ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN DE XILITOL POR FERMENTACIÓN CON LEVADURAS NO CONVENCIONALES

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Clave: FER285JCG20120130

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN DE

XILITOL POR FERMENTACIÓN CON LEVADURAS NO

CONVENCIONALES

Ricardo, Martínez Corona

1, 2

; Carlos, Cortés Penagos

1

; María del

Carmen, Chávez Parga

3

; Juan Carlos, González-Hernández

2

.

DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

1

Facultad de Químico Farmacobiología-UMSNH. 2Lab. de Bioquímica del Depto. de Ing. Bioquímica del Instituto Tecnológico de Morelia. 3Facultad de Ing. Química-UMSNH.

CORREO ELECTRÓNICO

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2

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INTRODUCCIÓN

El xilitol es un carbohidrato natural, químicamente clasificado como alcohol-azúcar, de alto valor agregado debido a sus propiedades dietéticas y tecnológicas: no produce pardeamiento de Maillard, incrementa el sabor y color de los productos alimenticios sin afectar sus propiedades, tiene la misma intensidad de dulzura que la sacarosa, es adecuado su uso en la alimentación de diabéticos (ya que su metabolismo no está regulado por la insulina), posee propiedades anticariogénicas y facilita la remineralización de los dientes evitando la formación de caries (Diz et al., 2002). Actualmente, el xilitol es obtenido por hidrogenación catalítica a altas presiones y temperaturas, usando como materia prima xilosa comercial o marlo de maíz. Su síntesis química es muy cara y genera subproductos indeseables, lo que se manifiesta en bajos rendimientos (Vanegas et al., 2004).

La conversión de xilosa a xilitol, puede ser lograda por un proceso fermentativo, donde las levaduras son reconocidas como las mejores productoras de dicho compuesto usando como sustrato un medio con alto contenido de xilosa (Ghindea et al., 2010).

Diversas fuentes orgánicas, altas en contenidos de xilosa, han sido usadas para la obtención de xilitol por un medio fermentativo: hidrolizado hemicelulósico de paja de arroz (Roberto et al., 1999), hidrolizado de eucalipto y de paja de trigo (Martínez et al., 2002), hidrolizado de

caña de azúcar (Santos et al., 2003) y salvado de arroz (Herazo et al., 2009). No se ha reportado el uso de medio hidrolizado de semilla de tamarindo para la obtención de xilitol. La semilla de tamarindo está compuesta en una gran proporción por carbohidratos, en un 50 a 72% (El-Siddig et al., 2006), mismos que se encuentran en forma de un heteropolisacárido ramificado, llamado xiloglucano. El xiloglucano, o goma de

tamarindo, está compuesto principalmente por D-glucosa, D-xilosa,

D-galactosa y L-arabinosa en una proporción 8: 4: 2: 1 (Kaur, 2006). Debido a sus altos contenidos en xilosa, la semilla de tamarindo es una fuente de sustrato potencial para levaduras productoras de xilitol.

OBJETIVOS

Determinar la levadura con mayor acoplamiento al medio hidrolizado de semilla de tamarindo y producción de xilitol de entre las tres propuestas: Candida guilliermondii, Candida magnoliae y Debaryomyces hansenii. MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos. Las levaduras C. guilliermondii, C. magnoliae y D. hansenii, fueron mantenidas en refrigeración en cajas de Petri con medio YPD-hidrolizado de semilla de tamarindo (10g/L glucosa, 10g/L azúcares de hidrolizado, 10g/L bactopeptona, 10g/L extracto de levadura, 10g/L agar), para su preadaptación al medio de cultivo.

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sin testa fue molida y tamizada hasta obtener un diámetro aproximado de partícula de 0.125mm. El polvo obtenido se sometió a hidrólisis ácida con ácido nítrico al 3%, y a hidrólisis térmica en autoclave a 121°C durante 20min. Para eliminar la fracción sólida del hidrolizado, se centrifugó a 4000 rpm por 15min y se filtró. Se ajustó el pH a aproximadamente 5.5 del medio hidrolizado con tris NH2C(CH2OH)3 2M.

La concentración de azúcares reductores del medio hidrolizado se cuantificó con el método DNS. La concentración se ajustó a 50g/L de azúcares reductores mediante diluciones con agua destilada. El medio se enriqueció con sales de fosfato de amonio (NH4)3PO4 en una proporción de

1g/L. La concentración de sustratos como glucosa y xilosa se cuantificaron por ensayos enzimáticos.

Inoculo. Se tomaron tres asadas de las levaduras almacenadas a 25mL del medio de fermentación, y se incubó a 180rpm y 30°C durante 24h. El crecimiento celular se midió por cuenta de células viables en cámara de Neubauer.

