Finalidad .
Sistema para determinación en modo cinético de la Fosfatasa Alcalina en el suero.Uso profesional.
[Solamente para uso diagnóstico in vitro]
Principio .
La fosfatasa alcalina (FALC) del suero en pH alcalino hidrolisa el p-nitrofenilfosfato liberando p-nitrofenol y fosfato inorgánico, según la reacción expuesta a continuación:FALC
p-Nitrofenilfosfato + H O p-Nitrofenol + fosfato2 La cantidad producida de p-nitrofenol, que tiene elevada absorbancia en 405 nm, es directamente proporcional a la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina en la muestra.
Características del sistema .
El substrato p-Nitrofenil fosfato fue seleccionado porque es prontamente hidrolisado por la fosfatasa alcalina. El producto de la hidrólisis posee elevada absortividad molar, permitiendo utilizar pequeño volumen de muestra y corto tiempo de reacción, porque utiliza un tampón transfosforilante que aumenta la velocidad del sistema. El sistema se basa en el método de referencia de la AACC, que optimiza todas las condiciones de la reacción, incluyendo temperatura, pH, concentración de los reactivos y volumen fraccional de la muestra. Este método, con pequeñas modificaciones, está siendo considerado por varias organizaciones nacionales e internacionales, interesadas en establecer un método de referencia para la fosfatasa alcalina. Las sustancias utilizadas en la reacción se encuentran distribuidas adecuadamente en dos reactivos, al objeto de ofrecer mayor estabilidad en la forma líquida original y mantener las condiciones óptimas de la reacción, de modo a permitir la utilización directa de los reactivos en sistemas automáticos.La metodología monorreactiva puede ser aplicada utilizando un Reactivo de Trabajo estable por 30 días bajo refrigeración obteniéndose desempeño adecuado incluso en situaciones de baja demanda de la prueba. El sistema también permite preparar el volumen de Reactivo de Trabajo necesario para solamente una medición de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina.
El sistema es sencillo y utiliza medidas en modo cinético continuado, pudiendo ser fácilmente aplicado en ana-lizadores automáticos y semiautomáticos capaces de medir absorbancia en 405 nm.
Metodología .
Bowers y Mc Comb modificado.Reactivos
1.
(
-
Reactivo 1 - Conservar entre 2-8 ºC.Contiene tampón pH 10,4; HEDTA 2,0 mmol/L; sulfato de zinco 1,2 mmol/L; acetato de magnesio 2,5 mmol/L; azida sódica 8 mmol/L.
2.
)
-
Reactivo 2 - Conservar entre 2-8 ºC.Contiene p-Nitrofenilfosfato 60 mmol/L y fenol 50 mmol/L.³ ³ Cuando almacenados en las condiciones indicadas, los reactivos no abiertos son estables hasta la fecha de caducidad impresa em el rótulo. Durante el manejo, los reactivos están sujetos a contaminaciones de naturaleza química y microbiana que puedem provocar reducción de la estabilidad.
Rastreabilidad del sistema -
La absortividad molar del p-Nitrofenol, producto de la reacción es usado como sistema de referencia para la calibración del ensaio.Se deben aplicar cuidados habituales de seguridad en el manejo del reactivo.
El Reactivo 1 contiene azida sódica, que es tóxica. Se debe tomar cuidado para evitar la ingestión y en caso de contacto con los ojos lavar inmediatamente con gran cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con tuberías de plomo y cobre. Así siendo, se deben utilizar grandes volúmenes de agua para deshacerse del reactivo.
No utilizar el Reactivo de Trabajo cuando su absorbancia, medida contra el agua en 405 nm, sea igual o mayor que 1,2 o cuando se muestre turbio o con señales de contaminación.
Materiales necesarios y no suministrados
1.
Fotómetro con cubeta termostatizada capaz de medir con exactitud la absorbancia en 405 nm.2.
Pipetas para medir muestras y reactivos.3.
Cronómetro.Se debe crear una instrucción de trabajo que establezca procedimientos adecuados para la recogida, preparación y almacenamiento de la muestra. Subrayamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mucho más grandes que los errores acaecidos durante el procedimiento analítico.
FOSFATASA ALCALINA Liquiform
Instrucciones de Uso
Ref.:
79
Precauciones y cuidados especiales
La muestra de sangre debe ser obtenida después de como mínimo 8 horas en ayunas.
