UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTÍN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
QUÍMICA
GUÍA DE PRÁCTICA
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA – PERÚ
2015
PROLOGO
PROLOGO
El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la elaboración de infinidad de productos útiles al hombre, en la generación de procesos productivos con menor contaminación del medio ambiente y con consumos de energía muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones genéticas para que puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos bioprocesos.
El conocimiento de la microbiología se hace imperioso para su aplicación a diversas disciplinas del saber humano. La presente Guía de Práctica se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las técnicas básicas del manejo de Microorganismos en laboratorio para estudiantes de Ingeniería Química.
ÍNDICE
ÍNDICE
PROLOGO ÍNDICE Pgs. RECOMENDACIONES GENERALES…... PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA...PRÁCTICA 2 : MICROSCOPIA; OBSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS IN VIVO, COLORACION VITAL... PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL... PRÁCTICA 4 : COLORACIONES ESPECIALES: TINCION Y
MORFOLOGIA DE HONGOS... PRÁCTICA 5 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO,
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN ... PRÁCTICA 6 : PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ... PRÁCTICA 7 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS... PRÁCTICA 8 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……... PRÁCTICA 9 : CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO... PRÁCTICA 10 :...CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS
67
PRÁCTICA 11 :...AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA... PRÁCTICA 12 :...AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
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PRÁCTICA 13 :...ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS...
FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRÁCTICAS ... BIBLIOGRAFÍA...
Recomendaciones Generales
1. La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia,después de este tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio
2. Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste.
3. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca.
5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. 6. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de
usarla.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse sentado y en su equipo de trabajo.
8. Hablar sólo lo necesario con los compañeros.
9. Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. 10. Si hay necesidad de llevar material biológico para la
realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el equipo. 11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá
esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su uso.
12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. 13. En caso de derramar material que contenga
microorganismos, cúbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor.
15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
16. Después de la incubación es necesario la esterilización del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud.
17. Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.
18. Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.
PRÁCTICA
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD;
BIOSEGURIDAD;
MICROSCOPIA
MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su función y el cuidado de cada uno de ellas.
Dominar el mecanismo de iluminación, la observación de una muestra con todos los objetivos.
II. MARCO TEORICO
2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.
2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD
Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se está dentro del laboratorio
Precauciones estándar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminación de una persona, evitando la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, por ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras por ejemplo guantes no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente
2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR - Barreras de protección
- Desinfección y esterilización.
- Manejo de objetos punzo cortantes. - Manejo y eliminación de desechos - Ventilación e iluminación adecuadas - Limpieza y desinfección de ambientes 2.1.3 VÍAS DE CONTAMINACIÓN
1. La boca
• Comer, beber y fumar en el laboratorio.
• Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección.
2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.).
3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.
4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles). 2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION
- Lavado de manos (antes y después) - Guantes
- Mascarilla o barbijo - Mandil
- Gorro
2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD
• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.
• Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente cerrado.
• Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.
• Lavar las manos con agua y jabón:
– antes de realizar las actividades programadas – antes de salir del laboratorio
– después de usar materiales contaminantes. • Recoger el cabello largo.
• Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable.
• No comer, beber, fumar.
• Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.
• Usar mascarillas para casos indicados 2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda de la luz usada. 2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. Parte mecánica: - Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo) - Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido - Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo
2. Parte óptica del Microscopio:
- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador - Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características: o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma
2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver hasta que haga “clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.
2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X 40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se usa.
Ocular Objetivo campo en micrasDiámetro del
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150
Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo microscópico, concluiremos que la célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de 1500.
2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X. Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.
IV.CUESTIONARIO
1. ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes? 2. ¿A qué se denomina campo óptico?
3. ¿Por qué decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal. 4. ¿Qué es el poder de resolución
5. ¿qué entiende por bioseguridad
6. Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio. 7. ¿qué barreras de protección debe tener en cuenta antes de empezar a
trabajar.
PRÁCTICA
PRÁCTICA
MICROSCOPIA: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
MICROSCOPIA: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO, COLORACION VITAL
IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfología de organismos unicelulares.
2) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.
II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS
UNICELULARES
Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes. Grafique la Observación y Resultados
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.
Hay 2 tipos de técnicas:
a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos.
EXAMEN EN FRESCO Material - Microscopio - Láminas cubreobjetos - Láminas portaobjetos - Agua destilada - Asas de Kolle - Gérmenes varios - Muestras fermentadas - Cultivo de microorganismos Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X. Grafique la Observación y Resultados
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Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teñidas.
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida).
Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ V. CUESTIONARIO
- ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco? - ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
PRÁCTICA
PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
I. OBJETIVOS .
Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
II. MARCO TEORICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las células de cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptídicos.
Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos
fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.
GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075
m.
2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.
Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son:
a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos.
Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. puede prepararse una suspensión del material en una gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa de platino.
b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación son: por el calor y alcohol en frío.
d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos. e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.
f. Secado. Se secará la preparación al aire. CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES
La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los cromóforos presentes.
a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica.
Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina. Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua
y solubles en alcohol. Ej: Sudán III. CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente.
c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos metacromáticos
III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1.PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Preparación del Frotis
- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posición plana en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de éste (el portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos. - Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir
cualesquiera bacterias que se encuentren en ella. Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre. - Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de
Bunsen, con la muestra hacia arriba. - Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.
3.2.TINCIONES SIMPLES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol
TINCIÓN DE AZUL DE METILENO
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
Grafique la Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ TINCIÓN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo. Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
Grafique la Observación y Resultados
_______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________
3.3.COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial - Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada
csp=100 ml) Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción. - Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la
superficie con solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
Grafique la Observación y Resultados
_______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ IV. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades? 2. ¿Por qué se le llama a un colorante ácido o básico?
3. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria? 4. ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
5. ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a las bacterias?
6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina
7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos 8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
9. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique la función que cumple cada uno de ellos. 10. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
11. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.
12. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos? 13. Mencione tres razones por las que un microorganismo
grampositivo se observa gramnegativo.
14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
15. Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.
PRÁCTICA
PRÁCTICA
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS
HONGOS
I. OBJETIVOS
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
en la industria.
II. MARCO TEÓRICO
1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:
B. ETIOPATOGENIA
Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive como saprofitos en el suelo, vegetales en descomposición, cualquier tipo de materia orgánica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropa vieja, recipientes con agua sin usar, reactivos químicos, paredes de refrigeradores, sistemas de ventilación, cuartos de hospital, lentes de contacto blancos, en las capas altas de la atmosfera.
Las especies que actúan como patógenos son termotolerantes. Tras la exposición a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalación o se instalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquier origen, como cavernas por TBC.
C. APLICACIONES INDUSTRIALES
En la producción de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera:
ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fúngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del
páncreas.
En la producción de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados.
INVERTASA O SACARASA.
Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar
invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
La aplicación de enzimas en los detergentes
Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y períodos más cortos de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actúan sobre los materiales que constituyen las manchas, facilitando la remoción de estos materiales y de forma más efectiva que los detergentes convencionales. • Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por
hidrólisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo.
Un ejemplo es la lipasa Hamicola , que se logró producir en Aspergillus
otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extracción de aceite. El uso de algunos preparados celulolíticos en el proceso de extracción ha tenido un efecto positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimático producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extracción del aceite de soya. En condiciones óptimas, el contenido de aceite de soya extraíble (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperación del aceite de soya (99 %).
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %
Extracción de colorantes. La extracción de colorantes es otra aplicación atribuida a algunos preparados enzimáticos.
Extracción de antioxidantes con preparados enzimáticos con actividades mixtasmixtas
El preparado enzimático comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente pectinasa, pero ambién celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no sólo fue efectivo al aumentar la extracción de los fenoles debido a la degradación de los polisacáridos (celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que mejoró también la actividad antioxidante de los extractos fenólicos
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras del espora-cojinete.
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la
colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas que en las rurales).
APLICACIONES DEL PENICILLLIUM
Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos tales como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son absolutamente seguros de comer. La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming producía 2 mg de penicilina por cada litro de cultivo, posteriormente se encontró que otros
Penicillium eran mejores productores de penicilina y se eligió a Penicillium chrysogenum como cepa súper productora de este antibiótico. Finalmente, la
selección de sucesivos mutantes súper productores y la mejora en las técnicas de fermentación realizadas por la industria biotecnológica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea en la producción de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.
Incluye las siguientes especies: Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie.
> Penicillium candida, ídem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola. > Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistémica emergente
que afecta a roedores y humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina. > Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y recientemente también gorgonzola
III. PROCEDIMENTO
A.MATERIAL • Asa de kolle • KOH al O% • Mechero • Azul de lactofenol• Láminas portaobjetos • Láminas cubreobjetos
• Microscopio
B.MATERIAL BIOLOGICO • Cultivo de Aspergillus flavus • Cultivo de Aspergillus niger
• Cultivo de Aspergillus fumigatus • Cultivo de Penicillium C.REACTIVOS C.l. Hidróxido de potasio al 10% KOH 10 g Agua destilada 100 ml C.2. Azul de lactofenol. Fenol 20 g Ácido láctico 20 g Glicerol 40 ml Agua destilada 20 ml
Disolver los componentes antes mencionados y después se agrega el colorante.