Fermentación. Se inocularon 3X106 cel/mL en 100mL del medio de fermentación, y se incubó a 180rpm y 30°C durante 92h. Se tomó muestra cada 4h y se determinó crecimiento celular (cuenta viable en cámara de Neubauer), pH y consumo de azúcares reductores (método DNS). La fermentación de cada levadura se realizó por duplicado.

Métodos analíticos. La concentración de glucosa, xilosa y xilitol se cuantificó por ensayo enzimático de muestras tomadas cada 12h, con respuesta a cambio de

espectofotómetro de UV-Visible. Dichas concentraciones fueron de uso para el cálculo de los factores de conversión xilosa a xilitol (Yp/s) y sustrato total en

células (Yx/s). Los rendimientos obtenidos

para las tres levaduras se analizaron estadísticamente con el Software JMP 6.0.

RESULTADOS

El hidrolizado preparado a las condiciones especificadas, alcanzó una concentración de azúcares reductores, cuantificada por el método DNS, de 86.146 g/L. Como era de esperarse, los componentes en mayor proporción en el medio hidrolizado de semilla de tamarindo fueron glucosa (33.53g/L) y xilosa (21.28g/L). El ajuste del medio hidrolizado a una concentración de azucares reductores, disminuyó la presencia de glucosa y xilosa en el medio usado durante la fermentación. Por tanto, las concentraciones iniciales de glucosa y xilosa fueron 28.13g/L y 17.35g/L, respectivamente, en el medio de fermentación.

D. hansenii no mostró adaptación alguna al medio de fermentación preparado a partir de semilla de tamarindo, ya que no existió crecimiento celular ni consumo de sustrato xilosa. En el caso contrario, C. guilliermondii y C. magnoliae si lograron una adaptación al medio de fermentación, con un consecuente consumo de sustrato y producción de xilitol (Figura 1).

La producción máxima de xilitol para C. guilliermondii (0.41g/L) y C. magnoliae (3.57g/L) se registró, en ambos casos,

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Figura 1: Consumo de sustrato y producción de xilitol en el medio hidrolizado de semilla de tamarindo. (♦, ◊) Candida guilliermondii; (●, ○)

Candida magnoliae; (▲, ∆) Debaryomyces hansenii.

transcurridas las 92h. Sin embargo, el rendimiento más alto obtenido se dio a las 48h para estas levaduras (Tabla I).

El consumo de glucosa fue distinto para las tres levaduras. Como era de esperarse, no hubo consumo de este azúcar por parte de D. hansenii.

Figura 2: Consumo de glucosa durante las fermentaciones en el medio hidrolizado de semilla de tamarindo. (♦) Candida guilliermondii; (●) Candida magnoliae; (▲) Debaryomyces hansenii.

Por su parte, C. guilliermondii presentó un consumo muy gradual de glucosa, alcanzando un consumo del 67% transcurridas las 92h. C. magnoliae, consumió prácticamente en un 100% la glucosa del medio hidrolizado después de 48h de iniciada la fermentación.

DISCUSIÓN

El hidrolizado de semilla de tamarindo preparado a las condiciones establecidas, tuvo una composición con concentraciones altas de glucosa (33.53g/L) y xilosa (21.28g/L), si es comparado con las concentraciones de estos monosacáridos en otros hidrolizados orgánicos que han sido utilizados como fuente de sustrato para la producción de xilitol. Martínez et al. (2002) reporta la composición de cuatro hidrolizados hemicelulósicos: Bagazo de caña con concentraciones de glucosa y xilosa de 1.70 y 22.71g/L, respectivamente; para paja de arroz de 3.29 y 18.33g/L; para hidrolizado de eucalipto de 1.53 y 24.32 g/L; y para paja de trigo 2.79 y 10.65g/L.

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fermentación en medios hidrolizados de semilla de tamarindo. Las medias seguidas de la misma letra no difieren entre sí a un nivel del 1 %.

La concentración de glucosa obtenida para el hidrolizado de semilla de tamarindo es mucho mayor a la de los cuatro hidrolizados antes mencionados. Mientras tanto, la concentración obtenida de xilosa es muy similar a la presente en hidrolizados hemicelulósicos de bagazo de caña y eucalipto.

Se ha reportado el uso de D. hansenii para la obtención de xilitol a partir de

hidrolizados hemicelulósicos, específicamente madera de eucalipto (Diz

et al., 2002), alcanzando un rendimiento (Yp/s) de 0.57g/g. Sin embargo, ésta

levadura no logró una adaptación al medio hidrolizado de semilla de tamarindo, traducido en un nulo consumo de glucosa (Figura 2) y xilosa (Figura 1). Su inhibición pudo deberse a la probable presencia de furfurales, generados durante la hidrólisis.