Suero o plasma (heparina). La muestra es estable 7 días entre 2-8ºC. Cuando la muestra es almacenada a temperatura ambiente, se obtienen resultados falsamente elevados.
Como ninguna prueba conocida puede asegurar que muestras de sangre no transmiten infecciones, todas deben ser consideradas como potencialmente infectantes. Así siendo, al manejarlas se debe seguir las normativas establecidas para bioseguridad.
Para deshacerse de los reactivos y el material biológico sugerimos aplicar las normativas locales, regionales o nacionales de protección ambiental.
Citrato, fluoruro, oxalato y EDTA son inhibidores de la actividad de la fosfatasa alcalina porque forman complejos con el magnesio. Valores de Bilirrubina de hasta 32 mg/dL no interfieren en la reacción. Muestras ligeramente hemolisadas con hemoglobina de hasta 30 mg/dL pueden ser toleradas, pero hemólisis más acentuadas no se deben aceptar porque producen resultados falsamente disminuidos. Valores de Triglicéridos por encima de 1800 mg/dL producen resultados falsamente elevados.
Para evaluar la concentración aproximada de la hemoglobina en una muestra hemolisada se puede proceder como expuesto a continuación: Diluir 0,05 mL de la muestra en 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) y medir la absorbancia en 405 ó 415 nm, ajustando el cero con agua desionizada o destilada.
Hemoglobina(mg/dL)@Absorbancia405x 601 Hemoglobina(mg/dL)@Absorbancia415x 467
Preparo del reactivo de trabajo .
El conjunto de un frasco de Reactivo 1 y un frasco de Reactivo 2, permite preparar el Reactivo de Trabajo. Transferir el contenido de un frasco de Reactivo 2 a un frasco de Reactivo 1 y homogeneizar por inversión. Apuntar la fecha de expiración. Estable por 5 días entre 15-25 ºC y 30 días entre 2-8 ºC, cuando no ocurra contaminación química o bacteriana. Identificar el frasco del Reactivo de Trabajo para evitar confusión con otros frascos del Reactivo 1. Para preservar el desempeño, el Reactivo de Trabajo debe permanecer fuera del frigorífico solamente el tiempo necesario para obtenerse el volumen a ser utilizado. Evitar exposición a la luz solar directa.Opcionalmente, se puede preparar menos cantidad del Reactivo de Trabajo utilizando la proporción 4 volúmenes del Reactivo 1 y 1 (un) volumen del Reactivo 2.
Ejemplo .Para preparar 1 mL del Reactivo de Trabajo mezsclar 0,8 mL del Reactivo 1 com 0,2 mL del Reactivo 2. Para evaluar la linealidad de la reacción verificar se las absorbancias medidas en intervalos de 1 minuto son comparables.
El Reactivo de Trabajo contiene tampón pH 10,4, sulfato de zinco 1,0 mmol/L, fenol 10 mmol/L, HEDTA 1,6 mmol/L, acetato de magnesio³ 2,0 mmol/L, p-nitrofenil fosfato 12 mmol/L, azida sódica 6,4 mmol/L.³
1.
En un tubo rotulado ‘‘Prueba’’ pipetear 1,0 mL del Reactivo de Trabajo.2.
Añadir 0,02 mL de la muestra, homogeneizar y transferir inmediatamente para la cubeta termostatizada a 37 0,2 ºC. Esperar± 1 minuto.3.
Hacer la lectura de la absorbancia inicial (A ), disparando1 simultáneamente el cronómetro. Repetir la lectura después de 2 minutos (A ).2Para evaluar la linealidad de la reacción verificar si las absorbancias medidas en intervalos de 1 minuto son comparables.
Calcular el ( A/minuto) restando A de A y dividiendo por 2.D 1 2
Cálculos .
Ver linealidad.Es práctica habitual calcular los resultados de la actividad enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de reacción las que incluyen:
Longitud de onda: 405 nm 0,2 nm.±
Cubeta termostatizada a 37 0,2 ºC con 1,0 cm de espesor de solución.± Ancho medio de banda 8 nm.£
Luz espuria 0,1 %.£
Como en la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la calibración del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el fabricante del reactivo. Labtest recomienda la línea Calibra para calibración del sistema Fosfatase Alcalina Liquiform.
