de dilución previa individuo (y) y el factor de dilución (2) del ensayo (x 2y).

(19)

17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO

1. Naldini, A.; Fleischmann, W. R., Jr.; Ballas, Z. K.; Klimpel, K. D.; Klimpel, G. R.. Interleukin 2 inhibits in vitro granulocyte-macrophage colony formation. J.Immunol. 1987; 139:1880-1884.

2. Tigges, M. A.; Casey, L. S.; Koshland, M. E.. Mechanism of interleukin-2 signaling: mediation of different outcomes by a single receptor and transduction pathway. Science 1989; 243:781-786.

3. Gressler, V. H.; Weinkauff, R. E.; Franklin, W. A.; Golomb, H. M.. Modulation of the expression of major histocompatibility antigens on splenic hairy cells--differential effect upon in vitro treatment with alpha-2b-interferon, gamma-interferon, and interleukin-2. Blood 1988; 72:1048-1053.

4. Phadke, K.; Carlson, D. G.; Gitter, B. D.; Butler, L. D.. Role of interleukin 1 and interleukin 2 in rat and mouse arthritis models. J.Immunol. 1986; 136:4085-4091.

5. Cornaby, A.; Simpson, M.; Vann, Rice R.; Dempsey, R.; Madras, P.; Jenkins, R.; Monaco, A.. Interleukin 2 levels and urine cytology distinguish between cyclosporine toxicity and rejection in renal and liver allograft recipients. Transplant Proc. 1988; 20:827-830.

(20)

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD

In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.

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