Se puede emplear cualquiera de los siguientes: Azul de algodón 0.05g
Azul de metileno 0.05 g
1.EXAMEN DIRECTO CON KOH 10%
Se realiza a partir del esputo, membranas expectoradas o fragmentos de tejido que se obtienen por broncospia.
Se encuentran filamentos hialinos, largos, sinuosos y ramificados de 3 a 4 de diámetro. En los aspergilomas puede observarse masas de filamentos con sus cabezas aspergilares. Se puede trabajar a partir del cultivo, con la finalidad de observar sus estructuras que permitan identificar el género.
• Colocar una gota de KOH al 10% en un portaobjeto y mezclar con una pequeña cantidad del material a examinar (micelio aéreo proveniente del cultivo).
• Colocar un cubre objeto (18 x 18 mm) sobre la gota.
• El hidróxido de potasio actúa disolviendo la queratina e intensificando el contraste de las estructuras fúngicas con otros materiales presentes en este preparado microscópico.
• Examinar microscópicamente en busca de hifas u otras estructuras nicóticas.
2.CULTIVOS
Se realiza en los medios habituales sin cicloheximida, Agar Sabauraud. Las colonias crecen con rapidez, son de color blanco y por la producción de esporas se tornan de diferentes colores. La superficie es aterciopelada o pulvurulenta. Estos hongos se diferencian por el aspecto y pigmentación de la colonia.
2.1. AGAR SABOURAUD A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a infecciones dermatológicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que pueden estar presentes en la muestra.
B. COMPOSICION
IV. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B.ASPERGILLUS FUMIGATUS
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
C.ASPEGILLUS FLAVUS
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... D.PENICILLIUM
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado derivado de las sojas. Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su padre, los zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.
EL GÉNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente los medios de cultivo.
EL GÉNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios de cultivo. En este Género los esporangióforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico, succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se
desarrolle. Una forma típica o filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de mostos azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas (amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente
fermenta los azúcares formados en la hidrólisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es en síntesis lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica se emplea para la fabricación de amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar
el almidón y producir etanol, pero en menor proporción que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de fermentación alcohólica, en cambio, en los últimos años se
A. CULTIVOS
Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente. Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rápido crecimiento, son vellosas o algodonosas y empujan la tapa de la placa petri. • Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrón o negro con la madurez a medida que se forman esporas.
B. OBSERVAR a. RHYZOPUS
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ... b. MUCOR
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ...
c. ABSIDIA
Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos ... ... ... ... ... ... ... ...
V. CUESTIONARIO
1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el género Aspergillus?
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscópicas y microscópicas) ? Dibuje.
4. Cómo diferencia el género Aspergillus del Penicilium? 5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium? 7. Qué es una enzima?
8. Dibuje e indique las partes del Penicillium?
9. Mencione Ud. Cuáles son las características macroscópicas del Penicillium? 10.Cuál es la estructura básica de la Penicilina?
11.Cuáles son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
12.Cómo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de cultivo se trata de un Zygomycete?
13.Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
14.Indique Ud. Cuáles son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una Absidia?
15.Qué enfermedades producen estos hongos?
PRÁCTICA
PRÁCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN
I.
OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico.
3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los alimentos.
II. MARCO TEÓRICO
El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas. 2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo.
Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura de 160-170ºC durante 1 hora.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio.
2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3
sobre la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de pequeñas moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente es resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe también degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo. c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de
presión y 121ºC por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización. c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar. 2.2 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
II.3 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método presenta muchas dificultades técnicas.
III. MATERIALES Y EQUIPO
- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri - Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodón, gasa, tijeras - Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente - Autoclave
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR a)Preparación de tubos matraces
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono truncado, con el diámetro a la medida del
mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo - Rotular la fecha de preparación.
b)Preparación para proteger las pipetas
- En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de algodón con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante.
- Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilización.
c)Preparación de las placas Petri
- Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las placas petri completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa poniéndose esta en el centro, se envuelve la placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de regalo.
4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal.
a)Procedimiento para la esterilización en horno - Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno. - Si hay un ventilador verifique que esté funcionando.
- Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60 minutos más.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del horno.
- El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color marrón oscuro, si el color del papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO
a)Procedimiento para la esterilización con autoclave
- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado. - Abrir la válvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado de la autoclave.
- Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles.
VI. CUESTIONARIO
1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?
2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control microbiológico, por qué?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.
PRÁCTICA
PRÁCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO
I.
OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo.
II. MARCO TEORICO
2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.
2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho
que es característico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas. Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.