A - A2 1 DA Prueba =
2
Actividad de la Fosfatasa Alcalina = A Prueba x 2764.D
El factor 2764 fue calculado para las condiciones propuestas arriba. Recalcular el factor cuando sea efetuada cualquier modificación en uno de los parámetros utilizados para calcularlo.
Ver método para cálculo del factor.
Ejemplo
A Prueba = 0,6101 A Prueba = 0,6602 0,660 - 0,610 DA/minuto = = 0,025 2Fosfatasa Alcalina (U/L) a 37ºC = 0,025 x 2764 = 69
Interferencias
*(Incluyendo adolescentes de hasta 16 años)
Conversión de U/L para Unidades SI: kat/L = U/L x 0,0167m
Temperatura .
La tabla expuesta a continuación permite convertir la actividad medida a una determinada temperatura para el valor que sería obtenido en la medición realizada a otras temperaturas.Ejemplo:la actividad enzimática obtenida a 37 ºC debe ser multiplicada por 0,70 para obtenerse la actividad a 30ºC o por 0,48 para obtenerse la actividad a 25 ºC.
Características del desempeño
7Exactitud .
En 2 muestras con concentraciones de Fosfatasa Alcalina iguales a 59 y 200 U/L se añadieron cantidades diferentes del analito obteniéndose recuperación de entre 94 y 102%.Especificidad .
El método propuesto fue comparado con método similar utilizando 40 muestras de suero con valores situados entre 47 y 707 U/L. La evaluación estadística de los resultados resultó en la ecuación de la regresión: y = 1,091x-10,926 y un coeficiente de correlación (r) igual a 0,999. El error sistemático total (constante y proporcional) verificado en el nivel de decisión (100 U/L), fue igual a 2 U/L ó 2,0%. Como las muestras fueron seleccionadas aleatoriamente en pacientes de ambulatorio y pacientes hospitalizados, se puede inferir que el método tiene una especificidad metodológica adecuada.Sensibilidad metodológica .
Una muestra proteica que no contenía fosfatasa alcalina fue utilizada para calcular el límite de detección del ensayo, habiendo sido encontrado un valor igual a 2,4 U/L,Método para cálculo del factor
VT x 1000 Factor =
x VA x d e
VT = volumen total del ensayo (1,02 mL) VA = volumen de la muestra (0,02 mL) 1000 = conversión de U/mL para U/L d = espesor de la solución (1 cm)
e= absortividad milimolar del p-nitrofenol en 405 nm (18,45)
Ejemplo
1,02 x 1000 Factor = = 2764 18,45 x 0,02 x 1Calibración
Calibraciones manualesUsar calibradores de la línea Calibra - Labtest. Intervalo de calibraciones
Calibración en 2 ó 3 puntos al cambiar de lote;
Calibración en 2 ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique. Sistemas automáticos
Blanco de reactivos: agua desionizada o solución de cloruro de sodio 150 mmol/L (0,85%);
Usar calibradores de la línea Calibra - Labtest. Intervalo de calibraciones
Calibración en 2 ó 3 puntos al cambiar de lote;
Calibración en 2 ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique.
La reacción es lineal hasta 1500 U/L. Para valores mayores, diluir la muestra 1:10 con NaCl 150 mmol/L (0,1 mL de suero + 0,9 mL de NaCl 150 mmol/L), repetir la determinación y multiplicar el resultado obtenido por 10.
Sugerimos la verificación de la linealidad metodológica y fotométrica como mínimo a cada seis meses, utilizando muestras con actividades de hasta 1500 U/L.
Control interno de la calidad .
El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina con claridad los reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Controles deben ser utilizados para evaluar la imprecisión e desviaciones de calibración. Se sugiere que las especificaciones para el coeficiente de variación máximo y el error total sean basados en los componentes de la variación biológica (VB) .5,6Intervalo de referencia .
Estos valores pueden ser usados tan solamente a modo de orientación.Se recomienda que cada laboratorio establezca su propia banda de valores de referencia de la población atendida.