A pesar de que C. guilliermondii y C. magnoliae se adaptaron al medio hidrolizado, su comportamiento durante la fermentación fue muy distinto. C. guilliermondii presentó un consumo gradual tanto de glucosa como de xilosa, lo que se tradujo en una baja productividad comparada con la alcanzada por C. magnoliae, y comprobada por una prueba t de Student (Tabla I). Así, el rendimiento producto-sustrato (Yp/s) también fue

estadísticamente diferente con respecto al obtenido en la fermentación de C. magnoliae.

C. guilliermondii es quizá la levadura más utilizada en la obtención de xilitol a partir de medios hidrolizados de fuentes orgánicas. El rendimiento obtenido por esta levadura en medio hidrolizado de semilla de tamarindo (0.1961g/g) es mucho menor a los obtenidos para hidrolizados de bagazo de caña con 0.63g/g (Martínez et al., 2002) y paja de arroz con 0.73 (Roberto et al., 2003), sólo por mencionar algunos.

A pesar de obtener baja productividad y rendimiento producto-sustrato con C. guilliermondii, el rendimiento de sustrato en obtención de biomasa (Yx/s) fue alto,

contrario a lo que podría esperarse, e incluso no difirió estadísticamente con el alcanzado con C. magnoliae.

Como se mencionó anteriormente, la levadura que alcanzó mayor productividad y rendimiento fue C. magnoliae, que consumió prácticamente toda la glucosa, y un 94.18% de xilosa. La producción de xilitol, comenzó durante la fase estacionaria de crecimiento celular, coincidiendo en el punto donde la glucosa se agotó. El rendimiento de producto-sustrato alcanzado en este medio de fermentación, es similar al 0.57 obtenido por Levadura Productividad (g/Lh) Yp/s (g/g) Yx/s (g/g) Consumo Xilosa (%)

Candida guilliermondii 0.005a 0.1961a 0.6057a 10a

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Wannawilai et al. (2007), en medios puros de fermentación, lo que habla de una buena adaptación al medio hidrolizado de semilla de tamarindo.

CONCLUSIONES

C. magnoliae fue la levadura que logró una mayor adaptación al medio hidrolizado de semilla de tamarindo, obteniendo rendimientos mayores con respecto a las C. guilliermondii. Esta levadura será utilizada en un diseño experimental con la finalidad de determinar condiciones ideales de fermentación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Diz, J.; Cruz, J. M.; Domínguez, H.;

Parajó, J. C. 2002: Xylitol Production from Eucalyptus Wood Hydrolysates in Low-Cost Fermentation Media, Food Technol. Biotechnol, 40(3), 191-197.

2. El-Siddig, K.; Gunasena, H. P. M.; Prasad, B. A.; Pushpakumara, D. K. N. G.; Ramana, K. V. R.; Vijayanand, P.; Williams, J. T. 2006: Tamarind Tamarindus indica L. Southampton Centre for Underutilized Crops.

3. Ghindea, R.; Csutak, O.; Stoica, I.; Tanase, A. M.; Vassu, T. 2010: Production of Xylitol by Yeasts, Romanian Biotechnological Letters, 15(3).

4. Herazo, I. C.; Ruiz, D.; Arrazola, G. S. 2009: Bioconversión de Xilosa a Xilitol por Candida guilliermondii empleando cascarilla de arroz, Revista de Temas Agrarios, 14.

5. Kaur, G.; Nagpal, A.; Kaur B. 2006: Tamarind. Science Tech Entrepreneur.

6. Martínez, E. A.; Villarreal, L. M.; Almeida e Silva, J. B.; Solenzal, A. I. N.; Canilha, L.; Mussatto, S. I. 2002: Uso de las Diferentes Materias Primas para la Producción Biotecnológica de Xilitol, Ciencia y Tecnología Alimentaria, 3(5), 295-301.

7. Roberto, I.; Mussatto, S.; Rodríguez, R. 2003: Dilute-Acid Hydrolysis for Optimization of Xylose Recovery from Rice straw in a Semi-Pilot Reactor, Industrial Crops and Products, 17, 171-176.

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9. Vanegas, I. A.; Yepes, M. S.; Ruiz, O. S. 2004: Producción de Xilitol a Partir de Levaduras Nativas Colombianas, Revista Colombiana de Biotecnología, 6(2).

10. Wannawilai, S.; Sirisansaneeyakul, S.; Vanichsriratana, W.; Prakulsuksatid, P. 2007: Optimization

for the Production of Xylitol using Candida magnolia, TSB: A Solution to the Global Economic Crisis.