Linealidad
37 ºC 27 - 100 75 - 390 Adultos (U/L) Niños* (U/L) Temperatura de trabajo25 ºC
30 ºC 37 ºCFactores de corrección de la temperatura 25 ºC 0,69 0,48 1,45 2,08 30 ºC 37 ºC 0,70 1,43 Media 92 174 451 DP 1,1 1,6 2,4 CV (%) 1,2 0,9 0,5 N 10 10 10 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 1
Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo
Media 89 175 447 DP 2,0 2,8 6,3 CV (%) 2,2 1,6 1,4 N 10 10 10 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 1
Efectos de la dilución de la matriz .
Una muestra con valor igual a 850 U/L fue utilizada para evaluar la respuesta del sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/L. Usando factores de dilución que variaron de 2 a 8 se encontraron recuperaciones de entre 101 y 104%.Significado clinico .
La fosfatasa alcalina es producida por muchos tejidos, principalmente por los huesos, hígado, intestinos y placenta, y es excretada por la bilis. El dosaje sérico de esta enzima es particularmente útil en la investigación de las enfermedades hepatobiliares y óseas. Niveles elevados de fosfatasa alcalina aparecen en pacientes con enfermedades óseas caracterizadas por el aumento de la actividad osteoblástica como la osteítis deformante, raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo, metástasis ósea, sarcoma osteogénico y enfermedad de Paget.Niveles elevados de fosfatasa alcalina se dan también en pacientes con enfermedades obstructivas de las vías biliares, metástasis hepáticas, dolencias granulomatosas y en la cirrosis hepática. En las enfermedades hepatocelulares como la hepatitis viral aguda, en general se observa un ligero aumento de la enzima.
Niveles disminuidos de la fosfatasa alcalina se encuentran en la desnutrición crónica, en la hipofosfatasemia y, ocasionalmente, en el hipotireoidismo y anemia perniciosa.
Observaciones
1.
La limpieza y secado adecuadas del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos.2.
El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o³ conductividad £1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/L. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua.3.
Como ocurre en toda medición de la actividad en-zimática, la rigurosa observación del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran importancia para la calidad de los resultados obtenidos.4.
Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodología, se sugiere consultar Young DS, Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3ª edición, Washington: AACC Press, 1990.Referencias
1. IFCC Methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes-Part 5, IFCC method for Alkaline Phosphatase. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:731-47.
2. McComb RB, Bowers GN, Upretti A. Clin Chem 1981;27:135-41. 3. Tietz NW, Burtis CA, Ducan P et al. Clin Chem 1983;29: 751-761. 4. Tonks DB Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott
Laboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada, 1972.
5.http://www.westgard.com/biodatabase1.htm (acceso en 25/10/07). 6. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular,
B a s e d e D a t o s d e Va r i a c i ó n B i o l ó g i c a . D i s p o n í v e l em:<http://www.seqc.es/ar ticle/ar ticleview/330/1/170> (acceso en 04/2006).
7. Labtest: Dados de Arquivo.
Están disponibles las aplicacionespara sistemas automáticos. El número de pruebasen aplicaciones automáticas depende de los parâmetros de programación.
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Presentación
Producto Referencia
79-4/30 79-4/50 79-2/64 Fosfatasa Alcalina Liquiform
Fosfatasa Alcalina Liquiform Labmax 560/400 Fosfatasa Alcalina Liquiform
CS 400/800 Fosfatasa Alcalina Liquiform
Labmax 560/400 Contenido 4 x 6 mL 4 x 11 mL 2 x 13 mL 4 x 24 mL 4 x 39 mL 2 x 51 mL 1 1 1 2 2 2 CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38
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Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro
Symbols used with ivd devices
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Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community
Conteúdo suficiente para < n > testes
Contenido suficiente para < n > tests Contains sufficient for < n > tests
Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa)
Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy)
Limite de temperatura (conservar a)
Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at)
Material Calibrador Material Calibrador Calibrator Material Material Calibrador Material Calibrador Calibrator Material
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Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use
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Liofilizado Lyophilized
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Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device
Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number Ref.: 140214 Corrosivo Corrosivo Corrosive Controle negativo Control negativo Negative control Controle positivo Control positivo Positive control Controle Control Control Controle Control Control Marca CE Marcado CE CE Mark Tóxico Tóxico Poison Reagente Reactivo Reagent Número do lote Denominación de lote Batch code Risco biológico Riesgo biológico Biological risk Fabricado por Elaborado por Manufactured by
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